一种用双酶串联制备β‑丙氨酸的方法与流程

本发明涉及一种用双酶串联制备β-丙氨酸的方法，属于生物工程领域。

背景技术：

β-丙氨酸在医药食品化工等领域都有着广泛的应用，尤其是可以作为具有高附加值的医药中间体。目前在工业生产中，β-丙氨酸的主要合成方式是丙烯酸、丙烯腈氨化法，或β-氨基丙腈水解法，这些方法多需要在高温、高压、强酸或强碱的条件下，而且产物纯化繁琐，存在环境污染问题，因此使用生物催化法替代化学合成法制备β-丙氨酸是发展趋势。

而目，前生物合成法主要有两种，一种是优化代谢途径，在培养微生物过程中合成β-丙氨酸，此法虽然较简便，但是由于微生物代谢过程中会产生大量副产物，对产物的分离纯化带来较大困难，增加了后期纯化成本；另一种方法是生物酶法合成β-丙氨酸，即通过表达L-天冬氨酸α-脱羧酶，以L-天冬氨酸作为底物，合成β-丙氨酸，虽然此法分离纯化简便，但是底物价格相对较高，不适合工业化生产。

技术实现要素：

本发明提供了一种以富马酸为底物，以双酶串联体系合成β-丙氨酸的方法。

所述双酶是天冬氨酸酶、L-天冬氨酸α-脱羧酶。

所述天冬氨酸酶的制备方法，是大肠肝菌来源的编码天冬氨酸酶的基因aspA，通过NdeⅠ和HindⅢ双酶切后连接到用同样限制性内切酶酶切的质粒载体pET 28a(+)上，获得重组质粒pET 28a-aspA；将重组质粒转化大肠杆菌BL21，筛选获得重组大肠杆菌BL21/pET28a-aspA；以该重组菌生产得到天冬氨酸酶。

所述L-天冬氨酸α-脱羧酶的制备方法，是将谷氨酸棒杆菌来源的编码L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因panD通过NdeⅠ和HindⅢ双酶切后连接到用同样限制性内切酶酶切的表达载体pET 24a(+)上，获得重组质粒pET 24a-panD；将重组质粒转化大肠杆菌BL21，筛选获得重组大肠杆菌BL21/pET24a-panD；以该重组菌生产得到L-天冬氨酸α-脱羧酶。

所述天冬氨酸酶、L-天冬氨酸α-脱羧酶的制备方法，还包括收集培养得到的重组菌的菌体，进行破碎、分离纯化目标蛋白质，获得电泳纯的酶。

所述双酶串联体系中，底物富马酸的浓度为50～100mmol/L；两种酶按照质量比天冬氨酸酶：L-天冬氨酸α-脱羧酶为1：80～100的比例添加至反应体系中；其中，天冬氨酸酶的用量为10～15μg/mL。

所述双酶串联体系中，底物富马酸的浓度为50mmol/L；两种酶按照质量比天冬氨酸酶：L-天冬氨酸α-脱羧酶为1：80的比例添加至反应体系中；其中，天冬氨酸酶的用量为10μg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述双酶串联体系还中含有1mmol/L的MgCl₂，以及50mmol/L pH 7.0的NaH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，所用天冬氨酸酶、L-天冬氨酸α-脱羧酶的纯酶的比酶活分别为168mmol/g·min、156mmol/g·h。

在本发明的一种实施方式中，所述底物富马酸是配制50-500mmol/L富马酸母液，用氨水调节pH至7.0，然后作为反应底物。

在本发明的一种实施方式中，将底物和酶混合好后，置于30～37℃、100-200rpm的条件下，反应6-24h。

本发明首次实现了双酶串联反应，可在较短时间内将底物富马酸完全转化为β-丙氨酸，β-丙氨酸的产率>95％，中间产物L-天冬氨酸无残余。本发明方法采用的底物价格相对低廉，而且，中间产物L-天冬氨酸无残余，可见本发明能显著降低目前生物合成β-丙氨酸的成本。

附图说明

图1不同的天冬氨酸酶、L-天冬氨酸α-脱羧酶的加酶量的双酶偶联反应进程，A：天冬氨酸酶与L-天冬氨酸α-脱羧酶的加酶质量比为1:40；B：天冬氨酸酶与L-天冬氨酸α-脱羧酶的加酶质量比为1:60；C：天冬氨酸酶与L-天冬氨酸α-脱羧酶的加酶质量比为1:80。

图2双酶偶联反应催化体系示意图。

具体实施方式

富马酸含量的测定：反应液经0.22μm有机滤膜过滤后用HPLC检测，色谱柱为Prevail Organic Acid(OA)有机酸分析柱(5μm，4.6×250mm)。流动相为20％甲醇溶液(磷酸调pH至2.2)，流速为0.6mL/min，检测波长为220nm，柱温为40℃，检测时间为15min，进样量为10μL。所测得衍生产物的含量等同于衍生前物质的含量。

L-天冬氨酸及β-丙氨酸含量的测定：反应液用苯基异硫酸酯(PITC)衍生，具体步骤为：取500μL反应液于1.5mL离心管，加入250μL 0.1mol/L PITC乙腈溶液和250μL 1mol/L三乙胺乙腈溶液，充分混匀，避光室温放置0.5h，加入700μL正己烷溶液，涡旋振荡器振荡1min，静置30-60min，吸取下层溶液，经0.22μm有机滤膜过滤，进样量为10μL。衍生产物用HPLC测定：色谱柱为La Chrom C18(5μm，4.6×250mm)；流动相A溶液为80％(V/V)已腈水溶液，B溶液为97:3(V/V，pH 6.5)的0.1mol/L乙酸钠-乙腈溶液；采用梯度洗脱：0-20min，B溶液由95％下降到65％；20-30min，B液由65％上升到95％；30-35min，B溶液梯度不变。检测波长为254nm，柱温为40℃。

重组蛋白的纯化及鉴定：将重组菌体溶于结合缓冲溶液(50mmol/L Na₂HPO₄、50mmol/L NaH₂PO₄、500mmol/L NaCl、20mmol/L imidazole)，超声破碎，离心，上清用0.22μm滤膜过滤。用10倍柱体积的结合缓冲溶液平衡5mL的His Trap HF柱，取20mL的破碎上清上样，用10倍柱体积的结合缓冲溶液洗去非特异性吸附的蛋白，分别用8倍柱体积的150、300和500mmol/L咪唑的缓冲液洗脱蛋白，收集样品并用SDS-PAGE分析鉴定。

实施例1重组大肠杆菌BL21/pET24a-panD的构建

根据GenBank所提供的谷氨酸棒杆菌来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因序列(EC4.1.1.11)设计引物，分别在上游引入NdeⅠ酶切位点和保护碱基，下游引入HindⅢ酶切位点和保护碱基，并在C端引入His标签。

提取谷氨酸棒杆菌基因组，将pCR扩增到的panD基因产物用NdeⅠ和HindⅢ双酶切后连接到用同样限制性内切酶酶切的质粒载体pET 24a(+)上，获得重组质粒pET 24a-panD。将重组质粒转化大肠杆菌BL21，筛选获得重组大肠杆菌BL21/pET24a-panD。

实施例2重组大肠杆菌BL21/pET28a-aspA的构建

根据GenBank所提供的大肠肝菌来源的天冬氨酸酶的基因序列(EC4.3.1.1)设计引物，分别在上游引入BamHⅠ酶切位点和保护碱基，下游引入HindⅢ酶切位点和保护碱基，并在C端引入His标签。

提取谷氨酸棒杆菌基因组，将pCR扩增到的panD基因产物用NdeⅠ和HindⅢ双酶切后连接到用同样限制性内切酶酶切的质粒载体pET 28a(+)上，获得重组质粒pET 28a-aspA。将重组质粒转化大肠杆菌BL21，筛选获得重组大肠杆菌BL21/pET28a-aspA。

实施例3天冬氨酸酶的表达

将重组大肠杆菌BL21/pET28a-aspA接种于4mL卡那霉素浓度为100μg/mL的TB培养基，37℃、200r/min振荡过夜培养。将上述过夜培养物按1％的接种量接种于含卡那霉素浓度为100μg/mL的TB培养基，37℃、200r/min振荡培养至菌液OD₆₀₀为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度0.2mmol/L，24℃诱导培养16-20h，收集菌体超声破碎，通过SDS-PAGE分析鉴定天冬氨酸酶重组蛋白表达水平。通过PAGE胶显示，该重组酶在大肠杆菌体内的表达量约为40％，同时通过高效液相色谱测得粗酶液中酶的比酶活为69mmol/g·min。

实施例4 L-天冬氨酸α-脱羧酶酶的表达

将重组大肠杆菌BL21/pET24a-panD接种于4mL卡那霉素浓度为100μg/mL的TB培养基，37℃、200r/min振荡过夜培养。将上述过夜培养物按1％的接种量接种于含卡那霉素浓度为100μg/mL的TB培养基，37℃、200r/min振荡培养至菌液OD₆₀₀至0.6-0.8，加入IPTG至终浓度0.8mmol/L，37℃诱导培养16-20h，收集菌体超声破碎，通过Tris-tricine SDS-PAGE方法分析鉴定L-天冬氨酸α-脱羧酶重组蛋白表达水平。通过PAGE胶显示，该重组酶在大肠杆菌体内的表达量约为30％，同时通过高效液相色谱测得粗酶液中酶比酶活为13.9mmol/g·h。

实施例5

将两种重组大肠杆菌分别接种于种子培养基中，37℃，200rpm活化6-8h后，以1％的接种量分别转接至1L TB表达陪养基中，待OD₆₀₀至0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG，摇床培养16-18h得到发酵液，4000-6000rpm的转速离心收菌。向收得的菌体中加入100mL缓冲液，超声破碎，离心，用亲和层析柱His Trap HF纯化蛋白，天冬氨酸酶、L-天冬氨酸α-脱羧酶的纯酶比酶活分别为168mmol/g·min和156mmol/g·h。

在含有底物浓度为50mmol/L富马酸和足量氨(调pH至7.0)的10mL反应液中，加入天冬氨酸酶：L-天冬氨酸α-脱羧酶的质量浓度比例为1：80，其中天冬氨酸酶的质量为10μg/mL，反应体系中含有1mmol/L的MgCl₂，50mmol/L NaH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液(pH 7.0)，37℃、200r/min下进行酶促反应(振荡反应)，每隔1-2h取样，终止反应时取适量反应液于100℃煮沸10min，12000r/min离心10min，取上清，用0.22μm微孔有机滤膜过滤，利用HPLC检测反应液中各成分的含量，计算得到β-丙氨酸的浓度为49.5mmol/L，β丙氨酸产率为99％。

在上述双酶偶联催化体系中，固定富马酸浓度为50mmol/L，天冬氨酸酶的添加浓度为10μg/mL，调整L-天冬氨酸α-脱羧酶的添加量，使天冬氨酸酶与L-天冬氨酸α-脱羧酶的加酶质量比分别为1:40、1:60，进行双酶偶联反应。

结果如图1所示，在1:40和1:60(W/W)的反应体系中，反应8h，β-丙氨酸的产率只有82％和93％，且尚有部分中间产物未完全转化，反应至12h，1:40的反应体系中仍有中间产物。而在1:80的反应体系中，反应8h，富马酸可完全转化为β-丙氨酸，β-丙氨酸的产率>95％，中间产物L-天冬氨酸无残余。随着L-天冬氨酸α-脱羧酶浓度的提高，β-丙氨酸的合成速度大大增加，且中间产物L-天冬氨酸的残余量减少。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。