本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种发酵生产他克莫司的方法。
背景技术：
他克莫司(Tacrolimus，FK506)是由筑波链霉菌(streptomyces tsukubaensis)发酵产生的一种23元大环内酯类抗生素，其分子式C44H69NO12，结构式如下式(1)所示。
他克莫司能减少肝肾移植受体的急、慢性排斥反应。用本品的患者，细菌和病毒感染率也较环孢素治疗者低，尤其是该药品有较强的亲肝性，对肝移植的功效比环孢素高100倍，因而大大降低了临床使用剂量，可降低原治疗费用1/3～1/2。FK-506和环孢菌素合用具有明显的协同作用，效果更好。他克莫司不仅可用于防止免疫反应的发生，还可用于治疗已发生的免疫反应及自身免疫性疾病，对防止器官移植的免疫反应和自身免疫性疾病的治疗具有重要意义。
自他克莫司发现以来，国内外对他克莫司进行了基础和临床研究，于1994被美国食品和药物管理局(FDA)批准上市。目前临床应用于预防肝脏或肾脏移植手术后的移植物排斥反应。他克莫司与其他免疫抑制剂如雷帕霉素和环孢霉素等对预防器官移植中所出现的排斥反应具有很好的效果，并且在临床效果免疫抑制剂作用比环孢霉素(CsA)强100倍，因而能够大大降低临床使用剂量，同时不良反应液明显降低，并且可以降低治疗费用他克莫司广泛应用于特应性皮炎(AD)、变应性接触式皮炎、银屑病、红斑狼疮(SLE)、白癜风、扁平苔藓和Nethenton等自身免疫疾病的治疗。目前，传统的发酵法制备他克莫司存在产量不高的缺陷，无法满足对他克莫司的巨大需求，且存在制备他克莫司的生产成本较高的缺陷，这就患者带来了较大负担。
有鉴于此，有必要对现有技术中通过发酵法生产他克莫司的方法予以改进，以解决上述问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于公开一种发酵生产他克莫司的方法，用以降低采用发酵法制备他克莫司的生产成本，缩短发酵周期。
为实现上述发明目的，本发明提供了一种发酵生产他克莫司的方法，包括以下步骤：
步骤(1)、将链霉菌接种于斜面培养基，26～30℃下培养9～15天；
步骤(2)、挑选成熟斜面接种于种子培养基上，在26～30℃，转速200～300rmp下在摇床上培养40～50h，按2～15％的接种量接种于发酵培养基后置入发酵罐；
步骤(3)、将发酵罐置于26～30℃下进行发酵，待发酵进行至20～30h时补加有机溶剂及盐溶液，待发酵进行至40～50h时再次补加有机溶剂及盐溶液，待发酵进行至70～80h时进行补料培养基，并在整个发酵过程中，通过改变转速的方式维持发酵罐内的溶解氧浓度保持在设定值之上；
步骤(4)、对经步骤(3)得到的发酵液进行分离提取，即得他克莫司。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(1)中的斜面培养基组成为：麦芽汁粉10～20g/L，酵母膏粉3～8g/L，葡萄糖5～15g/L和琼脂18～22g/L组成；所述斜面培养基的pH呈6.0～8.0。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(2)中的种子培养基组成为：玉米淀粉5～15g/L，玉米浆5～15g/L，葡萄糖10～20g/L，酵母粉5～15g/L，碳酸钙1～5g/L组成；所述斜面培养基的pH呈6.0～8.0。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(2)中的发酵培养基组成为：玉米淀粉45～55g/L，酵母粉5～15g/L，玉米浆5～15g/L，玉米油5～15g/L，K2HPO41～5g/L，KH2PO4 1～5g/L和碳酸钙1～5g/L组成；所述发酵培养基的pH呈6.0～8.0。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(3)中盐溶液的添加量为发酵罐中的发酵液的体积的0.05％～0.5％；有机溶剂的添加量为发酵罐中的发酵液的体积的0.01～0.05％。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(3)中的盐溶液选自氯化钠溶液或者氯化钾溶液，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇或者异丙醇；所述盐溶液的浓度为1.0～5.0mol/L。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(3)中的补料培养基组成为：玉米淀粉50～80g/L，酵母粉10～20g/L，碳酸钙0.3～0.6g/L组成；所述补料培养基的pH呈6.0～7.0。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(3)中发酵罐的罐压为0.01～0.05MPa，通气量为0.5～1.5VVM，初始发酵罐的溶解氧浓度为100％，发酵过程中发酵罐内的溶解氧浓度的设定值为25％。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明中，在发酵罐发酵过程中采用分批发酵的方式进行发酵培养，并在发酵的不同阶段向发酵培养基中添加有机溶剂及盐溶液，相对于传统的发酵法制备他克莫司本发明能够提高他克莫司的产量约20～40％，且发酵周期也较短，从而降低了他克莫司的生产成本。
具体实施方式
下面结合各实施方式对本发明进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本发明的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。
除非说明书中有特殊说明，本发明中的各个实施例中的组分、原料均采用分析纯级别。另外，各实施例中的“g”为重量单位“克”；“h”为时间单位“小时”；“ml”为体积单位“毫升”；“室温”为23℃。“VVM”为通气量单位(air volume/culture volume/min)，并具体为单位时间内(通常为每分钟)通入到发酵容器(例如“发酵罐”)的气体体积。“g/L”为培养基中各组分的含量单位。
实施例一：
一种发酵生产他克莫司的方法，包括以下步骤。
步骤(1)、将链霉菌接种于斜面培养基，26℃下培养15天。
步骤(2)、挑选成熟斜面进行接种于种子培养基，在26℃，转速300rpm下在摇床上进行培养50h。按2％的接种量接种于发酵培养基后置入发酵罐中进行发酵。
步骤(3)、将发酵罐置于26℃下进行发酵。待发酵进行至30h补加含甲醇的氯化钠溶液，待发酵进行至50h时再次补加甲醇及氯化钠溶液，甲醇的添加量为发酵罐中的发酵液的体积的0.01％，氯化钠溶液的添加量为发酵罐中的发酵液的体积的0.05％。氯化钠溶液的浓度为1.0mol/L。待发酵进行至80h时进行补料培养。在整个发酵过程中，发酵罐罐压为0.01MPa，通气量0.5VVM，初始发酵罐的溶解氧浓度为100％。同时，在发酵过程中通过改变转速的方式维持发酵罐内的溶解氧浓度保持在25％以上，发酵90h后放罐，制得发酵液。
步骤(4)、对经步骤(3)得到的发酵液进行分离提取，即得他克莫司。在本实施例中，对发酵液中的他克莫司可通过重结晶进行分离提取。
斜面培养基中的各组分为(单位：g/L)：麦芽汁粉10，酵母膏粉3，葡萄糖5，琼脂18，余量为水；斜面培养基的pH呈6.0。
种子培养基中的各组分为(单位：g/L)：玉米淀粉5，玉米浆5，葡萄糖10，酵母粉5，碳酸钙1，余量为水；种子培养基的pH呈6.0。
发酵培养基中的各组分为(单位：g/L)：玉米淀粉45，酵母粉5，玉米浆5，玉米油5，K2HPO4 1，KH2PO4 1，碳酸钙1，余量为水；发酵培养基的pH呈6.0。
补料培养基各组分为(单位：g/L)：玉米淀粉50，酵母粉10，碳酸钙0.3，余量为水。补料培养基的pH呈6.0。
实施例二：
一种发酵生产他克莫司的方法，包括以下步骤。
步骤(1)、将链霉菌接种于斜面培养基，30℃下培养9天。
步骤(2)、挑选成熟斜面进行接种于种子液培养基，在30℃，200rmp下在摇床上培养40h，按15％的接种量接种于发酵培养基后置入发酵罐中进行发酵。
步骤(3)、将发酵罐置于30℃下进行发酵。发酵进行至20h补加乙醇及氯化钾溶液，发酵进行至40h再次补加乙醇及氯化钾溶液，乙醇添加量为发酵罐中的发酵液的体积的0.05％，氯化钾溶液的添加量为发酵罐中的发酵液的体积的0.5％。氯化钾溶液的浓度为2.0mol/L。发酵进行至70h进行补料培养。在整个发酵过程中，发酵罐罐压为0.05MPa，通气量1.5VVM，初始发酵罐的溶解氧浓度为100％。同时，在发酵过程中通过改变转速的方式维持发酵罐内的溶解氧浓度保持在25％以上，发酵100h后放罐，制得发酵液。
在本实施例中，发酵罐的底部设置有搅拌装置，搅拌装置被伺服电机驱动，以控制搅拌装置的转速。搅拌装置的转速设定转速范围为180～400rpm。提高转速可提高发酵罐内的溶解氧浓度，降低转速可降低发酵罐内的溶解氧浓度。伺服电机在控制器，例如单片机或者PLC的控制下，通过自发酵罐内所设置的传感器所测得的溶解氧浓度，以自动控制伺服电机的转速，从而自动控制发酵罐底部所设置的搅拌装置的转速，从而通过改变转速的方式维持发酵罐内的溶解氧浓度保持在25％以上。
步骤(4)、对经步骤(3)得到的发酵液进行分离提取，即得他克莫司。
斜面培养基中的各组分为(单位：g/L)：麦芽汁粉20，酵母膏粉8，葡萄糖15，琼脂22，余量为水；斜面培养基的pH呈8.0。
种子培养基中的各组分为(单位：g/L)：玉米淀粉15，玉米浆15，葡萄糖20，酵母粉15，碳酸钙5，余量为水；种子培养基的pH呈8.0。
发酵培养基中的各组分为(单位：g/L)：玉米淀粉55，酵母粉15，玉米浆15，玉米油15，K2HPO4 5，KH2PO4 5，碳酸钙5，余量为水；发酵培养基的pH呈8.0。
补料培养基中的各组分为(单位：g/L)：玉米淀粉80，酵母粉20，碳酸钙0.6，余量为水；补料培养基的pH呈6.4。
实施例三：
一种发酵生产他克莫司的方法，包括以下步骤。
步骤(1)、将链霉菌接种于斜面培养基，28℃下培养12天。
步骤(2)、挑选成熟斜面进行接种于种子液培养基，在28℃，250rmp下在摇床上培养45h，按8％的接种量接种于发酵培养基后置入发酵罐中进行发酵。
步骤(3)、将发酵罐置于28℃下进行培养。发酵进行至24h时补加异丙醇及氯化钠溶液；发酵进行至48h时再次补加异丙醇及氯化钠溶液，异丙醇添加量为发酵罐中的发酵液的体积的0.20％，氯化钠溶液的添加量为发酵罐中的发酵液的体积的0.03％。氯化钠溶液的浓度为5.0mol/L。
发酵进行至75h时进行补料培养。在整个发酵过程中，发酵罐罐压为0.03MPa，通气量1.0VVM，初始发酵罐的溶解氧浓度为100％。同时，在发酵过程中通过改变转速的方式维持发酵罐内的溶解氧浓度保持在25％以上，发酵96h后放罐，制得发酵液。
步骤(4)、对经步骤(3)得到的发酵液进行分离提取，即得他克莫司。
斜面培养基中的各组分为(单位：g/L)：麦芽汁粉15，酵母膏粉5，葡萄糖10，琼脂20，斜面培养基的pH呈6.5。
种子培养基中的各组分为(单位：g/L)：玉米淀粉10，玉米浆10，葡萄糖15，酵母粉10，碳酸钙3，余量为水；种子培养基的pH呈6.5。
发酵培养基中的各组分为(单位：g/L)：玉米淀粉50，酵母粉10，玉米浆10，玉米油10，K2HPO4 3，KH2PO4 3，碳酸钙3，余量为水；发酵培养基的pH呈6.5。
补料培养基中的各组分为(单位：g/L)：玉米淀粉60，酵母粉15，碳酸钙0.4，余量为水；补料培养基的pH呈7.0。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。