本发明涉及蛋白酶提取技术领域，具体是一种菠萝蛋白酶的提取方法。
背景技术：
菠萝蛋白酶(bromelain，EC3.4.22.33)是存在于菠萝植株（包括果、茎、柄和叶片）中的蛋白水解酶，有多个同工酶，其活性中心含有巯基（－SH），所以属巯基蛋白酶。菠萝蛋白酶广泛用于医药、食品、化妆品、纺织、饲料、皮革等行业。它能分解纤维蛋白、血红蛋白等蛋白质，能在副作用较小的情况下使纤维蛋白和血凝块溶解，进而改善体液循环，增加组织通透性，导致炎症、水肿消退 ；与抗生素、化疗药物合用可促进药物对病灶的渗透和扩散，从而增强疗效。
蛋白质的提取纯化方法主要有盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、单宁 ( 鞣酸 ) 沉淀、离子交换层析、亲和层析、超滤浓缩等方法。菠萝蛋白酶的生产工艺主要有硫酸铵沉淀法、单宁沉淀法、超滤法等，这些方法都有其缺点 ：硫酸铵沉淀法需要使用大量的硫酸铵，环境污染严重；单宁沉淀法所得的酶制剂难溶于水，酶活力低；超滤法所需设备投资大，菠萝汁超滤浓缩过程中黏度逐渐加大，超滤膜极易堵塞，因此生产周期长，提取收率低。
现有技术如授权公告号为CN103305492B的中国发明专利，公开了一种菠萝蛋白酶的制造方法，特别是一种高纯度医药级菠萝蛋白酶的提取方法。它包括以下步骤 ：菠萝预处理、粗粉碎、酶解、榨汁、过滤、添加辅料、精过滤、添加稳定剂、吸附剂吸附、洗脱、超滤、冷冻干燥获得成品。该方法的优点在于：利用纤维素吸附法替换传统菠萝蛋白酶提取中高岭土吸附法、单宁沉淀法、有机溶剂萃取法，产率高、工艺简单、能耗低，所生产的菠萝蛋白酶酶活力、细菌含量、重金属含量、外观等指标达到或超过医药级标准。此外，吸附纤维素经洗脱再生后可以重复使用，能够极大的降低生产成本。但采用纤维素吸附，菠萝蛋白酶的提取率低，损失率高。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种提取率高、不采用有机溶剂，绿色环保，提取的菠萝蛋白酶纯度高，酶活力强，细菌和重金属含量很少的菠萝蛋白酶的提取方法。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：
一种菠萝蛋白酶的提取方法，具体步骤为：
1）预处理：将新鲜菠萝或菠萝茎清洗，预冷处理，预冷处理的温度为0~2℃，预冷时间为21~25h。粉碎，榨汁。将菠萝或菠萝茎先进行预冷处理，能减少菠萝蛋白酶酶活力损失；
2）酶解：在带有果肉的菠萝汁中加入蒸馏水、木质素酶和稳定剂，带有果肉的菠萝汁：蒸馏水质量比为1:6~10。木质素酶加入量为0.2~0.4%，稳定剂的加入量为0.004~0.007%，pH为3.5~4.2，温度为38~43℃，酶解时间为3~3.4h，酶解结束后沸水浴灭酶，调节pH，加入0.3~0.5%纤维素酶和0.1~0.2%果胶酶，酶解温度为53~56℃，pH为2.7~3.2，酶解时间为2.0~2.3h。酶解结束后沸水浴灭酶，过滤。木质素酶将木质素水解，菠萝细胞失去支持，分散开来，增大与酶液的接触面积；纤维素酶破坏菠萝细胞的细胞壁，使菠萝细胞质流出；果胶酶继续酶解细胞质，使菠萝蛋白酶分散在水溶液中，增大菠萝蛋白酶的提取率；
3）等电点沉淀：调节滤液pH值为9.5~9.6，搅拌，静置，过滤。pH为9.5~9.6时菠萝蛋白酶呈电中性，在水中的溶解度急剧下降，对菠萝蛋白酶作初步分离纯化；
4）超滤：沉淀中加入蒸馏水，超滤，先用6~8kDa的超滤膜超滤，取滤过液，再用0.9~1.2kDa的超滤膜超滤，取滞留液。先后去除分子量大于6~8kDa、分子量小于0.9~1.2kDa的杂质；对菠萝蛋白酶溶液去盐浓缩，减短干燥时间，节省能源；
5）干燥保存：将滞留液旋蒸浓缩，于-40~-50℃冷冻干燥，研磨，加入稳定剂，稳定剂：菠萝蛋白酶粉末体积比为1:300~400，搅拌，得到菠萝蛋白酶。最后得到的菠萝蛋白酶的酶活力、细菌含量、重金属含量、外观等指标达到或超过医药级标准。
优选的，稳定剂成份及其重量份为：110~20份B-1稳定剂、0.004~0.005份茄红素、2~5份EDTA、0.002~0.005份偏亚硫酸和0.001~0.003份叶酸。巯基、氨基、色氨酸残基和组氨酸残基是菠萝蛋白酶催化活性必需基团。酶分子的构象和催化部位的微环境的变化均影响酶的催化活力。上述稳定剂对菠萝蛋白酶有包埋作用，隔离氧和水，同时和蛋白质形成氢键。由于隔离了氧，能防止巯基被氧化，形成的氢键增强了酶分子构象的稳定性；蛋白质相互作用区域隔离了水，降低了自由能，使酶的贮藏稳定性得到了显著的提高；具有较好的抗氧化性，清除自由基，保护巯基；叶酸和茄红素通过偏亚硫酸、EDTA起到促进对重金属的络合作用，防止重金属抑制菠萝蛋白酶的活性。
优选的，用氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸氢钾中的一种或多种调节溶液pH。不会引入重金属或其他会抑制菠萝蛋白酶活性的物质，调节pH效果好。
与现有技术相比，本发明的优点在于：将菠萝或菠萝茎先进行预冷处理，能减少菠萝蛋白酶酶活力损失；木质素酶将木质素水解，菠萝细胞失去支持，分散开来，增大与酶液的接触面积；纤维素酶破坏菠萝细胞的细胞壁，使菠萝细胞质流出；果胶酶继续酶解细胞质，使菠萝蛋白酶分散在水溶液中，增大菠萝蛋白酶的提取率；采用的稳定剂对菠萝蛋白酶有包埋作用，隔离氧和水，同时和蛋白质形成氢键。由于隔离了氧，能防止巯基被氧化，形成的氢键增强了酶分子构象的稳定性；蛋白质相互作用区域隔离了水，降低了自由能，使酶的贮藏稳定性得到了显著的提高；具有较好的抗氧化性，清除自由基，保护巯基；对重金属具有络合作用，防止重金属抑制菠萝蛋白酶的活性；最后得到的菠萝蛋白酶的酶活力、细菌含量、重金属含量、外观等指标达到或超过医药级标准；操作步骤简单，成本低廉，适合大规模生产。
具体实施例
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种菠萝蛋白酶的提取方法，具体步骤为：
1）预处理：将新鲜菠萝或菠萝茎清洗，预冷处理，预冷处理的温度为0~2℃，预冷时间为21~25h。粉碎，榨汁。将菠萝或菠萝茎先进行预冷处理，能减少菠萝蛋白酶酶活力损失；
2）酶解：在带有果肉的菠萝汁中加入蒸馏水、木质素酶和稳定剂，带有果肉的菠萝汁：蒸馏水质量比为1:6~10。木质素酶加入量为0.2~0.4%，稳定剂的加入量为0.004~0.007%，pH为3.5~4.2，温度为38~43℃，酶解时间为3~3.4h，酶解结束后沸水浴灭酶，调节pH，加入0.3~0.5%纤维素酶和0.1~0.2%果胶酶，酶解温度为53~56℃，pH为2.7~3.2，酶解时间为2.0~2.3h。酶解结束后沸水浴灭酶，过滤。木质素酶将木质素水解，菠萝细胞失去支持，分散开来，增大与酶液的接触面积；纤维素酶破坏菠萝细胞的细胞壁，使菠萝细胞质流出；果胶酶继续酶解细胞质，使菠萝蛋白酶分散在水溶液中，增大菠萝蛋白酶的提取率；
3）等电点沉淀：调节滤液pH值为9.5~9.6，搅拌，静置，过滤。pH为9.5~9.6时菠萝蛋白酶呈电中性，在水中的溶解度急剧下降，对菠萝蛋白酶作初步分离纯化；
4）超滤：沉淀中加入蒸馏水，超滤，先用6~8kDa的超滤膜超滤，取滤过液，再用0.9~1.2kDa的超滤膜超滤，取滞留液。先后去除分子量大于6~8kDa、分子量小于0.9~1.2kDa的杂质；对菠萝蛋白酶溶液去盐浓缩，减短干燥时间，节省能源；
5）干燥保存：将滞留液旋蒸浓缩，于-40~-50℃冷冻干燥，研磨，加入稳定剂，稳定剂：菠萝蛋白酶粉末体积比为1:300~400，搅拌，得到菠萝蛋白酶。最后得到的菠萝蛋白酶的酶活力、细菌含量、重金属含量、外观等指标达到或超过医药级标准。
稳定剂成份及其重量份为：10~20份B-1稳定剂、0.004~00005份茄红素、2~5份EDTA、0.002~0.005份偏亚硫酸和0.001~0.003份叶酸。巯基、氨基、色氨酸残基和组氨酸残基是菠萝蛋白酶催化活性必需基团。酶分子的构象和催化部位的微环境的变化均影响酶的催化活力。上述稳定剂对菠萝蛋白酶有包埋作用，隔离氧和水，同时和蛋白质形成氢键。由于隔离了氧，能防止巯基被氧化，形成的氢键增强了酶分子构象的稳定性；蛋白质相互作用区域隔离了水，降低了自由能，使酶的贮藏稳定性得到了显著的提高；具有较好的抗氧化性，清除自由基，保护巯基；对重金属具有络合作用，防止重金属抑制菠萝蛋白酶的活性，以上实验数据呈非线性，所产生的优异效果其结果有待验证。
用氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸氢钾中的一种或多种调节溶液pH。不会引入重金属或其他会抑制菠萝蛋白酶活性的物质，调节pH效果好。
实施例2：
一种菠萝蛋白酶的提取方法，最优选步骤为：
1）预处理：将10kg新鲜菠萝或菠萝茎清洗，预冷处理，预冷处理的温度为1℃，预冷时间为22h。粉碎，榨汁。将菠萝或菠萝茎先进行预冷处理，能减少菠萝蛋白酶酶活力损失；
2）酶解：在带有果肉的菠萝汁中加入蒸馏水、木质素酶和稳定剂，带有果肉的菠萝汁：蒸馏水质量比为1:7。木质素酶加入量为0.4%，稳定剂的加入量为0.006%，pH为4.0，温度为40℃，酶解时间为3.4h，酶解结束后沸水浴8min灭酶，调节pH，加入0.5%纤维素酶和0.1%果胶酶，酶解温度为55℃，pH为3.0，酶解时间为2.2h。酶解结束后沸水浴8min灭酶，过滤。木质素酶将木质素水解，菠萝细胞失去支持，分散开来，增大与酶液的接触面积；纤维素酶破坏菠萝细胞的细胞壁，使菠萝细胞质流出；果胶酶继续酶解细胞质，使菠萝蛋白酶分散在水溶液中，增大菠萝蛋白酶的提取率；
3）等电点沉淀：用1M氢氧化钠调节滤液pH值为9.55，搅拌，静置，过滤。pH为9.55时菠萝蛋白酶呈电中性，在水中的溶解度急剧下降，对菠萝蛋白酶作初步分离纯化；
4）超滤：沉淀中加入蒸馏水，超滤，先用7kDa的超滤膜超滤，取滤过液，再用1kDa的超滤膜超滤，取滞留液。先后去除分子量大于7kDa、分子量小于1kDa的杂质；对菠萝蛋白酶溶液去盐浓缩，减短干燥时间，节省能源；
5）干燥保存：将滞留液旋蒸浓缩，于-46℃冷冻干燥，研磨，加入稳定剂，稳定剂：菠萝蛋白酶粉末体积比为1:320，搅拌，得到菠萝蛋白酶。最后得到的菠萝蛋白酶的酶活力、细菌含量、重金属含量、外观等指标达到或超过医药级标准。
稳定剂成份及其最优选重量份为：12份B-1稳定剂、0.004份茄红素、3份EDTA、0.003份偏亚硫酸和0.002份叶酸。巯基、氨基、色氨酸残基和组氨酸残基是菠萝蛋白酶催化活性必需基团。酶分子的构象和催化部位的微环境的变化均影响酶的催化活力。上述稳定剂对菠萝蛋白酶有包埋作用，隔离氧和水，同时和蛋白质形成氢键。由于隔离了氧，能防止巯基被氧化，形成的氢键增强了酶分子构象的稳定性；蛋白质相互作用区域隔离了水，降低了自由能，使酶的贮藏稳定性得到了显著的提高；具有较好的抗氧化性，清除自由基，保护巯基；对重金属具有络合作用，防止重金属抑制菠萝蛋白酶的活性。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。