鸭黄病毒与鸭圆环病毒二重rt-pcr检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种鸭黄病毒与鸭圆环病毒二重RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒含有两对特异性引物。本发明具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点，应用本发明可建立鸭黄病毒和鸭圆环病毒的二重PCR的检测方法，实现同时检测和鉴别鸭黄病毒与鸭圆环病毒两种病原体，用于鸭黄病毒感染造成的免疫力减低导致的鸭圆环病毒的混合感染，既可以节约时间的成本，又可以减少污染。
【专利说明】鸭黄病毒与鸭圆环病毒二重RT-PCR检测试剂盒【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种鸭黄病毒与鸭圆环病毒二重RT-PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]鸭黄病毒(Bai yang dian virus, BYD)又名鸭坦布苏病毒，主要引起种鸭和蛋鸭食欲急剧减退、产蛋急剧下降，卵泡变性，卵泡膜出血为主要特征。2010年以来，我国福建、浙江、江苏、山东、安徽、河南、河北、广东等地相继报道爆发了一种引起鸭产蛋大幅下降的疾病，给蛋鸭养殖业造成了很大的经济损失。鸭圆环病毒(Duck Circovirus, DuCV)是圆环病毒科圆环病毒属的一成员，首次在德国报道。近年来，相继有匈牙利、美国、中国台湾及我国山东、辽宁、福建、广东和广西等地发现有鸭圆环病毒造成鸭感染或发病的报道。DuCV造成鸭发病的主要临床表现为发育不良、体重下降及羽毛凌乱等，病理组织表现为法氏囊出现坏死淋巴细胞减少和组织细胞增多。组织细胞增生现象感染动物的淋巴组织逐渐萎缩导致免疫功能下降或免疫反应抑制进而提高了二重或多重感染的几率是圆环病毒感染的特征。鸭圆环病毒与其它病原菌或病毒的混合感染情形非常复杂。柴同杰对山东的樱桃谷鸭群鸭圆环病毒及混合感染的调查表明，鸭圆环病毒与鸭I型肝炎、鸭疫里默氏杆菌及大肠杆菌的混合感染率较高。屈素洁等对广西部分地区鸭圆环病毒感染情况进行调查，结果表明存在与鸭疫里氏杆菌、新城疫病毒、禽流感病毒和鸭肝炎病毒等病原混合感染现象。水禽圆环病毒不能在细胞和禽胚上生长，而且该病毒多以亚临床感染形式出现，所以用传统的分离病毒、动物试验方法无法进行诊断。 最初诊断圆环病毒主要靠病理组织和电镜观察，但这两种方法都需要专业的技能，并且敏感性不高。
[0003]由于BYD与DuCV均为严重危害养鸭业的传染病，特别是有混合感染时，更增加了临床诊断工作的难度。因此迫切需要建立快速敏感的鸭黄病毒和鸭圆环病毒检测技术，在感染早期就能检测出这些病毒，从而为这些病的控制争取宝贵的时间。目前，上述两种病毒的传统检测方法有血清中和试验、琼脂扩散试验和ELISA等，但这些检测存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点，在实际应用中具有一定的局限性。
[0004]PCR技术实现了对模板的定量，而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现多重反应等特点。在实际应用中，当样品量非常大时，单重PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量的快速检测。多重荧光PCR采用多对引物扩增检测多个模板，克服了单重PCR的不足。但是，建立二重或多重PCR方法比单重的要复杂得多，其对试剂和引物要求更高，同时需要保证不同引物间无相互干扰。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种操作简便、敏感性高、特异性强、重复性好的鸭黄病毒与鸭圆环病毒二重RT-PCR检测试剂盒，以实现同时检测和鉴别鸭黄病毒与鸭圆环病毒两种病原体。[0006]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:鸭黄病毒与鸭圆环病毒二重RT-PCR检测引物组，包括两对特异性引物，分别是引物I和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的碱基序列。
[0007]引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为0.5-1: 0.5_1:1:1。
[0008]引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为1:1:1:1。
[0009]上述鸭黄病毒与鸭圆环病毒二重RT-PCR检测引物组在二重PCR扩增方面的应用，二重PCR扩增的退火温度为50-60°C。
[0010]二重PCR扩增的退火温度为60°C。
[0011]鸭黄病毒与鸭圆环病毒二重RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒含有以下试剂:
[0012]A液:PCR反应液，含2XTaq PCR Mix (购自全式金.AS111-12)、BYD上下游引物、DuCV上下游引物、ddH20, BYD上下游引物分别是引物I和2，DuCV上下游引物分别是引物3和4，引物I至4分别具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的碱基序列；
[0013]B液:BYD+DuCV模板，作为阳性对照；
[0014]C液:ddH20，作为阴性对照。
[0015]PCR反应液含2XTaq PCR Mixl2.5 μ L、BYD上下游引物各0.5 μ l、DuCV上下游引物各0.5 μ l、ddH208.5 μ L，其中各引物浓度均为50 μ mol/mL ;B液含BYD+DuCV模板各I μ L，C 液为 2 μ L ddH20。`
[0016]上述鸭黄病毒与鸭圆环病毒二重RT-PCR检测试剂盒在二重PCR扩增方面的应用，二重PCR扩增的退火温度为50-60°C。
[0017]二重PCR扩增的退火温度为60°C。
[0018]针对目前缺乏对鸭黄病毒和鸭圆环病毒同时进行检测和诊断的有效可靠的技术，发明人研究设计了两对特异性引物，据此建立了鸭黄病毒和鸭圆环病毒的二重PCR的检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。本发明具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点，应用本发明可同时检测和鉴别鸭黄病毒与鸭圆环病毒两种病原体，用于鸭黄病毒感染造成的免疫力减低导致的鸭圆环病毒的混合感染，既可以节约时间的成本，又可以减少污染。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是二重PCR温度优化试验结果电泳图，图中:M:1OObp DNA ladder ;1_5:BYD引物 0.2μ L、0.4μ L、0.5μ L、0.6μ L、0.8μ L ；l-5:DuCV 引物 0.8 μ L、0.6 μ L、0.5 μ L、
0.4μ L、0.2μ L ;Ν:阴性对照。
[0020]图2 是二重 PCR 的优化结果电泳图，图中:Μ:1OObp DNA ladder ；1:50.0°C ；2:50.4°C ；3:51.5°C ；4:53.0°C ；5:54.8°C ；6:56.6°C ；7:58.4°C ；8:60.(TC。
[0021]图3是二重PCR特异性试验结果电泳图，图中:M:1OObp DNA ladder ;N:阴性对照CddH2O); 1:鸭黄病毒的cDNA+鸭圆环病毒的DNA (等体积混合)；2:鸭黄病毒的cDNA ;3:鸭圆环病毒的DNA ；4:新城疫病毒的cDNA ；5:鸭瘟病毒的DNA ；6:鸭肝炎病毒的cDNA ；7:番鸭细小病毒的DNA ；8:番鸭呼肠孤病毒的cDNA ；9:H9亚型流感病毒的cDNA ；10:减蛋综合症病毒的DNA。
[0022]图4是二重PCR方法检测BYD和DuCV的敏感性结果电泳图，图中:M:1OObp DNAladder ； I:10ng鸭新黄病毒cDNA和IOng鸭圆环病毒DNA ；2: Ing鸭黄病毒cDNA和Ing鸭圆环病毒DNA ；3:100pg鸭黄病毒cDNA和IOOpg鸭圆环病毒DNA ；4:10pg鸭黄病毒cDNA和IOpg鸭圆环病毒DNA ；5:Ipg鸭黄病毒cDNA和Ipg鸭鸭圆环病毒DNA ；6:IOOfg鸭黄病毒cDNA和IOOfg鸭圆环病毒DNA ；7:1Ofg鸭黄病毒cDNA和IOfg鸭圆环病毒DNA ；8:1fg鸭黄病毒cDNA和Ifg鸭圆环病毒DNA。
[0023]图5是二重PCR部分临床样品检测结果电泳图，图中:M为IOObp DNA ladder ；N为阴性对照(ddH20) ;1为阳性对照(鸭黄病毒cDNA+鸭圆环病毒DNA) ;2_22分别为编号为部分有目的条带的鸭病料检测结果。
【具体实施方式】
[0024]以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下:
[0025]鸭黄病毒记载在“4株广西鸭源坦布苏病毒分离及初步鉴定”，中国动物检疫，2013，30 (6): 31-35，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0026]鸭圆环病毒记载在“广西部分地区鸭圆环病毒感染情况调查”，中国畜牧兽医，2010,37 (11): 156-158，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0027]新城疫病毒记载在“新城疫植物油乳剂苗的研究”，中国预防兽医学报，2000，
(04): 23-27，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0028]鸭瘟病毒AV1221株购自中国兽医药品监察所。
[0029]鸭肝炎病毒AV2111株(以下简称为DHV I)购自中国兽医药品监察所。
[0030]番鸭细小病毒记载在“广西番鸭细小病毒的分离和鉴定”，广西畜牧兽医，2002，18 (6): 5-7，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0031]番鸭呼肠孤病毒记载在“番鸭花肝病的病原研究”，中国兽医科技，2003，33
(5): 7-9，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0032]H9亚型禽流感病毒记载在“多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病毒方法的建立”，中国人兽共患病学报，2006，(09):858-860，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0033]减蛋综合症病毒记载在“减蛋综合症植物油乳剂苗的研究”，中国预防兽医学报，2000，(04):23-27,公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0034]试剂:IOObpMarker ladder、2XTaq PCR Mix、DNA/RNA 提取试剂盒、反转录试剂均购自北京全式金生物技术有限公司；胶回收试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司；PMD18-T试剂盒购自大连宝生物公司。
[0035]实施例1、引物的设计与合成
[0036]根据GenBank中BYD的E基因与DuCV的REP基因的保守序列，利用DNAStar软件进行多序列比对，在保守区用Primer Premier5.0设计引物。引物(见表1)由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
[0037]表1引物信息
[0038]
【权利要求】
1.鸭黄病毒与鸭圆环病毒二重RT-PCR检测引物组，其特征在于包括两对特异性引物，分别是引物I和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的鸭黄病毒与鸭圆环病毒二重RT-PCR检测引物组，其特征在于:所述引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为0.5-1: 0.5-1: I: I。
3.根据权利要求2所述的鸭黄病毒与鸭圆环病毒二重RT-PCR检测引物组，其特征在于:所述引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为1:1:1:1。
4.权利要求1所述鸭黄病毒与鸭圆环病毒二重RT-PCR检测引物组在二重PCR扩增方面的应用，其特征在于:所述二重PCR扩增的退火温度为50-60°C。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述二重PCR扩增的退火温度为60°C。
6.一种鸭黄病毒与鸭圆环病毒二重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂:
A液:PCR反应液，含2XTaq PCR Mix(购自全式金.AS111-12)、BYD上下游引物、DuCV上下游引物、ddH20，BYD上下游引物分别是引物I和2，DuCV上下游引物分别是引物3和4，引物I至4分别具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的喊基序列； B液:BYD+DuCV模板，作为阳性对照； C液:ddH20，作为阴性对照。
7.根据权利要求6所述的鸭黄病毒与鸭圆环病毒二重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于:所述PCR反应液含2X Taq PCR Mixl2.5 μ L、BYD上下游引物各0.5 μ l、DuCV上下游引物各0.5 μ l、ddH208.5 μ L，其中各引物浓度均为50 μ mol/mL ;所述B液含BYD+DuCV模板各IyL,所述 C 液为 2 μ L ddH20。
8.权利要求7所述鸭黄病毒与鸭圆环病毒二重RT-PCR检测试剂盒在二重PCR扩增方面的应用，其特征在于:所述二重PCR扩增的退火温度为50-60°C。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:所述二重PCR扩增的退火温度为60°C。
【文档编号】C12R1/93GK103725801SQ201410019738
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2014年1月16日 优先权日:2014年1月16日
【发明者】谢芝勋, 张艳芳, 谢丽基, 刘加波, 庞耀珊, 范晴, 罗思思, 邓显文, 谢志勤 申请人:广西壮族自治区兽医研究所