本发明涉及一种提高吡咯喹啉醌产量的方法，属于生物
技术领域：
。
背景技术：
：吡咯喹啉醌(Pyrroloquinolinequinone，PQQ)，化学名称为4，5-二氢-4，5-二氧化-1-氢吡咯(2，3f)醌-2，7，9一三羧酸，别名Methaxatin，是1979年由Salisbury等人发现的，最初描述是在细菌细胞中作为膜结合脱氢酶的氧化还原辅因子。目前，在许多不同生物体内都发现存在PQQ，它可以防止活细胞被体内或体外的氧损伤；还可作为营养因子和维生素促进细胞生长和提高细菌在极端条件下的耐受性；哺乳动物细胞分化中诱导蛋白激酶的产生；通过增加不溶性磷酸盐的可利用性和作为生物防治剂来提高作物生产力；利用氧化还原特性应用于生物传感器；众多发现已经将PQQ具有异常高的氧化还原循环能力和它在抗神经细胞衰老、抗癌、药剂、作为信号分子等方面的潜力关联起来，其应用一旦成功，PQQ将发挥不可替代的重要作用。总之，吡咯喹啉醌有多种功能，作为营养因子或维生素参与多种生命活动，在农业、医药、轻工业和食品业等方面具有重要的开发价值。目前，化学法生产PQQ步骤繁杂、产率低、副产物多、提取纯化步骤多，并用到有毒化学试剂，污染严重且后续处理困难。微生物发酵法具有降低生产成本，清洁低碳、温和可控等优势；同时发酵法一般以甲醇为唯一碳源，培养基以无机盐为主，这有利于产品的提取。迄今发现的能过量产生PQQ的野生菌包括：无色杆菌属、交替单胞菌属、弯杆菌属、生、甲烷单胞菌属、甲基菌属、甲基单胞菌属、嗜甲基菌属、甲基杆菌属、微环菌属、枝动菌属、假单胞菌属、精朊杆菌属、原单胞菌属、硫杆菌、黄色杆菌属，以及粘球菌属和副球菌属等。目前的微生物产吡咯喹啉醌的研究，主要集中在高产野生菌的筛选、基因工程菌的构建等方面，而少有对产吡咯喹啉醌营养因子的研究。技术实现要素：为了克服上述问题，本发明提供了一种提高吡咯喹啉醌产量的方法，通过控制培养基中特定氨基酸含量以及维生素含量，有效地提高了吡咯喹啉醌的产量。在一种实施方式中，所述方法包括控制培养基中缬氨酸含量为150～200mg/L。在一种实施方式中，所述方法还包括控制培养基中维生素B2含量为4～8mg/L。在一种实施方式中，所述培养基中还含有氮源1～5g/L，硫酸镁0.3～2.4g/L，磷酸二氢钾1.4～2.8g/L，磷酸氢二钠3～6g/L，氯化锰5～10mg/L，叶酸0.05～0.5mg/L，甲醇7～50g/L；初始pH6.5～7.2。在一种实施方式中，所述氮源可以是氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾。在一种实施方式中，所述培养基具体是：硫酸铵3g/L，硫酸镁0.8g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钠4g/L，氯化锰6mg/L，叶酸0.25mg/L，甲醇9g/L，缬氨酸175mg/L，维生素B2含量为6mg/L；初始pH7.0。在一种实施方式中，所述方法是以浅绿黄假单胞菌(Pseudomonasviridiflava)为发酵菌株进行发酵生产。在一种实施方式中，所述浅绿黄假单胞菌可以是以下任意一种：CGMCC1.3319、CGMCC1.3198、CGMCC1.3118。在一种实施方式中，所述发酵生产是在35℃、200rpm下发酵生产72h。本发明还要求保护按照上述方法发酵生产得到的吡咯喹啉醌及其在农业、医药、轻工业和食品业方面的应用。本发明的有益效果：本发明通过对浅绿黄假单胞菌产吡咯喹啉醌的营养因子进行分析，发现通过控制培养基中特定氨基酸含量以及维生素含量，能够有效地提高吡咯喹啉醌的产量。采用本发明的方法，能够使菌株产吡咯喹啉醌产量提高15％～89％。此外，本发明方法简便、易控，适合工业化应用。具体实施方式吡咯喹啉醌的纯化与提取：纯化仪器如AKTAavant蛋白纯化仪，将发酵上清液膜虑后以1mL/min流速经过DEAE阴离子交换柱，接着用2～5倍柱体积的柠檬酸钠缓冲液(pH5.5)洗涤平衡，再以含有lMNaCl的柠檬酸钠缓冲液(pH5.5)进行梯度洗脱，洗脱体积为10～20CV，得到初步纯化后的呈红色的PQQ产物。吡咯喹啉醌分析方法：(1)NBT－Gly化学法：见《3种检测吡咯喹啉醌的方法比较》(生物技术通讯,2011,22(4):544-547.)。(2)HPLC分析：流动相为12.5mM磷酸二氢钾溶液：甲醇＝85：15(v/v)；进样量10～20μL；流速0.8～1.2mL/min；检测波长254nm；柱温30℃；检测器为DAD；色谱柱为WatersSunFireTMC18反向柱(5μm，4.6mm×250mm)。(3)紫外吸收光谱分析：利用紫外-可见光分光光度计，对PQQ标准品和纯化后的PQQ溶液直接进行220-400nm的波长扫描，测定二者的紫外吸收光谱是否一致。实施例1将浅绿黄假单胞菌CGMCC1.3198、CGMCC1.3118，分别活化后，分别接种到发酵培养基中进行发酵生产PQQ，其中发酵的条件是：在35℃、200rpm下发酵72h。发酵结束后测定上清液中PQQ含量。发酵培养基中含有：硫酸铵3g/L，硫酸镁0.8g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钠4g/L，氯化锰6mg/L，叶酸0.25mg/L，甲醇9g/L，缬氨酸含量为150mg/L，维生素B2含量为8mg/L；初始pH7.0。结果显示，CGMCC1.3198、CGMCC1.3118的发酵上清中PQQ含量分别为30.96mg/L、20.25mg/L，比以不添加缬氨酸和维生素B2的发酵培养基发酵生产得到的PQQ含量分别提高了72％、35％。实施例2将浅绿黄假单胞菌CGMCC1.3198、CGMCC1.3118，分别活化后，分别接种到发酵培养基中进行发酵生产PQQ，其中发酵的条件是：在35℃、200rpm下发酵72h。发酵结束后测定上清液中PQQ含量。发酵培养基中含有：硫酸铵3g/L，硫酸镁0.8g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钠4g/L，氯化锰6mg/L，叶酸0.25mg/L，甲醇9g/L，缬氨酸含量为200mg/L，维生素B2含量为4mg/L；初始pH7.0。结果显示，CGMCC1.3198、CGMCC1.3118的发酵上清中PQQ含量分别为32.04mg/L、19.80mg/L，比以不添加缬氨酸和维生素B2的发酵培养基发酵生产得到的PQQ含量分别提高了78％、32％。实施例3将3株浅绿黄假单胞菌CGMCC1.3319、CGMCC1.3198、CGMCC1.3118，分别活化后，分别接种到发酵培养基中进行发酵生产PQQ，其中发酵的条件是：在35℃、200rpm下发酵72h。发酵结束后测定上清液中PQQ含量。基础发酵培养基中含有：硫酸铵3g/L，硫酸镁0.8g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钠4g/L，氯化锰6mg/L，叶酸0.25mg/L，甲醇9g/L；初始pH7.0。实验组是在基础发酵培养基的基础上额外添加一定终浓度的氨基酸和/或维生素：A组：不添加；B组：175mg/L缬氨酸；C组：6mg/L维生素B2；D组：175mg/L缬氨酸、6mg/L维生素B2；E组：100mg/L缬氨酸；F组：250mg/L缬氨酸；G组：175mg/L苏氨酸；H组：6mg/L维生素B1；I组：2mg/L维生素B2。表1不同培养基发酵生产对PQQ产量的影响CGMCC1.3319CGMCC1.3198CGMCC1.3118A组21mg/L18mg/L15mg/LB组12.9％8.3％7.2％C组5％12.8％9.8％D组15％89％45％E组9.4％8.1％6.5％F组13.1％8.2％7.0％G组4.3％2.9％7.1％H组6.2％3.3％10.8％I组8.0％10.8％6.7％注：B组～G组数据，为相应菌株相对于A组的PQQ产量提高的质量百分比。由表1数据可知，缬氨酸和维生素B2组合使用能够有效提高浅绿黄假单胞菌发酵生产PQQ的产量，而且对CGMCC1.3198的提高作用要明显强于其他两株菌。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。当前第1页1 2 3