调节植物镉含量以及镉耐受性的基因及其应用

1.本发明属于生物技术及植物学领域，更具体地，本发明涉及调节植物镉含量以及镉耐受性的基因及其应用。


背景技术：

2.镉(cadmium，cd)是稀有元素，单元素镉毒性微小，但是以化合物状态(其中为硫镉矿最常见)存在于自然界的化合物镉毒性巨大。随着现代社会的不断发展，科学技术水平的不断提高，加快了工农业的发展进程，而矿产资源的大量开发，“三废”、固体废弃物的不合理排放，以及由于农业生产过程自身化学品施用不规范等原因，导致生态环境的重金属污染问题日益严重，镉污染就是其中代表之一。镉属于有光泽，且具有很好延展性的过渡金属，广泛存在于周围环境中，是植物和人体非必需且是环境中生物毒性最强的重金属元素之一，在us-epa宣布的126种优先污染物中也位列其中，并且在前20种毒素中排名第七位，根据who的报告显示土壤中cd的含量范围为0.07至1.1mg kg-1。由于cd在土壤中具有移动性，可以很容易通过植物根系的吸收和转运进入生物有机体并积累在植物的可食部分，随后进入食物链对动物以及人类的身体健康造成危害，引起各种人类疾病；同时由于其具有较长的半衰期(10-30年)，极易在人体内积累，久而久之则会引起人体器官病变，即使低浓度的摄入也会导致肾功能障碍；中毒症状从轻微的蛋白尿到症状明显的骨痛病等，而且长期的中毒还会引起肺气肿、肠胃病、贫血及高血压等。
3.由于镉在植物韧皮部可以自由移动，所以镉可以在植物的各个部位积累产生毒害作用，有研究表明，cd
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能够影响植物细胞内的错配修复系统，对dna产生损伤，使染色体畸变率显著增加。cd
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对植物的毒害作用，在整体水平上表现为根、茎生长迟缓，根毛数量增加，叶片失绿萎蔫、卷曲枯黄，整个地上部分生物量减少；在生理生化方面主要表现为光合作用、呼吸作用和蒸腾作用等受到抑制，引起细胞内的氧化胁迫和膜系统的损伤。先前的研究表明，cd
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能够通过影响光捕获复合物ii和两个光系统，导致叶绿素和类胡萝卜素含量降低，从而造成更高的非光化学猝灭，降低植物的光合作用效率。此外，cd
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能够阻滞电子在呼吸复合体iii中的半醌和细胞色素b之间转移，破坏线粒体电子传递过程，并且抑制细胞内抗氧化酶的活性，造成植物细胞中ros的产生和积累。而叶片是cd
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毒害的另一主要作用部位，研究表明在cd
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存在的条件下，叶片气孔的关闭与细胞内水的状态无关，气孔可以直接通过aba诱导胞质内ca
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的积累来进行关闭，而胞质内ca
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的积累会导致质膜阳离子通道和k
+
外排通道的打开，使水分丧失，影响植物体内水分的平衡，减少co2的吸收，进而在很大程度上降低植物的光和作用效率，因此，cd在水稻的生长发育过程中有着非常重大的影响。
4.综上所述，提高水稻对镉的耐受和降低籽粒中镉的积累已经成为关系人民生活和身体健康的大事，已经成为农业生产和食品安全关注的重点，是当前生命科学领域研究的热点。
5.对于土壤中重金属镉的治理问题，近些年来也有一些探索，目前治理方法主要分为物理法、化学法和生物法三种。
6.物理法可分为深耕翻土法、玻璃化技术、电动修复技术、土壤淋洗等，有一定的治理效果，适用于小面积低污染的土壤，但与此同时，物理法也会带来一些问题，如成本高，且不能从根本上清除重金属，造成植物营养元素的缺失等。
7.化学法有固化/稳定化、离子拮抗技术等，通过重金属镉经化学反应来降低含量，但是化学法在应用的同时会生成其他污染物。
8.生物法主要通过种植吸附镉能力强的植物吸附镉元素后对植物进行集中处理以及微生物-植物联合修复技术进行去除镉，分为植物提取和植物固定。微生物修复技术，可以通过工程菌培养、微生物投放，利用微生物对重金属具有吸附、沉淀、氧化、还原等作用来降低污染土壤中重金属的活性和毒性。
9.随着环境污染问题的日益严重，寻找能够抵抗重金属胁迫并且能降低水稻籽粒中重金属镉含量的功能基因并阐明其分子机制，对于培育水稻新品种具有重要的理论及实践意义。


技术实现要素：

10.本发明的目的在于提供一种增强植物对镉的耐受性并降低植物镉含量的编码基因；本发明的目的还在于提供所述编码基因在增强植物耐镉及降低植物中镉含量的方面的应用。
11.在本发明的第一方面，提供一种增强植物对镉的耐受性或降低植物镉含量的方法，包括：下调植物中cdc8a的表达或活性；其中所述cdc8a包括其同源物。
12.在一个优选例中，所述下调植物中cdc8a的表达或活性包括：在植物中敲除或沉默cdc8a的编码基因，或抑制cdc8a的活性。
13.在另一优选例中，所述在植物中敲除或沉默cdc8a的编码基因包括：以crispr系统进行基因编辑从而敲除cdc8a的编码基因；以同源重组的方法敲除cdc8a的编码基因；以特异性干扰cdc8a的编码基因表达的干扰分子来沉默cdc8a；或，在含有cdc8a的植物中将cdc8a进行功能丧失性突变。
14.在另一优选例中，所述方法包括：以crispr系统进行基因编辑从而敲除cdc8a的编码基因；较佳地，以crispr靶向于cdc8a的编码基因的第一个外显子和/或第二个外显子区域；更佳地，以acacgcgagcggttccgcgg的sgrna和gatgggcttcccccatccga的sgrna进行所述的基因编辑；更佳地，以seq id no:7和seq id no:9所示的引物构成靶向于acacgcgagcggttccgcgg的sgrna，以seq id no:8和seq id no:10所示的引物构成靶向于gatgggcttcccccatccga的sgrna。
15.在另一优选例中，所述的下调表达包括缺失表达。
16.在另一优选例中，所述的下调表示显著性的下调，如下调20％、40％、60％、80％、90％或更低。
17.在本发明的另一方面，提供一种cdc8a的下调剂的用途，用于增强植物对镉的耐受性或降低植物镉含量；或，用于制备增强植物对镉的耐受性或降低植物镉含量；所述的cdc8a包括其同源物。
18.在一个优选例中，所述下调剂包括：敲除或沉默cdc8a的试剂，抑制cdc8a活性的试剂。
19.在另一优选例中，所述下调剂包括：针对cdc8a的crispr基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述试剂将cdc8a进行功能丧失性突变；或，特异性干扰cdc8a的编码基因表达的干扰分子。
20.在另一优选例中，所述降低植物镉含量包括：降低植物地上部和/或地下部的镉含量，减少植物木质部流中镉含量(减少植物木质部将镉向地上部的运输)；较佳地，所述地上部包括：籽粒，叶片，茎。
21.在另一优选例中，下调所述cdc8a，下调hma2和/或nramp5的表达，从而下调水稻对植物对镉的吸收和/或转运，进而增强植物对镉的耐受性或降低植物镉含量。
22.在另一优选例中，所述的植物为表达cdc8a或其同源物的植物，或所述植物为单子叶植物或多子叶植物；较佳地，所述的植物为或所述cdc8a来自禾谷类作物，豆科植物，十字花科植物，菊科植物，大戟科植物，蔷薇科植物；较佳地，所述的禾谷类作物包括禾本科植物；更佳地，包括：水稻(oryza sativa)，玉米(zea mays)，小米(setaria italica)，大麦(hordeum vulgare)，小麦(triticum aestivum)，二穗短柄草(brachypodium distachyum(l.)beauv.)，黍(panicum miliaceum)，高粱(sorghum bicolor)，黑麦(secale cereale)，燕麦(avena satival)，豆科植物：大豆(glycine max(linn.)merr.)，花生(arachis hypogaea linn.)；较佳地，所述菊科植物包括：莴苣(lactuca sativa linn.)；较佳地，所述大戟科植物包括：橡胶树属植物(hevea brasiliensis(willd.ex a.juss.)muell.arg.)，木薯属植物(manihot esculenta crantz)；较佳地，所述蔷薇科植物包括：樱属(cerasus mill.)，樱花(cerasus serrulata(lindl.)g.don ex london)。
23.在另一优选例中，所述的cdc8a包括cdna序列、基因组序列，或在它们基础上人工优化或改造的序列。
24.在另一优选例中，所述的水稻选自下组：籼稻(oryza sativa linn.subsp.indica kato)、粳稻(oryza sativa linn.subsp.japonica kato)。
25.在另一优选例中，所述的cdc8a的多肽的氨基酸序列选自下组：
26.(i)具有seq id no:2所示氨基酸序列的多肽；
27.(ii)将如seq id no:2所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-20个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(i)多肽功能的、由(i)衍生的多肽；
28.(iii)氨基酸序列与seq id no:2所示氨基酸序列的同源性≥85％(较佳地≥90％，≥95％、≥98％或≥99％)，具有所述调控性状功能的多肽；
29.(iv)seq id no:2所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或
30.(v)在seq id no:2所示氨基酸序列的多肽的n或c末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其n末端添加信号肽序列后形成的多肽。
31.在本发明的另一方面，提供一种用于增强植物对镉的耐受性或降低植物镉含量的cdc8a的下调剂，其为crispr基因编辑试剂，其靶向于cdc8a的编码基因的第一个外显子区域，包括碱基的缺失或者增加(较佳地，确实或增加的碱基数为：非3的整数倍的碱基数)；较佳地，其是sgrna构建体，由seq id no:7和seq id no:9所示的引物和/或seq id no:8和seq id no:10所示的引物退火后，与特定扩增引物通过pcr(dna聚合酶链式反应)连接形成grna，然后通过酶切连接的方法插入到crispr表达载体中构建形成。
crispr-6，cdc8a-crispr-8叶片中重金属镉的含量。
47.图3、野生型水稻(9522)和水稻敲除突变体cdc8a-crispr的离子表型分析。
48.图4a、野生型水稻(9522)、nil(sg125)、cdc8a-crispr-5，cdc8a-crispr-6，cdc8a-crispr-8籽粒中cd的含量。
49.图4b、xrf检测cd在野生型水稻(9522)和cdc8a-crispr转基因材料籽粒中的含量和分布。
50.图5、野生型水稻(9522)和水稻敲除突变体木质部流中cd的含量。
51.图6、在20μm cd处理条件下，野生型水稻(9522)和水稻敲除突变体根中oshma2、osnramp5的表达量。
具体实施方式
52.本发明首次研究及揭示了一种cdc8a基因(oryza sativa cadmium decreased chromosome 8a)(loc_os08g34310)，其编码一条功能性多肽，可以调控植物的镉耐受能力以及植物地上部多种器官的镉含量。本发明的技术方案对于植物性状的遗传改良具有重要意义。
53.cdc8a
54.如本发明所用，除非特别说明，所述的cdc8a指具有seq id no:2序列的多肽或其编码基因，还包括具有与cdc8a多肽相同功能的序列变异形式。所述的编码基因可以是gdna或cdna，也可以包含启动子。例如，所述的cdna具有seq id no:1所示的核苷酸序列。所述编码基因的序列也包括与本发明所提供的序列相简并的序列。
55.所述cdc8a多肽的变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-30个，较佳地1-20个，更佳地1-15个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。任何与所述的cdc8a多肽同源性高(比如与seq id no:2所示的多肽序列的同源性为80％或更高；优选地同源性为85％或更高；更优选地同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有cdc8a多肽相同功能的蛋白也包括在本发明内。来源于水稻以外其它物种的与seq id no:2所示序列的多肽序列的同源性较高、或在同样或相近的调控通路中发挥同样或相近作用的多肽也包括在本发明中。
56.本发明中，所述的“cdc8a”也包括其同源物。应理解，虽然本发明中优选研究了获自特定物种水稻的cdc8a(oscdc8a)，但是获自其它物种的与所述cdc8a高度同源(如具有85％以上，如90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它多肽或基因也在本发明考虑的范围之内。
57.如本发明所用，所述的籽粒是指植物的果实或种子，在水稻等作物中也称为穗粒。
58.编码所述cdc8a多肽的多核苷酸(基因)可以是来自植物的天然基因，也可以是它们的简并的序列。
59.包含所述编码序列的载体，以及用所述的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞也包括在本发明中。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含合适的表达载体。
60.宿主细胞通常是植物细胞。转化植物一般可使用农杆菌转化或基因枪转化等方
法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等；优选的是农杆菌法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得相对于野生型而言性状发生改变的植物。
61.改良植物的方法
62.如本文所用，所述的“植物”包括表达cdc8a的植物。根据本领域的知识，存在cdc8a的植物，其内在存在如本发明所主张的作用机制，可以实现如本发明所主张的技术效果。所述的植物可以是单子叶植物或双子叶植物。
63.例如，所述的“植物”可以是选自以下的植物：禾本科(gramineae)、十字花科(brassicaceae)、茄科(solanaceae)、豆科(leguminosae)、葫芦科(cucurbitaceae)、菊科(asteraceae)、杨柳科(salicaceae)、桑科(moraceae)、桃金娘科(myrtaceae)、石松科(lycopodiaceae)、(selaginellaceae)、银杏科(ginkgoaceae)、松科(pinaceae)、苏铁科(cycadaceae)、天南星科(araceae)、毛茛科(ranunculaceae)、悬铃木科(platanaceae)、榆科(ulmaceae)、胡桃科(juglandaceae)、桦科(betulaceae)、猕猴桃科(actinidiaceae)、锦葵科(malvaceae)、梧桐科(sterculiaceae)、椴树科(tiliaceae)、柽柳科(tamaricaceae)、蔷薇科(rosaceae)、景天科(crassulaceae)、苏木科(caesalpinaceae)、蝶形花科(fabaceae)、石榴科(punicaceae)、珙桐科(nyssaceae)、山茱萸科(cornaceae)、八角枫科(alangiaceae)、卫矛科(celastraceae)、冬青科(aquifoliaceae)、黄杨科(buxaceae)、大戟科(euphorbiaceae)、小盘木科(pandaceae)、鼠李科(rhamnaceae)、葡萄科(vitaceae)、漆树科(anacardiaceae)，橄榄科(burseraceae)、桔梗科(campanulaceae)、红树科(rhizophoraceae)、檀香科(santalaceae)、木犀科(oleaceae)、玄参科(scrophulariaceae)、露兜树科(pandanaceae)、黑三棱科(sparganiaceae)、水蕹科(aponogetonaceae)、眼子菜科(potamogetonaceae)、茨藻科(najadaceae、冰沼草科(scheuchzeriaceae)、泽泻科(alismataceae)、花蔺科(butomaceae)、水鳖科(hydrocharitaceae)、霉草科(triuridaceae)、莎草科(cyperaceae)、棕榈科(槟榔科)(palmae(arecaceae))、天南星科(araceae)、浮萍科(lemnaceae)、须叶藤科(flagellariaceae)、帚灯草科(restionaceae)、刺鳞草科(centrolepidaceae)、黄眼草科(xyridaceae)、谷精草科(eriocaulaceae)、凤梨科(bromeliaceae)、鸭跖草科(commelinaceae)、雨久花科(pontederiaceae)、田葱科(philydraceae)、灯心草科(juncaceae)、百部科(stemonaceae)、百合科(liliaceae)、石蒜科(amaryllidaceae)、蒟蒻薯科(箭根薯科)(taccaceae)、薯蓣科(dioscoreaceae)、鸢尾科(iridaceae)、芭蕉科(musaceae)、姜科(zingiberaceae)、美人蕉科(annaceae)、竹芋科(marantaceae)、水玉簪科(burmanniaceae)、藜科(chenopodiaceae)或兰科(orchidaceae)的植物。可通过鉴定其中cdc8a或其同源物的存在情况，来确定适当的植物。
64.在一些优选方式中，所述的植物为作物，较佳地为禾谷类作物，所述禾谷类作物为具有籽粒(穗粒)的作物。所述的“禾谷类作物”可以是禾本科植物。较佳地，所述的禾本科植物包括：水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、高粱等。
65.在本发明人的研究工作中，发现镉处理cdc8a基因功能缺失突变体植株表现为对镉耐受，同时对cdc8a基因敲除植株进行镉表型分析，发现cdc8a基因敲除植株对镉耐受，表明cdc8a基因涉及镉耐受性的调控。此外，该基因可被镉胁迫抑制，在植物中敲除cdc8a基因能显著降低植物籽粒镉含量。为此，本发明人研究了该基因功能，通过对相关转运蛋白基因
的表达量进行检测，发现与野生型植物相比，cdc8a基因敲除植物中hma2、nramp5的表达量显著降低。因此，cdc8a可能通过影响hma2、nramp5的表达来调节植物对镉的吸收和转运过程，从而减少了镉在木质部流中的运输和在叶片、籽粒中的积累。
66.基于本发明人的新发现，本发明提供了一种改良植物的方法，所述方法包括：调控植物体内cdc8a的表达或活性，进而调控植物对镉的耐受性以及植物的镉含量(包括地上部或地下部镉含量，所述地上部包括：籽粒、叶片、茎等)。更具体地，本发明提供了一种增强植物对镉的耐受性或降低植物镉含量的方法，包括：下调cdc8a的表达或活性。
67.应理解，在得知了所述cdc8a的功能后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的cdc8a的表达或活性，比如可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低cdc8a表达或使之缺失表达。可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。
68.本发明中，所述的cdc8a的蛋白或其编码基因的下调剂是指任何可降低cdc8a蛋白的活性、降低cdc8a或其编码基因的稳定性、下调cdc8a蛋白的表达、减少cdc8a蛋白有效作用时间、抑制cdc8a基因的转录和翻译的物质、或降低蛋白的磷酸化/激活水平，这些物质均可用于本发明，作为对于下调cdc8a有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括dna、rna)的，也可以是蛋白水平的。例如，所述的下调剂是：特异性干扰cdc8a或其它信号通路基因表达的干扰rna分子或反义核苷酸；或是特异性编辑cdc8a的基因编辑试剂，等等。
69.作为本发明更为优选的实施方式，以crispr系统进行基因编辑从而敲除cdc8a的编码基因；较佳地，以crispr靶向于cdc8a的编码基因的第一个外显子和/或第二个外显子区域；更佳地，以acacgcgagcggttccgcgg的sgrna和gatgggcttcccccatccga的sgrna进行所述的基因编辑；更佳地，以seq id no:7和seq id no:9所示的引物构成靶向于acacgcgagcggttccgcgg的sgrna，以seq id no:8和seq id no:10所示的引物构成靶向于gatgggcttcccccatccga的sgrna。本发明人的实验结果显示，本发明的该组试剂靶向调控作用非常理想，在植物中实现了准确的、满足改良所需的调控。
70.作为本发明的一种优选方式，提供一种下调植物中cdc8a的方法，包括对cdc8a进行靶向性地突变、基因编辑或基因重组，从而实现下调。作为一种更为具体的实施例方式，藉由上述任一的方法，从而使其不再发挥作用。作为一种更为具体的实施例方式，采用crispr/cas9系统进行基因编辑。合适的sgrna靶位点，会带来更高的基因编辑效率，所以在着手进行基因编辑前，可以设计并找到合适的靶位点。在设计特异性靶位点后，还需要进行体外细胞活性筛选，以获得有效的靶位点用于后续实验。本发明的实施例中提供了优选的基因内编辑试剂。
71.作为其它可选的方式，所述下调植物中cdc8a的表达的方法可包括：(1)将干扰cdc8a基因表达的干扰分子转入植物细胞、组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子；(2)将步骤(1)获得的转入了所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。较佳地，所述方法还包括：(3)选择出转入了所述载体的植物细胞、组织或器官；和(4)将步骤(3)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。
72.植物定向筛选或靶向性筛选
73.在得知了cdc8a的功能以后，可以以其为分子标记物，来进行植物的定向筛选。也
可基于该新发现来筛选通过调节这一机制，从而定向调控植物镉耐受/镉含量性状的物质或潜在物质。
74.因此，本发明提供了一种定向选择或鉴定植物的方法，所述方法包括：鉴定测试植物中的cdc8a的表达或序列特征；若是该测试植物的cdc8a高表达，则其为(或潜在地为)镉耐受性低或镉含量高的植株；若是该测试植物的cdc8a低表达或不表达，则其为(或潜在地为)镉耐受性高或镉含量低的植株。
75.本发明提供了一种筛选增强植物对镉的耐受性或降低植物镉含量的物质(潜在物质)的方法，包括：(1)将候选物质加入到表达cdc8a的体系中；(2)检测所述体系，观测其中cdc8a的表达或活性，若其表达或活性提高，则表明该候选物质为可用于增强植物对镉的耐受性或降低植物镉含量的物质。
76.以蛋白或基因或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。
77.检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领域技术人员熟知的技术，比如gst沉降技术(gst-pull down)、双分子荧光互补实验、酵母双杂交系统或免疫共沉淀技术等。
78.经过大规模的筛选，可以获得一类特异性作用于cdc8a，对植物镉耐受性或镉含量有调控作用的潜在物质。
79.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
80.试剂和溶液
81.1000x yoshida分别为：
82.母液a：nh4no3ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
80g/l；
83.nah2po4·
2h2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
93g/l；
84.k2so4ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
52.4g/l；
85.母液b：cacl2·
2h2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
44.2g/l；
86.母液c：mgcl2·
6h2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
122g/l；
87.母液d：fe-edta
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
19g/l；
[0088][0089][0090]
溶液配方
[0091]
cd group(1000x)
[0092][0093]
序列信息
[0094]
oscdc8a cdna序列(非洲栽培稻cg14(oryza glaberrima stend)；seq id no:1)：
[0095]
atggcgctcgcggtcgacaacggcaacagcttgcacacgcgagcggttccgcggcggcccgttgatccccggggatcagaccccgtgttctttcatccggcgcctccgtgcgacggatgggcttcccccatccgacggtacaaagatgacctcttgtctgatccaacggctcgcggtcactccgtgcacagggcccaaggcttcgaagctcgtctaccacctctgcgcagcgcacgcctccccagcccagaagctgaaccatcgcgtcgttcatcagcagcggagaagccatcccgcttcccgcatcatctctcccaccacaaccaaaccctaaccccacccaccccaaccatggagttcgctcgccgagccaccgccccggtcgacgccgacgacggctgcggcgttccccacccgtccccgcgcgaaactaaacagcggtggggttggggagtttcagtgcaggtgacgatggacgcgctccgccgggagctctgggaggagggcattcgtcaggaggtcattgctgctgaaattgctgagcagagagaactggaggccaaggtccagcgcgatactggattgctctgtgatgtgccctcgcgattgtccgtcagcttccagccggtccgcggtgacacattcccttcgcctcatggtgagctttggttaggaggaccgatggcaatgcctgcaggagcatccatgtttagagtgcctgtgaaagatcggatcgaggaatggtatcgacctccatgggataggacagcagatgaagagaatgcatcttttaatgcgctctacaaggaagctacacgtatcagtctcaacgatcacatatgttgcctggccaagatgcgtagaaaggtgtcatctggagtgaagaggaaaaggggtgcagatactttccagatgaacaacaaaaaaatatgtgtgccaaggagctgtgatggaatccaacactctgctggccataggaacgaggaaaacaatgctttggaatcaagaaaggaagctattgggacgaagaagaaagtagaaacagagtccttatctgtcacacggcattatccaccaacatggaattatggtatttgcaaagccaattgttcaagtgaactggacttaaaaaatcacctaagaggtaggaggcaccaagaaaacttagaagccctgaagagagaagacaaggaaatggaagcaaaggtgtatgcaaaggaagtggcgcagtttgttgaaaagaaccaaaagtttgtgccaagatggagttgcagcacttgcaaggctaattgcacatctgcatctgacttggagaatcacttccggggtagaaggcaccaacagaacgtaggaaggagttcaaacgtggtaatgctccgtgcataa
[0096]
oscdc8a蛋白序列(seq id no:2)：
[0097]
malavdngnslhtravprrpvdprgsdpvffhpappcdgwaspirrykddllsdptarghsvhraqgfearlpplrsarlpspeaepsrrssaaekpsrfphhlshhnqtltpptptmefarratapvdaddgcgvphpspretkqrwgwgvsvqvtmdalrrelweegirqeviaaeiaeqreleakvqrdtgllcdvpsrlsvsfqpvrgdtfpsphgelwlggpmampagasmfrvpvkdrieewyrppwdrtadeenasfnalykeatrislndhicclakmrrkvssgvkrkrgadtfqmnnkkicvprscdgiqhsaghrneennalesrkeaigtkkkveteslsvtrhypptwnygickancsseldlknhlrgrrhqenlealkredkemeakvyakevaqfveknqkfvprwscstckanctsasdlenhfrgrrhqqnvgrssnvvmlra
[0098]
实施例1、oscdc8a基因在水稻中的表达特征
[0099]
本实施例中，进行oscdc8a基因在水稻(粳稻品系9522)中的表达特征的鉴定，鉴定步骤如下：
[0100]
(1)总rna的提取
[0101]
水稻种子经催芽萌发后，用无菌水洗涤4-5次，选择大小一致的幼苗转移至培养盒中，用yoshida培养液培养2周后用20μm浓度的cd处理24h，分别在不同时间点取叶片与根部于液氮中保存，利用植物总rna提取试剂盒(life)提取rna。
[0102]
(2)获得总cdna
[0103]
使用反转录试剂盒(北京全式金公司)进行总cdna的合成。
[0104]
(3)荧光定量pcr
[0105]
反转录合成总cdna第一链后，以其为模板进行荧光定量pcr扩增。基因osubiquitin，oscdc8a基因的定量pcr程序如下：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，40个循环后，72℃7min。基因的序列号和引物设计如表1。
[0106]
表1
[0107][0108]
表达分析结果发现，水稻基因oscdc8a在根系表达量显著高于地上部，且受到cd胁迫时，根系中表达量显著减少(图1)。
[0109]
实施例2、oscdc8a在大肠杆菌异源表达
[0110]
oscdc8a原核表达表达载体的构建与大肠杆菌转化：
[0111]
根据oscdc8a的cdna序列(seq id no:1)，分别设计去掉终止密码子的特异引物，以cdna全长为模板利用高保真酶kodplus(toyobo公司)进行pcr扩增。
[0112]
pcr产物经电泳回收后克隆到原核表达载体pa7的多克隆位点中。阳性克隆进行测序验证正确后保存。
[0113]
实施例3、oscdc8a的crispr-cas9敲除突变载体的构建与纯合突变体的鉴定
[0114]
本实施例中，建立oscdc8a敲除突变载体以及纯合突变体植株。
[0115]
(1)oscdc8a敲除突变载体的构建
[0116]
设计点突变体载体的引物：
[0117]
oscdc8a-cas9seq-u3-310-f：ggcacacgcgagcggttccgcgg(seq id no:7)；
[0118]
oscdc8a-cas9seq-u6a-310-f：gccgatgggcttcccccatccga(seq id no:8)；
[0119]
oscdc8a-cas9seq-u3-310-r：aaacccgcggaaccgctcgcgtg(seq id no:9)；
[0120]
oscdc8a-cas9seq-u6a-310-r：aaactcggatgggggaagcccat(seq id no:10)。
[0121]
利用pcr仪合成短序列，并将序列利用bsai单酶切连入中间载体cas9中，测序正确后将中间载体通过重组法连入表达载体crispr-cas9中。
[0122]
这一设计靶向于oscdc8a的acacgcgagcggttccgcgg(seq id no:13)和
gatgggcttcccccatccga(seq id no:14)进行缺失或者插入突变。
[0123]
(2)将酶连正确的载体，转入农杆菌备用
[0124]
(3)oscdc8a突变体的鉴定
[0125]
基因扩增引物如下：
[0126]
f：atggcgctcgcggtcgacaa(seq id no:11)；
[0127]
r：ttatgcacggagcattac(seq id no:12)。
[0128]
(4)提取植物叶片的总dna，以dna为模板，利用设计的突变体引物进行两轮pcr验证突变体的纯合性。
[0129]
(5)将鉴定出的纯合突变体提取rna进行荧光定量pcr鉴定基因oscdc8a的表达量。
[0130]
(6)纯合突变体命名为cdc8a。
[0131]
转基因苗的分子鉴定：提取转基因材料不同株系叶片的总rna，反转录总cdna，进行荧光定量pcr鉴定(总rna的提取，总cdna的合成，定量pcr方法同实施例1)。随机选取得到沉默效果明显cdc8-5(cdc8a-crispr-5)、cdc8-6(cdc8a-crispr-6)、cdc8-8(cdc8a-crispr-8)转基因株系(图2a)。
[0132]
其中，cdc8-8(cdc8a-crispr-8)与野生型相比的表型情况如图2b。与野生型相比，苗期的突变体材料的根系变短，地上部变矮。
[0133]
实施例4、oscdc8a突变体材料叶片中cd积累分析
[0134]
进行oscdc8a突变体材料以及野生型中叶片中cd总量的测定，具体实施过程如下：
[0135]
1)选取突变体材料(cdc8-5，cdc8-6，cdc8-8以及背景野生型9522)。
[0136]
2)将幼苗点播于96孔培养板中，用yoshida培养液培养1周。
[0137]
3)选取大小一致的幼苗，以20μm浓度cd进行处理。
[0138]
4)处理24小时后，将生长在96孔板上的水稻幼苗整株连根部一起取出，用陶瓷刀切割相应长度的叶片，分别用18mω的超纯水涮洗4遍，叶片如果没有沾到营养液或其它污染物可以只冲洗一到两遍。
[0139]
5)将清洗好的样品直接放入洁净的已经称过重量的玻璃消解管中，然后放到65℃专用烘箱内一到两天，将植物组织中的水分充分烘干。
[0140]
6)称取叶片转移于消煮管中，添加1ml加内标的浓硝酸(hno3)进行消煮。
[0141]
7)以超纯水将样品消煮结束的溶液定容至10ml，充分摇匀。
[0142]
8)利用icp-ms测定各样品中cd含量。
[0143]
结果表明，与野生型相比，oscdc8a突变体材料的叶片中富集了更少的cd(图2c)。
[0144]
实施例5、oscdc8a突变体材料籽粒中cd积累的icp-ms分析
[0145]
首先，本发明人利用icp-ms(电感耦合等离子体质谱仪)方法测定了oscdc8a突变体材料与野生型水稻(9522)相比，在含有cd(20μm浓度)和不含有cd处理的培养条件下，其离子表型。结果如图3，在20μm cd处理条件下，地下部的离子表型，oscdc8a突变体材料与野生型没有显著差异；但是，地上部的离子表型变化显著，在20μm cd处理条件下，oscdc8a突变体材料的重金属cd的含量显著降低。
[0146]
其次，本发明人进行oscdc8a突变体材料以及野生型(9522)中籽粒中cd总量的测定，具体实施过程如下：
[0147]
1)选取突变体材料(cdc8-5，cdc8-6，cdc8-8以及背景野生型9522)。
[0148]
2)将幼苗点播于96孔培养板中，用yoshida培养液培养1周。
[0149]
3)选取大小一致的幼苗，进行盆栽移至20l的中转箱中，以20μm浓度cd进行处理。
[0150]
4)控制水稻生长过程中的土壤水分，尽量保持以旱作方式进行全生育期盆栽实验
[0151]
5)收获成熟期水稻，于60℃烘箱烘3d。
[0152]
6)称取0.25g左右籽粒于消煮管中，添加1ml加内标的浓硝酸(hno3)进行消煮。
[0153]
7)以超纯水将样品消煮结束的溶液定容至10ml，充分摇匀。
[0154]
8)利用icp-ms测定各样品中cd含量。
[0155]
结果表明，oscdc8a突变体材料与野生型相比，籽粒中富集更少的cd(图4a)。
[0156]
实施例6、xrf检测oscdc8a突变体材料籽粒中cd分布
[0157]
oscdc8a突变体材料以及野生型(9522)中籽粒中cd元素分布的测定，具体实施过程如下：
[0158]
1)选取突变体材料(cdc8a以及背景野生型9522)。小心剥去颖壳，用超纯水清洗一下，晾干。
[0159]
2)小心的将水稻种子按顺序排列在专用膜上，操作的过程中使用专用镊子，将其整理的排列在载物台上，尽量不污染样品。
[0160]
3)操作软件，在10倍视野下移动载物台，使样品逐渐接近检测头，等到能看到样品大致轮廓时，使用自动对焦方式进行聚焦，然后在100倍视野下矫正。
[0161]
4)参数调节，设定检测电压为50kv，电流为600μa；检测斑直径大小为15μm，步径为10-15μm；
[0162]
5)选取样品的目的检测区域，尽量保持样品完整，空白区域最少，这样可以减少背景信号。
[0163]
然后开始检测，结束之后通过软件对图像进行相应处理。
[0164]
结果表明，oscdc8a突变体材料与野生型相比，籽粒中富集更少的cd元素，并且分布范围也缩小(图4b)。
[0165]
实施例7、oscdc8a突变体材料和野生型材料对cd的吸收分析
[0166]
进行oscdc8a突变体材料和野生型材料(9522)对cd的吸收实验，具体实施过程如下：
[0167]
1)将鉴定正确的突变体材料与野生型9522用纯水浸泡两天，然后放到37度培养箱萌发，等待其露白后挑选长势一致的水稻点播于96孔培养板；
[0168]
2)培养两周后将幼苗转移至重金属营养液中培养，培养1周后进行取样；
[0169]
3)每培养皿中种植突变体材料和野生型，每种材料4个重复，以20μm cd处理24h。
[0170]
4)处理24h后将水稻用单面刀片从横截面进行切断，:
[0171]
(1)收集水稻叶鞘横截面流出的伤流液；
[0172]
(2)从收集的各个材料的伤流液中吸取等量的体积，转移到消解管中，添加1ml加内标的浓硝酸(hno3)进行消煮。
[0173]
(3)以超纯水将样品消煮结束的溶液定容至10ml，充分摇匀。
[0174]
(4)利用icp-ms测定各样品中cd含量
[0175]
结果表明，oscdc8a突变体材料与野生型相比，木质部伤流液中cd的浓度显著减少，从而减少了cd向地上部的运输(图5)。
[0176]
实施例8、oscdc8a突变体材料和野生型材料
[0177]
在20μm cd处理条件下，本发明人测定了oscdc8a突变体材料与野生型水稻(9522)相比，根(地下部)中oshma2、osnramp5的表达量。
[0178]
结果如图6，在含有cd(20μm浓度)和不含有cd处理的培养条件下，其离子表型。在20μm cd处理条件下，与野生型水稻相比，oscdc8a突变体材料的地下部中oshma2(loc_os06g48720)、osnramp5(loc_os07g15370)的表达量发生非常显著的下降。
[0179]
该结果提示，oscdc8a通过影响oshma2、osnramp5的表达来调节水稻对镉的吸收和转运过程，从而减少了镉在木质部流中的运输和在叶片、籽粒中的积累。
[0180]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。