一种促进堆肥腐熟真菌、筛选方法及应用

1.本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种促进堆肥腐熟真菌、筛选方法及应用。


背景技术：

2.好氧堆肥是依靠专性和兼性好氧微生物作用降解有机物的生化过程，将需要堆腐的有机料与辅料按一定的比例混合，在合适的水分、通气条件下，使微生物繁殖并降解有机质，从而产生高温，杀死其中的病原菌及杂草种子，使有机物达到稳定化。好氧堆肥是畜禽废弃物资源化、无害化处理的重要途径，在堆肥过程中微生物将易降解的有机物分解后吸收转化成自身细胞物质，并将不易降解的有机物矿化再腐殖化，其中矿化作用和腐殖化作用主要对应堆肥的一次发酵和二次发酵两个阶段。一次发酵指堆肥升温期和高温期，然后随着温度不断降低，堆肥进入二次发酵阶段，此阶段微生物进一步分解剩余的有机物，并将形成的矿物质腐殖化。
3.研究发现，我国畜禽粪便产生量增速放缓，总量逐渐趋于稳定，目前每年产生的养殖废弃物可达38亿吨，但综合利用率不到60％。那些未能资源化利用或未经过无害化处理的废弃物不仅严重污染环境，而且在一定程度上危害人畜健康。因此，如何提高畜禽养殖废弃物的综合利用率已成为当前亟待解决的问题。好氧堆肥是畜禽废弃物无害化处理和资源化利用的重要方式，然而在实际生产中，堆肥周期过长、场地有限以及发酵不充分等问题严重限制了堆肥效率。
4.接种特异性外源微生物是加快腐熟进程、缩短堆肥周期的一种有效方法，但是大多数外源微生物都是为了促进堆肥升温、提高一次发酵的效率和品质，目前市场上缺乏促进堆肥二次发酵的微生物菌剂。


技术实现要素：

5.本发明为了解决上述技术问题，而提供一种促进堆肥腐熟真菌、筛选方法及应用，筛选出一种促进堆肥腐熟真菌，能够加快腐熟进程、缩短堆肥周期。
6.本发明通过下述技术方案实现：
7.一种促进堆肥腐熟真菌，该菌株已于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号是：cgmccno.21024，其生物学分类命名为：链格孢alternaria sp.。其保藏编号是：cgmcc no.21024。
8.促进堆肥腐熟真菌的筛选方法，包括下列步骤：
9.s1：取腐熟鸡粪与灭菌水按重量份数比1:9加入到三角瓶中，室温下放置于摇床中振荡 30min，取出后静置5min，然后吸取上清液并用无菌水稀释成10
‑5浓度梯度的菌悬液；
10.s2：分别吸取0.1ml不同浓度菌悬液涂布于马丁氏培养基上培养7d，培育温度为25℃，挑取形态各异的真菌点接在改良马丁培养基上进行纯化，纯化后得到纯化真菌；
11.s3：将纯化真菌分别接到改良马丁培养基制备纯化真菌菌悬液，将纯化真菌菌悬液按10％的接种量接入含有50g鸡粪的三角瓶，放置于25℃恒温培养箱中培养7d，得到鸡粪样品；
12.s4：将鸡粪样品与去离子水按重量份数比1：9在三角瓶中混合，放置于摇床中震荡浸提 1h后过滤，吸取该滤液10ml，加到铺有滤纸的培养皿内，培养皿点播小麦种子，通过计算种子的发芽指数筛选出促进堆肥腐熟真菌。
13.进一步，所述步骤s2中马丁氏培养基的制备方法，包括下列步骤：
14.a1：按重量份数计，将5份蛋白胨、20份葡萄糖、1份磷酸氢二钾、0.5份硫酸镁、18 份琼脂、1000份蒸馏水混合，得到混合液；
15.a2：将混合液灭菌后倒入平板，加入1％孟加拉红水溶液、1％链霉素溶液，最终得到马丁氏培养基。
16.进一步，所述混合液、1％孟加拉红水溶液、1％链霉素溶液按重量份数计，为1044.5：3.3:3。
17.进一步，所述步骤s2中改良马丁培养基的制备方法，包括下列步骤：
18.b1:按重量份数计，将5份蛋白胨、20份葡萄糖、1份磷酸氢二钾、0.5份硫酸镁、2份酵母粉、18份琼脂、1000份蒸馏水混合，得到混合液；
19.b2:将混合液调节至ph6.2
‑
6.6。
20.促进堆肥腐熟真菌的应用，将促进堆肥腐熟真菌应用于堆肥二次发酵。
21.本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：本发明促进堆肥腐熟真菌能够极大提高堆肥二次发酵的效果。
附图说明
22.此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
23.图1为促进堆肥腐熟真菌腐熟效果图；
24.图2为二次堆肥过程中温度的变化；
25.图3为二次堆肥过程中ec的变化；
26.图4为二次堆肥过程中gi的变化；
27.图5为二次堆肥过程中总腐殖酸、胡敏酸、富里酸含量及pha的变化；
28.图6为二次堆肥过程中f3堆料的变化；
29.图7为不同培养天数下fcm3的菌落形态；
30.图8为pcr电泳图。
具体实施方式
31.下面结合实施例对本发明进行进一步描述。以下实施例仅为本发明的几个具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。
32.下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
33.下述的实施例中的百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。
34.实施例
35.在一个实施例中，一种促进堆肥腐熟真菌，其保藏编号是：cgmcc no.21024。
36.在一个实施例中，促进堆肥腐熟真菌的筛选方法，包括下列步骤：
37.s1：取腐熟鸡粪与灭菌水按重量份数比1:9加入到三角瓶中，室温下放置于摇床中振荡 30min，取出后静置5min，然后吸取上清液并用无菌水稀释成10
‑5浓度梯度的菌悬液；
38.s2：分别吸取0.1ml不同浓度菌悬液涂布于马丁氏培养基上培养7d，培育温度为25℃，挑取形态各异的真菌点接在改良马丁培养基上进行纯化，纯化后得到纯化真菌；
39.s3：将纯化真菌分别接到改良马丁培养基制备纯化真菌菌悬液，将纯化真菌菌悬液按10％的接种量接入含有50g鸡粪的三角瓶，放置于25℃恒温培养箱中培养7d，得到鸡粪样品；
40.s4：将鸡粪样品与去离子水按重量份数比1：9在三角瓶中混合，放置于摇床中震荡浸提 1h后过滤，吸取该滤液10ml，加到铺有滤纸的培养皿内，培养皿点播小麦种子，通过计算种子的发芽指数筛选出促进堆肥腐熟真菌。
41.在一个实施例中，所述步骤s2中马丁氏培养基的制备方法，包括下列步骤：
42.a1：按重量份数计，将5份蛋白胨、20份葡萄糖、1份磷酸氢二钾、0.5份硫酸镁、18 份琼脂、1000份蒸馏水混合，得到混合液；
43.a2：将混合液灭菌后倒入平板，加入1％孟加拉红水溶液、1％链霉素溶液，最终得到马丁氏培养基。
44.在一个实施例中，所述混合液、1％孟加拉红水溶液、1％链霉素溶液按重量份数计，为1044.5： 3.3:3。
45.在一个实施例中，所述步骤s2中改良马丁培养基的制备方法，包括下列步骤：
46.b1:按重量份数计，将5份蛋白胨、20份葡萄糖、1份磷酸氢二钾、0.5份硫酸镁、2份酵母粉、18份琼脂、1000份蒸馏水混合，得到混合液；
47.b2:将混合液调节至ph6.2
‑
6.6。
48.在一个实施例中，促进堆肥腐熟真菌的应用，将促进堆肥腐熟真菌应用于堆肥二次发酵。
49.实验例
50.1、菌株的选取
51.将实施例中纯化真菌分别接到液体改良马丁培养基制备菌悬液，按10％的接种量接入含有50g鸡粪的三角瓶，放置于25℃恒温培养箱中培养7d，得到鸡粪样品。分为五组，每组称取10g以上鸡粪样品到装有90ml去离子水的三角瓶中，放置于摇床中震荡浸提1h后过滤，得到浸提液，将10ml浸提液加到铺有滤纸的培养皿内，每个培养皿点播10粒饱满的小麦种子，取蒸馏水代替浸提液作为空白对照，在恒温培养箱中保持25℃培养72h，然后测量发芽率和根长，计算种子的发芽指数(gi)。
52.gi可以直接体现出堆料的植物毒性，同时也能够判断堆料的腐熟程度。经分离纯化获得5 株真菌，分别编号为fcm1
‑
fcm5。图1是5株真菌腐熟效果验证的结果。结果表明，添加真菌fcm1和fcm3的gi值分别比ck高了12.3％和12.5％，显著促进了鸡粪的腐熟(p<0.05)。因此，选取真菌fcm1和fcm3进行堆肥二次发酵应用研究。
53.2、堆肥二次发酵试验
54.试验原料：二次发酵试验以经过一次发酵无害化后的物料为试验原料，一次发酵无害化后的物料为鸡粪和食用菌渣混合堆肥10d后的堆料，一次发酵条件为50℃以上高温持续5d，最高温度为60℃。
55.二次发酵实验：试验设置3个组，分别为，对照组ck：试验原料加入1％无菌液体培养基； f1：试验原料加入1％fcm1菌液；f3：试验原料加入1％fcm3菌液。1％指菌液体积与干物质量之比，单位为l/kg)各实验原料和菌液充分混匀后准确称量60kg装入泡沫箱中进行堆肥二次发酵试验。试验采用人工翻堆，在第1、7、14、21、28、35、45、60d翻堆采样，测定了温度、ec、种子发芽指数、总腐殖酸、胡敏酸以及富里酸含量。
56.实验结果：
57.1)对堆肥温度的影响
58.如图2所示，二次发酵原料仍含有未腐熟的物料，因此本试验中各处理都经历了升温和降温的过程，最终与环境温度变化趋于一致。ck、f1和f3分别于堆肥第19、25和11d开始升温，至堆肥第27、35和17d达到最高温度。整个二次发酵过程中ck的最高温度仅达到 50℃，而添加真菌fcm3的处理不仅升温快，且高温(>50℃)持续时间也最长(13d)，较 ck处理多12d，表明fcm3的添加更能促进堆料的快速腐熟，更有利于畜禽粪便的无害化。
59.2)对堆肥ec的影响
60.如图3所示，14
‑
21d，f3的ec显著低于其他处理，说明fmc3的添加促进了该阶段的腐殖化过程，导致可溶性盐浓度降低，更有利于植物的生长。
61.3)对种子发芽指数的影响
62.如图4所示，f3的gi明显高于其它处理，并在35d达到完全腐熟，分别比ck、f1处理提前25d和10d，这表明真菌fcm3可以有效促进堆肥腐熟、使堆料无害化。
63.4)对总腐殖酸、胡敏酸以及富里酸的影响
64.各组的总腐殖酸、胡敏酸和富里酸含量变化如图5所示。由图5a可知，当堆肥结束时，各处理的总腐殖酸含量都保持在180g
·
kg
‑
1左右。胡敏酸是腐殖酸中的分子量大、稳定性高的物质，且含有多种功能基，如羧基、酚羟基等，也是最有利于土壤修复的物质。由图5b 可知，与初始阶段相比，堆肥结束时ck的胡敏酸含量降低了13.63g
·
kg
‑1，但f1和f3分别升高了3.99和7.65g
·
kg
‑1，这表明添加真菌后有利于胡敏酸的产生，且真菌fcm3效果更好。由图5c可知，当堆肥结束时，ck、f1和f3处理的富里酸含量分别为65.62、58.81 和45.17g
·
kg
‑1，f3处理的富里酸含量显著低于其它处理(p<0.05)。pha(胡敏酸/总腐殖酸)是用于评价堆肥腐质化程度的重要参数，其值越高则堆肥氧化程度及芳构化程度越高，较高pha的堆肥产物用于土壤后不仅促进植物根部的生长，还可以增强植物呼吸作用和光合作用。由图5d可知，与ck和f1相比，f3的pha在14
‑
21d迅速升高，且21d后高于其它处理；试验结束时，比未ck处理高了10.99％，表明f3的腐质化程度明显优于其他处理。
65.5)添加fcm3后堆料的变化
66.由图6可以看出，堆体表层出现少量白色真菌(7d)，而ck无明显变化，可以推测此真菌为fcm3；随着fcm3的生长，堆体表层遍布白色菌丝(14d)，而此时堆体的温度不断升高，这表明fcm3的生长有效促进了堆体升温；然而，当温度高于50℃时fcm3大量休眠或死亡(21d)； 28d时，堆体表层还有少量白色菌丝，此时堆料接近腐熟(gi＝77.14％)；35d后，白色菌丝消失，堆体温度不断降低并趋于环境温度，堆料完全腐熟。
67.综上所述，真菌fcm3能够显著促进堆肥二次发酵腐熟并提高堆肥品质，具有较好的应用前景。
68.3、菌株的鉴定
69.3.1fcm3的形态鉴定
70.将fcm3接种于改良马丁培养基中，在转速为150rpm，温度为25℃的恒温振荡培养箱中培养七天，并观察菌落形态，在第7天观察fcm3微观形态。
71.如图7所示，fcm3在改良马丁培养基上25℃条件下培养7天后菌落直径为70mm，菌落絮状。菌落初期为白色，老后变暗，背面褐色。fcm3的不育菌丝匍匐，分隔，分生孢子梗单生或成簇；大多数不分枝，较短，与营养菌丝几乎无区别；分生孢子倒棒状，顶端延长成喙状，淡褐色，有壁砖状分隔，暗褐色，数个成链。
72.3.2fcm3的分子鉴定
73.1)试剂盒的选用
74.选用dnasecure新型植物基因组dna提取试剂盒，其组成为：缓冲液lp1(bufferlp1)、缓冲液lp2 (buffer lp2)、缓冲液lp3(buffer lp3)、漂洗液pw(buffer pw)、洗脱缓冲液te(buffer te)、rnase a(10 mg/ml)、吸附柱cb3(spin columns cb3)、收集管(2ml)(collection tubes 2ml)。
75.2)真菌基因组dna的提取
76.(1)处理材料：从上述3.1fcm3的形态鉴定实验中，fcm3培养到第三天，刮取一定菌丝样品，加入液氮充分碾磨。加入400μl缓冲液lp1和6μlrnasea(10mg/ml)，旋涡振荡1 min，室温放置10min。
77.(2)加入130μl缓冲液lp2，充分混匀，旋涡振荡1min。
78.(3)12000rpm离心5min，将上清移至新的离心管中。
79.(4)加入1.5倍体积的缓冲液lp3(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，立即充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀。
80.(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)， 12000rpm离心30sec，倒掉废液，吸附柱cb3放入收集管中。
81.(6)向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)， 12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。
82.(7)重复操作步骤(6)。
83.(8)将吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
84.(9)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50
‑
200μl 洗脱缓冲液te，室温放置2
‑
5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
85.3)pcr扩增
86.将提取的基因组dna进行its序列扩增，用于扩增的pcr反应引物：正向引物its1(5
’ꢀ‑
tccgtaggtgaacctgcgg
‑3’
)；反向引物its4(5
’‑
tcctccgcttattgatatgc
‑3’
)。pcr扩增体系如下：1.0μl基因组dna(20ng/μl)，5.0μl 10
×
buffer(含2.5mm mg2+)，1.0μ l taq聚合酶(5u/μl)，1.0μl dntp(10mm)，1.5μl its1引物(10μm)，1.5μl its4 引物(10μm)，加入无菌去离子水39μl，形成50μl的扩增体系。扩增条件：95℃预变性5min；之后95℃变性30s，
58℃退火30s，72℃延伸7min，经35个循环；取3μl pcr 产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，确认pcr扩增片段。如图8所示，pcr产物电泳图结果表明片段扩增成功。
87.4)测序及比对结果
88.测序获得的fcm3序列如序列表所示，在ncbi数据库中进行blast比对后发现，真菌fcm3 与alternaria sp.基因序列同源性最高，达到99.81％，可以确定其为链格孢霉菌属。
89.以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。