本发明属于蛋白质工程和核酸扩增技术领域，尤其是涉及一种DNA聚合酶促进剂的制备方法及其应用。
背景技术：
聚合酶链式反应（PCR）是一项在生命科学研究中广泛应用的分子生物学技术，用于扩增、检测各种核酸片断。各种耐高温DNA聚合酶广泛应用于PCR，主要分为A型和B型DNA聚合酶。A型DNA聚合酶没有校正活性，扩增DNA的忠实度远低于B型DNA聚合酶。B型DNA聚合酶具有校正活性，扩增DNA的忠实度高。PCR在高温下进行，高温导致DNA中的dC、dA碱基脱氨基生成dU、dI碱基。B型DNA聚合酶对DNA中dU、dI碱基的结合力很高，造成DNA合成反应停滞在dU、dI碱基处，因此B型DNA聚合酶活性会被DNA中的dU、dI碱基所抑制。如果把这部分被抑制的B型DNA聚合酶释放出来将会提高PCR中的有效聚合酶浓度，大大提高PCR产量。另外dU碱基会导致G:C→A:T突变，dI碱基导致A:T→T:A/G:C/C:G突变。切除修复dU、dI碱基还可以提高聚合酶催化PCR的忠实度。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对B型DNA聚合酶的缺点，提供一种新型的DNA聚合酶促进剂，该DNA聚合酶促进剂为热稳定性尿嘧啶DNA糖苷酶（UDG）、次黄嘌呤DNA糖苷酶（AlkA）和内切核酸酶IV的混合物。其中UDG和AlkA可以有效的切除PCR中生成的dU和dI碱基，生成脱碱基位点，释放出B型DNA聚合酶去催化PCR，从而提高PCR产量。然而UDG和AlkA生成的脱碱基位点会在PCR中引入碱基突变，降低PCR的忠实度。在本发明中，热稳定性内切核酸酶IV具有脱碱基位点特异性的内切酶活性，切断脱碱基位点，消除脱碱基位点导致的碱基突变，恢复PCR的忠实度。因此该DNA聚合酶促进剂为热稳定性尿嘧啶糖苷酶（UDG）、次黄嘌呤DNA糖苷酶（AlkA）和内切核酸酶IV的混合物，其使用简便，促进效果好、通用性强，对所有B型DNA聚合酶均有促进效果。同时也可用于A型DNA聚合酶，此时促进剂虽然不能够提高PCR产量，但DNA糖苷酶和内切核酸酶IV的联合作用可以修复dU、dI碱基，显著提高A型聚合酶合成DNA的忠实度；另外内切核酸酶IV还具有校正活性（3’外切酶活性），该校正活性可以补充A型DNA聚合酶缺失的校正活性，进一步提高其催化PCR的忠实度。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是设计一种DNA聚合酶促进剂的制备方法，包括步骤：首先制备热稳定尿嘧啶糖苷酶（UDG）、次黄嘌呤DNA糖苷酶（AlkA）和内切核酸酶IV。然后将尿嘧啶糖苷酶（UDG）、次黄嘌呤DNA糖苷酶（AlkA）和内切核酸酶IV混合溶解于蛋白储存液（20 mM Tris-HCl pH8.0，1 mM DTT，100 mM KCl，50%甘油）中，制备成DNA聚合酶促进剂。在PCR中DNA聚合酶促进剂的工作浓度为50－500纳克/50微升反应。
本发明的具体步骤如下：
1、热稳定性UDG的制备。首先将udg基因克隆到原核表达载体中，构建UDG的重组表达载体。然后将UDG重组表达载体转化到大肠杆菌等原核表达宿主中表达UDG蛋白。最后从原核表达宿主的细胞裂解液中纯化UDG蛋白。
2、热稳定性AlkA的制备。热稳定性DNA糖苷酶AlkA的制备方法与热稳定性UDG相似，只是克隆的基因为alka，其他步骤完全相同。具体操作参照步骤1。
3、热稳定性内切核酸酶IV的制备。热稳定性内切核酸酶IV的制备方法与热稳定性UDG相同，只是克隆的基因为内切核酸酶IV的基因，其他步骤完全相同。具体操作参照步骤1。
4、DNA聚合酶促进剂的制备。最后将热稳定性UDG、AlkA、内切核酸酶IV三者混合在一起，并溶解在储存液（20 mM Tris-HCl pH8.0，1 mM DTT，100 mM KCl，50%甘油）中，保存于-20度或-80度。
5、DNA聚合酶促进剂在PCR中的应用。聚合酶链式反应体系组成：热稳定性DNA 聚合酶反应缓冲液、dNTPs、热稳定性DNA聚合酶（A型或B型）、正向引物与反向引物、DNA模板分子、DNA聚合酶促进剂。将PCR反应混合物进行聚合酶链式反应，扩增DNA。PCR结束后，利用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA聚合酶促进剂对PCR扩增产量的促进效果。
本发明的优点和有益效果在于：本发明一种DNA聚合酶促进剂的制备方法及应用中制备得到的DNA聚合酶促进剂的与现有的DNA聚合酶促进剂相比有显著的进步。主要优点如下：（1）通用性强，促进剂可以促进所有B型DNA聚合酶催化的PCR。（2）并不降低PCR的忠实度，DNA糖苷酶和内切核酸酶IV的联合作用可以修复校正dU、dI碱基，并消除AP位点导致的碱基突变，从而进一步提高了B型DNA聚合酶催化PCR的忠实度。（3）可以用于A型DNA聚合酶催化的PCR，提高A型DNA聚合酶的忠实度。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例：
利用火球菌的UDG和AlkA两种DNA糖苷酶和内切核酸酶IV制备DNA聚合酶促进剂及其在Pfu DNA聚合酶催化的PCR中的应用。
第一步，火球菌UDG的制备。将火球菌udg基因克隆到原核表达载体pET28a中，克隆位点为NdeI和BamHI，构建火球菌UDG的重组表达载体pET28a-udg。然后将表达载体pET28a-udg转化到大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中，当大肠杆菌生长到OD600=0.5时加入终浓度0.5mM的IPTG诱导火球菌UDG蛋白的表达。最后超声波破碎IPTG诱导的大肠杆菌，并利用镍离子亲和色谱纯化表达的火球菌UDG。
第二步，火球菌AlkA的制备。火球菌热稳定性DNA糖苷酶AlkA的制备方法与热稳定性UDG相似，只是克隆到pET28a的基因为alka，其它操作完全相同，具体操作参照第一步。
第三步，火球菌内切核酸酶IV的制备。火球菌热稳定性内切核酸酶IV的制备方法与热稳定性UDG相似，只是克隆到pET28a的基因为内切核酸酶IV基因，其它操作完全相同，具体操作参照第一步。
第四步，火球菌DNA聚合酶促进剂的制备。最后将火球菌的热稳定性UDG、AlkA、内切核酸酶IV三者混合在一起，并溶解在储存液（20 mM Tris-HCl pH8.0，1 mM DTT，100 mM KCl，50%甘油）中，保存于-20度或-80度。
第五步，火球菌DNA聚合酶促进剂在Pfu DNA聚合酶催化的PCR中的应用。按下列组成配制PCR反应体系：Pfu DNA 聚合酶反应缓冲液、dNTPs、Pfu DNA聚合酶、正向引物与反向引物、DNA模板分子、火球菌DNA聚合酶促进剂。将PCR反应混合物按下列反应条件进行PCR：95度5分钟；（95度30秒，50度30秒，72度1分钟）×30循环，72度3分钟。PCR结束后，利用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产量，评价DNA聚合酶促进剂的促进效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。