用于从黑米中提取花青素的固定化酶及制备和使用方法

1.本发明属于提取加工技术领域，具体为用于从黑米中提取花青素的固定化酶及制备和使用方法。


背景技术：

2.黑米含有丰富的蛋白质以及维生素b1和b2，以及较多的fe、mn、zn、ga、mg等矿物质元素，黄酮类和生物碱类化合物，黑米及其加工产品在食品、医药和化妆品行业有着广泛的应用。此外，黑米还含有丰富的花青素，一类具有抗氧化特性的水溶性黄酮类化合物。黑米中主要的花色苷是矢车菊素
‑3‑
葡萄糖苷，而芍药素
‑3‑
葡萄糖苷是次要成分。在自然界中，花色苷是花朵，水果和谷物的鲜艳色彩的原因。花青素因其抗氧化，抗炎和降血糖等作用，以及包括抗诱变和抗癌活性的其他生物作用被认为是生物活性物质，受到广泛关注。近年来，随着对合成色素危害性认识的更加深入，天然色素越来越受到重视。开发提取天然色素，代替人工合成色素作为着色剂，已经成为食品、药品、化妆品行业的发展趋势。因此，利用黑米提取花青素作为天然添加剂，具有重要的经济效益和社会效益。
3.目前，从黑米中提取花青素的方法主要包括溶剂浸提法和辅助提取法。其中，溶剂浸提法因其提取成本低，工艺简单等优点被广泛使用。然而，细胞壁内存在多糖如半纤维素，淀粉，果胶，降低了常规提取技术的提取效率。且，常规提取技术都不可避免地存在痕量的有机溶剂，如无水甲醇，乙醇和丙酮，低提取产率，时间效率低和提取质量差等问题。因此，利用绿色和新颖的提取方法来提取花色苷是当前食品工业的发展趋势。酶辅助从植物中提取生物分子是传统溶剂提取方法的潜在替代方法之一，与传统方法相比，酶辅助提取方法具有更低的能量消耗，更高的提取率以及更少的溶剂用量。但是，天然酶在食品工业中的应用，由于其操作稳定性低，回收程序复杂和再次利用难等缺点受到阻碍。这些缺点通常可以通过酶的固定化得到的固定化酶来克服。酶的固定化可用作增强酶的操作性能，改善酶的稳定性以实现可扩展性。并且，酶固定化改善了酶催化性能和热稳定性以及对有机溶剂的耐受性，使其具有工业和经济可行性。
4.四氧化三铁(fe3o4)纳米粒子作为磁性微球是一种最流行的磁性固定材料，具有高饱和磁化强度，超顺磁性和大的比表面积，目前在药物输送和酶固定领域受到广泛关注。用磁性颗粒代替常规载体，可以通过在磁场中使用快速分离方法来回收固定化酶，但裸露的fe3o4不稳定，很容易在空气中被氧化成其他物质，从而降低了材料的磁性能和分散性；同时fe3o4的暴露表面具有化学活性，会导致酶蛋白失活。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术存在的问题，本发明提供用于从黑米中提取花青素的固定化酶及制备和使用方法，制备方法简单，成本低，环境友好，不仅提高了固定化酶的使用效率和可重复使用次数，同时提高了花青素的提取效率。
6.本发明是通过以下技术方案来实现：
7.用于从黑米中提取花青素的固定化酶的制备方法，包括如下步骤：
8.步骤1，将表面包裹有sio2的fe3o4纳米粒子分散在乙醇中，得到分散液，之后在分散液中加入3
‑
氨丙基三乙氧基硅烷后进行恒温处理，得到混合体系a，3
‑
氨丙基三乙氧基硅烷和所述纳米粒子的比例为1ml:1g，最后将所得的产物从混合体系a中分离并依次清洗、干燥，得到fe3o4/sio2‑
nh2纳米粒子；
9.步骤2，将fe3o4/sio2‑
nh2纳米粒子浸泡在戊二醛水溶液中，戊二醛将fe3o4/sio2‑
nh2纳米粒子中的氨基氧化成醛基，得到混合体系b，将所得的产物从混合体系b中分离并依次清洗、干燥，得到戊二醛活化的fe3o4/sio2‑
nh2纳米粒子；
10.步骤3，将戊二醛活化的fe3o4/sio2‑
nh2纳米粒子浸泡在温度为20
‑
70℃、ph为4.5
‑
7.0的酶液中进行固定，得到固定液，酶液由纤维素酶水溶液和α
‑
淀粉酶水溶液混合得到，纤维素酶和α
‑
淀粉酶的摩尔比为1:2，将所得的产物从固定液中分离并清洗，得到用于从黑米中提取花青素的固定化酶。
11.优选的，步骤1所述的fe3o4纳米粒子按如下过程得到，
12.将每2g fe3o4纳米粒子分散在200ml乙醇和40ml去离子水中，然后加入16ml质量分数为25％的氨水混合均匀，得到混合液，再在混合液中加入5ml正硅酸乙酯恒温处理，得到混合体系a，最后将所得的产物从混合体系a中分离并依次清洗、干燥，得到所述的fe3o4纳米粒子。
13.进一步，步骤1在混合液中加入5ml正硅酸乙酯在30℃恒温下搅拌12h，得到混合体系a。
14.优选的，步骤1在分散液中加入3
‑
氨丙基三乙氧基硅烷后在50℃恒温搅拌10h，得到混合体系a。
15.优选的，步骤2中所述的戊二醛水溶液为质量分数为2％
‑
12％的戊二醛水溶液。
16.优选的，步骤3将戊二醛活化的fe3o4/sio2‑
nh2纳米粒子浸泡在20
‑
70ml所述的酶液中，在20
‑
70℃下搅拌1
‑
6h。
17.优选的，步骤2和步骤3均采用磁铁吸附的方式对产物进行磁性分离，之后弃去上清液，然后用ph为7的磷酸盐缓冲液清洗。
18.一种由上述任意一项所述的用于从黑米中提取花青素的固定化酶的制备方法得到的固定化酶。
19.上述固定化酶的使用方法，将所述的固定化酶、黑米皮和ph为5.5
‑
6的柠檬酸钠缓冲液混合均匀，其中所述的固定化酶与黑米皮的质量比为9：10，固定化酶与黑米皮的总质量与柠檬酸钠缓冲液的质量比为1:(20
‑
70)，该柠檬酸钠缓冲液的温度为20
‑
70℃，该固定化酶对花青素进行提取，提取时间为30
‑
180min。
20.进一步，所述的黑米皮按如下方式得到，
21.将黑米粉碎后过200目筛，得到所述的黑米皮。
22.与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
23.本发明用于从黑米中提取花青素的固定化酶的制备方法，将表面包裹有sio2的fe3o4纳米粒子用作固定酶的载体，一方面较高的比表面积能够结合更多的酶，有利于较高的结合效率；另一方面固定化的酶可以在磁场下分离然后再利用，从而降低了操作成本，之后在aptes修饰的磁性fe3o4纳米粒子上引入醛基活性基团同时固定了纤维素酶和α
‑
淀粉
酶，为磁性纳米粒子固定化酶提供了新的方法，利用磁性材料具有的磁性回收酶，提高了酶的利用效率，无有机溶剂残留，利于花青素的稳定性，适宜产业化生产。
附图说明
24.图1为本发明实施例2得到的固定化酶在10μm下的电镜扫描图。
25.图2为本发明实施例2得到的固定化酶在1μm下的电镜扫描图。
26.图3为本发明实施例2得到的固定化酶的傅里叶红外图。
27.图4为本发明实施例2得到的固定化酶的x衍射图。
28.图5为本发明实施例2得到的固定化酶的磁力吸附曲线。
29.图6为本发明实施例2得到的固定化酶分离时的实物图和提取完花青素分离时的实物图。
具体实施方式
30.下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
31.本发明一种用于从黑米中提取花青素的固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
32.s1：在参数优化的基础上利用teos在fe3o4纳米粒子表面包裹sio2；
33.准确称取2g粒径为30nm的fe3o4纳米粒子，分散在200ml乙醇和40ml水中，超声45min以分散均匀，然后加入16ml氨水(质量分数为25％)搅拌30min，再加入5ml正硅酸乙酯(teos)，在30℃恒温搅拌12h，静置后采用磁铁吸附的方式对产物进行磁性分离，依次用无水乙醇和蒸馏水洗涤，在60℃烘干，得羟基功能化的fe3o4，记为fe3o4@sio2；
34.合成机理：溶胶
‑
凝胶法是磁性纳米粒子包裹sio2涂层最常用、最成功的方法。该技术原理是，正硅酸乙酯(teos)首先与水反应生成硅醇，然后硅醇之间脱水缩合生成硅氧硅键(硅上含有游离羟基)，sio2就成功的包覆在fe3o4表面。
35.s2：在参数优化的基础上利用aptes在fe3o4@sio2表面修饰氨基；
36.准确称取2g fe3o4@sio2纳米粒子，分散在200ml乙醇，超声30min，加入2ml 3
‑
氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，在50℃恒温搅拌10h，静置后采用磁铁吸附的方式对产物进行磁性分离，依次用无水乙醇和蒸馏水清洗，在60℃烘干，得氨基功能化的fe3o4@sio2，记为fe3o4@sio2‑
nh2；
37.引入氨基的方法是采用带有氨基的硅烷偶联剂(aptes)与目标物进行反应。在无水条件下，aptes在二氧化硅表面的吸附和反应，硅氧烷键直接与二氧化硅表面羟基反应实现修饰。在无水条件下aptes的乙氧基直接与二氧化硅表面的si
‑
oh发生缩醇反应，形成si
‑
o
‑
si键，无水条件下aptes分子之间不会缩合，故形成较为规则的单分子层修饰。在酶固定化领域通常使用的是带有氨基功能基团的硅烷偶联剂，可以利用硅烷偶联剂上的氨基功能基团与之后的交联剂戊二醛形成稳定的shiff碱结构，实现酶的固定化。
38.s3：在fe3o4@sio2‑
nh2表面固定酶(纤维素酶和α
‑
淀粉酶)；
39.a：准确称取0.2g fe3o4@sio2‑
nh2纳米粒子，加入质量分数为2％
‑
12％的戊二醛20ml，戊二醛将氨基氧化成醛基，以便醛基与之后的酶反应，常温下搅拌3h，静置后采用磁铁吸附的方式对产物进行磁性分离，弃去上清液，用ph为7的磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤3次，
得到戊二醛活化的fe3o4@sio2‑
nh2。
40.b：向戊二醛活化的fe3o4@sio2‑
nh2中加入20
‑
70ml ph为4.5
‑
7.0的酶液，于20
‑
70℃下搅拌固定1
‑
6h，静置后采用磁铁吸附的方式对产物进行磁性分离，弃去上清液，用ph为7的pbs洗涤3次，得到固定化酶，重新分散在ph为5.5
‑
6的柠檬酸钠缓冲液中，在4℃保存备用。
41.酶液由1mg/ml的纤维素酶水溶液和2mg/ml的α
‑
淀粉酶水溶液按体积比为1:1的比例混合得到。
42.酶固定的原理：经过氨基修饰的磁性fe3o4用双功能基团试剂(戊二醛)引入醛基(
‑
cho)活性基团，然后酶的氨基(
‑
nh2)与双功能基团试剂修饰后的磁性纳米载体上的另一个没有被载体连接的醛基(
‑
cho)形成
‑
n＝c
‑
键，即席夫碱(schiff base)结构，将酶固定在载体上，形成具有磁响应性的固定化酶。特别地，酶固定前，应该对载体进行醛基的修饰，并将过量的戊二醛除去，因为戊二醛作为一种交联剂，当它单独存在于溶液中时它会优先与酶分子发生共价交联反应，形成三维网状交联结构。同时，戊二醛是蛋白的变性剂，过量的戊二醛会使蛋白质分子中毒，降低酶的活性。
43.酶活性：通过3,5
‑
二硝基水杨酸(dns)试剂法测定α
‑
淀粉酶和纤维素酶(固定或游离)的活性。固定之后，α
‑
淀粉酶和纤维素酶的活性回收率分别为55％
‑
71％和50％
‑
65％(以酶的初始活性为100％)。
44.s4：黑米粗粉碎分离出黑米皮；
45.黑米烘干，粉碎，过200目筛，得到黑米皮，用于提取花青素。
46.s5：利用固定化酶提取花青素；
47.将固定化酶、黑米皮和ph为5.5
‑
6的柠檬酸钠缓冲液混合均匀，其中固定化酶与黑米皮的质量比为9：10，固定化酶与黑米皮的总质量与柠檬酸钠缓冲液的质量比为1:(20
‑
70)，温度为20
‑
70℃，时间为30
‑
180min，固定化酶的循环使用次数1
‑
6次。
48.之后采用ph示差法测定花青素的含量。
49.提取率为200
‑
250mg/100g。
50.实施例1
51.准确称取2g粒径为30nm的fe3o4纳米粒子，分散在200ml乙醇和40ml水中，超声45min以分散均匀，然后加入16ml氨水(质量分数为25％)搅拌30min，再加入5ml正硅酸乙酯(teos)，30℃恒温搅拌12h，静置后采用磁铁吸附的方式对产物进行磁性分离，依次用无水乙醇和蒸馏水洗涤，在60℃烘干，得羟基功能化fe3o4，记为fe3o4@sio2。
52.准确称取2g fe3o4@sio2纳米粒子，分散在200ml乙醇，超声30min，加入2ml 3
‑
氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，在50℃恒温搅拌10h，静置后采用磁铁吸附的方式对产物进行磁性分离，依次用无水乙醇和蒸馏水清洗，在60℃烘干，得氨基功能化的fe3o4@sio2，记为fe3o4@sio2‑
nh2；
53.准确称取0.2g fe3o4@sio2‑
nh2纳米粒子，加入质量分数为4％、6％、8％的戊二醛20ml，常温下搅拌3h，静置后采用磁铁吸附的方式对产物进行磁性分离，弃去上清液，用ph为7的磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤3次。
54.向戊二醛活化的fe3o4@sio2‑
nh2中加入40ml上述ph为4.5的酶液，于30℃下搅拌固定4h，静置后采用磁铁吸附的方式对产物进行磁性分离，弃去上清液，用ph为7的pbs洗涤3
次，重新分散在ph为5.5
‑
6的柠檬酸钠缓冲液中，在4℃保存备用。
55.选择市售黑米烘干，粉碎，过200目筛，用于提取花青素。固定化酶用量为900mg/g，料液比为1:50，提取时溶液的ph为6.0，提取温度为20℃，提取时间为60min，固定化酶的循环使用次数1次。
56.实施例2
57.准确称取2g粒径为30nm的fe3o4纳米粒子，分散在200ml乙醇和40ml水中，超声45min以分散均匀，然后加入16ml氨水(质量分数为25％)搅拌30min，再加入5ml正硅酸乙酯(teos)，30℃恒温搅拌12h，静置磁性分离，用无水乙醇和蒸馏水洗涤，60℃烘干，得羟基功能化fe3o4即fe3o4@sio2。
58.准确称取2g fe3o4@sio2纳米粒子，分散在200ml乙醇，超声30min，加入2ml 3
‑
氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，50℃恒温搅拌10h，静置磁性分离，用无水乙醇和蒸馏水清洗，60℃烘干，得氨基功能化fe3o4@sio2即fe3o4@sio2‑
nh2；
59.准确称取0.2g fe3o4@sio2‑
nh2纳米粒子，加入质量分数为6％的戊二醛20ml，常温下搅拌3h，静置磁性分离，弃去上清液，用ph为7的磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤3次。
60.向戊二醛活化的fe3o4@sio2‑
nh2中加入40ml上述ph为6的酶液，于30℃下搅拌固定1h，静置磁性分离，如图6所示，弃去上清液，用ph为7的pbs洗涤3次，重新分散在ph为5.5
‑
6的柠檬酸钠缓冲液中，4℃保存备用。纤维素酶的活性回收率为62％，α
‑
淀粉酶活性回收率为71％。
61.选择市售黑米烘干，粉碎，过200目筛，用于提取花青素。固定化酶用量为900mg/g，料液比为1：50，提取时溶液的ph为5.5，提取温度为40℃，提取时间为90min，如图6所示进行磁性分离，花青素的提取率为268.18mg/100g，固定化酶的循环使用次数1次。
62.如图1和图2所示，固定化酶呈球形或椭圆形，粒径小于100nm。纳米颗粒尺寸越小，比表面积与体积比越大，从而提高了酶的固定化率。
63.傅立叶变换红外光谱用于表征fe3o4@sio2‑
nh2的合成，并证明纤维素酶和α
‑
淀粉酶与纳米载体的结合。fe3o4，fe3o4@sio2‑
nh2和固定化酶的ft
‑
ir光谱如图3所示。fe
‑
o
‑
fe拉伸振动的特征吸收峰出现在590cm
‑1附近，表明fe3o4@sio2‑
nh2和fe3o4@sio2‑
nh2颗粒与纤维素酶和α
‑
淀粉酶的结合存在fe3o4纳米颗粒。另外，1628cm
‑1和3440cm
‑1分别表示o
‑
h变形振动和
‑
oh拉伸振动。800cm
‑1和460cm
‑1特征峰对应于si
‑
o
‑
si的对称拉伸振动和si
‑
o键的弯曲振动，可以证明硅烷聚合物在fe3o4纳米颗粒表面的吸附。949cm
‑1处的特征吸收峰对应si
‑
o
‑
h拉伸振动和si
‑
fe
‑
o振动。此外，在固定酶纳米颗粒上观察到1418cm
‑1处的特征峰，对应于c＝n拉伸振动。最后，固定化酶在1543cm
‑1(c＝o拉伸振动)，1650cm
‑1(n
‑
h)的ft
‑
ir光谱的特征波数证明酶成功固定在fe3o4@sio2‑
nh2纳米颗粒上。
64.x射线衍射用于分析固定纤维素酶和α
‑
淀粉酶之前和之后的磁性纳米颗粒的晶体结构。如图4所示，三个样品的特征峰几乎相同，并且在2θ＝30.1、35.5、43.0、53.4、56.9和62.4处可以观察到特殊的衍射峰，分别对应于晶格面(220)，(311)，(400)，(422)，(511)和(440)。结果表明，固定纤维素酶和α
‑
淀粉酶后，fe3o4的晶体结构没有改变。
65.固定化酶的磁力吸附曲线分析了纳米载体和固定化酶纳米颗粒的磁性变化。如图5所示，fe3o4和固定化酶的饱和磁化强度分别为47.74和25.87emu/g。饱和磁化强度的降低表明纤维素酶和α
‑
淀粉酶已成功固定在fe3o4纳米载体上。另外，如图6可以看到，通过使用
磁铁简单地从溶液中分离分散的fe3o4和固定化酶来证明纳米载体和固定化酶的超顺磁性。
66.实施例3
67.准确称取2g粒径为30nm的fe3o4纳米粒子，分散在200ml乙醇和40ml水中，超声45min以分散均匀，然后加入16ml氨水(质量分数为25％)搅拌30min，再加入5ml正硅酸乙酯(teos)，30℃恒温搅拌12h，静置磁性分离，用无水乙醇和蒸馏水洗涤，60℃烘干，得羟基功能化fe3o4即fe3o4@sio2。
68.准确称取2g fe3o4@sio2纳米粒子，分散在200ml乙醇，超声30min，加入2ml 3
‑
氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，50℃恒温搅拌10h，静置磁性分离，用无水乙醇和蒸馏水清洗，60℃烘干，得氨基功能化fe3o4@sio2即fe3o4@sio2‑
nh2；
69.准确称取0.2g fe3o4@sio2‑
nh2纳米粒子，加入质量分数为6％的戊二醛20ml，常温下搅拌3h，静置磁性分离，弃去上清液，用ph为7的磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤3次。
70.向戊二醛活化的fe3o4@sio2‑
nh2中加入40ml上述ph为7的酶液，于30℃下搅拌固定1h、2h、3h、4h，静置磁性分离，弃去上清液，用ph为7的pbs洗涤3次，重新分散在ph为5.5
‑
6的柠檬酸钠缓冲液中，4℃保存备用。
71.选择市售黑米烘干，粉碎，过200目筛，用于提取花青素。固定化酶用量为900mg/g，料液比为1：50，提取时溶液的ph为5.5，提取温度为20℃，提取时间为60min，固定化酶的循环使用次数1次。
72.实施例4
73.准确称取2g粒径为30nm的fe3o4纳米粒子，分散在200ml乙醇和40ml水中，超声45min以分散均匀，然后加入16ml氨水(质量分数为25％)搅拌30min，再加入5ml正硅酸乙酯(teos)，30℃恒温搅拌12h，静置磁性分离，用无水乙醇和蒸馏水洗涤，60℃烘干，得羟基功能化fe3o4即fe3o4@sio2。
74.准确称取2g fe3o4@sio2纳米粒子，分散在200ml乙醇，超声30min，加入2ml 3
‑
氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，50℃恒温搅拌10h，静置磁性分离，用无水乙醇和蒸馏水清洗，60℃烘干，得氨基功能化fe3o4@sio2即fe3o4@sio2‑
nh2；
75.准确称取0.2g fe3o4@sio2‑
nh2纳米粒子，加入质量分数为6％的戊二醛20ml，常温下搅拌3h，静置磁性分离，弃去上清液，用ph为7的磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤3次。
76.向戊二醛活化的fe3o4@sio2‑
nh2中加入40ml上述ph为5的酶液，于30℃、50℃、60℃下搅拌固定4h，静置磁性分离，弃去上清液，用ph为7的pbs洗涤3次，重新分散在ph为5.5
‑
6的柠檬酸钠缓冲液中，4℃保存备用。
77.选择市售黑米烘干，粉碎，过200目筛，用于提取花青素。固定化酶用量为900mg/g，料液比为1：50，提取时溶液的ph为6.0，提取温度为20℃，提取时间为90min，固定化酶的循环使用次数1次。