本发明涉及L-色氨酸生产领域，尤其是一种清液发酵培养基及提高L-色氨酸产量的方法。
背景技术：
L-色氨酸是人体和动物生命活动中必需的氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，由于其不可替代的生理作用，而被誉为第二必需氨基酸。近年来，由于L-色氨酸商业价值得到越来越多的认可，已广泛应用于医药、食品和饲料等方面,逐渐成为国际市场上发展前景良好、中国市场需求较大的产品。尤其是从二十世纪初开始，这种需求呈现年稳定增长的态势，统计显示：2003年全球L-色氨酸需求量为1180吨，2011年为5600吨，年均复合增长率为21.5％。2003年国内L-色氨酸的总使用量大约为300吨，2011年国内需求总量约为1200吨，年均复合增长率在18.9％。2014年全球L-色氨酸需求量为20000吨，年均复合增长率为53.85％；2015年国内L-色氨酸的总使用量大约为6000吨，同比增长9.1％。L-色氨酸虽已实现工业化生产，但目前产量仍不能满足需要。因此，进一步优化L-色氨酸的生产工艺具有重要意义。与国外先进水平相比，我国L-色氨酸生产存在发酵产酸低、转化率低且副产物多等问题。
目前，L-色氨酸的生产方法主要有：蛋白质水解法、化学合成法、发酵法及酶法。早期主要依靠蛋白质水解法和化学合成法生产L-色氨酸，蛋白质水解法对生产设备要求简单，成本低，但存在污染严重、产品得率低、杂质较多等缺点。化学合成法受到原料来源的限制，并且合成步骤复杂，除需考虑合成工艺条件外，还要考虑异构体的拆分与D-色氨酸异构体的消旋作用，不利于工业化生产。随着科学技术的不断进步，微生物法生产L-色氨酸已经走向实用并且处于主导地位。微生物法大体上可以分为酶法、微生物转化法和直接发酵法。酶法利用微生物中色氨酸生物合成酶系的催化功能生产色氨酸，包括色氨酸酶、色氨酸合成酶、丝氨酸消旋酶等；该法既可以直接加入细胞壁溶解酶使细胞破壁后再使用，也可以将所需的酶固定化后再使用，一般由菌体的培养、菌体的分离洗涤、固定化和反应几个阶段组成；微生物转化法使用葡萄糖作为碳源，同时添加合成色氨酸所需的前体物如邻氨基苯甲酸、吲哚等，利用微生物的色氨酸合成酶系来合成色氨酸；直接发酵法以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉价原料为碳源，利用优良的色氨酸生产菌种来生产色氨酸。随着重组DNA技术在微生物育种中的应用，为优良的色氨酸生产菌株的筛选和产酸水平的提高提供了可靠的技术保障，使微生物直接发酵法生产L-色氨酸成为一种主流的工业化生产方法。
目前，L-色氨酸发酵产酸及转化率仍处于较低水平。原因之一是在发酵前期底物葡萄糖同时用于合成L-色氨酸和菌体。细胞生长和L-色氨酸合成之间存在着对碳源和能源的竞争，过高的生物量必然会导致糖酸转化率下降。原因之二是在发酵后期由于细胞比生长速率下降，细胞合成乙酸等副产物，抑制L-色氨酸的合成。原因之三是在发酵中后期，菌体酶活下降较快，导致后期产酸速率下降。
酵母粉成分复杂且存在不稳定因素，导致发酵过程中存在产酸波动及一些不稳定营养成分的抑制现象。此外，酵母粉中含色素等杂质，在后期提取过程中难以去除，直接影响产品质量。以各类氨基酸及核苷对酵母粉进行替代发酵，不稳定营养成分大幅减少，使发酵液趋于稳定，产量波动降低。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种清液发酵培养基。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种应用上述清液发酵培养基来提高L-色氨酸产量的方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种清液发酵培养基，组分如下：葡萄糖10g/L，(NH4)2SO4 1-5g/L，肌苷0.1-1g/L，鸟苷0.1-1g/L，腺苷0.01-1g/L，甘氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸和丝氨酸各0.1-1g/L，异亮氨酸、苏氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸各0.2-2g/L，谷氨酸和赖氨酸各0.5-2g/L，柠檬酸0.1-2g/L，KH2PO4·3H2O 4-8g/L，MgSO4·7H2O 0.5-3g/L，FeSO4·7H2O 1-50mg/L，VB1 1-10mg/L，VB3 1-5mg/L，VB5 1-5mg/L，微量元素溶液0.5-2mL/L，生物素1-10mg/L，氯化胆碱0.1-2g/L，其中，所述微量元素溶液为含有4.5g/L MnSO4·H2O、6.4g/L ZnSO4、4.9g/L Co(NO3)2·6H2O、0.6g/L CuSO4·5H2O的混合溶液；pH至7.0。
上述清液发酵培养基用NaOH溶液和/或稀盐酸调pH至7.0，灭菌条件：0.1MPa湿热灭菌20min。
一种提高L-色氨酸产量的方法，采用色氨酸生产菌经上述清液发酵培养基发酵获得L-色氨酸。
优选的，上述提高L-色氨酸产量的方法，将大肠杆菌按接种量为10％接入上述清液发酵培养基发酵获得L-色氨酸。
优选的，上述提高L-色氨酸产量的方法，具体步骤为：在37℃、pH为7.0和溶氧为20％-30％条件下，按10％的接种量接入含有清液发酵培养基的30L自动控制发酵罐中,于自动控制发酵罐中培养至对数中后期，通入适当空气，调节适当搅拌转速，控制溶氧为30-50％，通过自动流加25％的氨水控制pH在6.7-7.0，通过流加适量泡敌消泡，并通过流加浓度为800g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在15％左右，发酵38h结束，即得。
优选的，上述提高L-色氨酸产量的方法，在所述清液发酵培养基中额外随糖流加2g/L氯化胆碱，10g/L KH2PO4·3H2O，2g/L精氨酸，2g/L赖氨酸。
优选的，上述提高L-色氨酸产量的方法，在所述清液发酵培养基中额外随糖流加2g/L柠檬酸，5g/L KH2PO4·3H2O，2g/L精氨酸，2g/L赖氨酸。
优选的，上述提高L-色氨酸产量的方法，所述色氨酸生产菌为保藏编号CGMCC NO.11073的大肠杆菌菌种。
本发明结构有如下有益效果：
上述提高L-色氨酸产量的方法，具有如下技术效果：
氨基酸及核苷不含色素等成分，为后续提取工艺及产品色泽及质量提供优势。基于该原理，本技术通过去除发酵培养基中酵母粉，添加各类氨基酸及核苷来提高L-色氨酸发酵产率。
以各类氨基酸及核苷对酵母粉进行替代发酵，不稳定营养成分大幅减少，使发酵液趋于稳定，产量波动降低。而且氨基酸及核苷不含色素等成分，为后续提取工艺及产品色泽及质量提供优势。基于该原理，本技术通过去除发酵培养基中酵母粉，添加各类氨基酸及核苷来提高L-色氨酸发酵产率及产酸稳定性。
此方法在不增加额外设备和的情况下，实现了整个发酵周期的稳定性和L-色氨酸产量的提高，及后期提取工艺的简化，适合于工业化生产。
本发明以各类氨基酸及核苷对酵母粉进行替代发酵，不稳定营养成分大幅减少，使发酵液趋于稳定，产量波动降低。而且氨基酸及核苷不含色素等成分，为后续提取工艺及产品色泽及质量提供优势。基于该原理，本技术通过去除发酵培养基中酵母粉，添加各类氨基酸及核苷达到提高L-色氨酸发酵稳定产率的目的。
保藏信息
分类名词：大肠埃希氏菌Escherichia coli
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2015年7月14日
保藏号：CGMCC NO.11073
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
实施例1
一种清液发酵培养基，组分如下：
葡萄糖10g/L(分消，0.075MPa湿热灭菌15min)，(NH4)2SO4 1.8g/L，肌苷0.1g/L，鸟苷0.1g/L，腺苷0.1g/L，甘氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸各0.1g/L，异亮氨酸、苏氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸各0.2g/L，谷氨酸、赖氨酸各0.5g/L，柠檬酸2g/L，KH2PO4·3H2O 7.5g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，FeSO4·7H2O 6mg/L，VB1 5mg/L，VB3 2mg/L，VB5 2mg/L，微量元素溶液1.2mL/L，生物素3mg/L，氯化胆碱0.5g/L，其中，所述微量元素溶液为含有4.5g/L MnSO4·H2O、6.4g/L ZnSO4、4.9g/L Co(NO3)2·6H2O、0.6g/L CuSO4·5H2O的混合溶液。
上述清液发酵培养基中各组分按组方量混合后用NaOH溶液和/或稀盐酸调pH至7.0，0.1MPa湿热灭菌20min，即得。
实施例2
一种清液发酵培养基，组分如下：
葡萄糖10g/L，(NH4)2SO4 1g/L，肌苷0.1g/L，鸟苷0.1g/L，腺苷0.01g/L，甘氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸和丝氨酸各1g/L，异亮氨酸、苏氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸各2g/L，谷氨酸和赖氨酸各2g/L，柠檬酸0.1g/L，KH2PO4·3H2O 4g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 1mg/L，VB1 1mg/L，VB3 1mg/L，VB5 1mg/L，微量元素溶液0.5mL/L，生物素1mg/L，氯化胆碱0.1g/L，其中，所述微量元素溶液为含有4.5g/L MnSO4·H2O、6.4g/L ZnSO4、4.9g/L Co(NO3)2·6H2O、0.6g/L CuSO4·5H2O的混合溶液。
上述清液发酵培养基中各组分按组方量混合后用NaOH溶液和/或稀盐酸调pH至7.0，0.1MPa湿热灭菌20min，即得。
实施例3
一种清液发酵培养基，组分如下：
葡萄糖10g/L，(NH4)2SO4 5g/L，肌苷1g/L，鸟苷1g/L，腺苷1g/L，甘氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸和丝氨酸各0.1g/L，异亮氨酸、苏氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸各0.2g/L，谷氨酸和赖氨酸各0.5g/L，柠檬酸2g/L，KH2PO4·3H2O 8g/L，MgSO4·7H2O 3g/L，FeSO4·7H2O 50mg/L，VB1 10mg/L，VB3 5mg/L，VB5 5mg/L，微量元素溶液2mL/L，生物素10mg/L，氯化胆碱2g/L，其中，所述微量元素溶液为含有4.5g/L MnSO4·H2O、6.4g/L ZnSO4、4.9g/L Co(NO3)2·6H2O、0.6g/L CuSO4·5H2O的混合溶液。
上述清液发酵培养基中各组分按组方量混合后用NaOH溶液和/或稀盐酸调pH至7.0，0.1MPa湿热灭菌20min，即得。
实施例4
一种清液发酵培养基，组分如下：
葡萄糖10g/L，(NH4)2SO4 3g/L，肌苷0.5g/L，鸟苷0.5g/L，腺苷0.5g/L，甘氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸和丝氨酸各0.5g/L，异亮氨酸、苏氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸各1g/L，谷氨酸和赖氨酸各1.5g/L，柠檬酸1g/L，KH2PO4·3H2O 6g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，VB1 3mg/L，VB3 2mg/L，VB54mg/L，微量元素溶液1mL/L，生物素5mg/L，氯化胆碱1g/L，其中，所述微量元素溶液为含有4.5g/L MnSO4·H2O、6.4g/L ZnSO4、4.9g/L Co(NO3)2·6H2O、0.6g/L CuSO4·5H2O的混合溶液。
上述清液发酵培养基中各组分按组方量混合后用NaOH溶液和/或稀盐酸调pH至7.0，0.1MPa湿热灭菌20min，即得。
实施例5
一种提高L-色氨酸产量的方法，具体步骤如下：
采用的大肠埃希氏菌(保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC NO.11073)；培养基为清液发酵培养基[葡萄糖10g/L(分消，0.075MPa湿热灭菌15min)，(NH4)2SO4 1.8g/L，肌苷0.1g/L，鸟苷0.1g/L，腺苷0.1g/L，甘氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸各0.1g/L，异亮氨酸、苏氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸各0.2g/L，谷氨酸、赖氨酸各0.5g/L，柠檬酸2g/L，KH2PO4·3H2O 7.5g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，FeSO4·7H2O 6mg/L，VB1 5mg/L，VB3 2mg/L，VB5 2mg/L，微量元素1.2mL/L(微量元素为含有4.5g/L MnSO4·H2O、6.4g/L ZnSO4、4.9g/L Co(NO3)2·6H2O、0.6g/L CuSO4·5H2O的混合溶液)，生物素3mg/L，氯化胆碱0.5g/L，用NaOH和盐酸调pH至7.0。灭菌条件：0.1MPa湿热灭菌20min]；培养方法：将菌种接入种子培养基[葡萄糖40g/L，(NH4)2SO4 3g/L，肌苷0.1g/L，鸟苷0.1g/L，腺苷0.1g/L，甘氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸各0.1g/L，异亮氨酸、苏氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸各0.2g/L，谷氨酸、赖氨酸各0.5g/L，柠檬酸2g/L，KH2PO4 6g/L，MgSO4·7H2O 1.6g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，VB1 5mg/L，VB3 2mg/L，VB5 2mg/L，微量元素1mL/L，生物素2mg/L]，接种量为10％；在37℃、pH为7.0和溶氧为20％-30％条件下于5L自动控制发酵罐中培养12h至对数中后期，按10％的接种量接入含有上述清液发酵培养基的30L自动控制发酵罐中,通入适当空气，调节适当搅拌转速，控制溶氧为30-50％，通过自动流加25％的氨水控制pH在6.7-7.0，通过流加适量泡敌消泡剂消泡，并通过流加浓度为800g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在15％左右，发酵38h结束；进行两批平行实验。放罐时，L-色氨酸的产量分别为38.6g/L、38.2g/L，分别比对照实验(两批实验)(L-色氨酸产量分别为34.2g/L、35.5g/L)提高了12.86％和7.61％，产酸稳定性较高，产量波动小。
实施例6
采用的菌株为大肠杆菌；培养基为清液发酵培养基(同实施例5)中随糖流加2g/L氯化胆碱，10g/L KH2PO4·3H2O，2g/L精氨酸，2g/L赖氨酸；培养方法同实施例5。进行两批平行实验。放罐时，L-色氨酸的产量分别为40.6g/L、41.0g/L，分别比对照实验(两批实验)(L-色氨酸产量分别为34.2g/L、35.5g/L)提高了18.71％和15.49％，产酸稳定性较高，产量波动小。
实施例7
采用的菌株为大肠杆菌；培养基为清液发酵培养基(同实施例5)中随糖流加2g/L柠檬酸，5g/LKH2PO4·3H2O，2g/L精氨酸，2g/L赖氨酸；培养方法同实施例5。进行两批平行实验。放罐时，L-色氨酸的产量分别为41.6g/L、41.9g/L，分别比对照实验(两批实验)(L-色氨酸产量分别为34.2g/L、35.5g/L)提高了21.64％和18.03％，产酸稳定性较高，产量波动小。
可见，通过去除现有培养基中的酵母粉，并在培养基中添加特定的氨基酸及核苷达到替代作用，使其在培养基中的浓度为0.1-0.5g/L，并在发酵中后期流加营养物质，最终获得高产量的L-色氨酸，其中，
所述各类氨基酸包括：甘氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸和赖氨酸；
所述各类核苷包括：鸟苷、肌苷、腺苷；
所述流加营养物质包括：柠檬酸、KH2PO4·3H2O、精氨酸、赖氨酸。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。