1.本发明涉及生物技术领域，具体属于基于活体成像技术的2型糖尿病小鼠胰腺癌模型构建方法。
背景技术：
2.糖尿病与胰腺癌关系密切，然而，糖尿病导致胰腺癌肿瘤细胞生长和转移的机制尚不清楚。为了深入研究，亟需理想的实验动物模型。目前胰腺癌动物模型大致可分为以下三类：(1)化学诱导的胰腺癌动物模型，其特点是制备方便，但周期长，且诱导成功率不高、诱导产生的肿瘤的病理特征与人类肿瘤差别很大。(2)人源性腺癌小鼠接种动物模型，一种为常规的皮下接种，形成皮下肿物；另一种是将癌细胞直接注入t/b细胞联合免疫缺陷小鼠的胰腺。(3)转基因小鼠模型，是研究基因表达调控及表达产物生物学效应的最佳体系之一。该系统的基因打靶实现了外源基因在受体基因组中的顶点整合，但这种整合没有组织特异性，往往导致转基因小鼠在围产期因细胞癌变而很快死亡。三类模型中“人源性腺癌小鼠接种动物模型”由于可操作性强、形成的动物模型较稳定、所致胰腺肿瘤的病理特征接近于人类，是研究胰腺癌的首选动物模型。因此，目前文献报道中糖尿病小鼠胰腺癌模型所采用的造模方式多源于此。但这种传统的造模方式比较粗糙，其成瘤情况也仅凭肉眼判断，易错过早期成瘤及早期转移这些最佳观察时间点，且对成瘤的空间分布也缺乏精准的定位、无法判断肉眼不可见的转移灶，很容易导致研究结果的偏差。并且，由于2型糖尿病建模时间长、难度大，以往的糖尿病荷瘤模型均是在1型糖尿病的基础上建模，而与胰腺癌关系密切的却是2型糖尿病，因此，目前尚未形成理想的2型糖尿病胰腺癌动物模型。
技术实现要素：
3.本发明的目的在于提供基于活体成像技术的2型糖尿病小鼠胰腺癌模型构建方法，该方法利用基于生物发光成像的活体成像技术，建立稳定的2型糖尿病小鼠胰腺癌模型，将为研究活体内血糖调控胰腺癌发生直至早期转移的分子机制提供理想的实验动物模型。
4.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
5.基于活体成像技术的2型糖尿病小鼠胰腺癌模型构建方法，包括以下步骤：
6.(1)细胞培养：人源性胰腺癌肿瘤细胞置于培养基中，置于适宜的温度下培养一段时间后备用；
7.(2)细胞转染：取对数生长期生长状态良好的人源性胰腺癌肿瘤细胞铺于培养瓶中，取含荧光素酶标记的逆转录病毒的培养基，加入polybrene混合，过滤后加入人源性胰腺癌肿瘤细胞中，孵育过夜后更换为完全培养基，加入灭瘟素来选择稳定感染的细胞克隆，感染后观察荧光表达情况，构建能稳定表达荧光素酶基因的胰腺癌细胞株；
8.(3)2型糖尿病小鼠模型的建立：采用无特定病原体级雄性小鼠，通过高热量饮食与小剂量多次腹腔注射链脲佐菌素建立2型糖尿病小鼠模型并对其进行评价；
9.(4)2型糖尿病小鼠胰腺癌模型的建立：将对数生长期、能稳定表达荧光素酶基因的胰腺癌细胞消化制备成单细胞悬液，使用无菌生理盐水调整细胞浓度后，注射在每只模型小鼠右侧腋部皮下；
10.(5)活体生物发光成像观察：用动物活体成像系统动态观测模型小鼠体内肿瘤生长及转移情况，观测前每只小鼠腹腔注射荧光素酶底物，10min之后将小鼠麻醉，然后置活体成像系统曝光成像，并采集模型小鼠的光子数值，以胰腺癌肿瘤细胞接种时间为横坐标、移植瘤发射的荧光光子数为纵坐标作图，分别绘制肿瘤细胞在模型小鼠体内的生长曲线。
11.进一步地，在步骤(1)中，所述培养是先将人源性胰腺癌肿瘤细胞置于37℃、5％co2培养基中，再用含10％胎牛血清和1％双抗的1640培养基培养。
12.进一步地，所述双抗为100ug/ml青霉素和100ug/ml链霉素的混合液。
13.进一步地，在步骤(2)中，所述生长状态良好的人源性胰腺癌肿瘤细胞的汇合度为20％
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30％，所述含荧光素酶标记的逆转录病毒的培养基的量为4ml，所述polybrene加入量为40ul，浓度为10mg/ml，所述过滤是采用0.45um的滤膜，所述孵育温度为37℃，所述灭瘟素的浓度为8ug/ml，所述观察荧光表达情况的时间在感染3
‑
4天后。
14.进一步地，在步骤(4)中，使用无菌生理盐水调整细胞浓度为2*106‑
5*107个/ml，每只模型小鼠右侧腋部皮下分别注射单细胞悬液0.2ml。
15.进一步地，在步骤(5)中，所述麻醉是将小鼠置入动物气体麻醉机的麻醉盒，用异氟烷进行诱导麻醉，所述采集模型小鼠的光子数值是使用luminaii living image 4.0软件操作
16.随着对亚细胞结构和功能、分子生理和病理、细胞间和细胞内信号通路研究的深入，人类对疾病和对生命本质的认识不断被追溯到蛋白质、基因水平。ct、mri、超声等宏观影像技术已经远不能满足对活体环境内细微生命过程的探询。组织切片和免疫染色能够部分解释一些生物现象，但是需要将研究对象从活体组织中分离，所得结果与其在活体内机制相比难免有所偏离，甚至完全相反。综上所述，由于本发明采用了上述技术方案，本发明具有以下技术效果：
17.动物活体成像技术刚好具有弥补这些缺点的优势：(1)在肉眼尚不能发现肿瘤的时候即可微观观察、量化活体内肿瘤细胞的生长，具有极高的灵敏性。(2)可对同一研究个体进行早期、无创、实时、动态、长时间反复的跟踪观察，也可避免不同实验动物之间的个体差异和人为误差。(3)能够非侵入式地检测活体内特异的生物学行为，最大限度地模拟人体内的生理病理状态。目前动物活体成像模式主要包括生物发光成像(bioluminescence)、荧光成像(fluorescence)、同位素成像(isotopes)、x光成像(x
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ray)等。其中利用萤火虫荧光素酶的生物发光成像在活体内无毒、无放射、可代谢、可穿过各种膜屏障，能在不影响生物体任何结构和功能的前提下，被外部检测设备检测。且生物发光成像是基于捕捉细胞中表达的萤火虫荧光素酶与注射底物反应所发出的光子信号的检测方式，由于不需要激发光，能够一定程度避免由于激发光产生的动物皮毛、组织等的自发光干扰，理论上可以检出低至50个发光细胞，灵敏度较高，是目前活体成像的前沿技术。
具体实施方式
18.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下参照附图并举出优选实
施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。
19.实施例1
20.基于活体成像技术的2型糖尿病小鼠胰腺癌模型构建方法，包括以下步骤：
21.(1)细胞培养：人源性胰腺癌肿瘤细胞置于37℃、5％co2培养基中，用含10％胎牛血清和1％双抗的1640培养基，双抗包含100ug/ml青霉素和100ug/ml链霉素。
22.(2)细胞转染：取对数生长期生长状态良好的人源性胰腺癌肿瘤细胞，铺于培养瓶中，确保细胞达到20％的汇合度。取4ml含荧光素酶标记的逆转录病毒的培养基，加入40ul(10mg/ml)的polybrene混合，以0.45um滤膜过滤后加入人源性胰腺癌肿瘤细胞中，37℃孵育过夜后更换为完全培养基。加入8ug/ml灭瘟素(blasticidin s)来选择稳定感染的细胞克隆。感染3天后，观察荧光表达情况，构建能稳定表达荧光素酶基因的胰腺癌细胞株。
23.(3)2型糖尿病小鼠模型的建立：采用无特定病原体(specific pathogen free,spf)级雄性小鼠，通过高热量饮食与小剂量多次腹腔注射链脲佐菌素(stz)的方法建立2型糖尿病小鼠模型并对其进行评价。
24.(4)2型糖尿病小鼠胰腺癌模型的建立：将对数生长期、能稳定表达荧光素酶基因的胰腺癌细胞消化制备成单细胞悬液，无菌生理盐水调整细胞浓度为2x106个/ml个/ml。每只模型小鼠右侧腋部皮下分别注射0.2ml能稳定表达荧光素酶基因的胰腺癌单细胞悬液。
25.(5)活体生物发光成像观察：用动物活体成像系统动态观测模型小鼠体内肿瘤生长及转移情况。观测前每只小鼠腹腔注射荧光素酶底物，10min之后将小鼠置入动物气体麻醉机的麻醉盒，用异氟烷进行诱导麻醉，然后置活体成像系统曝光成像，并用luminaii living image 4.0软件采集模型小鼠的光子数值。以胰腺癌肿瘤细胞接种时间为横坐标、移植瘤发射的荧光光子数为纵坐标作图，分别绘制肿瘤细胞在模型小鼠体内的生长曲线。
26.实施例2
27.基于活体成像技术的2型糖尿病小鼠胰腺癌模型构建方法，包括以下步骤：
28.(1)细胞培养：人源性胰腺癌肿瘤细胞置于37℃、5％co2培养基中，用含10％胎牛血清和1％双抗的1640培养基，双抗包含100ug/ml青霉素和100ug/ml链霉素。
29.(2)细胞转染：取对数生长期生长状态良好的人源性胰腺癌肿瘤细胞，铺于培养瓶中，确保细胞达到30％的汇合度。取4ml含荧光素酶标记的逆转录病毒的培养基，加入40ul(10mg/ml)的polybrene混合，以0.45um滤膜过滤后加入人源性胰腺癌肿瘤细胞中，37℃孵育过夜后更换为完全培养基。加入8ug/ml灭瘟素(blasticidin s)来选择稳定感染的细胞克隆。感染4天后，观察荧光表达情况，构建能稳定表达荧光素酶基因的胰腺癌细胞株。
30.(3)2型糖尿病小鼠模型的建立：采用无特定病原体(specific pathogen free,spf)级雄性小鼠，通过高热量饮食与小剂量多次腹腔注射链脲佐菌素(stz)的方法建立2型糖尿病小鼠模型并对其进行评价。
31.(4)2型糖尿病小鼠胰腺癌模型的建立：将对数生长期、能稳定表达荧光素酶基因的胰腺癌细胞消化制备成单细胞悬液，无菌生理盐水调整细胞浓度为5x107个/ml。每只模型小鼠右侧腋部皮下分别注射0.2ml能稳定表达荧光素酶基因的胰腺癌单细胞悬液。
32.(5)活体生物发光成像观察：用动物活体成像系统动态观测模型小鼠体内肿瘤生
长及转移情况。观测前每只小鼠腹腔注射荧光素酶底物，10min之后将小鼠置入动物气体麻醉机的麻醉盒，用异氟烷进行诱导麻醉，然后置活体成像系统曝光成像，并用luminaii living image 4.0软件采集模型小鼠的光子数值。以胰腺癌肿瘤细胞接种时间为横坐标、移植瘤发射的荧光光子数为纵坐标作图，分别绘制肿瘤细胞在模型小鼠体内的生长曲线。
33.实施例3
34.基于活体成像技术的2型糖尿病小鼠胰腺癌模型构建方法，包括以下步骤：
35.(1)细胞培养：人源性胰腺癌肿瘤细胞置于37℃、5％co2培养基中，用含10％胎牛血清和1％双抗的1640培养基，双抗包含100ug/ml青霉素和100ug/ml链霉素。
36.(2)细胞转染：取对数生长期生长状态良好的人源性胰腺癌肿瘤细胞，铺于培养瓶中，确保细胞达到25％的汇合度。取4ml含荧光素酶标记的逆转录病毒的培养基，加入40ul(10mg/ml)的polybrene混合，以0.45um滤膜过滤后加入人源性胰腺癌肿瘤细胞中，37℃孵育过夜后更换为完全培养基。加入8ug/ml灭瘟素(blasticidin s)来选择稳定感染的细胞克隆。感染3天后，观察荧光表达情况，构建能稳定表达荧光素酶基因的胰腺癌细胞株。
37.(3)2型糖尿病小鼠模型的建立：采用无特定病原体(specific pathogen free,spf)级雄性小鼠，通过高热量饮食与小剂量多次腹腔注射链脲佐菌素(stz)的方法建立2型糖尿病小鼠模型并对其进行评价。
38.(4)2型糖尿病小鼠胰腺癌模型的建立：将对数生长期、能稳定表达荧光素酶基因的胰腺癌细胞消化制备成单细胞悬液，无菌生理盐水调整细胞浓度为1x107个/ml。每只模型小鼠右侧腋部皮下分别注射0.2ml能稳定表达荧光素酶基因的胰腺癌单细胞悬液。
39.(5)活体生物发光成像观察：用动物活体成像系统动态观测模型小鼠体内肿瘤生长及转移情况。观测前每只小鼠腹腔注射荧光素酶底物，10min之后将小鼠置入动物气体麻醉机的麻醉盒，用异氟烷进行诱导麻醉，然后置活体成像系统曝光成像，并用luminaii living image 4.0软件采集模型小鼠的光子数值。以胰腺癌肿瘤细胞接种时间为横坐标、移植瘤发射的荧光光子数为纵坐标作图，分别绘制肿瘤细胞在模型小鼠体内的生长曲线。
40.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。