一种提高米曲霉曲酸产量的方法与流程

本发明涉及一种提高米曲霉曲酸产量的方法，属于微生物发酵领域。

背景技术：

曲酸是一种与葡萄糖结构相似的有机酸，是由好氧微生物利用糖类发酵产生的次级代谢产物，广泛存在于酒类、酱油及豆瓣酱等酿造产品中。目前，国内外主要利用米曲霉(Aspergillums oryzae)及不产黄曲霉毒素的黄曲霉(Aspergillusflavus)发酵生产曲酸。由于具有抑菌能力、抗氧化性、抑制酪氨酸酶活性、与金属离子螯合等性质，曲酸常用作防腐剂、杀虫剂、抗菌剂等，被广泛应用在医药、农业、食品及化妆品等各个行业。

曲酸的产量不仅与菌株的遗传特性有关，还与其所处的环境有着密切的关系。微生物的生长代谢是非常复杂的生化过程，需要大量的营养物质作为底物或诱导物，同时也有一些物质会对微生物的生长代谢产生抑制，即使是同一种物质也有可能随着浓度的变化而对曲酸发酵产生不同影响的现象。微生物只有在适宜的营养环境生长代谢才能将其性能发挥到最优水平，而原始条件往往不能满足工业生产需求。培养基组分及其配比不合理会直接降低曲酸的产率和提高生产成本。因此，在利用米曲霉发酵生产曲酸这一领域，迫切需要改良其发酵培养基，以期提高曲酸的发酵效率，并且进一步降低生产成本。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种发酵培养基，其成分包括葡萄糖180～240g/L、酵母提取物4～6g/L、豆饼粉2～6g/L、KH₂PO₄ 0.1～5.0g/L、Mg²⁺ 0.1～5.0mmol/L。

在本发明的一种具体实施方式中，所述发酵培养基组成为：葡萄糖210g/L、酵母提取物5g/L、豆饼粉4g/L、KH₂PO₄ 2g/L、Mg²⁺ 2.0mmol/L。

本发明的第二个目的是提供一种提高曲酸产量的方法，所述方法是控制培养基pH为5.0～8.0、培养温度为27～34℃、接种量按体积比为6～12％。

在本发明的一种具体实施方式中，所述方法是控制发酵培养基初始pH为6.0，培养温度为30℃，接种量为8％(v/v)。

在本发明的一种实施方式中，所述米曲霉是米曲霉QS，已于2014年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No：M 2014436，并公开于申请号为201410564556.3的发明专利申请中。

在本发明的一种实施方式中，所述接种是接种活化后的种子液。

在本发明的一种实施方式中，所述活化是取一环保藏的米曲霉孢子悬液接种于斜面培养基，30℃培养3～5d获得成熟孢子，用无菌生理盐水洗下成熟孢子，经玻璃珠打散后过滤制成孢子悬浮液，以1.0～15％接种量转接至种子培养基中，培养转速200r/min，在30℃下培养30h；

在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基含有：葡萄糖10～200g/L、玉米淀粉1.0～40g/L、酵母提取物1.0～20g/L、KH₂PO₄ 0.5～10g/L、Mg²⁺ 1.0～20mmol/L，pH为3.0～7.0。

本发明还提供所述方法在医药、农业、食品及化妆品领域制备含曲酸的产品中的应用。

本发明的有益效果：利用本发明的培养基及发酵方法可以使曲酸产量达37.27g/L，与优化前相比提高了142.41％。该方法能显著提高曲酸的产量和生产效率，降低生产成本，为其工业化生产提供了基础。

附图说明

图1为碳源种类对曲酸产量的影响；

图2为葡萄糖浓度对曲酸产量的影响；

图3显示了氮源种类及浓度对曲酸产量的影响；

图4为酵母提取物浓度对曲酸产量的影响；

图5为豆饼粉浓度对曲酸产量的影响；

图6为发酵培养基初始pH对曲酸产量的影响；

图7为温度对曲酸产量的影响；

图8为接种量对曲酸产量的影响。

具体实施方式

生孢培养：从-70℃的甘油保藏管中取一环孢子悬液接种于斜面培养基，30℃恒温培养箱中培养5d。

种子培养：将培养5d的成熟孢子用无菌生理盐水洗下，经玻璃珠打散后过滤制成孢子悬浮液，用血球计数板计数。将孢子悬浮液转接至种子培养基中，培养转速200r/min，在30℃下恒温摇床培养30h。

发酵培养：按10％(v/v)的接种量，将液体种子接种到发酵培养基中，发酵培养基的装液量为250mL三角瓶中装入30mL培养基，转速200r/min，30℃下恒温摇床培养。

种子培养基：葡萄糖100g/L、玉米淀粉20g/L、酵母提取物10g/L、KH₂PO₄ 5g/L、MgSO₄·7H₂O 2.5g/L，pH为6.0。

发酵培养基：葡萄糖120g/L、酵母提取物3g/L、豆饼粉5g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，pH为6.0。

曲酸含量测定：将发酵结束的发酵液10000r/min离心2～3min，采用三氯化铁比色法(《三氯化铁比色法测定曲酸含量方的改进》，张理珉等,公开于2000年)测定离心后发酵上清液的曲酸产量。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例1不同碳源及碳源浓度对米曲霉产曲酸的影响

向含酵母提取物3g/L、豆饼粉5g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L的培养基中的依次加入120g/L葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖和可溶性淀粉。将米曲霉进行种子培养、发酵培养液体种子接种到含上述培养基的三角瓶中，装液量为30mL/250mL，转速200r/min，30℃下恒温摇床培养米曲霉，结果如图1所示，碳源种类对曲酸产量影响较大，当碳源为葡萄糖时，曲酸产量比蔗糖、麦芽糖和可溶性淀粉时高，达15g/L以上(图1)。

实施例2

改变发酵培养基中葡萄糖的浓度(90～240g/L)，其他组分不变，对米曲霉进行种子培养、发酵培养，测定发酵后的曲酸含量，结果显示，葡萄糖浓度为180～240g/L时曲酸产量较高，其中浓度为210g/L和240g/L时，曲酸产量分别达到23.48g/L和23.73g/L(图2)。

实施例3

在含葡萄糖120g/L，酵母提取物3g/L、豆饼粉5g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L培养基的基础上，将发酵培养基中的酵母提取物依次用蛋白胨、牛肉膏、氯化铵、硫酸铵和硝酸钠替换，对米曲霉进行种子培养、发酵培养，测定发酵后的曲酸含量，研究不同氮源对发酵产酸的影响。结果如图3所示，酵母提取物作为氮源时曲酸产量最高，达24g/L以上。

实施例4

改变发酵培养基中酵母提取物的浓度(1～6g/L)，其他组分不改变，对米曲霉进行种子培养、发酵培养，测定发酵后的曲酸含量，结果显示(图4)，酵母提取物浓度为4～6g/L时曲酸产量较高，其中浓度为5g/L时曲酸产量最高达到29.89g/L。

实施例5

在培养基中葡萄糖120g/L，酵母提取物3g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L的浓度下，改变发酵培养基中豆饼粉的浓度(0～10g/L)，对米曲霉进行种子培养、发酵培养，测定发酵后的曲酸含量，结果显示，豆饼粉浓度为2～6g/L时曲酸产量较高，其中浓度为4g/L时曲酸产量最高达到32.88g/L(图5)。

实施例6

配制发酵培养基：葡萄糖210g/L、酵母提取物5g/L、豆饼粉2g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，pH为6.0。对米曲霉进行种子培养、发酵培养，测定发酵7d后的曲酸含量，结果显示，曲酸产量为36.22±0.67g/L。

实施例7

配制发酵培养基：葡萄糖210g/L、酵母提取物6g/L、豆饼粉4g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，pH为6.0。对米曲霉进行种子培养、发酵培养，测定发酵7d后的曲酸含量，结果显示，曲酸产量为31.89±1.8g/L。

实施例8

配制发酵培养基：葡萄糖240g/L、酵母提取物5g/L、豆饼粉6g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，pH为6.0。对米曲霉进行种子培养、发酵培养，测定发酵7d后的曲酸含量，结果显示，曲酸产量为34.65±0.48g/L。

实施例9

配制发酵培养基：葡萄糖240g/L、酵母提取物4g/L、豆饼粉4g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，pH为6.0。对米曲霉进行种子培养、发酵培养，测定发酵7d后的曲酸含量，结果显示，曲酸产量为30.29±1.29g/L。

实施例10

配制发酵培养基：葡萄糖240g/L、酵母提取物5g/L、豆饼粉4g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，pH为6.0。以葡萄糖120g/L、酵母提取物3g/L、豆饼粉1g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，pH为6.0的发酵培养基作为对照，在相同条件下接种米曲霉，进行种子培养和发酵培养。测定发酵结束(7d)的曲酸含量。结果显示，曲酸产量为36.72g/L，与对照相比提高了46.88％。

实施例11

以实施例10的培养基作为发酵培养基，分别调节发酵培养基的初始pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，研究不同培养基pH对米曲霉产酸的影响，结果显示(图6)，初始pH在5.0～8.0时，曲酸产量在33g/L以上。其中，米曲霉在培养基pH为6.0时曲酸产量达到36.59g/L。

实施例12

分别调节培养温度为27℃、30℃、34℃和37℃，初始pH为6.0，其它实施方式同实施例11，对米曲霉进行培养、发酵，测定发酵7d曲酸产量。结果显示(图7)，发酵温度为27～30℃可使曲酸产量达到33g/L以上，在30℃时曲酸产量达35g/L以上。

实施例13

将种子液分别以2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％(v/v)的比例接入发酵培养基，控制发酵温度为30℃，其它实施方式同实施例12，结果显示(图8)，在接种量为6％～12％范围内，曲酸产量达33g/L以上，接种量为8％时曲酸产量为37.27g/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。