本发明涉及一种悬浮细胞培养法制备生物药物的方法，具体地说是一种利用黄花倒水莲愈伤组织或悬浮细胞生产黄酮类化合物的方法，属于植物生物技术领域。
背景技术：
黄花倒水莲（Polygala fallax Dunn）为远志科远志属灌木或小乔木，别名鸡仔树、黄花参、观音串、吊吊黄、黄花吊水莲、黄花大远志。中国独特的物种，生于山坡疏林之下或者沟谷丛林之中。分布广泛，大多散布在广西、广东、湖南、江西省等地区。黄花倒水莲属珍贵中药材，有补益气血，健脾利湿，祛湿化瘀，活血调经之功能，主要用于病后体虚，腰膝酸痛，跌打挫伤，黄疸型肝炎，肾炎水肿的治疗。黄花倒水莲提取物具有活血、抗炎、抗血脂的作用。黄花倒水莲主要在根的药用价值，其根含有机酸、糖脂、皂苷、黄酮等物质，具有抗发炎，促进血液循环，调节血脂，对乙型肝炎病毒的体外抑制的作用。
黄酮类化合物是自然界中宽泛存在且重要的一类化合物，该化合物在植物中是一种重要的次生代谢产物，黄酮类化合物不仅能使植物有更好的颜色和味道，而且对人体健康有多种保健和医学功能。它们在体内具有明显的清除自由基的作用，能够抑制细胞的凋亡，可以抗氧化，抗炎，抗病毒，预防骨质疏松，发挥植物雌激素活性，抗癌，抑制酒精成瘾，保护心血管系统和肝脏等作用，经常是治疗心血管疾病方面药物的重要成分。黄酮类化合物提取的办法很多，传统的提取手段有水提法、有机溶剂提取法、系统溶液提取法、碱性水或者碱性稀醇提取法等，可以根据提取物质的性质、工艺设备、提取成本等条件来抉择最佳的提取工艺，来提高黄酮类物质的提取率，增大原料的使用效果。但是，研究报道中也明确表示了许多问题仍待解决，比如，许多化学成分提取率低等问题。对于黄花倒水莲植株总黄酮提取工艺研究，国内外均有许多研究，但是，利用黄花倒水莲的愈伤组织或悬浮细胞为材料进行黄酮提取的工艺却未见报道。为了寻找更多更好的黄酮类化合物，研究其药理作用，提出本发明。
技术实现要素：
针对现有技术的上述技术问题，本发明的目的是提供一种黄花倒水莲细胞培养法制备黄酮类化合物的方法，制得的化合物为可以供药用的黄酮类化合物，所以要解决的技术问题是利用植物组织培养方法诱导稳定、高产的能生产黄酮类化合物的细胞株系，同时优化黄花倒水莲植物细胞黄酮化合物提取工艺，对提取温度、超声波时间、液料比以及酒精浓度这些影响因子进行了优化，从而提高总黄酮的得率。
为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种黄花倒水莲细胞培养法制备黄酮类化合物的方法，包括以下步骤：
（1）将愈伤组织转移到液体培养基中进行振荡培养；
（2）添加不同种类和不同浓度的诱导因子，筛选出高产黄酮的细胞；（3）将高产悬浮细胞进行增殖培养；
（4）愈伤组织或悬浮细胞的干燥和粉碎；
（5）黄酮测量对照品制备，进行光谱扫描，确定测量波长；
（6）愈伤组织或悬浮细胞中总黄酮的提取条件优化，液料比、乙醇浓度、水浴温度、超声波最优时间的确定；
（7）黄花倒水莲愈伤组织和悬浮细胞总黄酮含量测定。
所述步骤（2）中高产黄酮细胞的筛选包括以下步骤：将步骤（1）中获得的愈伤组织接种于液体培养基中，所述的培养基为：MS+0.5mg·L-1 2,4-二氯苯氧乙酸+0.1mg·L-1苄氨基嘌呤+蔗糖30g·L-1，pH为5.8-6.0，黑暗条件下振荡培养，培养条件为温度25±1℃，摇床的转速110-130转/分钟，3周继代一次，继代3-5次，得到液体悬浮培养细胞。
在液体培养基中加入适量的诱导因子，所述的诱导因子为50-100mg·L-1柠檬酸+20-60mg·L-1苯丙氨酸+ 100-200mg·L-1乙酸钠。
所述步骤（4）包括以下步骤：将收获的黄花倒水莲愈伤组织或悬浮细胞置于50-60℃的恒温烘箱中干燥至恒重后，用粉碎机打碎，过80-100目筛，收集粉末备用。
所述步骤（6）包括以下步骤：称取黄花倒水莲愈伤组织和悬浮细胞粉末，分别放入圆底烧瓶中，加入乙醇，设置不同液料比，在50-90℃的恒温水浴中回流1-3 h后,用离心机离心后过滤，将滤液收集起来，在滤渣中加入10-25mL乙醇，振荡20-50min，然后用离心机离心后过滤，将滤液收集起来，滤渣再重复上述步骤1-2次，最后合并所有滤液，用漩涡蒸发仪浓缩并烘干，并进行超声波提取，将提取液进行蒸发，蒸发所得沉淀用乙醇溶解后，用乙醇定容。
所述的黄花倒水莲愈伤组织和悬浮细胞其总黄酮含量为25.0-33.3 mg·g-1。
本发明的有益效果如下：
本发明黄花倒水莲细胞培养法制备黄酮类化合物的方法，通过系统的试验对黄花倒水莲愈伤组织及植物细胞总黄酮的提取工艺进行了研究，为了解黄花倒水莲黄酮类化合物的含量，更全面的评价和合理开发药用植物提供了参考。传统提取工艺时，生产过程中存在着工序繁多、周期较长、有效成分损失大、得率不高等缺点。本发明用植物细胞或愈伤组织的大量培养生产黄花倒水莲次生代谢产物，可以工业化的生产黄花倒水莲黄酮类化合物，同时优化了传统工艺方式，能更加有效率地提取愈伤和植物细胞内的黄酮。因此，提供一种通过黄花倒水莲愈伤组织或悬浮细胞的方法对于黄酮类备制新途径的开发有着重要的意义。
本发明利用组织及细胞培养生产含有较高黄酮类化合物的黄花倒水莲愈伤组织和悬浮细胞，同时优化了利用愈伤组织和悬浮细胞提取黄酮的工艺，不仅可以节约土地、人力资源，保护生态环境，而且不受季节等外界因素的限制，可以源源不断的提供黄酮类化合物的药源。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1
所获得的黄花倒水莲愈伤组织接种于30mL液体培养基的100mL的三角瓶中，培养基为：MS+0.5mg·L-1 2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）+0.1 mg·L-1BAP（苄氨基嘌呤）+蔗糖30g·L-1，pH为5.8-6.0，黑暗条件下振荡培养，培养条件为温度25±1℃，摇床的转速110-130转/分钟，3周继代一次，继代3-5次，得到液体悬浮培养细胞。液体培养基中加入50-100 mg·L-1柠檬酸作为诱导因子，所培养的黄花倒水莲悬浮细胞中总黄酮的含量为12.0-15.6mg·g-1。
实施例2
所获得的黄花倒水莲愈伤组织接种于30mL液体培养基的100mL的三角瓶中，培养基为：MS+0.5mg·L-1 2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）+0.1 mg·L-1BAP（苄氨基嘌呤）+蔗糖30g·L-1，pH为5.8-6.0，黑暗条件下振荡培养，培养条件为温度25±1℃，摇床的转速110-130转/分钟，3周继代一次，继代3-5次，得到液体悬浮培养细胞。液体培养基中加入20-60mg·L-1苯丙氨酸+100-200mg·L-1乙酸钠为诱导因子，所培养的黄花倒水莲悬浮细胞中总黄酮的含量为18.3-20.2mg·g-1。
实施例3
所获得的黄花倒水莲愈伤组织接种于30mL液体培养基的100mL的三角瓶中，培养基为：MS+0.5 mg·L-1 2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）+ 0.1 mg·L-1BAP（苄氨基嘌呤）+蔗糖30g·L-1，pH为5.8-6.0，黑暗条件下振荡培养，培养条件为温度25±1℃，摇床的转速110-130转/分钟，3周继代一次，继代3-5次，得到液体悬浮培养细胞。液体培养基中加入50-100mg·L-1柠檬酸+20-60 mg·L-1苯丙氨酸+100-200mg·L-1乙酸钠为诱导因子，所培养的黄花倒水莲悬浮细胞中总黄酮的含量为25.1-30.5mg·g-1。
实施例4
电子天平精细称取已真空干燥至恒重的芦丁标准品20mg，用100%乙醇溶解，制成0.4mg/ml的对照品溶液。分别取制备好的对照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，置于25ml容量瓶中，加50%乙醇至10ml，加5%亚硝酸钠1ml，混匀，静置6min；加10%硝酸铝溶液1ml，混匀，静置6min；加4%氢氧化钠溶液10%，用50%乙醇调至刻度，混匀，得空白液、对照品溶液。静置15min后在200-800nm进行光谱扫描。确定选用510nm作为测定波长。以吸光度为横坐标，黄酮浓度为纵坐标绘制回归曲线，回归方程为y=0.1242x+0.0003（R²=0.9939），线性关系良好。
称取黄花倒水莲愈伤组织和悬浮细胞粉末各0.5g，分别放入圆底烧瓶中，加入10mL乙醇，液料比为20:1，在90℃的恒温水浴中回流3h后,用3000r/min离心机离心5min后过滤，将滤液收集起来，在滤渣中加入10-25mL乙醇，振荡20-50min，然后用3000r/min离心机离心5min后过滤，将滤液收集起来，滤渣再重复上述步骤1-2次，最后合并所有滤液，用漩涡蒸发仪浓缩并烘干，并进行超声波提取，超声波频率为高频（61KHz），超声波功率为180W，每个样品提取两次，每次20min。将提取液进行蒸发，蒸发所得沉淀用乙醇溶解后，用乙醇定容于25mL的容量瓶中待测。以芦丁为对照品，用100%乙醇配制成0.4 mg·mL-1的溶液作为对照品溶液，510nm作为测定波长，经紫外-可见分光光度计法测定结果，本发明方法所制备得到的黄花倒水莲愈伤组织和悬浮细胞其总黄酮含量范围为22.6-25.5 mg·g-1。
实施例5
称取黄花倒水莲愈伤组织和悬浮细胞粉末各0.5g，分别放入圆底烧瓶中，加入20-25mL乙醇，液料比为40:1或50:1，在50-90℃的恒温水浴中回流1-2h后,用3000r/min离心机离心5min后过滤，将滤液收集起来，在滤渣中加入10-25mL乙醇，振荡20-50min，然后用3000r/min离心机离心5min后过滤，将滤液收集起来，滤渣再重复上述步骤1-2次，最后合并所有滤液，用漩涡蒸发仪浓缩并烘干，并进行超声波提取，超声波频率为高频（61KHz），超声波功率为180W，每个样品提取两次，每次30-40 min。将提取液进行蒸发，蒸发所得沉淀用乙醇溶解后，用乙醇定容于25 mL的容量瓶中待测。以芦丁为对照品，用100%乙醇配制成0.4mg·mL-1的溶液作为对照品溶液，510nm作为测定波长，经紫外-可见分光光度计法测定结果，本发明方法所制备得到的黄花倒水莲愈伤组织和悬浮细胞其总黄酮含量范围为25.0-33.3mg·g-1。
本发明中的MS（Murashige and Skoog）为国际通用的培养基，其成分和配制方法参看下述文献：李浚明，朱登云.植物细胞培养技术（第3版）[M]. 北京：中国农业大学出版社，2006。培养基及所用无菌器具均使用高温灭菌锅灭菌，在0.105MP和121℃下灭菌20min。
本发明的方法可以生产出黄花倒水莲的黄酮类次生代谢产物，生产成本低，不受季节和环境限制，周期短。
上述实施例仅用于解释说明本发明的发明构思，而非对本发明权利保护的限定，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应落入本发明的保护范围。