一种分离自华蟾素注射液的镇痛肽CI5及其应用

一种分离自华蟾素注射液的镇痛肽ci5及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医学领域，具体涉及一种分离自华蟾素注射液的镇痛肽ci5及其应用。


背景技术：

2.华蟾素是我国传统中药材中华大蟾蜍(buro bufo gargarizans cantor)或黑眶蟾蜍(bufo melanostitus schneider)干皮的提取物，随着对华蟾素药理作用的深入研究，已证实华蟾素在抗炎、抗病毒、抗肿瘤、消肿止痛等方面具有重要的应用价值。已有研究表明，华蟾素具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导癌细胞凋亡、调节人类先天免疫反应且具有抗菌活性等功能。现阶段临床上将华蟾素用于治疗胃癌等多种晚期恶性肿瘤。随着临床研究不断的深入，大量数据表明华蟾素联合化疗、放疗对癌症有更好的治疗效果且能明显减少化疗或放疗引起的不良反应，除此之外还可缓解恶性肿瘤或化疗药物引起的癌性疼痛。目前国内外已有众多文献以及大量的临床研究表明华蟾素可有效缓解疼痛且能提高病患的生活质量
3.多肽是由10～100个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物。现在多肽在医学领域已有了广泛的用途，比如用于抑菌的抗菌肽，用于心血管疾病的多肽，检测病毒、细胞、支原体等的多肽等。近年来，来源于自然界的天然肽类分子因其镇痛活性好，毒副作用低，安全性高等优点一直被视为传统镇痛药物的替代品。因此，具有镇痛性的多肽也可能成为具有良好应用前景的临床候选药物。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供了一种分离自华蟾素注射液的镇痛肽ci5及其应用。所述镇痛肽ci5具有显著的镇痛活性和抗炎活性，其结构简单、制备方便。
5.为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：
6.本发明提供了一种分离自华蟾素注射液的镇痛肽ci5，所述镇痛肽ci5的氨基酸序列如seq id no.1所示。
7.进一步的，所述镇痛肽ci5具有显著的镇痛活性和抗炎活性。
8.进一步的，所述镇痛肽ci5分离自华蟾素注射液。
9.本发明还提供了所述的分离自华蟾素注射液的镇痛肽ci5在制备用于治疗或缓解疼痛的药物中的应用。
10.进一步的，所述疼痛包括炎症引起的疼痛、高温或热刺激引起的疼痛、腹痛、急性疼痛。
11.进一步的，所述镇痛肽ci5的使用浓度为5
‑
10mg/ml。
12.进一步的，所述镇痛肽ci5能够明显的缓解疼痛。
13.本发明还提供了所述的分离自华蟾素注射液的镇痛肽ci5在制备用于抗炎的药物中的应用。
14.进一步的，所述镇痛肽ci5能够明显的缓解炎症。
15.与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：
16.本发明从华蟾素注射液中分离纯化得到了具有镇痛活性的新型镇痛肽ci5，该镇痛肽ci5的氨基酸序列经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽，并且华蟾素注射液镇痛肽ci5具有结构简单、镇痛作用好的优点。本发明通过实验证明华蟾素注射液镇痛肽ci5具有很好的镇痛和抗炎作用，在小鼠疼痛实验动物模型实验和角叉菜胶足肿胀实验中均显示了良好的镇痛和抗炎的作用，且应用范围广泛，与其他的镇痛多肽相比，本发明的镇痛肽ci5的结构简单、获取方便，具有广阔的临床应用前景。
附图说明
17.图1为镇痛肽ci5注射后小鼠第一次扭体时间结果。
18.图2为镇痛肽ci5注射后20分钟内小鼠的醋酸扭体次数结果。
19.图3为镇痛肽ci5注射后小鼠舔足潜伏期结果。
20.图4为镇痛肽ci5注射后福尔马林实验小鼠一相结果。
21.图5为镇痛肽ci5注射后福尔马林实验小鼠二相结果。
具体实施方式
22.下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
23.实施例1
24.1、华蟾素注射液镇痛肽ci5的获取
25.华蟾素注射液购买自安徽华润金蟾药业股份有限公司，将华蟾素注射液进行蛋白多肽组学分析，根据多肽组学鉴定结果，从华蟾素注射液中共鉴定到120条不同的多肽分子。根据其氨基酸序列，采用固相合成法合成后，分别使用醋酸扭体实验、热板实验，福尔马林模型实验以及角叉菜胶模型实验进行镇痛活性筛选，从而获得具有镇痛活性的华蟾素注射液镇痛肽ci5。
26.2、镇痛肽ci5的分子鉴定
27.(1)氨基酸序列的测定：
28.将人工固相合成的多肽粗产物经过高效液相色谱纯化，纯化得到的华蟾素注射液镇痛肽ci5，在全自动蛋白质序列测定仪上经edman降解法，测定华蟾素注射液镇痛肽ci5的氨基酸全序列，结果表明华蟾素注射液镇痛肽ci5的序列为aglqfpvgr(seq id no.1)。
29.(2)质谱分子量测定：
30.通过基质辅助激光解吸飞行时间质谱(maldi
‑
tof
‑
ms)检测华蟾素注射液镇痛肽ci5的精确分子量，结果显示华蟾素注射液镇痛肽ci5质谱测定的分子量为944.10da。
31.实施例2：镇痛肽ci5的镇痛活性测定
32.为深入了解镇痛肽ci5的镇痛活性，本发明利用经典的醋酸扭体动物疼痛模型、热板法动物疼痛模型、福尔马林动物疼痛模型以及角叉菜胶动物疼痛模型进行了研究，结果表明镇痛肽ci5在以上四种动物疼痛模型中均显示了较好的镇痛活性，分述如下：
33.1、镇痛肽ci5对小鼠醋酸扭体疼痛模型的镇痛作用
34.实验动物采用spf级4周龄昆明种小鼠(体重18
‑
22g)。将小鼠随机分为对照组(无菌生理盐水)、阳性药物组(50mg/kg阿司匹林)、ci5组(50mg/kg镇痛肽ci5)，每组各10只小鼠。将镇痛肽ci5溶解于无菌生理盐水至稀释浓度为5mg/ml。ci5组的小鼠左侧腹腔注射5mg/ml的镇痛肽ci5稀释液200μl；阳性药物组小鼠左侧腹腔注射等体积的50mg/kg的阿司匹林；对照组小鼠左侧腹腔注射等体积的无菌生理盐水。30分钟后，三组小鼠的右侧腹腔注射250μl的0.7％的醋酸溶液，分别记录小鼠注射醋酸后第一次出现扭体的时间和20分钟内扭体的次数。
35.如图1和图2所示，镇痛肽ci5能延长小鼠第一次出现扭体的时间并减少小鼠醋酸扭体次数，显现了镇痛肽ci5对醋酸引起动物疼痛的具有明显的镇痛效果。
36.2、镇痛肽ci5对小鼠热板法疼痛模型的镇痛作用
37.实验采用雌性昆明小鼠(体重18
‑
22g)，先在实验前24小时筛选基础热痛阈在5
‑
30秒内的小鼠。将小鼠随机分为对照组(无菌生理盐水)、阳性药物组(50mg/kg阿司匹林)、ci5组(50mg/kg镇痛肽ci5)，每组各10只小鼠。将镇痛肽ci5溶解于无菌生理盐水至稀释浓度为5mg/ml。ci5组的小鼠采用腹腔注射5mg/ml镇痛肽ci5 200μl；阳性药物组小鼠腹腔注射等体积的50mg/kg阿司匹林；对照组小鼠腹腔注射等体积的无菌生理盐水。给药后半个小时，将三组的小鼠放入热板仪，记录小鼠第一次出现舔足的时间即舔足潜伏期。
38.如图3所示，实验结果表明镇痛肽ci5能提高小鼠对热板疼痛的痛阈，延长小鼠第一次舔后足的时间，说明镇痛肽ci5对高温或热刺激引起的疼痛具有镇痛效果。
39.3、镇痛肽ci5对福尔马林诱导的疼痛实验
40.将小鼠随机分为对照组(无菌生理盐水)、阳性药物组(50mg/kg阿司匹林)、ci5组(50mg/kg镇痛肽ci5)，每组各10只小鼠。将镇痛肽ci5溶解于无菌生理盐水至稀释浓度为5mg/ml。ci5组的小鼠采用腹腔注射5mg/ml镇痛肽ci5200μl；阳性药物组小鼠腹腔注射等体积的50mg/kg阿司匹林；对照组小鼠腹腔注射等体积的无菌生理盐水。腹腔注射给药30min后，于小鼠右后脚注射20μl3％的福尔马林溶液，记录一相(0
‑
5min)和二相(15
‑
30min)的舔足时间。
41.如图4
‑
5所示，实验结果表明ci5可显著降低小鼠一相、二相的舔足时间，说明镇痛肽ci5对强直期疼痛具有很好的镇痛效果。
42.4、角叉菜胶足肿胀实验
43.采用角叉菜胶致小鼠足肿胀实验评价镇痛肽ci5的抗炎作用。将小鼠随机分为正常组、模型组(卡拉胶)、阳性组(10mg/kg吲哚美辛)、ci5组(50mg/kg镇痛肽ci5)，每组各10只小鼠。正常组和模型组小鼠腹腔注射无菌生理盐水，ci5组小鼠注射5mg/ml镇痛肽ci5 200μl，阳性组小鼠注射10mg/kg吲哚美辛；在腹腔注射药物30min后，正常组小鼠右后足注射30μl生理盐水，模型组注射30μl 1％卡拉胶，阳性组和ci5组小鼠分别注射30μl 1％角叉菜胶，自2h后每隔一小时测量小鼠的右后足趾厚度。实验结果(表1)表明，由对照组和模型组数据比较可看出角叉菜胶小鼠模型建立成功，模型组和阳性组均在3h时达到肿胀程度的最高峰，与这两组相比，镇痛肽ci5在3h、4h、5h、6h时均有不同程度的抑制炎症的效果，其中3h时最为明显，说明镇痛肽ci5具有明显的抗炎作用。
44.表1：角叉菜胶模型小鼠足部肿胀实验结果
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综上所述，本发明通过系列实验获得了分离自华蟾素注射液的镇痛肽ci5，并通过各种小鼠疼痛实验动物模型实验证明镇痛肽ci5不仅具有显著的镇痛做作用，还具有明显的抗炎效果，而且应用范围广泛，可以用于治疗或缓解炎症以及炎症引起的疼痛、高温或热刺激引起的疼痛、腹痛、急性疼痛等多种疼痛，可以应用于治疗或缓解疼痛药物的制备。
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以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。