一种酶法制备脂溶性葡萄籽原花青素的方法与流程

本发明涉及脂溶性葡萄籽原花青素，特别涉及一种天然抗氧化剂的制备方法，具体涉及一种酶法制备脂溶性葡萄籽原花青素的方法。

背景技术：

葡萄籽原花青素，简称OPC，是一种有着特殊分子结构的生物类黄酮，是目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂。葡萄籽原花青素具有非常强的体内活性，具有极强的抗氧化、消除自由基的作用，可有效消除超氧阴离子自由基和羟基自由基，还具有眼睛保健、心率保健、降低癌症发病危险、增强血管强度、消炎、祛肿等多种功效。

葡萄籽原花青素易溶于水，也能溶于甲醇、乙醇、丙酮等极性有机溶剂中。但其多羟基结构，导致其亲水性好而亲油性弱，难溶于油中，限制了其在脂酯类食品以及其它含油食品中的应用。因此，开发研制脂溶性葡萄籽原花青素产品具有广阔的市场前景。

传统方法制备脂溶性葡萄籽原花青素的方法虽相对容易，但溶剂残留量大，为了使产品不含有毒成分，导致后续处理工艺复杂，而且还带来排放污染问题。中国发明专利CN101066075公布了添加葡萄籽原花青素微乳液的食用油生产方法，将油酸聚甘油单酯与乙醇以4：1的比例在20‐40℃范围内搅拌混合均匀，按体积比为1‐5％的量逐滴加入葡萄籽原花青素水溶液，边搅拌边加入，直到形成均匀稳定的溶液，用Ultra‐TurraxT25高速分散机将葡萄籽原花青素乳化液在20,000rpm条件下分散3‐5分钟，静止1小时，待用；调节食用油温度在20‐40℃范围内，用搅拌机在1,000rpm条件下搅拌30分钟，将制备好的葡萄籽原花青素乳化液按照体积比5‐10％的比例缓慢加入食用油中，边加边搅拌，直到油脂澄清无浑浊为止，即为添加葡萄籽原花青素微乳液的食用油。

中国发明专利申请CN101703636A公布了一种油溶性葡萄籽提取物及其制备方法，含有6～28个碳原子的有机脂肪酸和氢氧化钠混合，加热回流反应，得到高级脂肪酸钠，将高级脂肪酸钠加盐酸酸化，取其上层油脂，在25～130℃时，向油脂中滴入酰化剂；以葡萄籽提取物为溶质，有机溶剂为溶剂，其溶液在30～90℃时，滴入上述酰化反应的合成物，反应后减压蒸去其滤液成粘稠油状物。

上述两种制备方法虽能制备天然产物，但工艺较为复杂，且需添加大量溶剂。另外，中国发明专利CN101066075的乳化法制成的产品稳定差，易分层；中国发明专利CN101703636A的化学法需采用长时间高温处理，制备时间长，不仅耗能，而且副产物多，产品的抗氧化性减弱。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种不污染环境，又易于分离，制得的产品食用安全，性能稳定，抗氧化效果明显的酶法制备脂溶性葡萄籽原花青素的方法。

酶法分子修饰因具有反应条件温和，区域选择性强，副产物少、流程简单可控等优点逐渐成为取代化学合成的一种新方法。脂肪酶是工业生产中最重要的生物催化剂之一，固定化脂肪酶因其良好的稳定性和催化活性在食品工业中得到广泛应用。在酶法酸化过程中，选择合适的酶至关重要。本发明发现9种适用于黄酮类化合物酰化的脂肪酶，分别为脂肪酶CALB、脂肪酶435、脂肪酶RMIM、脂肪酶TLIM、脂肪酶IM、脂肪酶TL100L、脂肪酶CRL、洋葱假单胞菌脂肪酶和皱褶假丝酵母脂肪酶。本发明采用酶法制备脂溶性葡萄籽原花青素，通过改变反应条件，制备脂溶性葡萄籽原花青素。本发明可提高产品稳定性、缩短制备时间，增强食用安全性、避免环境污染。本发明方法以脂肪酶为催化剂，既不污染环境，又易于分离；制得的产品食用安全，可以任意比例添加到食用油中，性能稳定，抗氧化效果明显，且制备工艺简单可控。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种酶法制备脂溶性葡萄籽原花青素的方法，包括如下步骤：

(1)将葡萄籽原花青素与含有2～30个碳原子的有机脂肪酸混合，加入溶剂，20～90℃下搅拌0.1～10h；

(2)加入固定化脂肪酶作为催化剂，在20～90℃下加热搅拌反应1～48h；所述固定化脂肪酶为脂肪酶CALB、脂肪酶435、脂肪酶RMIM、脂肪酶TLIM、脂肪酶IM、脂肪酶TL100L、脂肪酶CRL、洋葱假单胞菌脂肪酶和皱褶假丝酵母脂肪酶中的任一种；

(3)将脂肪酶分离，终止反应，反应后减压蒸去其滤液，得紫红色的粘稠油状物，为合成的脂溶性葡萄籽原花青素。

为进一步实现本发明目的，优选地，所述含2～30个碳原子的有机脂肪酸为月桂酸、棕搁酸、硬脂酸、油酸和亚油酸中的一种或多种。

进一步优选，所述有机脂肪酸为含8～22个碳原子的不饱和脂肪酸。

优选地，所述葡萄籽原花青素与有机脂肪酸的质量比为10:1～1:50。

优选地，所述溶剂为水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和石油醚中的一种或多种。

优选地，加入溶剂与葡萄籽原花青素的质量比为20:1～1:40。

优选地，加入固定化脂肪酶与葡萄籽原花青素的质量比为1:100～1:1。

优选地，减压蒸去其滤液的装置为旋转蒸发仪，温度为30～90℃。

本发明制得的产品可以任意比例添加到食用油中，抗氧化效果明显，性能稳定，并保持原有油脂的品质，制得的产品食用安全，制备工艺简单可控。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)酶法制备脂溶性葡萄籽原花青素，比现有技术CN101066075的乳化法等传统方法性能稳定、食用安全。可以任意比例添加到食用油中；

(2)酶法制备脂溶性葡萄籽原花青素，其脂肪酶具有高度的选择性和专一性，相比现有技术CN101703636A化学法，目标产物易分离；

(3)酶法制备脂溶性葡萄籽原花青素，比现有技术CN101703636A化学法的反应步骤少、简单可控；

(4)酶法制备脂溶性葡萄籽原花青素，其采用固定化脂肪酶为催化剂，相比现有技术CN101703636A化学法的碱性催化剂，副产物少，不产生含碱废液污染环境，且易于分离。

附图说明

图1为实施例1原料葡萄籽原花青素的红外光谱图。

图2为实施例1所得产物脂溶性葡萄籽原花青素的红外光谱图。

图3为实施例1原料葡萄籽原花青素的HPLC谱图。

图4为所得产物脂溶性葡萄籽原花青素的HPLC谱图。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明做进一步描述，需要说明的是，实施例并不构成对本发明要求保护范围的限制。

实施例1：

将5g葡萄籽原花青素与20g月桂酸混合，加入1L丙酮，40℃下搅拌2h。加入固定化脂肪酶435(杭州创科生物科技有限公司)作为催化剂，在45℃下加热搅拌反应8h。自加入固定化脂肪酶起开始计时，将脂肪酶分离，终止反应，反应后减压蒸去其滤液，剩下的紫红色的粘稠油状物，即为合成的脂溶性葡萄籽原花青素产品。经检测，所得脂溶性葡萄籽原花青素乙酸乙酯溶解度为1.6g/100g，其转化率为77％。

实施例2：

将5g葡萄籽原花青素与50g棕榈酸混合，加入5L乙醇，50℃下搅拌4h。加入固定化脂肪酶RMIM(杭州创科生物科技有限公司)作为催化剂，在60℃下加热搅拌反应12h。自加入固定化脂肪酶起开始计时，将脂肪酶分离，终止反应，反应后减压蒸去其滤液，剩下的紫红色的粘稠油状物，即为合成的脂溶性葡萄籽原花青素产品。经检测，所得脂溶性葡萄籽原花青素乙酸乙酯溶解度为2.4g/100g，其转化率为73％。

实施例3：

将5g葡萄籽原花青素与1g亚油酸混合，加入2L石油醚，50℃下搅拌1h。加入固定化脂肪酶TLIM(杭州创科生物科技有限公司)作为催化剂，在50℃下加热搅拌反应5h。自加入固定化脂肪酶起开始计时，将脂肪酶分离，终止反应，反应后减压蒸去其滤液，剩下的紫红色的粘稠油状物，即为合成的脂溶性葡萄籽原花青素产品。经检测，所得脂溶性葡萄籽原花青素乙酸乙酯溶解度为1.3g/100g，其转化率为61％。

实施例4：

将5g葡萄籽原花青素与5g豆油脂肪酸混合，加入100ml蒸馏水，30℃下搅拌0.5h。加入固定化脂肪酶CALB(杭州创科生物科技有限公司)作为催化剂，在40℃下加热搅拌反应18h。自加入固定化脂肪酶起开始计时，将脂肪酶分离，终止反应，反应后减压蒸去其滤液，剩下的紫红色的粘稠油状物，即为合成的脂溶性葡萄籽原花青素产品。经检测，所得脂溶性葡萄籽原花青素乙酸乙酯溶解度为3.1g/100g，其转化率为82％。

利用FT‐RI和HPLC‐MS对实施例1所得样品进行检测分析，其他实施例情况如实施例相似，不一一提供；实施例1测试所得结果如下：

FT‐RI(VERTEX33，Bruker)采用溴化钾压片法，按照GB/T6040的规定进行试验。如图1和图2所示；经检测，脂溶性葡萄籽原花青素的红外光谱与葡萄籽原花青素相比，3400cm^‐1左右的酚羟基吸收峰大大减弱，表明原物质的水溶性降低，1700cm^‐1附近出现强的酯羰基吸收峰，表明新物质的脂溶性增强，反应后葡萄籽原花青素被酰化。其原理主要是葡萄籽原花青素的酚羟基生成了酯羰基，由水溶性基团转变成脂溶性基团。

Waters2998高效液相色谱(HPLC)分离条件为：分析柱Waters C18(4.6mm×250mm ID，5.0μm)；检测波长280nm；柱温28℃；进样量20μL；流速1mL/min；流动相：甲醇和水。

线性梯度洗脱程序：0‐5min，5‐25％甲醇；5‐20min，25％甲醇；20‐25min，25‐30％甲醇；25‐40min，30％甲醇；40‐45min，30‐100％甲醇；45‐60min，100％甲醇。

MS检测通过Thermo Scientific LCQ Ion‐Trap Mass Spectrometer进行，质谱条件如下：ESI⁺，毛细管电压3.5kV，m/z 50‐2000。

采用HPLC‐MS/MS对GSP‐o进行了分析，结果见图3、4，可见葡萄籽原花青素在保留时间40min后，几乎没有其它物质出现，而改性后的葡萄籽原花青素在保留时间40min后有10种以上物质存在，利用质谱进一步确定了7种主要物质，分别为表没食子儿茶素二棕榈酸酯、儿茶素三棕榈酸酯、原花青素B1二棕榈酸酯、表儿茶素四棕榈酸酯、表儿茶素没食子酸酯二棕榈酸酯、原花青素C1三棕榈酸酯、原花青素A2二棕榈酸酯。由表1(实施例1葡萄籽原花青素改性前后的成分分析情况表)可知，这些物质主要是葡萄籽原花青素通过二、三和四取代酰化反应得到，说明葡萄籽原花青素的酯化完成。

与现有技术CN101066075的乳化法等传统方法相比，本发明实施例制得的产品为酶法制备脂溶性葡萄籽原花青，属于的酯化反应，产物性能稳定，脂溶性好，可以任意比例添加到食用油中，抗氧化效果明显，并保持原有油脂的品质。

本发明酶法制备脂溶性葡萄籽原花青素，其采用固定化脂肪酶为催化剂，相比现有技术CN101703636A化学法的碱性催化剂，副产物少，不产生含碱废液污染环境，且易于分离。因脂肪酶具有高度的选择性和专一性，相比现有技术CN101703636A化学法，本发明无需调节pH，只需将脂肪酶分离，减压蒸去其滤液，即可将目标产物易分离。

本发明实施例原料皆为食品级原料，且为酶法反应，无副反应，反应温和，所以制得的产品食用安全，制备工艺简单可控。

表1实施例1葡萄籽原花青素改性前后的成分分析情况表