一种利用细菌静态发酵制备生物改性细菌纤维素纳滤膜的方法与流程

本发明涉及一种发酵培养法制备细菌纤维素膜的方法，特别涉及一种利用细菌静态发酵制备生物改性细菌纤维素纳滤膜的方法，属于微生物培养技术领域。

背景技术：

细菌纤维素是一种由细菌合成的天然生物材料。与植物纤维素和动物纤维素相比，细菌纤维素具有许多优良的特性，如：超细、超纯、超高机械强度、高结晶度、高持水量以及较好的生物适应性。因此，研究和开发出细菌纤维素制品将会产生巨大的经济效益和社会效益。目前，细菌纤维素已成功地在食品、医药、纺织、造纸、化工等行业得到了广泛地开发应用。然而在我国，对细菌纤维素的研究相较于日、美依旧处于落后水平，尤其是将细菌纤维素纳滤膜应用于膜分离领域的研究。日本和美国已经开发了细菌纤维素膜滤器，利用细菌纤维素的高渗透性使物质扩散，广泛应用于无菌装置、超滤装置和反渗透滤膜等领域。

细菌纤维素的合成过程是可调控的。细菌将葡萄糖分子以糖苷键聚合成葡萄糖，细菌纤维素的分泌伴随着合成同时进行。从细菌纤维素孔道分泌出来的是最小构成单元亚小纤维，大量亚小纤维相互间以氢键连接形成微纤维，而微纤维不断延伸，相互缠绕组成纤维丝带，大量具有高结晶性的纤维丝带相互交织，便形成了网状多孔结构，即细菌纤维素膜。正是由于细菌纤维素膜具有高机械强度、高形状维持力和纤维素带相互交织形成的网状多孔结构，突显了可发展成为理想膜材料的优势。研究表明，未经改性的细菌纤维素膜的平均孔径集中在几百纳米，而通过在培养过程中添加不同碳源，利用生物改性技术，对细菌纤维素膜的孔径实现调控，便可获取具有纳米级孔径的细菌纤维素纳滤膜材料，实现其在纳滤领域的应用，提高其市场价值。

在细菌纤维素纳滤膜的发酵制备及改性领域，中国专利(CN201610250934.X)“一种纳米级细菌纤维素膜的制备方法及应用”利用经过预处理的废弃菌液或废弃菌体为发酵原料，通过调整发酵培养基中的营养成分含量，进行静态发酵获得纳米级细菌纤维素膜，用于获得高附加值的美容面膜。中国专利(CN201110190887.1)“一种改性细菌纤维素膜制备质子交换膜的方法及其应用”将纯化处理后的纤维素膜在过量的无机酸或有机酸中浸泡，干燥后得到改性的质子交换膜并用于组装成燃料电池，此方法制备工艺简单，成本低，对环境污染小。美国专利(US 20090028927 A1)“Poly(vinyl alcohol)-bacterial cellulose nanocomposite”利用羟基溶剂或非质子溶剂溶解聚乙烯等聚合物后，将其制成水凝胶，再与用木醋杆菌(700178)发酵培养制备的细菌纤维素膜做成复合纳滤膜材料。美国专利(US 20130011385 A1)“Transparent bacterial cellulose nanocomposite hydrogels”利用由木醋杆菌制备的细菌纤维素和甲基丙烯酸羟乙酯单体一起发生自由基共聚反应，干膜通过在水相中沉浸获取高透明度的细菌纤维素纳米复合水凝胶膜。截至目前，还未见到以木醋杆菌(ATCC 23119)和木醋杆菌(GDMCC 1.423)作为制备细菌纤维素纳滤膜的菌种，利用氨基葡萄糖在细菌成膜培养过程的调控作用，来发酵制备细菌纤维素纳滤膜的相关工艺技术出现。

目前，绿色生态的发展理念不断深化，人们对于环保材料的关注不断提升，而细菌纤维素膜作为一种环境友好型的膜材料，若能通过孔径调控，制备出一种细菌静态发酵的生物改性的具有纳米级孔径的纤维素纳滤膜材料，实现其在纳滤领域的应用，具有十分重要的意义。

技术实现要素：

为了减小目前细菌纤维素膜孔径，使其达到纳滤膜的孔径要求，本发明利用氨基葡萄糖在细菌成膜培养过程中的调控作用，借助细菌发酵的生物方法，制备细菌纤维素纳滤膜，应用于海水脱盐等膜分离领域。本发明的目的是提供一种利用细菌静态发酵制备生物改性细菌纤维素纳滤膜的方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案采用以下实施步骤：

1)在无菌条件下，用接种环挑取培养于固体斜面培养基上的细菌菌落，接种于120mL液体活化培养基中，置于恒温摇床震荡培养，培养温度28～32℃、转速80～120r/min，培养时间48～72h，得到经扩大培养的细菌种子液；

2)将步骤1)中得到的扩大培养的细菌种子液，按发酵培养基溶液体积2～5％接种量接种于120mL改性液体发酵培养基中，制备改性发酵培养基时，只需在未改性液体发酵培养基中加入0～3.3w/v％的氨基葡萄糖，逐步取代葡萄糖，葡萄糖和氨基葡萄糖的总量保持在3.0～3.3w/v％，将其置于恒温生化培养箱中静态培养，培养温度36～40℃，发酵时间4～6d，去除发酵培养液，得到未经纯化的细菌纤维素纳滤膜；

3)将步骤2)中得到的未经纯化的细菌纤维素纳滤膜用去离子水反复冲洗，直至去除表面有色絮状物质及残留于表面的菌体，将整张纳滤膜浸泡于浓度为60℃、0.1mol/L NaOH溶液中，直至细菌纤维素膜呈无色透明且NaOH溶液不再浑浊，取出细菌纤维素纳滤膜并浸泡于常温0.5％乙酸溶液中30min，取出细菌纤维素纳滤膜并用去离子水反复冲洗，直至细菌纤维素纳滤膜表面pH为中性，即得到生物改性细菌纤维素纳滤膜。

所述的细菌菌种为木醋杆菌(ATCC 23119)、木醋杆菌(GDMCC 1.423)中的一种。

所述的液体活化培养基配方为：36～40g/L葡萄糖、8～10g/L酵母膏、12～15g/L蛋白胨、2.4～2.8g/L柠檬酸、2.6～3.0g/L硫酸镁、pH 3～5，经过110℃高温高压蒸汽灭菌30min。

所述的未改性液体发酵培养基配方为：36～40g/L葡萄糖、7～9g/L酵母膏、12～15g/L蛋白胨、2.4～2.8g/L柠檬酸、2.6～3.0g/L硫酸镁、3.0～3.4g/L Na₂HPO₄、2.4～2.8g/L KH₂PO₄、pH 3-5，经过110℃高温高压蒸汽灭菌30min。

与背景技术相比，本发明具有的有益效益是：

本发明利用木醋杆菌(ATCC 23769)、木醋杆菌(GDMCC 1.423)等菌种，在培养基中添加氨基葡萄糖逐步取代葡萄糖，便可通过影响由细菌细胞壁孔道分泌出来的亚小纤维的直径及微纤维的扁化过程来减小纤维网孔结构，从而获得具有三维网状纳米级孔径范围的细菌纤维素纳滤膜，平均孔径在几十纳米左右，绝大部分孔径集中在1～10nm范围内。该制备方法操作简单，药品无毒无害，不会对环境造成污染，而且能有效调控细菌纤维素纳滤膜的孔径，制备出适用于纳滤膜分离过程的细菌纤维素膜材料，进一步地拓宽了细菌纤维素的应用领域，具有重要的现实意义。

附图说明

图1是实施例1发酵制备的生物改性细菌纤维素纳滤膜润湿状态下的数码照片。

图2是实施例1发酵制备的生物改性细菌纤维素纳滤膜冷冻干燥后的数码照片。

图3是实施例1发酵制备的生物改性细菌纤维素纳滤膜润湿状态下的场发射扫描电镜照片。

具体实施方式说明

实施例1：

1)在无菌条件下，用接种环挑取培养于固体斜面培养基上的木醋杆菌(ATCC 23119)菌落，接种于120mL液体活化培养基(配方：40g/L葡萄糖、8g/L酵母膏、13g/L蛋白胨、2.8g/L柠檬酸、2.6g/L硫酸镁、pH 5，经110℃高温高压蒸汽灭菌30min)中，置于恒温摇床震荡培养，培养温度28℃、转速120r/min，培养时间72h，得到扩大培养的细菌种子液；

2)将步骤1)中得到的扩大培养的细菌种子液，按发酵培养基溶液体积的4％的接种量接种于120mL改性液体发酵培养基(配方：36g/L葡萄糖、7g/L酵母膏、15g/L蛋白胨、2.6g/L柠檬酸、2.6g/L硫酸镁、3.0g/L Na₂HPO₄、2.4g/L KH₂PO₄、pH 3，经110℃高温高压蒸汽灭菌30min)中，将其置于恒温生化培养箱中静态培养，培养温度36℃，发酵时间5d，去除发酵培养液，得到未经纯化的细菌纤维素纳滤膜；

3)将步骤2)中得到的未经纯化的细菌纤维素纳滤膜用去离子水反复冲洗，直至去除表面有色絮状物质及残留于表面的菌体，将整张纳滤膜浸泡于60℃的浓度为0.1mol/L NaOH溶液中，直至细菌纤维素膜呈无色透明且NaOH溶液不再浑浊，取出细菌纤维素纳滤膜并浸泡于常温0.5％乙酸溶液中30min，取出细菌纤维素纳滤膜并用去离子水反复冲洗，直至细菌纤维素纳滤膜表面pH为中性，即得到生物改性细菌纤维素纳滤膜1。

实施例2：

1)在无菌条件下，用接种环挑取培养于固体斜面培养基上的木醋杆菌(GDMCC 1.423)菌落，接种于120mL液体活化培养基(配方：36g/L葡萄糖、9g/L酵母膏、12g/L蛋白胨、2.6g/L柠檬酸、2.8g/L硫酸镁、pH 3，经110℃高温高压蒸汽灭菌30min)中，置于恒温摇床震荡培养，培养温度30℃、转速100r/min，培养时间48h，得到扩大培养的细菌种子液；

2)将步骤1)中得到的扩大培养的细菌种子液，按发酵培养基溶液体积的5％的接种量接种于120mL改性液体发酵培养基(配方：20g/L葡萄糖、20g/L氨基葡萄糖、8g/L酵母膏、14g/L蛋白胨、2.4g/L柠檬酸、3.0g/L硫酸镁、3.2g/L Na₂HPO₄、2.8g/L KH₂PO₄、pH 5，经110℃高温高压蒸汽灭菌30min)中，将其置于恒温生化培养箱中静态培养，培养温度38℃，发酵时间4d，去除发酵培养液，得到未经纯化的细菌纤维素纳滤膜；

3)将步骤2)中得到的未经纯化的细菌纤维素纳滤膜用去离子水反复冲洗，直至去除表面有色絮状物质及残留于表面的菌体，将整张纳滤膜浸泡于60℃的浓度为0.1mol/L NaOH溶液中，直至细菌纤维素膜呈无色透明且NaOH溶液不再浑浊，取出细菌纤维素纳滤膜并浸泡于常温0.5％乙酸溶液中30min，取出细菌纤维素纳滤膜并用去离子水反复冲洗，直至细菌纤维素纳滤膜表面pH为中性，即得到生物改性细菌纤维素纳滤膜2。

实施例3：

1)在无菌的条件下，用接种环挑取培养于固体斜面培养基上的木醋杆菌(GDMCC 1.423)菌落，接种于120mL液体活化培养基(配方：38g/L葡萄糖、10g/L酵母膏、15g/L蛋白胨、2.4g/L柠檬酸、3.0g/L硫酸镁、pH 4，经110℃高温高压蒸汽灭菌30min)中，置于恒温摇床震荡培养，培养温度32℃、转速80r/min，培养时间60h，得到扩大培养的细菌种子液；

2)将步骤1)中得到的扩大培养的细菌种子液，按发酵培养基溶液体积的2％的接种量接种于120mL改性液体发酵培养基(配方：38g/L氨基葡萄糖、9g/L酵母膏、12g/L蛋白胨、2.8g/L柠檬酸、2.8g/L硫酸镁、3.4g/L Na₂HPO₄、2.6g/L KH₂PO₄、pH 4，经110℃高温高压蒸汽灭菌30min)中，将其置于恒温生化培养箱中静态培养，培养温度40℃，发酵时间6d，去除发酵培养液，得到未经纯化的细菌纤维素纳滤膜；

3)将步骤2)中得到的未经纯化的细菌纤维素纳滤膜用去离子水反复冲洗，直至去除表面有色絮状物质及残留于表面的菌体，将整张纳滤膜浸泡于60℃的浓度为0.1mol/L NaOH溶液中，直至细菌纤维素膜呈无色透明且NaOH溶液不再浑浊，取出细菌纤维素纳滤膜并浸泡于常温0.5％乙酸溶液中30min，取出细菌纤维素纳滤膜并用去离子水反复冲洗，直至细菌纤维素纳滤膜表面pH为中性，即得到生物改性细菌纤维素纳滤膜3。

测定实施例1、2、3制备的三个生物改性细菌纤维素纳滤膜样品的干重产量、孔径集中分布范围和平均孔径。表1为实施案例1、2、3制备的三个生物改性细菌纤维素纳滤膜样品的干重和平均孔径测定结果。由表中所得数据可知，采用本发明所述的发酵液利用生物改性发酵培养所得的生物改性细菌纤维素纳滤膜1、2和3的产量分布在1.2～1.5g/L,孔径集中分布范围在4～17nm，平均孔径分布在7～12nm。此外，氨基葡萄糖取代葡萄糖的比例越大，细菌纤维素纳滤膜的孔径越小，且都符合作为纳滤膜材料的条件要求。

如图1，从实施例1制备的生物改性细菌纤维素纳滤膜润湿状态下的数码照片可以看出，纳滤膜在湿态时呈现无色透明平整的水凝胶膜状态，符合一般纤维素膜或复合膜的特征；如图2，从实施例1制备的生物改性细菌纤维素纳滤膜冷冻干燥后的数码照片可以看出，此实施例制备的细菌纤维素纳滤膜具有较大的厚度，膜的状态符合细菌纤维素干膜的外观形态特征；如图3，从实施例1制备的生物改性细菌纤维素纳滤膜润湿状态下的场发射扫描电镜照片可以看出，细菌纤维素纳滤膜表面纤维素密集排列，呈现出良好的三维网状结构，且膜孔径致密，适用于纳滤膜分离领域。

表1

以上实施案例仅是本发明选取的几例个别的实验例，不限于以上实施例，可以在一定范围内进行适当的各种变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。