制备蛋白酶的方法与流程

本发明涉及发酵技术领域，特别是涉及一种制备蛋白酶的方法。

背景技术：

酶制剂已经广泛应用于食品、医药、轻工、化工、环境保护以及农业和能源等方面。酶制剂是指从有机生物中提取或由微生物分泌出的一类具有催化活性的物质，主要可通过深层发酵的方式利用细菌、丝状真菌和酵母等生产酶制剂。

然而，通过发酵的方法生产酶制剂的过程中，由于酶制剂容易降解，稳定性较差，导致产量较低，这点在通过发酵制备蛋白酶时尤其如此。大部分微生物来源的蛋白酶在进行大规模的工业化生产时，由于蛋白酶倾向于自降解，所以难于积累。抑制剂可以抑制蛋白酶的自降解，然而传统的方法加入抑制剂后会极大抑制发酵微生物的生长，导致整体产量下降，所以现有的发酵生产工艺无法将其应用到提升蛋白酶产量当中。另一种方案是通过控制发酵过程的温度提升蛋白酶产量的方法，但该方法仍不能解决蛋白酶自降解导致的发酵产量受到限制的问题。

综上，传统的微生物发酵生产蛋白酶过程中，蛋白酶自降解导致蛋白酶的产量下降是行业迫切的需要解决的技术问题，该问题已成为制约蛋白酶工业化生产的瓶颈。

技术实现要素：

基于此，有必要提供一种能够解决蛋白酶自降解从而提升蛋白酶的产量的制备蛋白酶的方法。

一种制备蛋白酶的方法，包括如下步骤：

在培养基中发酵培养微生物，并在所述微生物生长的特定时间段内持续向所述培养基中加入蛋白酶抑制剂，所述特定时间段处于所述微生物生长的对数期至稳定期的时间段内；以及

所述微生物分泌产生蛋白酶。

在一个实施方式中，所述特定时间段持续时间为4h～48h，所述蛋白酶抑制剂在所述培养基中的终浓度为0.1g/L～5g/L，向所述培养基中加入所述蛋白酶抑制剂的速率为0.002g/(L·h)～1.25g/(L·h)。

在一个实施方式中，所述蛋白酶抑制剂为硼酸衍生物。

在一个实施方式中，所述蛋白酶抑制剂选自4-甲酰基苯基硼酸、N-2-吡嗪羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸硼酸、噻吩-3-硼酸、3-乙酰氨基苯基硼酸、N-酰基-肽基硼酸、4-甲基噻吩-2-硼酸、2-氟-5-(甲氧羰基)苯硼酸、5-乙基噻吩-2-硼酸、2-氟-4-(甲氧羰基)苯硼酸、5-溴噻吩-2-硼酸、4-(1-哌啶基甲基)苯硼酸、4-(1-吡咯烷基甲基)苯硼酸、二苯并噻吩基-1-硼酸、2-(甲氧羰基)-4-甲基苯硼酸、2,6-二氯-3-甲基苯硼酸、二苯并呋喃-4-硼酸、2-异丙氧基苯硼酸、2-氟-4-甲砜基苯硼酸、呋喃-2-硼酸、3-氟-4-甲砜基苯硼酸、1-Boc-7-甲氧基吲哚-2-硼酸、呋喃-3-硼酸、4-(1-哌啶基磺酰基)苯硼酸、3-乙酰氨基苯硼酸、3-甲氧基噻吩-2-硼酸、2-甲基-4-甲氧基苯硼酸、5-甲基-3-吡啶硼酸、5-正丙基噻-2-硼酸、10-苯基-9-蒽硼酸、3-溴噻吩硼酸、5-甲基-6-氟-3-吡啶硼酸、3-溴噻吩-4-硼酸、2,6-二氟-3-吡啶硼酸、4-甲酰基苯基硼酸、3-氯-4-甲氧羰基苯硼酸、苯硼酸、2-氯-4-甲氧基苯硼酸、5-乙基呋喃-2-硼酸、3-甲基-4-氯苯硼酸、二苯代硼酸、4-(环丙基氨磺酰基)苯硼酸和5-甲基氧呋喃-2-硼酸中的至少一种。

在一个实施方式中，还包括在所述微生物生长的特定时间段内持续向所述培养基中加入蛋白酶稳定剂。

在一个实施方式中，所述蛋白酶稳定剂选自镁离子和钙离子中的至少一种。

在一个实施方式中，所述特定时间段持续时间为4h～48h，所述镁离子和所述钙离子中的至少一种在所述培养基中的终浓度为0.005mol/L～0.1mol/L。

在一个实施方式中，所述微生物为枯草芽胞杆菌，在培养基中发酵培养所述枯草芽胞杆菌35h～40h后开始向所述培养基中加入4-甲酰基苯基硼酸，所述4-甲酰基苯基硼酸在5h～20h的时间段内持续的加入至所述培养基中，所述4-甲酰基苯基硼酸在所述培养基中的终浓度为0.2g/L～0.6g/L，向所述培养基中加入所述4-甲酰基苯基硼酸的速率为0.01g/(L·h)～0.12g/(L·h)。

在一个实施方式中，还包括在所述微生物生长的特定时间段内持续向所述培养基中加入蛋白酶稳定剂，所述蛋白酶稳定剂选自镁离子和钙离子中的至少一种，所述镁离子和所述钙离子中的至少一种在所述培养基中的终浓度为0.0125mol/L～0.025mol/L。

在一个实施方式中，所述微生物为毕赤酵母，在培养基中发酵培养所述毕赤酵母30h～40h后开始向所述培养基中加入4-甲酰基苯基硼酸，所述4-甲酰基苯基硼酸在5h～20h的时间段内持续的加入至所述培养基中，所述4-甲酰基苯基硼酸在所述培养基中的终浓度为0.2g/L～0.6g/L，向所述培养基中加入所述4-甲酰基苯基硼酸的速率为0.01g/(L·h)～0.12g/(L·h)。

上述制备蛋白酶的方法，在微生物生长的对数期至稳定期的特定时间段内，持续向培养基中加入蛋白酶抑制剂，蛋白酶抑制剂能够有效抑制蛋白酶的自降解。并且发明人意外发现蛋白酶抑制剂在微生物生长的特定时间段内持续加入培养基中，并不会抑制发酵微生物的生长，极大的提升蛋白酶的产量。

另外，在微生物生长的特定时间段内持续向培养基中加入蛋白酶稳定剂，蛋白酶抑制剂与蛋白酶稳定剂配合，能够进一步的提升蛋白酶的产量。

附图说明

图1为一实施方式的制备蛋白酶的方法的流程图；

图2为实施例1中枯草芽胞杆菌SCK6的生长曲线示意图；

图3为实施例1中毕赤酵母GS115的生长曲线示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

请参阅图1，一实施方式的制备蛋白酶的方法包括如下步骤S110～S120。

S110、在培养基中发酵培养微生物，并在微生物生长的特定时间段内持续向培养基中加入蛋白酶抑制剂，特定时间段处于微生物生长的对数期至稳定期的时间段内。

具体的，本发明用来发酵培养微生物的培养基是指任何适合微生物生长的常规培养基，包括基本培养基和复合培养基。培养基的获得可以通过从商业供应商购买，或参考中国普通微生物菌种保藏中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，中国典型培养物保藏中心(China Centre for Type Culture Collection,CCTCC)，美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)，德国微生物与细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,DSMZ)等机构公布的制作方法，利用本领域已知的方法制备。

本发明的制备蛋白酶的方法可以在任何规模的蛋白酶工业发酵生产中使用，例如，可用于规模达到10L、100L、1000L、10000L、甚至100000L的发酵设备的生产。发酵培养的工艺可以采用批次、重复批次、补料批次和连续补料的发酵方法。在一个实施方案中，微生物采用枯草芽孢杆菌的发酵采用的是批次发酵的方法。在另一个实施方案中，微生物采用毕赤酵母的发酵采用的是补料批次发酵的方法。发酵培养的温度、pH等条件也可根据具体培养的微生物的特性进行选择，发酵培养还可以包括接种微生物、一级扩大培养、二级扩大培养等操作，按培养微生物的一般的方法操作即可，在此不作赘述。

具体的，微生物也称蛋白酶生产菌，微生物发酵培养后能够分泌产生蛋白酶。本发明中的微生物包含细菌和真菌。细菌蛋白酶生产菌主要为芽孢杆菌，芽孢杆菌的实例包含但不限定于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)。研究人员可以从培养物保藏机构获得上述菌株，比如中国普通微生物菌种保藏中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，中国典型培养物保藏中心(China Centre for Type Culture Collection,CCTCC)，美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)，德国微生物与细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,DSMZ)。

真菌蛋白酶生产菌主要为酵母，酵母的实例包含但不限定于球拟酵母(Torulopsis)细胞、克鲁维酵母(Kluyveromyces)细胞、多型汉逊酵母(Hansenula poIymorpha)细胞、假丝酵母(Candida)细胞、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)细胞和毕赤酵母(Pichia)细胞。研究人员可以从培养物保藏机构获得上述菌株,比如中国普通微生物菌种保藏中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，中国典型培养物保藏中心(China Centre for Type Culture Collection,CCTCC)，美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)，德国微生物与细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,DSMZ)。

具体的，发酵培养过程中根据微生物生长速率和比生长速率，将微生物的生长情况划分为不同的阶段。通过检测微生物在特定培养条件下生物量随时间的变化可以得到该条件下该微生物的生长曲线。生长曲线能够反应微生物生长的四个时期，延迟期、对数期、稳定期和衰亡期所应的具体时间，能够反映细胞活力随着时间变化的规律。需要注意的是，不同种类的微生物，不同的培养条件和培养策略都会使生长曲线发生改变。测定发酵过程中微生物的生物量可以通过检测发酵液在600nm波长处的吸光值，即OD₆₀₀的值；也可以通过检测发酵液中细胞的湿重。在一个实施方案中，微生物采用枯草芽孢杆菌的发酵检测的是OD₆₀₀的值。在另一个实施方案中，微生物采用毕赤酵母的发酵检测的是细胞湿重的值。

具体的，生长的对数期是指发酵过程中根据微生物生长速率和比生长速率，将微生物的生长情况划分为不同的阶段，其中当微生物生长达到比生长速率最大的阶段被称为对数生长期。

具体的，生长的稳定期是指发酵过程中根据微生物生长速率和比生长速率，将微生物的生长情况划分为不同的阶段，其中当微生物增长速度和死亡速度处于动态平衡的阶段被称为稳定期。

本实施方式中，可通过预实验确定在一定条件下培养的微生物的生长曲线，确定微生物生长的延迟期、对数期、稳定期和衰亡期所应的具体时间点，从而确定开始加入蛋白酶抑制剂的时间点以及加入的持续时间。具体的，在微生物生长的特定时间段内持续向培养基中加入蛋白酶抑制剂的操作中，特定时间段处于微生物生长的对数期至稳定期的时间段内。即从微生物开始对数期生长的时刻点至微生物结束稳定生长的时刻点之间的任意截取时间段作为特定时间段持续向培养基中加入蛋白酶抑制剂。更具体的，特定时间段处于微生物生长的对数期的末期至稳定期的前期的时间段内。

在一个实施方式中，特定时间段开始的时间处于微生物生长曲线的对数期。在另一个实施方式中，特定时间段开始的时间处于微生物生长曲线的稳定期。

在一个实施方式中，特定时间段持续时间为4h～48h，蛋白酶抑制剂在培养基中的终浓度为0.1g/L～5g/L，向培养基中加入所述蛋白酶抑制剂的速率为0.002g/(L·h)～1.25g/(L·h)。具体的，可将蛋白酶抑制剂配置成溶液状，蛋白酶抑制剂在特定的时间段内均匀的滴加到培养基中。在另一个实施方式中，特定时间段持续时间为5h～45h。在另一个实施方式中，特定时间段持续时间为10h～36h。在另一个实施方式中，特定时间段持续时间为15h～24h。蛋白酶抑制剂配置成溶液状能够均匀的滴加到培养基中。本发明人发现在微生物的对数生长期至稳定生长期持续加入蛋白酶抑制剂，能够有效抑制蛋白酶自降解，相比在同一时间一次性加入蛋白酶抑制剂能够明显获得更高的蛋白酶产量，并且不会抑制微生物的生长。

具体的，蛋白酶抑制剂是指能够与蛋白酶活性中心区域可逆或不可逆地结合，使蛋白酶活性下降或消失，但通常不会引起蛋白质变性的物质。本实施方式中，蛋白酶抑制剂为硼酸衍生物，硼酸衍生物可以通过竞争抑制的方式降低蛋白酶的活力。硼原子在元素周期表属第二周期，有机硼酸在正常条件下表现为sp2杂化形式，当与水分子作用时，水分子中氧原子的孤对电子将进入硼的空轨道，并释放一个质子，有机硼酸也由sp2变为sp3杂化形式。一般来说，不同取代的苯基硼酸，其酸性随取代基的不同变化较大，pKa值范围为4.5～8.8。在生理pH条件下，有机硼酸化合物易由sp2杂化变为sp3杂化的负离子形式，此结构与酶催化底物的四面体过渡态十分相似，因此有机硼酸类化合物可以作为酶抑制剂应用。1970年起，硼酸被发现具有抑制酶活性的特性，自此科学家们设计并合成了大量此类化合物，其中研究较多的是水解酶抑制剂(如蛋白酶抑制剂)和蛋白酶体抑制剂等。本发明所述蛋白酶抑制剂选自4-甲酰基苯基硼酸、N-2-吡嗪羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸硼酸、噻吩-3-硼酸、3-乙酰氨基苯基硼酸、N-酰基-肽基硼酸、4-甲基噻吩-2-硼酸、2-氟-5-(甲氧羰基)苯硼酸、5-乙基噻吩-2-硼酸、2-氟-4-(甲氧羰基)苯硼酸、5-溴噻吩-2-硼酸、4-(1-哌啶基甲基)苯硼酸、4-(1-吡咯烷基甲基)苯硼酸、二苯并噻吩基-1-硼酸、2-(甲氧羰基)-4-甲基苯硼酸、2,6-二氯-3-甲基苯硼酸、二苯并呋喃-4-硼酸、2-异丙氧基苯硼酸、2-氟-4-甲砜基苯硼酸、呋喃-2-硼酸、3-氟-4-甲砜基苯硼酸、1-Boc-7-甲氧基吲哚-2-硼酸、呋喃-3-硼酸、4-(1-哌啶基磺酰基)苯硼酸、3-乙酰氨基苯硼酸、3-甲氧基噻吩-2-硼酸、2-甲基-4-甲氧基苯硼酸、5-甲基-3-吡啶硼酸、5-正丙基噻-2-硼酸、10-苯基-9-蒽硼酸、3-溴噻吩硼酸、5-甲基-6-氟-3-吡啶硼酸、3-溴噻吩-4-硼酸、2,6-二氟-3-吡啶硼酸、4-甲酰基苯基硼酸、3-氯-4-甲氧羰基苯硼酸、苯硼酸、2-氯-4-甲氧基苯硼酸、5-乙基呋喃-2-硼酸、3-甲基-4-氯苯硼酸、二苯代硼酸、4-(环丙基氨磺酰基)苯硼酸和5-甲基氧呋喃-2-硼酸中的至少一种。

在一个实施方式中，蛋白酶抑制剂在培养基中的终浓度为0.1g/L～5g/L。

在另一个实施方式中，蛋白酶抑制剂在培养基中的终浓度为0.2g/L～2.5g/L。

在另一个实施方式中，蛋白酶抑制剂在培养基中的终浓度为0.4g/L～1.25g/L。

在另一个实施方式中，蛋白酶抑制剂在培养基中的终浓度为0.2g/L～0.6g/L。

具体的，根据蛋白酶抑制剂在培养基中的终浓度，以及持续加入的时间即可计算出对应的蛋白酶抑制剂的加入速率。

在一个实施方式中，微生物为芽孢杆菌，蛋白酶抑制剂为4-甲酰基苯基硼酸，蛋白酶抑制剂在培养基中的终浓度为0.2g/L～0.6g/L。4-甲酰基苯基硼酸可提高芽孢杆菌蛋白酶的产量。所述提高蛋白酶的产量例如可以是指加入蛋白酶抑制剂后的方案蛋白酶产量和不加入蛋白酶抑制剂的方案蛋白酶产量相差5％或以上。

在一个实施方式中，还包括在微生物生长的特定时间段内持续向所述培养基中加入蛋白酶稳定剂。蛋白酶稳定剂和蛋白酶抑制剂配合形成的组合物能够更加显著的提升蛋白酶的产量。

具体的，蛋白酶稳定剂是指有益于蛋白酶维持正常结构的物质，蛋白酶稳定剂可选自镁离子和钙离子中的至少一种。钙离子的来源例如可以是CaSO₄、CaCl₂、Ca(H₂PO₄)₂、CaHPO₄、Ca(HCO₃)₂、CaCO₃和Ca(NO₃)₂中的至少一种。镁离子的来源例如可以是MgSO₄、MgCl₂、Mg(H₂PO₄)₂、MgHPO₄、Mg(HCO₃)₂、MgCO₃、和Mg(NO₃)₂中的至少一种。

具体的，镁离子和钙离子中的至少一种在培养基中的终浓度为0.005mol/L～0.1mol/L。例如，镁离子和钙离子中的至少一种在培养基中的终浓度为0.075mol/L～0.05mol/L。或例如，镁离子和钙离子中的至少一种在培养基中的终浓度为0.01mol/L～0.025mol/L。

在一个实施方式中，可以单独加入镁离子作为蛋白酶稳定剂，镁离子在培养基中的终浓度为0.005mol/L～0.1mol/L。

在另一个实施方式中，可以单独加入钙离子作为蛋白酶稳定剂，钙离子在培养基中的终浓度为0.005mol/L～0.1mol/L。

在另一个实施方式中，同时加入镁离子和钙离子作为蛋白酶稳定剂，镁离子在培养基中的终浓度为0.005mol/L～0.1mol/L，钙离子在培养基中的终浓度为0.005mol/L～0.1mol/L。

具体的，蛋白酶抑制剂和蛋白酶稳定剂可混合后加入至培养基中，也可以是分别加入培养基中。本发明人发现利用微生物发酵生产蛋白酶时，在已经使用添加蛋白酶抑制剂的前提下，再加入钙盐和/或镁盐时，能够进一步提高蛋白酶的产量。具体的，所述提高蛋白酶的产量例如可以是是指采用钙盐或镁盐作为稳定剂的蛋白酶产量和不采用上述稳定剂的蛋白酶产量相差5％或以上。

在一个实施方式中，蛋白酶抑制剂和蛋白酶稳定剂形成的组合物加入至培养基中，组合物的加入量为1g/L～100g/L。组合物包含重量百分比含量为0.1％～10％的蛋白酶稳定剂和重量百分比含量为0.01％～10％的蛋白酶抑制剂。

在一个实施方式中，微生物为枯草芽胞杆菌，在培养基中发酵培养枯草芽胞杆菌35h～40h后开始向培养基中加入4-甲酰基苯基硼酸，4-甲酰基苯基硼酸在5h～20h的时间段内持续的加入至培养基中。4-甲酰基苯基硼酸在培养基中的终浓度为0.2g/L～0.6g/L。向培养基中加入4-甲酰基苯基硼酸的速率为0.01g/(L·h)～0.12g/(L·h)。发酵培养枯草芽胞杆菌35h～40h后，枯草芽胞杆菌处于对数期末期，此时开始向培养基中加入蛋白酶抑制剂，并在5h～20h的时间段内持续的加入至培养基中，4-甲酰基苯基硼酸可抑制蛋白酶的自降解。并且发明人意外发现在培养枯草芽胞杆菌35h～40h后的5h～20h时间段内持续的将的蛋白酶抑制剂加入至培养基中，并不会抑制枯草芽胞杆菌的生长，从而极大的提升蛋白酶的产量。

更具体的，还包括在发酵培养枯草芽胞杆菌35h～40h后加入蛋白酶稳定剂，蛋白酶稳定剂选自镁离子和钙离子中的至少一种，镁离子和钙离子中的至少一种在培养基中的终浓度为0.0125mol/L～0.025mol/L。4-甲酰基苯基硼酸与镁离子和/或钙离子配合，能够进一步抑制蛋白酶的自降解，提升蛋白酶的产量。

在另一个实施方式中，微生物为毕赤酵母，在培养基中发酵培养毕赤酵母30h～40h后开始向培养基中加入4-甲酰基苯基硼酸，4-甲酰基苯基硼酸在5h～20h的时间段内持续的加入至培养基中，4-甲酰基苯基硼酸在培养基中的终浓度为0.2g/L～0.6g/L。发酵培养毕赤酵母30h～40h后，毕赤酵母处于稳定期生长的开始阶段，此时开始向培养基中加入蛋白酶抑制剂，并在5h～20h的时间段内持续的加入至培养基中，4-甲酰基苯基硼酸可抑制蛋白酶的自降解。并且发明人意外发现在培养毕赤酵母30h～40h后的5h～20h时间段内持续的将的蛋白酶抑制剂加入至培养基中，并不会抑制毕赤酵母的生长，从而极大的提升蛋白酶的产量。

S120、S110中发酵培养的微生物分泌产生蛋白酶。

蛋白酶也称作蛋白质酶、蛋白水解酶、肽酶或者肽水解酶，是一类可以水解蛋白质或肽链的酶的总称。按照其水解的方式分为内肽酶和端肽酶两种。按照NC-IUBMB的命名方法，蛋白酶属于EC3.4酶族中的任何酶，共含有十三个亚种，基于它们的催化机制不同，分为丝氨酸蛋白酶(S)，半胱氨酸蛋白酶(C)，天冬蛋白酶(A)，金属蛋白酶(M)，和未知的或尚未分类的蛋白酶(U)，后来又有发现谷氨酸蛋白酶(G)和苏氨酸蛋白酶(T)，详细可参阅Handbook of Proteolytic Enaymes,Neil D.Rawlings and Guy Salvesen,Acadimic Press,2013。对于应用本发明生产的蛋白酶的起源没有限制，只要能够通过微生物分泌产生蛋白酶即可。因而，所述术语蛋白酶不仅包括来源于生物体的天然蛋白酶，还包括其它具有蛋白酶活性的任何突变体和片段或人工合成的蛋白酶。

具体的，发酵培养的微生物后得到发酵液，微生物分泌产生蛋白酶在发酵液中。本实施方式还包括对蛋白酶进行回收的步骤，本发明所涉及的一个方面是蛋白酶的回收，即为发酵下游处理工艺。例如可以是通过絮凝剂(包括化学絮凝剂和生物絮凝剂)预处理发酵液；通过过滤或离心将发酵中的细胞和残余营养底物除去；通过蒸发或超滤浓缩酶制剂，加入稳定体系使蛋白酶保存。

得到蛋白酶后，还包括对蛋白酶活力测定。本发明可以采用任何测定方法对回收的蛋白酶进行活力的测定，例如可以采用一种或多种底物测定，该底物包含蛋白酶特异性相关的肽键，测定方法的温度和pH值采用适合该蛋白酶的温度和pH值。通过对回收的蛋白酶进行活力的测定可以确定发酵的产量，从而评价制备蛋白酶的方法的产量等。

上述制备蛋白酶的方法在微生物生长的对数期至稳定期的特定时间段内，持续向培养基中加入蛋白酶抑制剂，蛋白酶抑制剂能够有效抑制蛋白酶的自降解。并且发明人意外发现蛋白酶抑制剂在微生物生长的特定时间段内持续加入培养基中，并不会抑制发酵微生物的生长，极大的提升蛋白酶的产量。上述制备蛋白酶的方法能够有效解决蛋白酶自降解导致蛋白酶的产量下降的技术问题，实现蛋白酶大批量的工业化生产。

另外，在微生物生长的特定时间段内持续向培养基中加入蛋白酶稳定剂，蛋白酶抑制剂与蛋白酶稳定剂配合，能够进一步的提升蛋白酶的产量。

以下为具体实施例。

除非另外指明，配制溶液和测试活性等实验均在25℃左右的环境进行。

以下实施例中微生物分泌产生蛋白酶的活力通过下述方法测定。

1、溶液配制：

(1)Tris缓冲液的制备：制备规格为0.1M/L的Tris；0.01mol/L的CaCl₂；0.005％的TritonX-100，pH为8.6的缓冲液。具体为称量12.1g的Tris base并溶于800mL蒸馏水中，在溶液中加入1.1g的CaCl₂和50mg的TritonX-100混合均匀，再用6mol/L的HCl调节pH至8.6(市售浓盐酸浓度一般为12mol/L，稀释后使用)，用蒸馏水定容至1000mL，尽量现配现用。

(2)储存底物溶液的准备：制备规格为20mg/mL的合成肽N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide(SIGMA S7388)，以DMSO为溶剂。在9mL的DMSO中加入180mg底物，混合溶解，装入离心管中并用锡箔纸包裹，置于阴凉避光处，一个月后未用完遗弃。

(3)工作底物溶液：制备规格为1mg/mL的合成肽N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide，用Tris缓冲液将储存底物稀释20倍，根据需要现用现配，遗弃未用完的多余底物。

(4)蛋白酶液的配置(包括对照组)：将待测的蛋白酶液第一步稀释约250倍，然后第二步稀释约125倍，对于待测蛋白酶液可以先测最终稀释液的酶活，如果与对照差距较大，再测定第一步稀释获得的酶液。具体为精确称取蛋白酶液0.1±0.05g(精确到0.1mg)于5mL离心管中，再用0.1M的Tris缓冲液溶解至25g，搅拌5分钟，再精确称取0.2±0.05g储备液于另一个50mL离心管中，再用0.1M的Tris缓冲液溶解至25g，搅拌5min。

2、使用酶标仪高通量测定蛋白酶活力：

单个反应体系总体积为200μL，将每一个待测的180μL蛋白酶液分别加入到96孔板中，将装有样品的96孔板放置于酶标仪的样品仓，程序设定为37℃下保温5min，自动打开舱门，此时使用排枪将20μL工作底物，加入到每一个装有样品的孔中，快速震荡20s混匀体系，通过测定释放出的对硝基苯胺的速率(OD₄₀₅)获得反应动力学数据。最后得出的待测酶的反应速率与对照酶反应速率进行比值计算，算出酶活力。

实施例1

枯草芽胞杆菌SCK6发酵生产制备蛋白酶

1、配制培养基：

(1)、一级斜面种子培养基(100mL)：琼脂粉1.5g；葡萄糖5g；玉米浆粉1g；酵母粉1.5g；大豆蛋白0.75g；(NH₄)₂SO₄ 1.5g；MgSO₄·7H₂0 0.4g；K₂HPO₄ 0.2g；MnSO₄ 0.001g；FeSO₄ 0.001g；CaCl₂ 0.2g；补充水至100mL，加热后每试管中分装8mL，高压蒸汽灭菌后微倾斜冷却凝固后待用。

(2)、二级液体种子培养基(100mL)：葡萄糖5g；玉米浆粉1g；酵母粉1.5g；大豆蛋白0.75g；(NH₄)₂SO₄ 1.5g；MgSO₄·7H₂0 0.4g；K₂HPO₄ 0.2g；MnSO₄ 0.001g；FeSO₄ 0.001g；CaCl₂ 0.2g；高压蒸汽灭菌后待用。

(3)、三级液体种子培养基：与二级液体种子培养基相同。

(4)、发酵培养基(1L)：玉米淀粉100g；大麦粉40g；大豆水解液30g；大豆蛋白10g；MgSO₄·7H₂0 4g；Na₂HPO₄ 5g；MnSO₄ 0.01g；FeSO₄ 0.01g，配制后加入1gα-淀粉酶煮沸并搅拌至淀粉液化，装至发酵罐中进行原位灭菌。

2、接种培养

(1)、培养一级斜面种子：

冰上融化-80℃保藏的菌种SCK6，用接种环沾取一环均匀涂布于斜面培养基上，置于37℃培养箱中，培养16h。

(2)、培养二级液体种子：

用接种环刮下斜面培养基上生长的菌体，接入1000mL装有液体种子培养基的锥形瓶中，装液量为100mL，置于旋转震荡摇床，转速200rpm，温度37℃，培养12h开始测定细胞生长浓度，培养至OD₆₀₀＝0.7-0.9时收获种子。

(3)、培养三级液体种子

将二级种子以10％的接种量接入5个2000mL装有液体种子培养基的锥形瓶中，装液量为200mL，置于旋转震荡摇床，转速200rpm，温度37℃，培养12h后开始分别测定细胞生长浓度，培养至OD₆₀₀＝0.7-0.9时收获种子。

(4)、枯草芽胞杆菌SCK6发酵培养分泌产生蛋白酶

将三级种子以6％的接种量接入10L发酵罐，装液量为7L，通气量控制为0.8Nm³/h，消泡剂加入控制为自动，罐体压力保持为0.02MPa，发酵温度为35℃，培养时间持续60h，每2h通过取样管收取样品10mL。

溶氧水平控制：设定为自动控制，范围为25％～45％，通过搅拌速度的变化进行调节。

搅拌速度：设置为与溶氧联动，调节范围为100rpm～900rpm。

根据枯草芽胞杆菌SCK6在此条件下生物量随时间的变化，绘制其生长曲线如图2所示，得到其发酵生产中延迟期、对数期、稳定期和衰亡期所对应的时间，据此确定发酵开始后10h、20h、35h和40h分别作为加入蛋白酶抑制剂的开始时间，本实施例中蛋白酶抑制剂为4-甲酰基苯基硼酸。并同时记录不加入蛋白酶抑制剂时的产量。

加入蛋白酶抑制剂4-甲酰基苯基硼酸的策略如下表1所示，每一策略进行一个批次的芽孢杆菌发酵生产蛋白酶实验，比对不同策略下获得的最高酶活力及其与不加入蛋白酶抑制剂的发酵蛋白酶的酶活力的比值：

表1：不同的蛋白酶抑制剂添加策略与不添加的蛋白酶产量对比

其中，*发酵液＝FB(Fermentation broth)，加入开始时间表示培养微生物多少小时后的时间点，持续时间表示在该特定时间段内持续均匀的向培养基中加入蛋白酶抑制剂。终浓度(g/L)表示4-甲酰基苯基硼酸在培养基中的终浓度。产量通过上述蛋白酶活力的方法测定。酶活比为对应的批次的产量除以第0批次的产量。

表1中1～36批次的发酵生产实验结果显示，批次22、23、24、25、26、27、31、32、33、34、35和36获得较高酶产量，且显著高于未加蛋白酶抑制剂的对照批次0，说明在芽孢杆菌SCK6在对数生产期后期和稳定期即发酵培养35h和40h时后，持续5h～20h加入蛋白酶抑制剂至终浓度为0.2g/L～0.6g/L时，能够显著提升发酵生产蛋白酶的产量。

分别对表1中1～36批次的发酵生产实验均采集发酵时间为0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、30h、35h、40h、60h、80h和100h的发酵液测定OD₆₀₀的值，并均绘制生长曲线，得到批次22、23、24、25、26、27、31、32、33、34、35和36生长曲线结果均与图2一致，说明在枯草芽胞杆菌SCK6生长的特定时间段内持续均匀的向培养基中加入4-甲酰基苯基硼酸不会对枯草芽胞杆菌SCK6的生长产生影响。

实施例2

毕赤酵母GS115发酵生产制备蛋白酶

1、配制培养基：

(1)、毕赤酵母通用微量元素(PTM1)储液(100mL)：FeSO₄·7H₂O，6.5g；ZnCl₂，2.0g；CuSO₄·5H₂O，0.6g；MnSO₄·H2O，0.3g；CoCl₂，0.05g；生物素，0.03g；Na₂MoO₄·2H₂O，0.02g；NaI，0.008g；H₃BO₃，0.002g；浓H₂SO₄(98％，m/v)，0.5mL。

(2)、毕赤酵母通用微量元素(PTM4)储液(100mL)：FeSO₄·7H₂O，2.2g；ZnCl₂，0.7g；MnSO₄·H₂O，0.3g；CuSO₄·5H₂O，0.2g；CoCl₂，0.05g；CaSO₄·2H₂O，0.05g；生物素，0.02g；Na₂MoO₄·2H₂O，0.02g；NaI，0.008g；H₃BO₃，0.002g；以上物质配制溶解均匀后，小心加入浓H₂SO₄(98％，m/v)，0.1mL。

(3)、YPD培养基(90mL)：酵母提取物1g，蛋白胨2g。

高压蒸汽灭菌后加入10mL含有2g葡萄糖的过滤除菌溶液。

(4)、FM22培养基(100mL)：KH₂PO₄，4.3g；(NH₄)₂SO₄，0.5g；CaSO₄·2H₂O，0.1g；K₂SO₄，1.5g；MgSO₄·7H₂O，1.2g；甘油，4g和0.25mL的PTM4储液

(5)、发酵罐甘油补料培养基(100mL)：甘油50g，PTM1毕赤酵母通用微量元素储液1.2mL。

(6)、发酵罐甲醛补料培养基(100mL)：甲醇98.8mL，PTM1毕赤酵母通用微量元素储液1.2mL。

2、接种培养

(1)生产菌种的活化：将超低温磁珠保存的保存毕赤酵母GS115蛋白酶生产菌接种到10mL的含有26μg/mL博莱霉素抗性的YPD培养基中活化至OD₆₀₀＝3.5，

(2)培养种子：将新鲜的活化培养液以3％的量接入375mL种子培养基YPD中，置于卧式摇床29℃培养20-24h检测OD₆₀₀至达到4-5后停止培养。

(3)发酵生产蛋白酶

以FM22培养基作为发酵培养基，在10L发酵罐中初始装液量为3.75L，原位灭菌后，将收获的种子培养液375mL接入发酵罐，发酵过程中溶氧控制在15-45％，通气量为1.0Nm³/h，搅拌速度设定自动调节并与溶氧设置联动，变化范围为100-900rpm，菌体生长阶段的温度设定为28℃，进入诱导阶段后温度设定为26℃，保持pH恒定为5.5，正常情况下仅需要碱性溶液调节，补碱采用自动加入氨水，消泡设置采用自动加入消泡剂，检测碳源耗尽时，加入400mL发酵罐甘油补料培养基。

待发酵罐溶氧显示开始上升至15％以上时，加入甲醛补料培养基，加入量为使发酵罐终浓度约为0.5％(v/v)，然后开始以6mL/h～14mL/h的速度流加甲醛补料培养基8h；此后根据溶氧的变化控制甲醛补料培养基的加入速度，使溶氧保持在15％～45％之间，通常，流加的速度为3mL/L/h～10mL/L/h，直至发酵结束，发酵过程中需要定期取样，测定酵母的生物量，发酵上清液蛋白酶活力和蛋白质的含量。

根据毕赤酵母在此条件下生物量随时间的变化，绘制其生长曲线如图3所示，得到其发酵生产中延迟期、对数期、稳定期和衰亡期所对应的时间，确定发酵开始后10h、20h、30h和40h分别为加入蛋白酶抑制剂的开始时间，本实施例中蛋白酶抑制剂为4-甲酰基苯基硼酸。并同时记录不加入蛋白酶抑制剂时的产量。

加入蛋白酶抑制剂4-甲酰基苯基硼酸的策略显示于下表2，每一策略进行一个批次的毕赤酵母发酵生产蛋白酶发酵实验，比对不同策略下获得的最高酶活力及其与不加入蛋白酶抑制剂的发酵蛋白酶的酶活力的比值：

表2不同的蛋白酶抑制剂添加策略与不添加的蛋白酶产量对比

*发酵液＝FB(Fermentation broth)，加入开始时间表示培养微生物多少小时后的时间点，持续时间表示在该特定时间段内持续均匀的向培养基中加入蛋白酶抑制剂。终浓度(g/L)表示4-甲酰基苯基硼酸在培养基中的终浓度。产量通过上述蛋白酶活力的方法测定。酶活比为对应的批次的产量除以第0批次的产量。

表2中1～36批次的发酵生产实验结果显示，批次22、23、24、25、26、27、31、32、33、34、35和36获得较高酶产量，且显著高于未加蛋白酶抑制剂的对照批次0，说明在毕赤酵母GS115对数生产期后期和稳定期即发酵开始30h和40h时，持续5h～20h加入蛋白酶抑制剂至终浓度为0.2g/L～0.6g/L时，能够提升发酵生产蛋白酶的产量。

表2中1～36批次的发酵生产实验均采集发酵时间为0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、30h、40h、60h、80h、100h、120h和140h的发酵液测定细胞湿重的值，并均绘制生长曲线，得到批次22、23、24、25、26、27、31、32、33、34、35和36生长曲线结果均与图3一致，说明在毕赤酵母GS115生长的特定时间段内持续均匀的向培养基中加入4-甲酰基苯基硼酸不会对毕赤酵母GS115的生长产生影响。

实施例3

加入蛋白酶抑制剂提升蛋白酶的产量

芽孢杆菌发酵所用的生产菌株和发酵生产条件与实施例1中相同。

蛋白酶抑制剂添加种类见表3，每一种蛋白酶抑制剂进行一个批次的发酵实验，添加策略为发酵进行40h后，开始向发酵液中添加蛋白酶抑制剂，持续20h各蛋白酶抑制剂的最终浓度为0.4g/L，对应的发酵酶产量结果以及与未添加蛋白酶抑制剂的发酵实验产酶量(对照)的比值结果显示于下表3

表3添加蛋白酶抑制剂与不添加蛋白酶抑制剂的蛋白酶产量对比

表3的结果显示，在枯草芽孢杆菌发酵进行40h时开始添加表3所示的蛋白酶抑制剂，持续匀速添加20h，使各蛋白酶抑制剂终浓度达到0.4g/L后，均能够提升蛋白酶的产量。

实施例4

加入蛋白酶抑制剂和蛋白酶稳定剂组合物对芽孢杆菌发酵生产蛋白酶的产量的影响

芽孢杆菌发酵所用的生产菌株和发酵生产条件与实施例1中相同。

组合物添加策略为发酵进行40h后，开始添加蛋白酶抑制剂和稳定剂的组合物，持续匀速添加20h，各组合物的最终浓度和和对应的发酵酶产量结果显示于下表4：

表4添加蛋白酶抑制剂和稳定剂组合物与不添加的蛋白酶产量对比

从以上表4显示的结果可以看出，添加蛋白酶抑制剂、钙盐和/或镁盐的组合物能够显著提高芽孢杆菌SCK6发酵蛋白酶的产量，而仅添加钙盐和/或镁盐对酶的产量的影响不显著。

实施例5

加入蛋白酶抑制剂和蛋白酶稳定剂组合物对毕赤酵母GS115发酵生产蛋白酶的产量的影响

毕赤酵母发酵所用的生产菌株和发酵生产条件与实施例2中相同。

组合物添加策略为发酵进行30h后，开始添加蛋白酶抑制剂和稳定剂的组合物，持续匀速20h，各组合物的最终浓度和和对应的发酵酶产量结果显示于下

表5：添加蛋白酶抑制剂和稳定剂组合物与不添加的蛋白酶产量对比

从以上表5显示的结果可以看出，添加蛋白酶抑制剂、钙盐和/或镁盐的组合物能够显著提高毕赤酵母GS115发酵蛋白酶的产量，实验结果同样显示仅添加钙盐和/或镁盐对毕赤酵母产酶的量影响不显著。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。