一种具有光致电子转移效应的pH荧光分子探针的制备方法及应用与流程

一种具有光致电子转移效应的ph荧光分子探针的制备方法及应用
技术领域
1.本发明属于分析化学技术领域，涉及一种具有光致电子转移效应的ph荧光分子探针的制备方法及应用。


背景技术：

2.细胞增殖、凋亡、自噬和酶活性等生理活动与人体细胞内的ph值紧密相关。正常情况下，细胞内ph值通常在6.8-7.4之间，酸性环境可以激活酶功能和蛋白质降解。如在真核细胞中，酸性细胞器包括溶酶体（ph 4.5-5.5）和内质体（ph 4.5-6.8）含有多种酶和分泌蛋白，会表现出多种活性和功能。而ph值的改变会通过间隙连接和信号通路的变化影响到突触传递、神经元兴奋性和细胞间耦合等神经系统活动。研究表明，细胞内ph值异常会引发炎症、神经退行性疾病和癌症等疾病。因此，开发一种灵敏度高、特异性强的检测方法，以实现生物体内ph值的检测，具有非常重要的意义。
3.目前，包括电化学法、原子吸收光谱法、气相色谱法等多种传统检测方法均已用于ph的检测和分析，具有测定准确等优势。然而这些技术一般需要复杂的样品前处理步骤以及高成本的实验仪器或机械损伤，且无法进行实时监测，因此不适用于细胞内中h
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的检测。与这些方法相比，基于荧光探针的荧光检测法则具有灵敏度高、特异性强、细胞膜透过性好、细胞毒性低、不会破坏样品及可实现实时监测等特点，近年来已成为研究热点。其中，小分子荧光探针以其化学结构易于修饰、发射颜色易于调节等诸多优势被广泛应用于h
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的检测中。
4.105548097 b报道了基于喹哪啶衍生物的荧光分子探针，它可用于活细胞中极端ph值的检测。探针本身无荧光，在ph为2~ 4的乙腈溶液中，探针呈现绿色荧光，且随着ph值的增大，绿色荧光逐渐减弱；而在ph为10~12的乙腈溶液中，则呈现红色荧光，且随ph值的增大，细胞的红色荧光增强。但该探针在ph为5~9的乙腈溶液中，则没有任何荧光，无法进行检测，因此该探针无法用于活细胞中ph的实时检测响应。cn 108752275 a公开了一个基于菲并咪唑-荧光素的ph荧光探针，该探针中与亚胺基团相邻的羟基与亚胺基团形成分子内氢键，从而具有激发态分子内电子转移（excited state intramolecular proton transfer，esipt）效应，而随着ph变化，分子内电子转移被破坏，esipt效应被抑制，从而产生荧光变化。但该探针仅能实现ph在6.5-8.0范围内的定量检测，检测范围窄，且合成步骤复杂，在实际应用中具有一定局限性。可见，开发一个具有合成简单、检测范围宽、灵敏度高、特异性强，可实现生理状态下ph实时监测的荧光分子探针，具有非常重要的意义。


技术实现要素：

5.针对现有ph荧光分子探针存在的不足，本发明的目的在于提供合成简单、检测范围宽、灵敏度高、特异性强，可实现生理状态下ph实时监测的荧光分子探针本发明的第二个目的在于提供上述荧光分子探针的高效制备方法。
6.本发明的第三个目的在于提供上述荧光分子探针在水溶液中h
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的检测应用。
7.为了实现上述目的，本发明提供了一种荧光分子探针，具有式i结构：式i所述荧光探针的制备方法优选为：以4-溴-1,8-萘二甲酸酐、邻二苯胺为原料，在四氢呋喃溶液中加热回流，反应完成后，抽滤、收集并用四氢呋喃溶液洗涤滤饼，可得化合物1。将其溶解于乙二醇单甲醚溶液中，并加入n-羟乙基哌嗪回流反应，反应完全后硅胶柱层析纯化，即可得到目标分子探针。
8.本发明的合成如下所示：本发明提供了一种所述荧光探针的应用，可应用于环境中ph的定量检测，检测原理为：由于光致电子转移效应(photo-induced electron transfer，pet)，探针本身荧光很弱，在酸性ph溶液下，pet效应被抑制，使得探针在523 nm处荧光显著增强，最终实现了对h
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的定量检测。
9.检测机理如下所示：
相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：本发明所涉及的一种检测溶液中生理状态ph的荧光分子探针，具有以下优势：（1）本发明的荧光探针2步即可合成，具有合成工艺简单、收率高、纯度高、成本低廉等优点；（2）本发明的荧光探针具有对h
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响应快、灵敏度高，可在ph=3.0~8.0范围内实现定量检测；（3）本发明的荧光探针具有响应快速、特异性高的优点，能够避免其他金属离子和相关氨基酸的干扰，有利于环境中h
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的快速检测，在环境科学领域具有较强的实际应用价值。
附图说明
10.【图1】本发明实施中荧光探针的荧光强度随h
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浓度变化的发射光谱图；【图2】本发明实施中荧光探针对h
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的选择性图。
具体实施方式
11.以下实施方式旨在进一步阐释说明本发明而不是对本发明的限定。
12.实施例1化合物1的合成称取4-溴-1,8-萘二甲酸酐（554 mg，2.0mmol）加入10ml四氢呋喃溶液中，加入邻苯二胺（217 mg，2.0mmol）回流反应，tlc监测至反应完全，抽滤、收集并用四氢呋喃溶液洗涤滤饼，可得化合物1 492mg，产率为70.3 %。
13.目标分子探针的合成：称取化合物1（350 mg，1.0mmol）加入3 ml乙二醇单甲醚溶液中，加入n-羟乙基哌嗪（390 mg，3.0mmol）回流反应，tlc监测至反应完全。减压除去溶剂后，硅胶柱层析纯化，旋蒸除去溶剂后得到目标分子探针261 mg，产率为65.5 %。1h-nmr (400 hz, cdcl3, tms)：δ=2.71 (t, 2h)，3.68 (t, 2h)，8.90 (dd, j=8.48 hz, 1h)，8.79 (dd, j=7.36 hz, 1h)，8.53 (d, j=7.92 hz, 1h)，8.24 (d, j=7.92 hz, 1h )，8.04 (dd, j=8.48 hz, 1h )，7.74 (m, 3h), 7.56 (m,1h)。hr-ms (esi), m/z: calculated [m+h]
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: 399.45708, found: 399.56415.实施例2荧光探针荧光强度与h
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浓度的关系将上述分离得到的纯度在99 %以上的产物，准确称量3.98 mg并小心转移于50ml的容量瓶中，室温下加入ch3cn溶液并使之完全溶解，定容至刻度线，得浓度为1mm的探针母液。在测试过程中，每次用微量进样器量取20μl的上述溶液，将其溶于测试体系中，使得每次测试总体积为2ml，此时荧光探针的浓度为10μm。分别取100μl的探针母液，加入到10ml ph分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0的pbs-ch3cn溶液中（10mm, 3:7, v/v, ph=7.4）。室温孵育20 min后，分别在10 mm的比色皿中测试不同体系的荧光光谱（附图1）。结果表明，在ph=3.0~8.0的范围内，随着h
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浓度的增加，体系在523nm处的荧光发射强度逐渐增强。
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实施例3荧光探针对h
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检测的选择性将浓度为1mm探针母液50μl溶解于4.900ml pbs缓冲溶液，再移取50μl浓度为3 mm的nacl，kcl，cacl2，zncl2，cucl2，agno3，fecl3，甘氨酸（gly），丙氨酸（ala）和缬氨酸（val）母液分别加入体系中，室温孵育20 min，分别测定其荧光光谱，记录523nm的荧光强度值。结果如附图2所示，加入其它测试金属离子和氨基酸时，均没有或只有微弱的荧光变化。表明该荧光探针具有良好的选择性。
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上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明范围的限制，本领域的相关技术人员能从发明公开的内容不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围之内。