本发明属于食品微生物、发酵技术领域，具体涉及一种提高鸟苷发酵菌株产率的方法。
背景技术：
鸟嘌呤核苷(简称：鸟苷)是生产鸟苷酸的原料，同时也是抗病毒药物三氮唑核苷和无环鸟苷的前体，鸟苷在食品、医药和化工等领域都有广泛的应用，鸟苷生产具有良好的发展前景。
上世纪60年代，日本学者zalkin等人开始对核苷酸代谢途径的调节机制进行研究，现已阐明了嘌呤代谢途径的调节机制，受到严格的反馈调控。目前提高鸟苷发酵产率的常用方法有菌种选育及方法优化。普通的菌种选育方法由于受严格的反馈调控作用，存在自然界自发突变高产鸟苷菌株的几率极低；传统的诱变方法工作量大、效率低；基因工程育种存在可能会引起生态危机、技术难度大、应用受禁止使用基因菌种的客户限制；选育单株在大生产应用中出现对方法调控适应性能差等缺点。
技术实现要素：
针对上述技术缺陷，本发明提供一种提高鸟苷发酵菌株产率的方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：a：确立菌种耐高温的目标温度值：根据生产方法对菌种耐高温的最高温度值+1℃制定菌种耐高温的目标温度，在本发明中，确立菌种耐高温的目标温度为40～42℃；
b：选取出发菌液：在以解淀粉芽孢杆菌作鸟苷生产菌的发酵生产过程中，选取发酵产率较高批次的发酵液，每隔6小时无菌抽取10～200ml不同周期的发酵液，暂存放于2～8℃冰箱，同步另外取样测定鸟苷含量、还原糖含量、发酵液体积，计算发酵糖酸转化率，选取发酵糖酸转化率最高时间段的发酵液作首次出发菌液。
所述步骤b的发酵糖酸转化率计算方法为：发酵液鸟苷含量×体积÷耗糖量＝发酵糖酸转化率。
c：出发菌液采用变温式定向培育：取出首次发菌液划线于固体茄瓶斜面基中，32～35℃培养20～24小时，将茄瓶斜面种用100ml生理盐水洗脱入5l发酵罐的发酵培养基中。发酵过程控制条件：温度为0小时34～35℃，12小时36～37℃，24～80小时37～42℃。24小时开始每隔6小时无菌抽取10～30ml不同周期的发酵液，暂存放于2～8℃冰箱，同步另外取样测定鸟苷含量、还原糖含量、发酵液体积，计算发酵糖酸转化率，选取24～80小时发酵液作变温式定向培育下一阶段的出发菌液。
所述步骤c的固体茄瓶培养基配方为：可溶性淀粉3.0±0.5％、酵母粉1.0±0.5％、蛋白胨0.5±0.1％、琼脂2.0±0.2％，ph7.0。
所述步骤c的5l发酵罐的发酵培养基配方为：葡萄糖12％、酵母粉2±0.5％、硫酸铵3.0±0.5％、磷酸二氢钾0.3±0.1％、硫酸亚铁0.002％，ph7.0。
按c步骤操作，重复1～5次变温式定向培育，每次温度升高0.5～1.0℃，直到5l罐最高温度达菌种耐高温的目标温度值。选取24～80小时的发酵液作终段出发菌液。
温度是影响微生物生长及代谢的关键因素之一，菌种生长最适温度并不一定是发酵的最适温度，也不等于积累代谢物的最适温度，采用变温式培养更利于提高产量。由于温度改变，可影响生物体内无数个酶反应，所以以往采用单一地提高选育种温度的方法获得的耐高温菌株，往往存在产量提不上去的大生产适用性差问题。为确立每次升温范围，进行了一系列的升温幅度试验，最终确立0.5～1.0℃最佳。采用本专利方法，所选耐高温菌株在大生产适用性明显提高，达提高产量目标。
e：挑选高产鸟苷的耐高温单菌株：取步骤d选得的终段出发菌液1ml用0.85％生理盐水梯度稀释至10－8，分别取10－4、10－5、10－6、10－7、10－8稀释液涂布在固体培养基平板上，每稀释涂布5个，制得平板种。32～35℃培养36～72小时，达单株菌落直径达0.8～1.5mm。
挑选单菌落分别接种于固体培养基斜面中，32～35℃培养24小时，接斜面种一环入摇瓶发酵基中，于往复式摇床7.5cm冲程、110～120rpa、37～40℃培养62～72小时，选取摇瓶发酵产率高的单菌株应用于f步骤。
所述步骤e的固体培养基配方为：可溶性淀粉3.0±0.5％、酵母粉1.0±0.5％、蛋白胨0.5±0.1％、琼脂2.0±0.2％，ph7.0。
所述步骤e的摇瓶发酵培养基配方为：葡萄糖12％、酵母粉2±0.5％、硫酸铵3.0±0.5％、磷酸二氢钾0.3±0.1％、硫酸亚铁0.002％，轻质碳酸钙3.0％，ph7.0。
f：发酵采用变温式控制方法：取步骤e选得的高产单菌株出发，将菌种划线于固体茄瓶斜面基中，32～35℃培养20～24小时，按生产接种量要求将茄瓶斜面种用适量生理盐水洗脱入发酵罐的发酵培养基中。发酵过程控制条件：温度为0小时34～35℃，12小时36～37℃，24～80小时37～42℃。培养至达放罐要求。
与现有技术相比，本发明的创新点在于：选取发酵产率较高批次、发酵糖酸转化率最高时间段的发酵液作为出发菌液，利用与生产方法高度融合的培养环境，通过定向改变育种环境温度，获得菌种特性更接近野生型菌株、耐高温的高产鸟苷菌株应用于鸟苷发酵生产，菌种对变温式调控方法适应能力更强，大大提高发酵菌株产率，使生产企业的生产成本大大降低，增强了企业市场竞争性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下操作中，未做详细说明的，均可按照分子生物学实验手册进行。
实施例：
a：确立菌种耐高温的目标温度值：根据生产方法对菌种耐高温的最高温度值+1℃制定菌种耐高温的目标温度为41℃。
b：选取出发菌液：在以解淀粉芽孢杆菌作鸟苷生产菌的发酵生产过程中，选取现阶段发酵产率较高批次的发酵液，每隔6小时无菌抽取10～200ml不同周期的发酵液，暂存放于2～8℃冰箱，同步另外取样测定鸟苷含量、还原糖含量、发酵液体积，计算发酵糖酸转化率，选取发酵糖酸转化率最高时间段(42小时)的发酵液作出发菌液。
所述步骤b的发酵糖酸转化率计算方法为：发酵液鸟苷含量×体积÷耗糖量＝发酵糖酸转化率。
c：出发菌液采用变温式定向培育：取出发菌液划线于固体茄瓶斜面基中，33℃培养24小时，将茄瓶斜面种用100ml生理盐水洗脱入5l发酵罐的发酵培养基中。发酵过程控制条件：温度为0～12小时34℃－12～24小时36℃－24～80小时38℃。24小时开始每隔6小时无菌抽取20ml不同周期的发酵液，暂存放于2～8℃冰箱，同步另外取样测定鸟苷含量、还原糖含量、发酵液体积，计算发酵糖酸转化率，选取24～80小时发酵糖酸转化率最高时间段(54小时)的发酵液作d步骤的出发菌液。
所述步骤c的固体茄瓶培养基配方为：可溶性淀粉3.0±0.5％、酵母粉1.0±0.5％、蛋白胨0.5±0.1％、琼脂2.0±0.2％，ph7.0。
所述步骤c的5l发酵罐的发酵培养基配方为：葡萄糖12％、酵母粉2±0.5％、硫酸铵3.0±0.5％、磷酸二氢钾0.3±0.1％、硫酸亚铁0.002％，ph7.0。
d：按c步骤操作，重复变温式定向培育，温度均升高0.5～1.0℃。取出发菌液划线于固体茄瓶斜面基中，33.5℃培养23小时，将茄瓶斜面种用100ml生理盐水洗脱入5l发酵罐的发酵培养基中。发酵过程控制条件：温度为0～12小时34.5℃－12～24小时37℃－24～80小时39℃。24小时开始每隔6小时无菌抽取20ml不同周期的发酵液，暂存放于2～8℃冰箱，同步另外取样测定鸟苷含量、还原糖含量、发酵液体积，计算发酵糖酸转化率，选取24～80小时发酵糖酸转化率最高时间段(48小时)的发酵液作e步骤的出发菌液。
e：按d步骤操作，重复变温式定向培育，温度均升高0.5～1.0℃。取出发菌液划线于固体茄瓶斜面基中，34℃培养22小时，将茄瓶斜面种用100ml生理盐水洗脱入5l发酵罐的发酵培养基中。发酵过程控制条件：温度为0～12小时35℃－12～24小时37.5℃－24～80小时40℃。24小时开始每隔6小时无菌抽取20ml不同周期的发酵液，暂存放于2～8℃冰箱，同步另外取样测定鸟苷含量、还原糖含量、发酵液体积，计算发酵糖酸转化率，选取24～80小时发酵糖酸转化率最高时间段(48小时)的发酵液作f步骤的出发菌液。
f：按e步骤操作，重复变温式定向培育，温度均升高0.5～1.0℃。取出发菌液划线于固体茄瓶斜面基中，35℃培养20小时，将茄瓶斜面种用100ml生理盐水洗脱入5l发酵罐的发酵培养基中。发酵过程控制条件：温度为0～12小时35.5℃－12～24小时38.5℃－24～72小时41℃。24小时开始每隔6小时无菌抽取20ml不同周期的发酵液，暂存放于2～8℃冰箱，同步另外取样测定鸟苷含量、还原糖含量、发酵液体积，计算发酵糖酸转化率，选取24～72小时发酵糖酸转化率最高时间段(42小时)的发酵液作g步骤的出发菌液。
g：挑选高产鸟苷的耐高温单菌株：取步骤f选得的出发菌液1ml用0.85％生理盐水梯度稀释至10－8，分别取10－4、10－5、10－6、10－7、10－8稀释液涂布在固体培养基平板上，每稀释涂布5个，制得平板种。35℃培养36小时，达单株菌落直径达0.8～1.5mm。
挑选单菌落分别接种于固体培养基斜面中，34℃培养22小时，接斜面种一环入摇瓶发酵基中，于往复式摇床7.5cm冲程、110～120rpa、37～41℃培养62～72小时，经检测选出摇瓶发酵产率最高的单菌株m201。
h：高产菌株应用于鸟苷发酵，发酵采用变温式控制方法：取步骤g选得的高产菌株m201出发，将菌种划线于固体茄瓶斜面基中，34℃培养22小时，按生产接种量要求将茄瓶斜面种用适量生理盐水洗脱入种子罐，培养10小时，转入发酵罐，种子罐及发酵罐培养基配比按原生产。发酵过程控制条件：温度为0小时34～35℃，12小时36～37℃，24～80小时37～42℃。培养至80小时，按生产要求测定发酵液鸟苷产率等放罐参数。
本专利实施结果：
1)、对采用本专利选育出的高产鸟苷菌株m201进行菌种遗传特性验证，结果该菌株经过用固体培养基斜面传代8次，f1→f8菌种生长及摇瓶发酵水平未呈下降趋势，菌种遗传特性稳定性良好。
2)、对采用本发明选育出的高产鸟苷菌株m201，按本发明所述变温式发酵控制方法进行大生产水平验证。结果该菌株在12m3罐应用，发酵鸟苷产率达＞70g/l，同比原菌种原方法，发酵产率提高幅度达＞16％，单批鸟苷产量明显提高。
检测方法如下：
纸层析法：用微量进样器精确吸取20μl上清液，点于3#新华滤纸上，层析液为氨水：水＝1：4。于展开缸内展开至层析液前沿到层析纸的2/3以上时，取出晾干下，用浓盐酸烟雾熏蒸5分钟，于253nm紫外灯下画出与标准样对应位置的紫色斑点，分别将斑点前剪下，用0.05mol/l的naoh溶液10ml浸泡60分钟，于752紫外分光光度计下260nm波长测定吸光度a值。将a值代入公式鸟苷含量g/l＝a值×12.5327×10。
标准：5％鸟苷标准液
仪器：纸层层析缸、紫外检测仪、752紫外分光光度计。
显然，本发明实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明实施方式的限定。在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。