一种用于酿造食醋澄清的微生物絮凝剂及其制备方法与应用与流程

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种用于酿造食醋澄清的微生物絮凝剂及其制备方法与应用。

背景技术：

絮凝剂广泛应用于废水处理、饮用水净化、食品和发酵加工等工业过程。絮凝剂可分为无机絮凝剂如铝盐(硫酸铝和聚氯化铝)、化学合成絮凝剂(聚丙烯酰胺和聚乙烯的衍生物)和生物絮凝剂三大类。在这些絮凝剂中,有机合成高分子絮凝剂由于其良好的絮凝效果和低成本而被广泛应用于实际生产之中。聚丙烯酰胺是较为常用的一种，但其具有难降解性，有证据表明丙烯酰胺单体是一种强致癌物，且具有强烈的神经毒性，残留于环境中的丙烯酰胺单体易造成二次污染。目前许多国家已禁止或限制使用此类絮凝剂。无机絮凝剂的使用会给食品和发酵工业的处理液中带入大量的无机离子，过量的无机离子不仅影响产品的风味和口感,也不利于人的健康，尤其是al³⁺的摄入，与目前日益增多的老年痴呆症的引发有直接关系；fe³⁺具有强腐蚀性，且易残留，能使被处理的水带有颜色，影响水质。成为处理、再生和再利用的一个新的问题。生物絮凝剂中壳聚糖、藻酸钠、几丁质等天然高分子絮凝剂虽无毒、能安全降解，但其絮凝活性较弱、成本较高，限制了其广泛应用。微生物絮凝剂是一类由微生物在生长过程中产生的，可以使水体中不易降解的固体悬浮颗粒、菌体细胞及胶体粒子等凝集、沉淀的特殊高分子聚合物。它易于分离、沉降效率高、可降解、其降解产物对环境无毒无害,不会产生二次污染，适应范围广，同时具有很好的除浊和脱色作用，是一种高效及对环境友好的絮凝剂。由于微生物生长速度快，易于采取发酵工程等的方法实现产业化。因此，来源于微生物的生物絮凝剂受到越来越多的关注。微生物絮凝剂作为一种有前景的化学絮凝剂替代品，有望在各个领域得到越来越多的应用。

食醋在世界各地广泛用作酸性调味品已有数千年的历史。它们富含营养物质和生物活性化合物，包括氨基酸、糖、有机酸、多酚、黑色素和四甲基吡嗪。这些功能性化合物不仅可以增加醋的风味，而且在预防和治疗人类疾病中发挥重要作用，如调节血脂水平、减肥、抗疲劳、抗肿瘤等。食醋在整个酿造过程中，由于原料中的淀粉、纤维素、蛋白质和脂肪等大分子物质分解不彻底，致使食醋混浊，形成沉淀，影响食醋质量，所以，食醋在出厂前，都要进行澄清处理，否则在储存过程中，这些成分还会逐渐凝集，再次形成沉淀。目前醋的澄清方法主要有絮凝法、膜过滤法、酶澄清法。在这些方法中，絮凝法因其工艺简单、成本低而被广泛应用。在食醋的澄清过程中，有许多絮凝剂被报道，如膨润土、壳聚糖、蛋清等。然而，微生物絮凝剂在食醋澄清中应用与研究未见报道。

技术实现要素：

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一株高产生物絮凝剂菌株的发酵工艺，并将其应用于实际的食醋生产过程中澄清工艺处理。通过栗树类芽孢杆菌体斜面培养、一级种子培养、发酵培养液制备，cpc络合-醇沉提取纯化制备微生物絮凝剂，并应用于食醋澄清处理工艺中。

一种用于酿造食醋澄清的微生物絮凝剂制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将栗树类芽孢杆菌接入试管斜面培养基上进行活化，活化完成后用无菌水洗下得到菌悬液，接入含有种子培养液的三角瓶中进行种子培养，种子生长完成后，镜检无杂菌备用；

2)将发酵培养基装入发酵罐中，121℃高压灭菌20分钟后，接种步骤1)得到的种子，进行发酵培养，得到培养液；

3)对步骤2)得到的培养液进行提取纯化，获得微生物絮凝剂。

所述的一种用于酿造食醋澄清的微生物絮凝剂制备方法，其特征在于所述步骤1)中斜面培养基组成为：可溶性淀粉2.0％、蛋白胨0.5％、氯化钾0.05％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、琼脂2.0％，活化培养方法为：调整ph至7.0，对装有斜面培养基的试管进行121℃高压灭菌20分钟后，接种栗树类芽孢杆菌于28℃培养48小时。

所述的一种用于酿造食醋澄清的微生物絮凝剂制备方法，其特征在于所述步骤1)中种子培养液的组成为：可溶性淀粉1.0％、蔗糖1.5％、蛋白胨0.5％、氯化钾0.05％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％，种子培养方法为：对含有种子培养液的三角瓶进行121℃高压灭菌20分钟后，接种菌悬液于28℃培养30小时。

所述的一种用于酿造食醋澄清的微生物絮凝剂制备方法，其特征在于所述步骤2)中发酵培养基组成为：葡萄糖3.0％、硝酸钠0.1％、蛋白胨0.3％、氯化钾0.05％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％。

所述的一种用于酿造食醋澄清的微生物絮凝剂制备方法，其特征在于所述步骤2)中发酵培养方法为：培养温度28℃，通气量1vvm，初始ph为7.0，起始搅抖转速为300转/分钟，后搅拌转速与溶氧联动，控制最低溶氧为20％，培养时间36小时，至od600在2.5以上，补加发酵液体总体积的3.0％(w/v)蔗糖搅拌均匀后，放罐至培养盘中，控制液体深度不超过2.5cm，于26℃继续培养24小时，至培养液呈果冻状，所述发酵罐装料量为70％，接种量为3.0％。

所述的一种用于酿造食醋澄清的微生物絮凝剂制备方法，其特征在于所述微生物絮凝剂的主要成分为粘多糖，分子结构中含有氨基葡萄糖和糖醛酸。

所述制备方法得到的一种微生物絮凝剂。

所述的一种微生物絮凝剂在澄清酿造食醋中的应用。

所述的应用，其特征在于应用具体为：将酿造食醋加热至41.5℃，添加cacl2至其终浓度为0.32mm，再添加微生物絮凝剂至其终浓度为3.94mg/l。

本发明提供的方法新颖且易于操作，生产的微生物絮凝剂具有良好的食用安全性及较宽ph适用范围，适用ph范围2.0-9.0，在食醋等酿造食品、饮用水净化、废水处理等工业过程中具有重要的实用价值。本方法制备的发酵培养液中胞外多糖含量大于3.57％，粘多糖含量占比90％以上，本发明可使米醋的透光率(λ＝900nm)的增加240.63％以上，可应用于酿造食醋(ph2.9-3.5)的澄清。

附图说明

图1为微生物絮凝剂用量对透过率增加速率的影响；

图2为絮凝体系温度对透过率增加速率的影响；

图3为金属离子对透过率增加速率的影响；

图4为ca²⁺对透过率增加速率的影响。

具体实施方式

以下将通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：

栗树类芽孢杆菌(paenibacilluscastaneae)接种前首先在试管斜面上进行活化，28℃培养48小时，培养使用的斜面培养基组成为：可溶性淀粉2.0％，蛋白胨0.5％，氯化钾0.05％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.05％，琼脂2.0％，ph7.0；然后用无菌水洗下菌体细胞接入含100ml种子培养液的三角瓶(500ml)中，进行种子培养(28℃培养30小时)，培养基为可溶性淀粉1.0％，蔗糖1.5％，蛋白胨0.5％，氯化钾0.05％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.05％。种子生长完成后，镜检无杂菌备用。

配制7l发酵培养基，培养基配方为葡萄糖3.0％，硝酸钠0.1％，蛋白胨0.3％，氯化钾0.05％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.05％。装入到10l发酵罐中，121℃高压实消灭菌20分钟，接种200ml已培养好的三角瓶种子。调整培养基初始ph值7.0。控制培养条件：温度28℃，通气量1vvm，控制ph为7.0，起始搅拌转速为300转/分钟，后搅拌转速与溶氧联动，控制最低溶氧为20％，培养时间36小时，至od600在2.5以上，补加发酵液总体积的3％蔗糖(w/v)搅拌均匀后，放罐至培养盘，控制液体深度不超过2.5cm，于26℃继续培养24小时至培养液呈果冻状。

将培养液收集后加入3倍体积水稀释，滤布过滤，去除菌体细胞。加入2.0％(w/v)氯化十六烷基吡啶(cpc)，直到不再形成不溶性的cpc-生物絮凝剂络合物。在沉淀中加入0.6mol/lnacl盐水直至溶解完全，再加入3倍体积乙醇进行醇沉6小时，除去上清液，醇沉物进行冻干即获得纯化的微生物絮凝剂。

微生物絮凝剂在食醋澄清处理工艺中的使用方法及剂量为食醋温度加热至41.5℃，添加至终浓度为0.32mm的cacl2，再添加至终浓度为3.94mg/l微生物絮凝剂。其在此条件下，食醋的透光率(λ＝900nm)的可增加240.63％以上。

实施例2：微生物絮凝剂在酿造食醋应用条件的优化

1、食醋絮凝效果测定方法

收集深层液态发酵食醋，以透过率作为衡量纯化生物絮凝剂在米醋中的絮凝效果的指标。将纯化的生物絮凝剂溶液1ml加入100ml米醋中。搅拌2min，静置10min，取上清液分析。在900nm波长下测定上清液的透过率。对照组除用样品溶液代替蒸馏水外，其余均按相同过程制备。

透射率的增加速率(increaserateoftransmittance,irt)计算如下:

a:初始值；b：絮凝处理后值

2、食醋絮凝条件单因素优化方法

2.1微生物絮凝剂的投加量对絮凝效果的影响

微生物絮凝剂投加量在1～11mg/l范围内考察了其对食醋透过率增加率的影响，结果见图1。

如图1所示，微生物絮凝剂投加量在1～11mg/l范围内的irt超过48％，当最佳生物絮凝剂投加量为3.0mg/l时，最大irt达到133.62％。生物絮凝剂不足时，微生物絮凝剂桥接现象不能有效形成。相反，带负电荷的生物絮凝剂过多会引起带负电荷粒子的排斥，同样会减小有效体积，导致稳定性变差。这与微生物粘多糖絮凝剂特性是一致的。

2.2絮凝体系温度对絮凝效果的影响

絮凝体系温度对絮凝效果的影响见图2。随着温度的升高，絮凝活性逐渐增大，达到40℃时达到最大值，之后絮凝活性逐渐减小。这可能是由于高温改变了生物絮凝剂的空间结构，导致絮凝效率降低。

2.3金属离子种类及浓度对絮凝效果的影响

为了达到较高的絮凝活性，在絮凝过程中通常加入金属阳离子，以增强絮凝剂的桥联和中和作用絮凝。阳离子种类对絮凝效果的影响见图3，ca²⁺浓度对絮凝效果的影响见图4。

由图3显示，三价离子(al³⁺和fe³⁺)和二价离子(ca²⁺、mg²⁺和fe²⁺)比一价离子(na⁺和k⁺)更有效。考虑到高成本和其他考虑(fe²⁺容易氧化和使系统着色，al³⁺容易导致阿尔茨海默病)，ca²⁺是理想的助凝剂。从图4中可以看出，当ca²⁺浓度为0.3mm时，絮凝效率较高。

3.box-behnken设计进一步优化食醋絮凝条件

在单因素试验的基础上，利用box-behnken设计对这些因素进行了进一步优化。试验进行了三次，以每次运行时的平均irt作为响应变量。采用design-expert10.0软件，根据二次多项式方程对rsm获取的数据进行分析。试验结果及方差分析分别见表1及表2。

表1.box-behnken设计及其测量值

表2.絮凝条件方差分析

生物絮凝剂投加量、絮凝体系温度和氯化钙是影响絮凝效果的重要因素。box-behnken设计优化这些因素，以irt的平均值为响应变量。将方差分析得到的实际响应值与预测响应值进行比较，结果表明，模型概率p(pmodel＝0.0009)具有统计学意义，对絮凝效率的预测是非常可靠的。拟合值的缺失不显著(p＝0.1292)，能较好地预测絮凝效率。决定系数(r²＝0.9504)表示模型的充分性，占响应变异性的95.04％。利用design-expert10.0中的“numericaloptimization”函数得到生物絮凝剂的最佳条件。当絮凝剂为3.94mg/l,cacl2为0.32mm，絮凝体系温度为41.5℃时，透光率的最高增幅为241.04％。为验证模型的重现性，所有实验均在最佳条件下进行。结果表明透射率的提高率分别为240.63％、242.51％和243.64％。说明该模型可以合理优化米醋的絮凝条件，预测米醋澄清的絮凝效率。

实施例3：本发明方法制备得到的产品安全性试验

1.小鼠急性经口毒性试验

将制备好样品匀浆机均匀分散于70℃蒸馏水中，配制成浓度为0.1g·ml^-1溶液，冷却至40℃备用。选用清洁级icr小鼠，体重为18-24g，雌雄各10只，灌胃前16h禁食，称重后受试物24h内分三次灌胃给予，灌胃容量为40ml·kg^-1，累计总剂量为12g·kg^-1。灌胃后4h给食，连续观察14d，记录中毒表现及死亡情况。

表3急性毒性小鼠体重增长记录

注：*与对照组比差异显著(p<0.05)，**与对照组比差异极显著(p<0.01)

小鼠给药后外观毛色光亮、无兴奋、不安、窜动、跳跃、竖毛、流泪、流涎、凸眼、扭体反应现象；给药后摄食、取水、大小便等均无明显异常。观察期间无动物死亡，体重增长记录见表3。给药14d后，颈椎脱臼处死小鼠，进行心、肝、脾、肺、肾、子宫、睾丸、胃、肠等重要脏器病理检查，均未见出血、充血、水肿、渗出、溃疡、穿孔、胸腔、腹腔、心包膜无积液等明显的病理变化。结果表明，粘多糖粉雌雄两性小鼠经口最大耐受度均大于12g·kg^-1。根据急性毒性分级，样品属无毒级。

2.小鼠骨髓细胞染色体畸变试验

选用25-30g健康icr小鼠50只，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。制备的样品分为1.0、2.0、4.0g·kg^-1三个剂量组，阳性对照组用环磷酰胺(cp)40mg·kg^-1，用蒸馏水配至所需浓度。溶剂对照组用蒸馏水，给予受试物3次，每次间隔24h，在末次给受试物后24h取材，处死动物前2h按4mg·kg^-1体重腹腔注入秋水仙素。小鼠颈椎脱臼处死取股骨，将骨髓洗入10ml离心管中，反复冲洗数次后，用吸管混匀制成1.0ml细胞悬液。染色后用油镜进行细胞中期染色体分析，每只动物分析100个中期相细胞。

表4小鼠骨髓细胞染色体畸变试验结果

由表4可以看出，样品各剂量组与阴性对照组比较，无明显差异，与阳性对照组(cp组)差异较大，且各试验结果染色体畸变率无剂量反应关系。表明该样品无致小鼠骨髓细胞染色体畸变的作用。

3.小鼠精子畸形试验

雄性清洁级icr小鼠25只，体重28-35g，随机分为5组，每组5只。剂量分别为1.0、2.0、4.0g·kg^-1三组，另设阴性对照组和cp阳性对照组(50mg·kg^-1)灌胃给予受试物，连续5d，至首次给受试物后的第35d用颈椎脱臼法处死小鼠，取出两侧副睾，放入盛有2ml生理盐水的平皿中。用眼科剪将副睾纵向剪1-2刀，静止3-5min，轻轻摇动。用合成纤维血网袋过滤，吸滤液涂片。空气干燥后，用甲醇固定5min以上干燥，用1.5％伊红染色1h，用水轻冲，干燥。每组记数5只动物，每只动物计数1000个结构完整的精子，计算畸变精子发生率(以百分率计)。

表5精子畸形试验结果

由表5可知，样品各剂量组与阴性对照组比较，无明显差异，与阳性对照组(cp组)比差异较大，且各试验结果染色体畸变率无剂量反应关系。表明在实验条件下，该样品对小鼠精子无畸变作用。

4.30d饲喂试验

清洁级icr小鼠80只，体重18-24g，随机分成4组，每组20只，雌雄各半。实验组分为剂量1.0、2.0、4.0g·kg^-1等高、中、低剂量三个剂量组。再设对照组一个，每天灌胃同等剂量的蒸馏水。实验期间每天观察小鼠一般状态、体征、摄食量、饮水及粪便状况。每7d测一次体重，按体重变化调整给药量，连续观察30d。给药期满30d，禁食禁水12h后，摘眼球取血，检查血液学指标及血液生化学指标。取血后立即剖取动物肝、肾、脾、胃、睾丸或卵巢等脏器称重，根据体重计算器官重量系数，并进行肉眼观察形态变化。

4.1一般毒性反应

高、中、低三个剂量给药组及对照组小鼠在30d试验期内均活动正常，行为活泼，毛色光泽，进食饮水正常，大、小便无异常改变，无一死亡。

4.2体重测定结果

由表6可知，高、中、低三个剂量给药组体重增长正常，各组与对照组结果比较，未见显著性差异(p>0.05)。

表6小鼠体重测量结果

注：*与对照组比差异显著(p<0.05)，**与对照组比差异极显著(p<0.01)

4.3小鼠脏器系数测定结果

由表7可知，给药30d后，各剂量组与对照组结果比较，脏器系数未见显著性差异((p>0.05)。

表7脏器系数测定结果

注：*与对照组比差异显著(p<0.05)，**与对照组比差异极显著(p<0.01)

4.4血常规指标测定结果

由表8、9和10可知，各剂量组小鼠白细胞数量(wbc)、红细胞数量(rbc)、血红蛋白浓度(hb)、红细胞压积(hct)、平均红细胞压积(mcv)、平均血小板容量(mpv)、平均红细胞血红蛋白含量(mch)、嗜中性白细胞百分比(ne)、淋巴细胞百分比(ly)、嗜酸性粒细胞百分比(eo)、单核细胞百分比(mo)、嗜碱性粒细胞(ba)、平均红细胞血红蛋白浓度(mchc)、红细胞分布宽度(rdw)、血小板数量(plt)等指标与对照组比较差异均无显著性(p>0.05)。

表8血常规测定结果

表9血常规测定结果

表10血常规测定结果

注：*与对照组比差异显著(p<0.05)，**与对照组比差异极显著(p<0.01)

4.5血生化指标测定结果

由表11、12可知，各剂量组小鼠甘油三脂(tg)、总胆固醇(cho)、谷草转氨酶(got)、谷丙转氨酶(gpt)、肌酐(cre)、尿素氮(bun)、葡萄糖(glu)、总蛋白(tp)、白蛋白(alb)等血生化指标和对照组比较差异均无显著性(p>0.05)。

表11血生化测定结果

表12血生化测定结果

4.630d喂养小鼠的病理组织学检查

全面细致观察各组心、肝、肾、脾、胃、睾丸及卵巢等器官大小，形态、色泽、质感等均未见异常。各主要脏器无明显变性、坏死，光泽正常。