一种抗猪肺炎支原体高免血清及其制备方法与流程

[0001]
本发明属于生物血清制备技术领域，具体涉及一种抗猪肺炎支原体高免血清，并进一步公开其制备方法。


背景技术：

[0002]
猪支原体肺炎（mycoplasmapneumoniae of swine，mps）俗称猪喘气病，又称猪地方流行性肺炎，是一种由猪肺炎支原体（mycoplasma hyopneumoniae，mhy）引起的一种高发病率、低死亡率的猪慢性接触性呼吸道传染病。mps广泛分布于世界各地，大多数养猪国家均有报道此病发生，猪群中mhy感染率为30%-90%，主要表现为咳嗽和气喘，肺部呈现暗红色至灰色的“肉样”或“胰样”实变。猪支原体肺炎一般患猪死亡率不高，其主要危害是引起猪的生长受阻和饲料转化率大幅下降，长期生长发育不良，严重影响养猪业的经济效益。
[0003]
目前，免疫接种猪肺炎支原体疫苗是防控mps的重要措施之一，也是控制猪支原体肺炎最有效的方法，可有效减少肺部损失、提高饲料转化率、缩短出栏时间。通常在疫苗免疫后，效力实验的评价方法中，猪免疫攻毒实验是最有效的手段。但是，通常实验猪筛选较为困难，且人工费、饲养费成本高，实验时间也长达两个月。因此，寻找一种纯度高、特异性强、稳定性好的检测抗体，以体外相对效力检测方法代替动物攻毒实验，以实现便捷经济的体外效力检测，对于猪肺炎支原体疫苗的接种具有积极的意义。


技术实现要素：

[0004]
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种纯度高、特异性强、稳定性好的猪肺炎支原体高免血清检测抗体，可用于猪肺炎支原体疫苗的体外评价；本发明所要解决的第二个技术问题在于提供上述猪肺炎支原体高免血清的制备方法。
[0005]
为解决上述技术问题，本发明所述的一种抗猪肺炎支原体高免血清，其以保藏编号为cgmcc no.4545的猪肺炎支原体dj-166菌株制备的灭活疫苗为免疫原，并从免疫兔中分离血清制得。
[0006]
具体的，所述猪肺炎支原体dj-166株灭活疫苗为将所述猪肺炎支原体dj-166株灭活与油佐剂乳化制备而成。
[0007]
本发明还公开了一种制备所述高免血清的方法，包括如下步骤：（1）免疫：以保藏编号为cgmcc no.4545的所述猪肺炎支原体dj-166株的灭活疫苗为免疫原进行健康大白兔的免疫；（2）采血：于免疫完成后14-21天，检测抗体效价，当所述琼扩抗体效价≥1：16时即为合格，对大白兔进行采血；（3）血清分离：将采集的兔血进行培养，经固液分离收集血清，备用；（4）血清纯化：将收集的血清样品离心并收集上清液，采用protein a亲和柱进行纯化，收集目的峰位置的纯化样品，备用；（5）冻干：将收集血清样品除菌，并加入冻干保护剂进行冻干处理，即得。
[0008]
具体的，所述步骤（1）中，所述免疫步骤具体包括：第一次免疫为肌肉注射，免疫剂量3-5ml；在第一次免疫后14日进行第二次免疫，免疫剂量3-5ml，并分两点注射；在第二次免疫后14日进行第三次免疫，免疫剂量3-5ml，并分两点注射。
[0009]
具体的，所述步骤（3）中，37℃放置1-2h的步骤，以及于4℃放置4h-24h的步骤。
[0010]
具体的，所述步骤（4）中，所述protein a亲和柱纯化步骤中，以10-20mmol/l pb溶液平衡柱子，并以100-300mmol/l柠檬酸钠溶液进行洗脱。
[0011]
具体的，所述步骤（4）中，还包括在所述纯化样品中加入ph7.5-8.5的tris-nacl调节液的步骤。
[0012]
具体的，所述步骤（4）中，所述protein a亲和柱纯化步骤具体包括：将血清用冰冷的10-20mmol/l pb溶液稀释5倍，备用；再用冰冷的10-20mmol/l pb溶液平衡2.5ml的protein a亲和柱10-20个柱体；随后将20ml稀释的样品上柱结合；上样完毕用冰冷的10-20mmol/l pb溶液平衡2.5ml的protein a亲和柱10-20个柱体；再用100-300mmol/l柠檬酸钠溶液洗脱，每个组分收集1ml，收集完毕，立即加入ph8.0的tris-nacl调节混匀即可。
[0013]
优选的，所述方法还包括将所述高免血清进行冻干的步骤，即将收集血清样品除菌，并加入冻干保护剂进行冻干处理，得到血清冻干产品。
[0014]
具体的，所述冻干保护剂包括明胶、蔗糖、海藻糖、甘露糖或小牛血清白蛋白中的一种或几种的混合物；所述冻干保护剂的加入量占所述血清冻干产品总量的10-40wt%。
[0015]
本发明所述抗猪肺炎支原体高免血清，其以保藏编号为cgmcc no.4545的猪肺炎支原体dj-166菌株制备的灭活疫苗为免疫原，并从免疫兔中分离血清制得，其物理性状为淡黄色海绵状疏松团块且形状良好，加稀释液后可迅速溶解，无细菌、霉菌和支原体生长，无外源病毒污染，最重要的是，本发明所述高免血清来源于兔体，作为一种标准血清特异性抗体在特异性检验中，与猪肺炎支原体呈阳性反应，与猪鼻支原体抗原和猪絮状支原体抗原呈阴性反应；且-40℃以下保存，有效期为36个月，具有特异性强、稳定性好的优势，可用于制备猪肺炎支原体试剂和标准物质。
[0016]
本发明所述抗猪肺炎支原体高免血清的制备方法，通过将猪肺炎支原体dj-166株制备成灭活疫苗，并对健康新西兰大白兔进行免疫，当琼扩抗体效价≥1:16时，采血并分离血清，采用protein a亲和柱层析纯化血清进行冻干分装。本发明所述方法采用protein a亲和层析柱法纯化的血清比传统的离心法，对血清具有浓缩作用，制备的抗体纯度和浓度均有效提高，抗体效价是传统方法的两倍；而且有效的去除了非特异性成分，与猪源相关血清和抗原交叉反应低，特异性更强；本发明所述高免血清采用兔子制备的高免血清，并加入冻干保护剂组份，保存期比传统方法延长16个月，且稳定性更好。
附图说明
[0017]
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，图1为纯化步骤前后血清样品的sds-page电泳图；其中，泳道1为纯化后，泳道2为纯化前；图2为纯化后的血清与2771株和dj-166株的western-blot图；其中，泳道1：27714株猪
肺炎支原体菌体蛋白；泳道2：dj-166株猪肺炎支原体菌体蛋白。
具体实施方式
[0018]
本发明下述实施例所述猪肺炎支原体dj-166株是从山西发病猪肺脏分离，经过2次亚克隆而来，菌种免疫原性好，制备疫苗后免疫猪保护率80%以上，保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为：cgmcc no.4545。
[0019]
实施例1猪肺炎支原体dj166株灭活疫苗的制备本实施例中，所述猪肺炎支原体dj-166接种于改良的ch液体培养基中进行培养，所述ch液体培养基具体成分包括：a液：脑心浸出液2.0g、pplo肉汤5.0g、去离子水300ml以上成分混合，搅拌，使之完全溶解，116℃高压灭菌20分钟，冷却后备用；b液：10
×
hank’s液5.0ml、乳清蛋白水解物1.0g、酵母浸出液5.0g、丙酮酸钠0.8g，蛋白胨3.0g、硫代硫酸钠0.1g、0.1%酚红、青霉素400u/ml、去离子水545ml。以上各成分混合、搅拌，使之完全，用0.22um滤膜过滤除菌，4℃保存备用：c液：健康马血清140ml；将上述a液、b液和c液充分混合均匀，1mol/l氢氧化钠ph至7.6，制得猪肺炎支原体改良ch液体培养基。
[0020]
水相制备：取猪肺炎支原体dj-166种子按8%-10%的量接种于上述改良的ch液体培养基中，置37℃发酵罐20%通氧量培养3-4日，待培养基颜色变黄、呈轻度浑浊，ph值降至6.5-6.8时收获菌液；将收获的菌液进行活菌计数，活菌滴度不低于10
10
ccu/ml；50kd膜包浓缩至原体积的1/10，再以10000r/min、4℃离心60分钟，沉淀菌体用tris-nacl（ph7.2-7.4）缓冲液悬浮，离心洗涤3次，制成原培养物体积1/100菌悬液；将浓缩纯化菌悬液加入1.0%硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01%，混合均匀，置2-8℃灭活12小时。用bca试剂盒进行蛋白浓度测定，1/100浓缩菌液蛋白浓度应≥4mg/ml，将半抗原稀释成300ug/ml。
[0021]
油相制备：矿物油佐剂装入灭菌瓶内，121℃灭菌 30分钟，冷却后备用。先将 1份油相加入剪切机内，在低速搅拌的同时缓缓加入1份量的水相，以10000r/min搅拌5-8分钟，即成乳白色油乳剂灭活疫苗。
[0022]
实施例2血清制备本实施例所述抗猪肺炎支原体高免血清的制备方法，包括如下步骤：（1）免疫：取健康兔6只，分别肌肉注射上述实施例2中制得猪肺炎支原体灭活疫苗，3.0ml/只；具体的，第一次免疫：肌肉注射共3ml；第二次免疫：在第一次免疫后14日进行，免疫剂量3ml，分两点注射；第三次免疫：在第二次免疫后14日进行，免疫剂量3ml，分两点注射；（2）采血：于免疫完成后14-21天，检测抗体效价，当所述琼扩抗体效价≥1：16时即为效价合格，可对大白兔进行心脏采血；（3）血清纯化：将采集的兔血置37℃培养箱孵育1小时，2-8℃放置4小时，经3000r/min离心10分钟，分离并收集血清，备用；
（4）血清纯化：将收集的血清样品以10000r/min、4℃离心10分钟，取上清并过滤除菌，随后用冰冷的20mmol/l pb溶液稀释5，备用；用冰冷的20mmol/l pb溶液平衡2.5ml的protein a亲和柱10个柱体；随后将20ml稀释的血清样品上柱结合；上样完毕，用冰冷的20mmol/l pb溶液平衡2.5ml的protein a亲和柱10个柱体，并用100mmol/l柠檬酸钠溶液洗脱，每个组分收集1ml，收集完毕后立即加入ph8.0的tris-nacl调节溶液150μl，轻轻混匀即可；收集完毕用冰冷的20mmol/l pb溶液平衡2.5ml的protein a亲和柱10个柱体，重复操作对血清进行纯化，对纯化后的血清进行sds-page和western-blot检测。
[0023]
本实施例中，所述血清样品在进行protein a亲和柱层析纯化前后的血清样品的sds-page电泳图见附图1所示。
[0024]
分别将本发明纯化后的血清与2771株和dj-166株进行western-blot检测，检测结果如图2所示。结果可以看出，纯化后血清与猪肺炎支原体27714株和dj-166株抗原反应均出现特异性条带，表明纯化后阳性血清仍可与猪肺炎支原体发生特异性反应。
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实施例3血清效价测定采用琼脂扩散试验检测猪肺炎支原体抗体效价，1%琼脂糖平板制备1%琼脂粉+8%nacl加蒸溜水，水浴加温使充分溶化后，加入培养皿，每皿约20ml；平置，在室温下凝固冷却后，将琼脂板放在预先印好的7孔形图案上，用打孔器按图形准确位置打孔，中央孔孔径为4mm，周边孔孔径为3mm，孔距均为3mm。
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检测血清抗体经过倍比稀释，向中央孔滴加标准琼扩抗原，向周边孔滴加待检不同稀释度的血清和至少有一孔加阳性血清，均以加满而不溢出为度；将加样后的琼脂平皿加盖后平放于加盖的湿盒内，置37℃温箱中孵育，8-24h内观察并记录结果。以出现沉淀线的最大稀释度为血清的效价，最终测得血清效价结果见下表1。
[0026]
表1 免疫前、二免后和三免后21日血清抗体效价检测结果实施例4血清冻干产品采用牛血清白蛋白位冻干保护剂，按照20wt%的比例与5%的蔗糖与75%的纯化血清混合均匀，每瓶分装1ml，冻干程序如下表2所示，即得所需血清冻干产品。
[0027]
表2冻干程序对上述得到的血清冻干产品的一般性状进行检测，包括性状、纯净性检验、真空度和水
分检测，检测结果见表3。
[0028]
表3阳性血清性状及无菌检验结果注：
“−”
表示无菌生长；“+”表示有菌生长。
[0029]
从表3结果可以看出，本发明方案制备的阳性血清为淡黄色海绵状疏松团块，加稀释液后迅速溶解，且无菌生长。
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实施例5血清特异性检测将上述实施例2中制备的阳性血清分别与猪肺炎支原体、猪鼻支原体和猪絮状支原体抗原进行琼脂扩散试验，检验其特异性，同时分别设猪鼻支原体以及絮状支原体阳性血清对照和阴性血清对照，测试结果见表4。
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表4阳性血清效价测定和特异性检验结果实施例6血清稳定性检测将本方案制得的冻干阳性血清置于-40℃保存，分别于0、3、6、12、18、24、36和40个月进行性状检验、无菌检验、效价测定以及特异性检验，测试结果见表5。
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表5冻干阳性血清保存期试验结果
从表5结果可以看出，本发明制得冻干阳性血清产品于-40℃保存40个月，其性状无变化且无菌生长；琼扩效价以及特异性均符合阳性血清质量标准要求；为保证阳性血清质量，确定其-40℃以下保存，有效期为36个月。
[0033]
实施例7纯化方式选择本发明所述高免血清的制备方法中，对于血清样品的纯化采用了protein a亲和层析柱法纯化的方式，传统的纯化方法则是3000rpm-4000rpm/min，离心10-30min的分离的方式。
[0034]
分别采用如实施例1中protein a亲和层析柱法和相同其他操作条件下的传统的离心分离法进行血清样品的纯化，得到高免血清抗体的效价、纯度和浓度差异如下表6所示，稳定性差异见下表7。
[0035]
表6纯化方式对高免血清抗体效价、纯度和浓度差异的影响表7纯化方式对产品稳定性的影响
由上面数据可知，本发明方法采用protein a亲和层析柱法纯化的血清比传统的简单的离心法，对血清也有浓缩作用，制备的抗体纯度和浓度均有效提高，抗体效价是传统方法的两倍；而且有效的去除了非特异性成分，与猪源相关血清和抗原交叉反应低，特异性更强；本发明所述高免血清采用兔子制备的高免血清，并加入冻干保护剂组份，保存期比传统方法延长16个月，且稳定性更好。
[0036]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。