本发明涉及生物化工领域，具体地说，涉及利用顺酐制备L-天冬氨酸和L-丙氨酸的方法。
背景技术：
L-丙氨酸为白色结晶或结晶性粉末，无异臭，带有甜味。化学性能稳定，易溶于水(16.5％，25℃)，不溶于乙醚或丙酮。分解温度为297℃，等电点5.79，pKa-COOH＝2.34，pKa-NH3＝9.60，[α]25D+14.6(C＝0.5～2.0g/ml，5mol/L HCl)。5％L-丙氨酸水溶液的pH值为5.5-7.0。化学结构式为：
L-丙氨酸的分子式为C3H7O2N，分子量89.09，包括α-丙氨酸和β-丙氨酸两种同分异构体。
L-丙氨酸是人体非必需氨基酸，在生物体内甘氨酸的氨基转移至丙酮酸而成。在葡萄糖-丙氨酸循环中，保持低血氨水平。丙氨酸是血液中氮的优良运输工具。另外，L-丙氨酸是一种有效生糖氨基酸。丙氨酸是构成蛋白质的基本单位，是组成人体蛋白质的20种氨基酸之一。目前，它主要用于生化研究、组织培养、肝功能测定，作为增味剂，可增加调味品的调味效果，还可用作酸味矫正剂，改善有机酸的酸味。
L-丙氨酸自1993年开始在国内小批量生产，1993-2013年采用的技术主要是酶催化技术，以L-天门冬氨酸为原料，利用L-天门冬氨酸-β-脱羧酶进行催化，脱去L-天门冬氨酸β位上的羧基生成L-丙氨酸。期间，由安徽省应用技术研究所从日本引进该技术，并进行技术改进。
从2013年开始，采用发酵法生产L-丙氨酸，主要原料为葡萄糖，旨在替代价格较高的L-天门冬氨酸原料，降低L-丙氨酸的生产成本。
目前，国内L-丙氨酸实际生产的企业有三家，安徽华恒生物科技股份有限公司(产能20000t/a)、烟台恒源生物工程股份有限公司(产能2600t/a)和淮北新旗氨基酸有限公司(产能4000t/a)。德国BASF公司年需求量在4000吨以上，主要用于合成日化产品，该公司2014年1-5月份总计进口L-丙氨酸超过2000吨。美国年需求量约为2000吨，主要作为食品添加剂。其它国家和地区年需求量约为2000吨，主要用于医药原料和食品添加剂。国外正在开发环保新材料聚合乳酸，该产品需要L-丙氨酸作为助剂，一旦市场推广应用，将会极大拓展L-丙氨酸的应用市场空间。
L-天冬氨酸又称L-天门冬氨酸，是一种酸性氨基酸，其化学名为L(+)-氨基丁二酸，分子式为C4H7NO4，分子量133.1，化学结构式为：
L-天冬氨酸生产应用十分广泛，因其具有酸味，可作为酸味调节剂，其具有两个羧基，容易生产稳定的天冬氨酸盐，适用于各种食品的营养强化和风味调节，如天冬氨酸钠是一种鲜味剂，也可以与呈味核苷酸等联用，具有解除人体疲劳的作用。L-天冬氨酸作为主要原料可以合成甜味剂阿斯巴甜，阿斯巴甜作为代替蔗糖的首选甜味剂，欧美国家需求强劲。天冬氨酸能调节脑和神经的代谢功能，其左旋体L-天冬氨酸广泛用做氨解毒剂，肝机能促进剂，疲劳恢复剂等医药用品和各种清凉饮料的添加剂；其外消旋体DL-天冬氨酸(DL-Asp)可用于合成DL-天冬氨酸钾镁盐(脉安定)，可用于治疗心律失常、心动过速、心力衰竭、心肌梗塞、心绞痛、肝炎和肝硬化等疾病。DL-天冬氨酸还可作为合成多肽的原料，其氨基酸的取代衍生物(NMDLA)可以作为治疗神经类疾病和大脑疾病的药物，如天冬氨酸的衍生物N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)能明显增强视神经单元放电单元的兴奋作用，可作为哺乳动物中枢神经系统中重要的兴奋神经递质受体之一。
L-天冬氨酸的工业生产始于上世纪七十年代的日本，早期采用传统的微生物发酵法，即以糖类物质为基础原料，通过细胞的新陈代谢来积累，再经过适当的提取精制工艺而制成。由于该工艺生产周期长，副产物多且技术风险大，导致生产成本高。随着生物酶技术的发展，特别是固定化酶技术研究的不断深入，到了八十年代，由于采用酶法生产所需的主要原料富马酸能得以大量廉价生产，据此开发出以固定化酶法进行生产的技术，并且逐步取代了传统的发酵工艺，成为当时主要的生产方法。该工艺设备投入多，技术要求高，使产品的生产成本相对较高。近年来随着市场竞争的日趋激烈，如何有效降低生产成本，提高产品质量成为关键；而固定化酶法由于自身工艺上的限制，决定了其无法进一步降低成本。
由于L－天冬氨酸主要用于食品添加剂、合成阿斯巴甜、丙氨酸、聚天冬氨酸方面，而这些产品的市场需求逐年加大，尤其是阿斯巴甜，目前全球有一百多个国家在使用，产量已增至1.8万t/a。随着肥胖和糖尿病的高发，对低热量食品的需求不断加大，阿斯巴甜作为代替蔗糖的首选甜味剂，欧美国家需求强劲。L-天冬氨酸在我国的生产历史不长，规模化生产始于上世纪九十年代中后期，经过十多年的发展，已形成一定的产业规模，合计年生产能力约在8～10万吨左右，但生产规模在5000吨以上的仅有为数不多的几个厂家。近几年由于L-天冬氨酸的应用领域不断扩大，需求大幅度增长，尤其在合成阿斯巴甜和聚天冬氨酸方面，国际国内需求量的增加导致产量也在逐年增加，有较大的潜在市场需求。
技术实现要素：
本发明的目的是提供利用顺酐制备L-天冬氨酸和L-丙氨酸的方法。
目前生产L-天冬氨酸的工艺多以富马酸为原料经过酶转化获得L-天冬氨酸，其中富马酸由马来酸经过异构化获得，但异构化过程副产物苹果酸的含量较高，需进行多步分离纯化得到富马酸，利用此种工艺生产L-天冬氨酸较为繁琐。本发明旨在提供一种从顺酐一步酶转化法获得L-天冬氨酸，中间不经过富马酸过程，工艺简便，转化率高，产品质量好，同时采用膜分离技术对L-天冬氨酸结晶母液进行净化，去除杂质和无机盐，母液可重复循环套用，废水排放量低，L-天冬氨酸收率高。
为了实现本发明目的，本发明的利用顺酐制备L-天冬氨酸和L-丙氨酸的方法，包括以下步骤：
S1、以顺酐为原料，加热进行水合反应得到马来酸溶液；
S2、向马来酸溶液中加入马来酸异构酶和L-天冬氨酸酶，在一定pH值下进行酶转化反应，所得酶转化液依次经过微孔过滤、纳滤膜过滤；
S3、滤液经浓缩脱氨后，以马来酸溶液作为酸化剂调pH值至L-天冬氨酸等电点2.8，采用连续等电结晶的方式结晶析出L-天冬氨酸，晶浆液经离心、洗涤、干燥后制得L-天冬氨酸晶体。
S4、为了进一步制备L-丙氨酸，向细菌发酵产生的pH8.8-9.0的L-天冬氨酸脱羧酶发酵液中加入上述制得的L-天冬氨酸晶体，采用少量多次连续性投料方式，于48-50℃反应60-72h，控制反应体系pH值不低于6.5；反应结束后，离心收集沉淀(湿晶体)，用水洗涤，烘干即得L-丙氨酸成品，产品质量标准达到国家标准。
S1具体为：称取一定量顺酐加水于20-80℃(优选60℃)溶解，得到15-80％(优选60％)的马来酸溶液。
S2具体步骤如下：
S21、将马来酸溶液加入酶反应釜中，调节反应釜温度为30-50℃，用氨水调pH值至7.0-9.0，作为反应底物。
S22、按反应底物体积的2％-30％分别加入马来酸异构酶酶液和L-天冬氨酸酶酶液，于30-50℃反应8-18h，然后加热至80-105℃保持30-60min(优选80℃保持30min)，对酶进行灭活，得到酶转化液。其中，所述马来酸异构酶酶液和L-天冬氨酸酶酶液的酶活力分别为120-150U/mL。
S23、酶转化液依次经过陶瓷膜微孔过滤及纳滤膜过滤。
其中，S23中使用0.05-0.2μm孔径的陶瓷膜过滤，进膜压力0.2-0.3MPa，出膜压力0.15-0.2Mpa，运行温度50-70℃，收集微滤液，然后采用截留分子量0.5-3KD的纳滤膜过滤，以去除大分子蛋白、色素及无机盐等杂质，膜运行压力15-20MPa，运行温度40-45℃，收集滤液。
S3具体步骤如下：
S31、滤液用旋转蒸发器在60-70℃下进行真空浓缩脱氨，真空度为-0.08～-0.09Mpa，浓缩至固含量25-30％(优选25％)；
S32、所得浓缩液分成两份，将其中一份浓缩液加入结晶釜中，于50-70℃(优选60℃)条件下，流加浓度15-80％的马来酸溶液至pH2.8；然后流加另一份浓缩液，同时流加浓度15-80％的马来酸溶液，使结晶釜中体系pH值始终维持在2.8，直至浓缩液流加完毕；
S33、待体系温度降至15-35℃，所得晶浆液用离心机进行离心，沉淀加水洗涤，收集湿晶体，干燥后即得L-天冬氨酸晶体。
其中，S33中水的用量为晶浆液体积的7％-10％。
S33中所得湿晶体用流化床于50-60℃烘干。制得的L-天冬氨酸晶体为白色针状，产品质量达到国家标准。
前述的方法，S4中向细菌(例如芽孢杆菌)发酵产生的pH8.8-9.0的L-天冬氨酸脱羧酶发酵液中加入上述制得的L-天冬氨酸晶体，料液比为(1±0.5)g：100mL。优选地，按照20g-30g/次/5min的投料速度投入L-天冬氨酸脱羧酶液中。
前述方法还包括对S3中晶浆液离心后所得母液以及水洗后所得洗液进行合并、浓缩，重新作为反应底物进行循环利用的步骤。具体方法如下：将所得母液与洗液合并，然后用旋转蒸发器在60-70℃下进行真空浓缩，真空度为-0.08～-0.09Mpa，浓缩至马来酸含量15-80％，再用氨水调pH值至7.0-9.0，作为反应底物循环套用。
本发明所用马来酸异构酶、L-天冬氨酸酶购自安徽丰原发酵技术工程研究有限公司。L-天冬氨酸脱羧酶由淮北新旗氨基酸股份有限公司生产。
本发明采用双酶法一步反应制备L-天冬氨酸，工艺简便，转化率达98％以上，可有效控制副产物苹果酸的产生，产品质量好；采用膜分离技术对L-天冬氨酸酶转化液进行净化，除杂，同时利用马来酸作为酸化剂等点结晶制备L-天冬氨酸，结晶母液可用作酶反应底物反复套用，实现了顺酐制备L-天冬氨酸的循环生产，大大降低废水排放量，符合绿色环保理念。此外，利用L-天冬氨酸脱羧酶，进一步将L-天冬氨酸转化为L-丙氨酸，使整套工艺获得的产品多元化，更具有市场竞争力。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
实施例1-3中涉及到马来酸异构酶酶液和L-天冬氨酸酶酶液，其酶活力分别为120-150U/mL。
实施例1 L-天冬氨酸的制备
1)将顺酐加纯水于60℃水浴搅拌溶解，配制成浓度为60％的马来酸溶液备用。
2)将步骤1)所得马来酸溶液加入50L酶反应釜，调节反应温度40℃，用30％氨水调节pH值，控制在7.0-9.0，作为反应底物。按反应底物的体积计算，分别加入8％马来酸异构酶酶液和10％L-天冬氨酸酶酶液进行反应，于40℃反应12h，反应终点转化液加热至80℃并保持30min。
3)将步骤2)所得酶反应液使用0.05-0.2μm孔径的陶瓷膜过滤，进膜压力0.3MPa，出膜压力0.15Mpa，运行温度60℃，收集过滤清液。
4)将步骤3)所得微滤液使用截留分子量0.5-3.0KD的纳滤膜过滤，去除大分子蛋白、色素及无机盐，收集滤液，膜运行压力18MPa,温度42℃。
5)将步骤4)所得纳滤液使用旋转蒸发器进行真空浓缩脱氨，真空度为-0.08～-0.09Mpa，温度65℃，浓缩至固含量25％。
6)将步骤5)所得浓缩液1L加入体积为5L的1号结晶釜，搅拌加热维持结晶釜温度为60℃，流加60％的马来酸溶液至pH2.8时停止流加，60℃保温2h后一边流加浓缩液，一边流加60％的马来酸溶液，控制1号结晶釜中pH始终维持在2.8，直至1号结晶釜满后，打开溢流阀使1号结晶釜中的晶浆液溢流至体积为50L的2号结晶釜，打开2号结晶釜降温水阀门控制2号结晶釜温度在18℃。
7)将步骤6)所得全部晶浆液用离心机进行离心，沉淀加水洗涤，洗水加量为晶浆液体积的7％-10％，收集湿晶体、离心所得母液和洗水。
8)将晶体用流化床于55℃烘干后得到含量为98.7％的L-天冬氨酸成品。
实施例2 L-天冬氨酸的制备
1)将顺酐加纯水于60℃水浴搅拌溶解，配制成浓度为15％的马来酸溶液备用。
2)将步骤1)所得马来酸溶液加入50L酶反应釜，调节反应温度40℃，用30％氨水调节pH值，控制在7.0-9.0，作为反应底物，按反应底物的体积计算，按反应底物的体积计算，分别加入10％马来酸异构酶酶液和15％L-天冬氨酸酶酶液进行反应，于40℃反应10h，反应终点转化液加热至105℃并保持30min灭活。
3)将步骤2)所得酶反应液使用0.05-0.2μm孔径的陶瓷膜过滤，进膜压力0.2MPa，出膜压力0.15Mpa，运行温度50℃，收集过滤清液。
4)将步骤3)所得微滤液使用截留分子量0.5-3.0KD的纳滤膜过滤，去除大分子蛋白、色素及无机盐，收集滤液，膜运行压力15MPa，温度40℃。
5)将步骤4)所得纳滤液使用旋转蒸发器进行真空浓缩脱氨，真空度为-0.08～-0.09Mpa，温度60℃，浓缩至固含量25％。
6)将步骤5)所得浓缩液1L加入体积为5L的1号结晶釜，搅拌加热维持结晶釜温度于60℃，流加60％的马来酸溶液至pH3.0时停止流加，60℃保温2h后一边流加浓缩液，一边流加40％的马来酸溶液，控制1号结晶釜中pH始终维持在3.0，直至1号结晶釜满后，打开溢流阀使1号结晶釜中的晶浆液溢流至体积为50L的2号结晶釜，打开2号结晶釜降温水阀门控制2号结晶釜温度在15℃。
7)将步骤6)所得全部晶浆液用离心机进行离心，沉淀加水洗涤，洗水加量为晶浆液体积的7％-10％，收集湿晶体、离心所得母液和洗水。
8)将晶体用流化床于50-60℃烘干后得到含量为98.8％的L-天冬氨酸成品。
实施例3 L-天冬氨酸的制备
1)将顺酐加纯水于60℃水浴搅拌溶解，配制成浓度为60％的马来酸溶液备用。
2))将步骤1)所得马来酸溶液加入50L酶反应釜，调节反应温度40℃，用30％氨水调节pH值，控制在7.0-9.0，作为反应底物，按反应底物的体积计算，按反应底物的体积计算，分别加入8％马来酸异构酶酶液和10％L-天冬氨酸酶酶液进行反应，于40℃反应16h，反应终点转化液加热至90℃并保持60min灭活。
3)将步骤2)所得酶反应液使用0.05-0.2μm孔径的陶瓷膜过滤，进膜压力0.3MPa，出膜压力0.2Mpa，运行温度70℃，收集过滤清液。
4)将步骤3)所得微滤液使用截留分子量0.5-3.0KD的纳滤膜过滤，去除大分子蛋白、色素及无机盐，收集滤液，膜运行压力20MPa，温度45℃。
5)将步骤4)所得纳滤液使用旋转蒸发器进行真空浓缩脱氨，真空度为-0.08～-0.09Mpa，温度70℃，浓缩至固含量25％。
6)将步骤5)所得浓缩液1L加入体积为5L的1号结晶釜，搅拌加热维持结晶釜温度于60℃，流加60％的马来酸溶液至pH2.8时停止流加，60℃保温2h后一边流加浓缩液，一边流加50％的马来酸溶液，控制1号结晶釜中pH始终维持在2.8，直至1号结晶釜满后，打开溢流阀使1号结晶釜中的晶浆液溢流至体积为50L的2号结晶釜，打开2号结晶釜降温水阀门控制2号结晶釜温度在15℃。
7)将步骤6)所得全部晶浆液用离心机进行离心，沉淀加水洗涤，洗水加量为晶浆液体积的7％-10％，收集湿晶体、离心所得母液和洗水。
8)将晶体用流化床于50-60℃烘干后得到含量为99.0％的L-天冬氨酸成品。
实施例4 L-丙氨酸的制备
1、按实施例1步骤1)～7)进行操作，将离心所得母液与洗水合并，然后用旋转蒸发器在60-70℃下进行真空浓缩，真空度为-0.08～-0.09Mpa，浓缩至马来酸含量为60％，再用氨水调pH值至7.0-9.0，作为反应底物循环套用。再按反应底物体积的12％加入发酵获得的马来酸异构酶和L-天冬氨酸酶酶发酵液(发酵液酶活力分别为120-150U/mL)反应，反应时间10h，反应终点转化液加热至80℃并保持30min。
2、将步骤1所得酶反应液使用0.05-0.2μm孔径的陶瓷膜过滤，进膜压力0.3MPa，出膜压力0.15Mpa，运行温度60℃，收集过滤清液。
3、将步骤2所得微滤液使用截留分子量0.5-3.0KD的纳滤膜过滤，去除大分子蛋白、色素及无机盐，收集滤液，膜运行压力18MPa,温度42℃。
4、将步骤3所得纳滤液使用旋转蒸发器进行真空浓缩脱氨，真空度为-0.08～-0.09Mpa，温度65℃，浓缩至固含量25％。
5、将步骤5)所得浓缩液1L加入体积为5L的1号结晶釜，搅拌加热维持结晶釜温度于60℃，流加60％的马来酸溶液至pH2.8时停止流加，60℃保温2h后一边流加浓缩液，一边流加50％的马来酸溶液，控制1号结晶釜中pH始终维持在2.8，直至1号结晶釜满后，打开溢流阀使1号结晶釜中的晶浆液溢流至体积为50L的2号结晶釜，打开2号结晶釜降温水阀门控制2号结晶釜温度在15℃。
6、将步骤5所得全部晶浆液用离心机进行离心，沉淀加水洗涤，洗水加量为晶浆液体积的7％-10％，收集湿晶体、离心所得母液和洗水。
7、将晶体用流化床于55℃烘干后得到含量为98.8％的L-天冬氨酸成品。
8、取芽孢杆菌发酵生产的L-天冬氨酸脱羧酶发酵液5L(pH值8.98)，酶发酵液采用水浴升温至48℃，将步骤7获得的L-天冬氨酸成品按照20g-30g/次/5min的投料速度投入L-天冬氨酸脱羧酶发酵液中，共加入L-天冬氨酸4000克，控制酶反应温度48℃，反应pH值不低于6.5，酶转化周期65h。反应结束后，通过离心机分离酶反应液，湿晶体用纯水洗涤，烘干后包装得L-丙氨酸成品。反应转化率>99.5％，L-丙氨酸收率>95％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。