一种从棉子糖乳球菌次级代谢物中分离活性化合物的方法与流程

本发明涉及一种从棉子糖乳球菌次级代谢物中分离活性化合物的方法，属于生物领域。
背景技术：
：天然产物是药物先导化合物发现的重要来源，近年来，越来越多的天然产物化学家把目光投向生物种类更加多样的微生物。本发明从一株棉子糖乳球菌次级代谢物中分离出一种活性化合物，并通过优化培养条件，可以高效生产该化合物，成本低。经鉴定，该活性化合物具有显著的降血脂作用，还具有美白作用。技术实现要素：本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出从一株棉子糖乳球菌次级代谢物中分离出一种活性化合物，并通过优化培养条件，可以高效生产该化合物，成本低。经鉴定，该活性化合物具有显著的降血脂作用，还具有美白作用。本发明人从广东微生物保藏中心购得一株棉子糖乳球菌，其编号为：GIM1.1015，根据保藏中心的记载，该菌株的其他编号为：JCM5706。＝ATCC43920＝CGMCC1.1935＝DSM20443＝NBRC100932。对该株棉子糖乳球菌进行培养，在MRS液体培养基中培养24-72h，共发酵100L。过滤、浓缩后得到水相10L，用乙酸乙酯进行萃取，减压浓缩后得到乙酸乙酯层浸膏20g，经300目硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇(3:1-1:2)梯度洗脱，合并相同组分，各组分再经反复硅胶层析，SephadexLH-20和RP-18反相柱色谱分离纯化以及C18高效液相制备得两种化合物，1(3.5mg)、化合物2(8.1mg)经鉴定，化合物1的结构式为：本发明人还惊讶地发现，该活性化合物具有显著的降血脂作用，还具有美白作用。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。本发明的有益之处在于：本发明从一株棉子糖乳球菌次级代谢物中分离出一种活性化合物，并通过优化培养条件，可以高效生产该化合物，成本低。经鉴定，该活性化合物具有显著的降血脂作用，还具有美白作用。附图说明图1为黑色素代谢原理图。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例1：本发明人从广东微生物保藏中心购得一株棉子糖乳球菌，其编号为：GIM1.1015，根据保藏中心的记载，该菌株的其他编号为：JCM5706。＝ATCC43920＝CGMCC1.1935＝DSM20443＝NBRC100932。对该株棉子糖乳球菌进行培养，在MRS液体培养基中培养24-72h，共发酵100L。过滤、浓缩后得到水相10L，用乙酸乙酯进行萃取，减压浓缩后得到乙酸乙酯层浸膏20g，经300目硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇(3:1-1:2)梯度洗脱，合并相同组分，各组分再经反复硅胶层析，SephadexLH-20和RP-18反相柱色谱分离纯化以及C18高效液相制备得两种化合物，化合物1(3.5mg)、化合物2(8.1mg)经鉴定，化合物1为淡黄色粉末，溶于二氯甲烷，分子式为C13H14O3；mp.60摄氏度，化合物1的结构式为：其核谱数据如下所示：经检索核实，和已知文献报告过的化合物一致(天然产物研究与开发NatProdResDev2014，26:159-161)，但是该文献没有对该化合物的功能进行研究。实施例2：本发明人对实施例1的发酵方法进行改进，发现可以大幅提高该化合物的产量，为低成本工业化生产提供了可能性。本发明基于如下发现：特定浓度范围的甘草查尔酮B配合特定的温度曲线，可以令人惊讶地大幅提高该化合物的产量。甘草查尔酮B购自上海丽臣公司，纯度＞98％。从广东微生物保藏中心购得一株棉子糖乳球菌，其编号为：GIM1.1015，根据保藏中心的记载，该菌株的其他编号为：JCM5706。＝ATCC43920＝CGMCC1.1935＝DSM20443＝NBRC100932。对该株棉子糖乳球菌进行培养，接种进modified-MRS液体培养基中培养48h：前18h保持35摄氏度；第19-22h保持18摄氏度，第23-48h保持30摄氏度培养；所述modified-MRS液体培养基为MRS+0.002％甘草查尔酮B，共发酵100L。过滤、浓缩后得到水相10L，用乙酸乙酯进行萃取，减压浓缩后得到乙酸乙酯层浸膏20g，经300目硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇(3:1-1:2)梯度洗脱，合并相同组分，各组分再经反复硅胶层析，SephadexLH-20和RP-18反相柱色谱分离纯化以及C18高效液相制备得两种化合物，化合物1(36.8mg)、化合物2(8.1mg)。实施例3：法尼酯X受体(FXR)是一种核受体，在体内与配体结合后，通过激活下游靶基因的转录对体内生理过程产生广泛的调节作用，其中最重要的是维持体内胆汁酸和胆固醇的稳态。另外它还能够调节糖类和脂质代谢。目前已有两个以FXR为靶标的小分子化合物进入三期临床，用于治疗原发性胆汁酸性肝硬化和高血脂症。另外，研究表明治疗2型糖尿病的药物曲格列酮也是一种FXR拮抗剂【参见：Kaimal,R.；Song,X.；Yan,B.；King,R.；Deng,R.DifferentialmodulationoffarnesoidXreceptorsignalingpathwaybythethiazolidinediones[J].J.Pharmacol.Exp.Ther.2009,330,125-134】。因此，作用于FXR的小分子化合物有望被开发成为治疗代谢性疾病的药物。化合物的浓度分别为1μM,5μM，所用的细胞系是293T细胞。取对数期293T细胞以25,000/孔接种至96孔板。过夜培养后，表达载体pCMV-GAL4-DBD-hFXR-LBD(5ng/孔)，pFR-Luciferase报告基因(25ng/孔)以及Renilla-Luciferase(RL)质粒(5ng/孔)，按照0.25μL/孔的Lipofectamine进行瞬时转染。转染18小时后，用含有CDCA(25μM)的0.5％活性炭处理的FBS的MEM培养液，然后加入5μM化合物1。继续培养24小时后，根据Dual-Luciferase报告基因说明书检测Luciferase酶活性。以RL酶活性为内参。化合物1的FXR拮抗活性如下表所示：Antagonistrate(％)1μM22.75μM93.8这表明，细胞转染和荧光报告实验表明化合物1在5μM浓度下，能够对CDCA(鹅去氧胆酸，FXR内源性配体)诱导的法尼酯X受体激活产生强烈的拮抗作用。实施例4：对KKay糖尿病小鼠血脂的的调节作用药效学实验：通过体内实验确证了化合物1能够显著降低糖尿病模型小鼠的甘油三酯水平。实验所使用的动物模型是自发性2型糖尿病KKay小鼠，雌性(购于中国医学科学院动物中心)。依据胰岛素耐量实验，按空腹血糖、体重、血浆甘油三酯和胆固醇水平随机分为2组，分别为模型对照组(Con)、f给药组(50mg/kg)。每天灌胃给药一次，连续给药21天后测定血脂水平。给药组的血浆甘油三酯水平较对照组下降28.3％(p<0.05)。动物实验结果表明化合物1能够显著降低糖尿病小鼠的甘油三酯水平，具有开发成抗糖尿病药物的潜力。具体数据如下所示：甘油三酯(mg/dl)Con328.2±22.3f236.7±31.2可见，通过体内实验确证了化合物1能够显著降低糖尿病模型小鼠的甘油三酯水平，具有开发成抗糖尿病药物的潜力。实施例5：黑色素为高分子生物色素，主要由2种醌型的聚合物组成，分别是真黑素(eumelanin)和褐黑素(pheomelanin)。黑色素的生物合成首次由Raper和Mason阐明，近年来Cooksey和Schallreuter对其进行了完善。皮肤黑色素的形成过程包括黑色素细胞的迁移、分裂成熟、黑色素小体(melanosome)的形成、黑色素颗粒的转运以及黑色素的排泄等一系列生制生化过程，黑色素的合成过程过程如附图所示。黑色素的合成必须有3种物质参与：合成黑色素的主要原料酪氨酸(tyrosine，Tyr)；催化酪氨酸转变为黑色素的主要限速酶酪氨酸酶(tyrosinase，Tyr)以及参与此催化过程的氧元素①在酪氨酸酶的催化作用下，酪氨酸被氧化为多巴醌；②多巴醌自动氧化生成多巴和多巴色素，多巴也是酪氨酸酶的底物，它被催化后再次生成多巴醌。③多巴色素的反应产物5，6-二羟基吲哚(DHI)和5，6-二羟基吲哚羧酸(DHICA)经一系列的氧化反应生成真黑素，其为皮肤的色素主要组分。④在半胱氨酸或者谷胱甘肽存在的条件下，多巴醌会转变成半胱氨酰多巴，最后生成褐黑素，目前褐黑素在皮肤中的功能尚无文献报道。具有以上6种作用机制的化合物中，只有特异性的酪氨酸酶灭活剂和特异性的酪氨酸酶抑制剂能直接作用于酪氨酸酶，它们的抑制作用相对较强，而其他几类化合物都是间接作用于酪氨酸酶，抑制作用相对较弱。酪氨酸酶抑制剂根据抑制类型可分为竞争性抑制剂、非竞争性抑制剂和混合型(竞争性/非竞争性)抑制剂3类。酪氨酸酶是一种多活性酶，实验原理是通过测定催化多巴氧化成多巴醌过程中的多巴化酶活性求得酪氨酸酶的抑制效果。在96孔细胞培养板上以密度为3×104细胞/孔接种人黑色素细胞悬液培养24h，用PBS洗涤细胞两次，再加入含有曲通100的PBS溶液，添加L-多巴和待测物多巴。继续培养1h后，计算反应前后的475nmA的差值，结果除以细胞数，作为评价酪氨酸酶活性高低的指标。结果以半数抑制量IC50表示，结果越小，表明美白物质的抑制作用越大。经测定，化合物1的IC50为8.3μM。可见，化合物1具有很好的酪氨酸酶抑制性能，是具有潜力的美白产品。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。当前第1页1 2 3