本发明属于植物细胞培养基技术领域，具体涉及一种培养杜仲细胞生产黄酮的培养基及其制备方法。
背景技术：
杜仲属杜仲科杜仲属，为杜仲科多年生落叶乔木。杜仲是我国特产古老树种，属国家二类保护树种。杜仲是一种名贵的药用植物，树皮、叶均可入药，味甘、微辛，性温，具有补肝肾、壮筋骨、安胎、降血压等功能，主治肾虚腰痛、筋骨痞软、乏力眩晕、小便频数、阳萎、遗精、胎元不固、高血压等。树皮含树脂，药理研究证实，树皮提取物具有降压、利尿作用，又能减少胆固醇的吸收，是一种良好的抗衰老天然药物。杜仲叶中也有十几种药用有效成分，目前，专家已成功分离并提取抗衰老作用强、降血压、调节免疫作用的成分，国外还研究出其具有促进骨细胞和肌肉纤维生长的作用等。杜仲富含黄酮类化合物，不仅具有治疗糖尿病的功效，同时研究表明，杜仲黄酮类物质还具有明显的调节骨代谢功能的药效作用，可防治骨质疏松。
中国专利CN101358197B提供了一种杜仲毛状根诱导生产药用成分桃叶珊瑚甙的方法，遗传转化获得可生产桃叶珊瑚甙的杜仲毛状根，其过程是用发根农杆菌遗传转化杜仲，获得了杜仲毛状根，经分子检测确为遗传转化的毛状根，HPLC检测表明遗传转化获得的杜仲毛状根能够生产桃叶珊瑚甙。中国专利CN1422948B公开了一种植物细胞培养基及使用培养基培养植物细胞的方法，该培养基应用水培技术，含有1.0mM-6.0mM钙盐，1.0nm-6.0mm硝酸盐和1.0ng-5.0ng/L磷酸盐；优选的钙盐为CaCl2·2H2O，硝酸盐为NaNO3，磷酸盐为Ca3(P04)2。
由于杜仲含有丰富的生物活性成分，因此，自古以来，杜仲被列为名贵中药和上品。但是，其野生资源正在日益稀竭，由于杜仲生长缓慢，一般需15年才能提供商品，而商品药材的有效药用成分含量极低、产量质量都不稳定。因此，研究出一种适用于培养杜仲细胞生产黄酮的培养基是必要的。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种培养杜仲细胞生产黄酮的培养基及其制备方法。本发明提供的培养杜仲细胞生产黄酮的培养基，成分明确且价格较低，黄酮含量高，产量质量稳定，有利于日常应用、广泛推广及产业化培养。
本发明的技术方案是：
一种培养杜仲细胞生产黄酮的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：甘油30-50mg/L，烟酸0.05-0.1mg/L，碘化钾2-4mg/L，氨基乙酸0.3-0.8mg/L，硫胺素3-7mg/L，活性炭0.02-0.1g/L，谷胱甘肽20-50μg/L，木犀草素40-80μg/L，胞嘧啶4-10mg/L和萘乙酸9-15mg/L。
一种培养杜仲细胞生产黄酮的培养基，优选的方案是，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：甘油38mg/L，烟酸0.08mg/L，碘化钾3mg/L，氨基乙酸0.6mg/L，硫胺素5mg/L，活性炭0.07g/L，谷胱甘肽42μg/L，木犀草素60μg/L，胞嘧啶8mg/和萘乙酸14mg/L。
优选地，所述基础培养基为MS培养基或White培养基。
另外，本发明还提供了培养杜仲细胞生产黄酮的培养基的制备方法，步骤如下：
S1向基础培养基中加入烟酸、谷胱甘肽和木犀草素，搅拌24-36分钟，加入碘化钾、氨基乙酸、硫胺素、活性炭、胞嘧啶和萘乙酸，继续搅拌18-24分钟，加入甘油，搅拌10分钟，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至5.6-6.0，灭菌温度为115℃-122℃，灭菌时间为20-28分钟，即得。
优选地，所述步骤S1搅拌28分钟。
优选地，所述步骤S1继续搅拌22分钟。
优选地，所述步骤S2调节步骤S1所得混合物的pH至5.7。
优选地，所述步骤S2灭菌温度为118℃。
优选地，所述步骤S2灭菌时间为25分钟。
本发明所用主要原料的作用：
烟酸：烟酸也称作维生素B3，或维生素PP，分子式：C6H5NO2，耐热，能升华。烟酸又名尼克酸、抗癞皮病因子。在人体内还包括其衍生物烟酰胺或尼克酰胺。它是人体必需的13种维生素之一，是一种水溶性维生素，属于维生素B族。烟酸在人体内转化为烟酰胺，烟酰胺是辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ的组成部分，参与体内脂质代谢，组织呼吸的氧化过程和糖类无氧分解的过程。
硫胺素：硫胺素又称维生素B1、抗脚气病因子、抗神经炎因子等，是维生素中发现最早的一种。由嘧啶环和噻唑环结合而成的一种B族维生素。为白色结晶或结晶性粉末；味苦，有引湿性，露置在空气中，易吸收水分。在碱性溶液中容易分解变质。在体内，维生素B1以辅酶形式参与糖的分解代谢，有保护神经系统的作用；还能促进肠胃蠕动，增加食欲。维生素B1缺乏时，可引起多种神经炎症，如脚气病菌。维生素B1缺乏所引起的多发性神经炎，患者的周围神经末梢有发炎和退化现象，并伴有四肢麻木、肌肉萎缩、心力衰竭、下肢水肿等症状。
活性炭：活性炭可以降低组织培养物的有害代谢物浓度，对细胞生长有利。活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉末结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糖醛及激素等。
谷胱甘肽：谷胱甘肽(分子式C10H17O6N3S)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合，含有巯基的的三肽，具有抗氧化作用和解毒作用。谷胱甘肽在生命体内的作用机理和四大生理功能：1、清除人体细胞内的自由基，是细胞内最主要的抗氧化剂。2、与人体内的有毒物质结合并排出体外，是人体内重要的解毒剂。3、激活和保护免疫细胞，增强人体免疫功能，是重要的免疫增强剂。4、影响皮肤细胞酪氨酸酶活性、抑制黑色素生成，防止皮肤色斑的产生。
木犀草素：木犀草素是一种天然黄酮类化合物，存在于多种植物中。化学名：3',4',5,7-四羟黄酮。CAS号：491-70-3，分子式：C15H10O6，分子量：286.23。具有抗癌、抗菌、抗炎、祛痰、解痉、抗过敏和免疫增强等作用。
胞嘧啶：学名为2-羰基-4-氨基嘧啶，CAS号：71-30-7，分子式：C4H5N3O。核酸(DNA和RNA)中的主要碱基组成成分之一。胞嘧啶可由二巯基脲嘧啶、浓氨水和氯乙酸为原料合成制得。胞嘧啶核苷、胞嘧啶核苷酸均可作为升高白细胞的药物。
萘乙酸：CAS号：86-87-3，分子式：C12H10O2，分子量：186.21。萘乙酸是促进植物根系生长的植物生长调节剂，也是萘乙酰胺的中间体。萘乙酸用作植物生长调节剂，在医药上用作鼻眼净和眼可明的原料。萘乙酸具有促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根，增加坐果，防止落果，改变雌、雄花比率等。萘乙酸可经叶片、树枝的嫩表皮、种子进入到植物体内，随同营养流输导到作用部位。通常用于小麦、水稻、棉花、茶、桑、番茄、苹果、瓜类、马铃薯、林木等，是一种良好的植物生长刺激素。
本发明提供的培养杜仲细胞生产黄酮的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，添加的添加剂包括甘油、烟酸、碘化钾、氨基乙酸和木犀草素等。在本发明培养基中使用的甘油，作为诱导物，能够诱导杜仲细胞，来提高黄酮的产量。在本发明培养基中使用的烟酸和硫胺素，能够促进细胞新陈代谢，在杜仲细胞的代谢中起一定的作用。在本发明培养基中使用的活性炭，能够吸附杜仲生长中代谢的有毒物质，但是，活性炭在吸附培养基中的有害物质的同时，也能吸附生长调节物质和其它培养基中的成分，发明人在使用活性炭时，考虑到活性炭的两面性，经大量实验，得到合适的活性炭与培养基中生长调节物质的配比，使其都能更好的发挥作用。在本发明培养基中使用的谷胱甘肽，能够诱导细胞的增殖，避免过氧化物对杜仲细胞的损害。发明人意外发现，在本发明培养基中使用木犀草素，能够与其它物质协同作用，促进细胞生长增殖。在本发明培养基中使用的胞嘧啶，能够调控细胞增殖与分化。在本发明培养基中使用的萘乙酸，能够促进杜仲细胞的分裂与扩大。本发明培养杜仲细胞生产黄酮的培养基搭配合理，各成分间协同作用，能够促进黄酮的合成。
与现有技术相比，本发明提供的培养杜仲细胞生产黄酮的培养基具有以下优势：
(1)本发明提供的培养杜仲细胞生产黄酮的培养基，成分明确且价格较低，黄酮含量高，产量质量稳定，有利于日常应用、广泛推广及产业化培养。
(2)采用此培养基培养杜仲细胞不占耕地、不破坏杜仲野生资源，保护了生态环境，解决了杜仲资源短缺的问题。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明MS培养基可购自上海博耀生物科技有限公司；White培养基可购自青岛海博生物技术有限公司；木犀草素可购自西安百川生物科技有限公司。
实施例1、一种培养杜仲细胞生产黄酮的培养基
所述培养杜仲细胞生产黄酮的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：甘油30mg/L，烟酸0.05mg/L，碘化钾2mg/L，氨基乙酸0.3mg/L，硫胺素3mg/L，活性炭0.02g/L，谷胱甘肽20μg/L，木犀草素40μg/L，胞嘧啶4mg/L和萘乙酸9mg/L。
所述基础培养基为MS培养基。
制备方法：
S1向基础培养基中加入烟酸、谷胱甘肽和木犀草素，搅拌24分钟，加入碘化钾、氨基乙酸、硫胺素、活性炭、胞嘧啶和萘乙酸，继续搅拌18分钟，加入甘油，搅拌10分钟，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至5.6，灭菌温度为115℃，灭菌时间为20分钟，即得。
实施例2、一种培养杜仲细胞生产黄酮的培养基
所述培养杜仲细胞生产黄酮的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：甘油50mg/L，烟酸0.1mg/L，碘化钾4mg/L，氨基乙酸0.8mg/L，硫胺素7mg/L，活性炭0.1g/L，谷胱甘肽50μg/L，木犀草素80μg/L，胞嘧啶10mg/L和萘乙酸15mg/L。
所述基础培养基为White培养基。
制备方法：
S1向基础培养基中加入烟酸、谷胱甘肽和木犀草素，搅拌36分钟，加入碘化钾、氨基乙酸、硫胺素、活性炭、胞嘧啶和萘乙酸，继续搅拌24分钟，加入甘油，搅拌10分钟，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至6.0，灭菌温度为122℃，灭菌时间为28分钟，即得。
实施例3、一种培养杜仲细胞生产黄酮的培养基
所述培养杜仲细胞生产黄酮的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：甘油38mg/L，烟酸0.08mg/L，碘化钾3mg/L，氨基乙酸0.6mg/L，硫胺素5mg/L，活性炭0.07g/L，谷胱甘肽42μg/L，木犀草素60μg/L，胞嘧啶8mg/L和萘乙酸12mg/L。
所述基础培养基为White培养基。
制备方法：
S1向基础培养基中加入烟酸、谷胱甘肽和木犀草素，搅拌28分钟，加入碘化钾、氨基乙酸、硫胺素、活性炭、胞嘧啶和萘乙酸，继续搅拌22分钟，加入甘油，搅拌10分钟，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至5.7，灭菌温度为118℃，灭菌时间为25分钟，即得。
对比例1、一种培养杜仲细胞生产黄酮的培养基
所述培养杜仲细胞生产黄酮的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：一缩二甘油38mg/L，烟酸0.08mg/L，碘化钾3mg/L，氨基乙酸0.6mg/L，硫胺素5mg/L，活性炭0.07g/L，谷胱甘肽42μg/L，木犀草素60μg/L，胞嘧啶8mg/L和萘乙酸14mg/L。
所述基础培养基为White培养基。
制备方法与实施例3类似。
与实施例3的区别在于，将甘油替换为一缩二甘油。
对比例2、一种培养杜仲细胞生产黄酮的培养基
所述培养杜仲细胞生产黄酮的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：甘油38mg/L，烟酸0.08mg/L，碘化钾3mg/L，氨基乙酸0.6mg/L，硫胺素5mg/L，活性炭0.042g/L，谷胱甘肽42μg/L，木犀草素60μg/L，胞嘧啶8mg/L和萘乙酸0.042g/L。
所述基础培养基为White培养基。
制备方法与实施例3类似。
与实施例3的区别在于，将活性炭和萘乙酸的终浓度均调整为0.042g/L。
对比例3、一种培养杜仲细胞生产黄酮的培养基
所述培养杜仲细胞生产黄酮的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：甘油38mg/L，烟酸0.08mg/L，碘化钾3mg/L，氨基乙酸0.6mg/L，硫胺素5mg/L，活性炭0.07g/L，谷胱甘肽42μg/L，槲皮素60μg/L，胞嘧啶8mg/L和萘乙酸14mg/L。
所述基础培养基为White培养基。
制备方法与实施例3类似。
与实施例3的区别在于，将木犀草素替换为槲皮素。
试验例一、本发明培养杜仲细胞生产黄酮的培养基对杜仲细胞的培养效果
1、试验对象：本发明实施例1-3所得培养杜仲细胞生产黄酮的培养基，以及对比例1-3所得培养杜仲细胞生产黄酮的培养基。
2、试验方法
将由杜仲种子萌发的无菌苗真叶诱导的杜仲愈伤组织系经筛选，并继代培养得到稳定快速生长的细胞系，分别以本发明实施例1-3所得培养杜仲细胞生产黄酮的培养基，以及对比例1-3所得培养杜仲细胞生产黄酮的培养基为继代培养基，进行培养，接入杜仲细胞，置于摇床中进行悬浮培养，摇床转速150r/min，培养温度25℃，全天光照，光照强度为1000Lx。继代培养3次，收获细胞。
细胞生长测定：继代培养细胞经过滤、蒸馏水洗涤，称得细胞鲜重，烘干至恒重即得干重。结果如表1所示。
表1：不同培养基所得细胞干重比较
由表1可以看出，在相同的培养时间内，生长在本发明实施例1-3制备的培养基中所得细胞干重，明显高于生长在对比例1-3制备的培养基中所得细胞干重。这说明，本发明实施例1-3制备的培养杜仲细胞生产黄酮的培养基更有利于杜仲细胞的增殖。
采用分光光度法测定杜仲细胞中的黄酮含量，结果如表2所示。
表2：不同培养基所得杜仲细胞中的黄酮含量的比较
由表2可以看出，在相同的培养时间内，生长在本发明实施例1-3制备的培养基中杜仲细胞的黄酮含量，明显高于生长在对比例1-3制备的培养基中杜仲细胞的黄酮含量。这说明，本发明实施例1-3制备的培养杜仲细胞生产黄酮的培养基更有利于黄酮的合成，提高黄酮的产量，且黄酮产量质量稳定。