一种抗猪圆环病毒2型高免血清及其制备方法与流程

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本发明属于生物血清制备技术领域，具体涉及一种抗猪圆环病毒2型高免血清，并进一步公开其制备方法。


背景技术：

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猪圆环病毒（porcinecircovirus，pcv）是迄今发现的最小的动物病毒之一，现已知pcv有两个血清型，即pcv1和pcv2，pcv1为非致病性的病毒，pcv2为致病性的病毒。其中，猪对pcv2具有较强的易感性，感染猪可自鼻液、粪便等废物中排出病毒，经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪。pcv2是断奶仔猪多系统衰竭综合征、皮炎与肾病综合征等相关疾病的首要致病因子，给养猪业造成巨大的经济损失。据报道，猪圆环病毒2型（pcv2）在世界范围内广泛分布，血清学和病原学调查己证实全世界范围内许多国家和地区的猪群均存在pcv2感染，几乎100%的商品化养猪场感染过pcv2，严重影响世界养猪业的发展。
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我国在2000年首次报道了猪圆环病毒病，至今pcv2已在我国猪群中流行二十年。pcv2通常与其他多种病原混合感染，引发猪群发生严重的死亡率，较严重的地区暴病时死淘率高达40%。大量的流行病学研究表明，我国猪群中pcv2感染十分普遍，pcv2抗体阳性率高达80%以上，被调查的猪场阳性率高达100%。在2001-2012年期间，中国分离了258株pcv2株，其中有242株序列均为pcv2b基因亚型，约占比93.8%，证明我国近几年流行的毒株为pcv2b 亚型。
[0004]
目前，免疫接种猪圆环病毒2型灭活疫苗是防控pcv的重要措施之一。通常在疫苗免疫后，效力实验的评价方法中，猪免疫攻毒实验是最有效的手段。但是，通常实验猪筛选较为困难，且人工费、饲养费成本高，实验时间也长达两个月。因此，寻找一种纯度高、特异性强、稳定性好的检测抗体，以体外相对效力检测方法代替动物攻毒实验，以实现便捷经济的体外效力检测，对于种猪圆环病毒2型灭活疫苗的接种具有积极的意义。


技术实现要素：

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为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种纯度高、特异性强、稳定性好的抗猪圆环病毒2型高免血清检测抗体，可用于猪圆环病毒2型疫苗的体外评价；本发明所要解决的第二个技术问题在于提供上述抗猪圆环病毒2型高免血清的制备方法。
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为解决上述技术问题，本发明所述的一种抗猪圆环病毒2型高免血清，其以保藏编号为 cgmcc no 3064的猪圆环病毒2型病毒dbn-sx07株制备的灭活疫苗为免疫原，并从免疫猪中分离血清制得。
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具体的，所述灭活疫苗为将所述猪圆环病毒2型病毒dbn-sx07灭活与油佐剂乳化制备而成。
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本发明还公开了一种制备所述抗猪圆环病毒2型高免血清的方法，包括如下步骤：（1）感染免疫：以保藏编号为 cgmcc no 3064的猪圆环病毒2型病毒dbn-sx07株的灭活
hitrap
tm
mabselect亲和层析柱法进行冻干分装。本发明方法采用ge hitrap
tm
mabselect亲和层析柱法纯化的血清比传统的简单的离心法，对血清也有浓缩作用，制备的抗体纯度和浓度均有效提高，抗体效价也得到提高；而且有效的去除了非特异性成分，特异性更强；本发明所述高免血清加入冻干保护剂组份，保存期比传统方法延长16个月，且稳定性更好。
附图说明
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为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，图1为纯化后血清的sds-page电泳图图2为纯化后血清的western-blot图。
具体实施方式
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本发明下述实施例中，所用的猪圆环病毒ii型dbn-sx07株由福州大北农生物技术有限公司分离和鉴定，为当前中国流行毒株。该毒株已于2009年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏（简称cgmcc），保藏号为：cgmcc no.3064，分类命名为猪圆环病毒ii型porcine circovirus type 2。
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实施例1猪圆环病毒2型灭活疫苗的制备在pk15细胞上培养猪圆环病毒2型，收获培养的猪圆环病毒培养上清，纯化浓缩后，病毒效价1
×
107/ml，bei灭活后，进行下一步疫苗制备。
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弗氏完全佐剂疫苗制备：采用等体积的完全弗氏佐剂和猪圆环病毒2型灭活抗原混合，并于12000rpm/min混合乳化3-5min，4℃保存，备用。
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弗氏不完全佐剂疫苗制备：采用等体积的不完全弗氏佐剂和猪圆环病毒2型灭活抗原混合，并于12000rpm/min混合乳化3-5min，4℃保存，备用。
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实施例2血清制备免疫：以实施例1中制备的检验合格的弗氏完全佐剂（fca）疫苗于后颈部肌肉注射3周龄健康易感猪，每头4.0ml；免疫后21日，以同样剂量的不完全弗氏佐剂（fia）疫苗在同样位置和途径加强免疫1次。
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采血：在第二次免疫后的28日后进行试血，用猪圆环病毒2型elisa抗体检测试剂盒检测血清抗体效价，当抗体效价达到1：2000以上时，采猪全血，收集血清。
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血清分离：将采集的猪血置于37℃培养箱1h，然后4℃培养4h，经2000-3000r/min离心10分钟，分离并收集血清，置于-70℃保存。
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实施例3血清效价测定本实施例将灭活的血清采用猪圆环病毒2型elisa抗体检测试剂盒（jbt）进行抗体效价测定，对不同时间血清抗体的检测结果见下表1。
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表1 免疫前、二免后和三免后21日血清抗体效价检测结果
实施例4血清纯化将实施例2中灭活的血清离心以去除杂质，用pbs缓冲液稀释10倍，置于4℃采用ge hitrap
tm
mabselect 5ml预装柱低速循环挂柱；挂柱结束后，采用bio-rad ngctm chromatography system纯化。先用结合缓冲液（3m nacl+1.5m氨基乙酸，ph=9.0）平衡纯化系统并冲洗层析柱至基线平衡；然后使用洗脱缓冲液（0.2m氨基乙酸，ph=3.0），以5-10倍柱体积从0%b～ 100%b线性梯度洗脱目的抗体，洗脱出峰后，分管收集（管内预装50ul ph=9.0，tris-hcl缓冲液）各阶段洗脱液。
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本实施例中纯化后血清的sds-page电泳图和western-blot图分别见附图1-2所示。可见，猪抗pcv2特异性血清经过ge hitraptm 5ml预装柱纯化后的，经灰度扫描纯度可达90%以上；纯化的血清与pcv2cap蛋白反应出现28kd的目的条带；纯化的血清样品采用thermotm nanodrop2000检测a280紫外吸收浓度测定结果为0.64mg/ml。
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实施例5血清冻干采用牛血清白蛋白按照25wt%的比例与5wt%的蔗糖与70wt%的纯化血清混合均匀，每瓶分装1ml，冻干程序如下表2所示，即得所需血清冻干产品。
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表2冻干程序对上述得到的血清冻干产品的一般性状进行检测，包括性状、纯净性检验、真空度和水分检测，检测结果见表3。
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表3阳性血清性状及无菌检验结果
注：
“−”
表示无菌生长；“+”表示有菌生长。
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从表3结果可以看出，制备的阳性血清为淡黄色海绵状疏松团块，加稀释液后迅速溶解，且无菌生长。
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实施例6血清特异性检测对上述制备的血清特异性检验：采用ifa检测，中和组应无绿色荧光物质着染，病毒对照组细胞胞浆内应可见大量绿色荧光物质着染；elisa抗体检测试剂盒（jbt）抗体效价1:2000，具体检测结果见下表4。
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表4抗体效价测定和特异性检验结果从上表4结果可以看出，本发明制备的猪抗pcv2特异性血清抗体效价为1：2000；在特异性检验中，经过ifa检测，中和组无绿色荧光物质着染，病毒对照组可见大量绿色荧光物质着染。
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实施例7血清稳定性检测将上述实施例制备的冻干阳性血清置于-40℃保存，分别于0、3、6、12、18、24、36和40个月进行性状检验、无菌检验、效价测定以及特异性检验，检测结果见表5所示。
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表5猪抗pcv2特异性血清保存期试验结果
从上中表5结果可以看出，本方案制得猪抗pcv2特异性血清-40℃保存40个月，其性状与初始样品无显著差异，且无菌生长，抗体效价也未见降低。为保证血清质量，确定其-40℃以下保存，有效期为36个月。
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实施例8纯化方式选择本发明所述高免血清的制备方法中，对于血清样品的纯化采用了ge hitrap
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mabselect亲和层析柱法纯化的方式，传统的纯化方法则是离心分离的方式，3000rpm-4000rpm/min，离心10-30min的分离的方式。
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分别采用上述实施例中ge hitrap
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mabselect亲和层析柱法和相同其他操作条件下的传统的离心分离法进行血清样品的纯化，得到高免血清抗体的效价、纯度和浓度差异如下表6所示、稳定性差异见下表7。
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表6纯化方式对高免血清抗体效价、纯度和浓度差异的影响
表7纯化方式对血清产品稳定性比较由上面数据可知，本发明方法采用ge hitrap
tm
mabselect亲和层析柱法纯化的血清比传统的简单的离心法，对血清也有浓缩作用，制备的抗体纯度和浓度均有效提高，抗体效价也得到提高；而且有效的去除了非特异性成分，特异性更强；本发明所述高免血清加入冻干保护剂组份，保存期比传统方法延长16个月，且稳定性更好。
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显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。