玫瑰功能基因RrFLS1在调控植物类黄酮代谢中应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于植物基因工程【技术领域】。具体涉及一种玫瑰功能基因RrFLS1在调控植物类黄酮代谢中的应用。分离得到玫瑰花色功能基因RrFLS1，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示，其对应的蛋白质的序列如SEQ?ID?NO：2所示。转化试验表明：该基因能够改变植物特别是烟草的花色，提高植物类黄酮的含量。将该基因转化烟草，使转基因植物的花色发生改变，类黄酮含量增加，转基因烟草花瓣颜色由粉红色变成白色。
【专利说明】玫瑰功能基因RrFLSI在调控植物类黄酮代谢中应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物基因工程【技术领域】。具体涉及一种玫瑰功能基因RrFLSl片段的分离克隆、功能验证和应用。所述的基因与植物类黄酮代谢有关。将该基因的完整翻译区与花椰菜花叶病毒启动子结合后直接转入一般植物体，转基因植株的花色发生变化，类黄酮含量也增加了。
【背景技术】
[0002]类黄酮(Flavonoids)是一类在植物中广泛存在被研究最深入的多酣类次生代谢产物，目前发现的大约有6000多种(乔小燕等，2009)。类黄酮在植物界分布最多的是被子植物，种类最全，含量较高；大量研究证实类黄酮化合物是一种强活性氧自由基清除剂，它可以通过抗自由基活性、抗氧活性、抗脂质氧化活性和金属螯合活性而发挥抗氧化活性(Benavente, 1993;Bombardelli and Morazzoni, 1993)。国内报道沙棘总黄丽、懈皮素、卢丁、甘草黄酮 、灯盖花素等都具有不同程度抗氧化作用(孟申等，1992)。目前已经发现多种具有抗癌功能的类黄酮物质，如山奈素、槲皮素和杨梅酮等类黄酮，可以通过诱导细胞调亡发挥抗癌功能(Kampa era, 2007);国内外科研工作者发现类黄酮化合物具有降血脂、胆固醇的作用，还具有抑制血栓和扩张冠状动脉的功能，因此可以用于治疗心脑血管系统的一些疾病。
[0003]玫瑰(Rosa rugosa Thunb.)是蔷薇科蔷薇属落叶丛生灌木,花型秀美,芳香四溢，色彩绚丽，在中国传统名花中评价极高，素有“花中皇后”之称。玫瑰具有重要的经济价值，其花瓣叶片含有多种类黄酮物质，应用于医疗、保健等。
[0004]目前尚未见玫瑰功能基因RrFLSl在调控植物类黄酮代谢中的应用的报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种分离的玫瑰功能基因RrFLSl，本发明的目的还涉及该基因在调控植物类黄酮合成中的应用，所述的基因与花色的形成相关。
[0006]本发明提供了玫瑰中表达RrFLSl的基因编码序列及其功能，具体包括=RrFLSl基因的核苷酸编码序列的克隆，表达载体的构建，以及将该基因转化宿主烟草，对转基因烟草植株进行分子鉴定和表型观察，以评估该基因在在调控植物类黄酮代谢中的应用的前景。
[0007]本发明通过以下技术方案实现:
[0008]首先从玫瑰中克隆出RrFLSl功能基因。该基因片段为具有特定序列的DNA分子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，其开放阅读框(编码区)为1008bp。
[0009]本发明还提供了这种玫瑰RrFLSl蛋白编码序列，它有335个氨基酸残基，其对应的蛋白质的序列如SEQ ID NO:2所示。
[0010]本发明还提供了用于调取获得玫瑰样品中基因RrFLSl的一对核苷酸引物。该引物对根据基因RrFLSl设计，使用该对引物对玫瑰花瓣样品cDNA进行PCR扩增可获得IOOSbp的基因片段。所述引物对的DNA序列如下所示:
[0011]Pl 正向引物:5’ ATGGGGGTAGAGAGAGTTCAAG 3’(序列见序列表 SEQ ID NO:3)；
[0012]P2 反向引物:5’ TTACTGGGGGATCTTGTTGA 3’ (序列见序列表 SEQ ID NO:4)。
[0013]本发明还提供了一对用于检测玫瑰RrFLSl基因在转基因烟草中表达的核苷酸的引物对。该引物对根据基因RrFLSl设计，使用此对引物对转化该基因的烟草样品cDNA进行RT-PCR扩增，检测该基因是否在转基因烟草中表达，可获得176bp的基因片段。该引物对的DNA序列如下所示:
[0014]P3 正向引物:5，TGGAGGGATACGGAACATTTTTA 3’ (序列见序列表 SEQ ID NO:5)；
[0015]P4 反向引物:5，CACCACCTTGTGTAGATTCTTTGC 3，(序列见序列表 SEQ ID NO:6)。
[0016]可利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，例如可以通过直接DNA转化、电导、农杆菌介导等常规生物技术方法将本发明提供的RrFLSl的编码基因导入植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。使用本发明的基因片段构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前面可加上任意一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或者植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入具有抗性的抗生素标记物(例如卡那霉素或潮霉素等)。被转化的宿主是包括烟草在内的多种植物，培育不同花色的植物种类。
[0017]与本发明的配套的，本发明还提供了一种转基因烟草代谢物提取方法，这对于全面理解本发明的技术方案是有益的。方法是准确称取0.5g转基因烟草植株的叶片和花瓣，加入2.5mL提取液(甲醇: 盐酸:水体积比=70: 0.1: 29.9)于黑暗条件下4°C浸提24h，期间每隔6h用旋转振荡器振荡lmin。12000rpm离心IOmin,取上清至新的离心管中，再用孔径0.22 μ m的尼龙微孔滤器过滤后，保存于-40°C冰箱中，用于花青苷与其他类黄酮的HPLC-DAD 分析。
[0018]本发明的配套方法还提供了一种转基因烟草植株中类黄酮代谢物检测方法。具体是:使用日本岛津公司生产的“岛津液相系统”进行定性分析，步骤包括:LC-20AT型二元梯度泵，SIL-20AC自动进样器，CT0-20AC色谱柱控温箱，SPD-20AC检测器，LC-Solution工作站；色谱柱为日本Tosoh株式会社生产的TSK gel 0DS-80Ts QA反相硅胶柱(4.6mmX 250mm,粒径5 μ m,日本Tosoh株式会社)。分析条件:流速0.8mL.min-1,柱温35°C，进样体积10 μ L，200~800nm范围内全波长扫描吸收光谱，在520nm和360nm波长下一次性同时检测花青苷和花黄素。流动相组成为:A相，10%甲酸超纯水(体积比)；B相，乙腈。分析时间 35min。梯度洗脱程序为:0min,90%A, 10%B ；20min, 70%A, 30%B ；25min,90%A,
10%Bo
【专利附图】
【附图说明】
[0019]序列表SEQ ID NO:1是本发明分离克隆的包含有RrFLSl基因编码区的DNA片段(其中l-1008bp为CDS)。序列全长为1008bp，编码335个氨基酸。
[0020]序列表SEQ ID N0:2是上述RrFLSl基因片段对应的蛋白质的序列。
[0021]序列表SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4是扩增上述玫瑰花瓣样品cDNA的引物对的DNA序列。
[0022]序列表SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6是检测转基因烟草中表达基因片段引物对的DNA序列。
[0023]图1:是原始超量植物表达载体pCAMBIA2300s结构示意图(载体大小为11630bp)。
[0024]图2:对照早花烟草与转化RrFLSl基因的早花烟草的花色比较图。图中:图2A是对照早花烟草花色；图2B是本发明转RrFLSl早花烟草的花色。
[0025]图3 =RrFLSl基因在转基因植株中的表达量情况图。图3A是RrFLSl基因在转基因烟草植株中的表达量图；图38是烟草看家基因在转基因烟草以及早花烟草中的表达量图；上述图3A和图3B中:M为分子量大小，泳道1-3为3个转基因株系，P为质粒，CK为早花烟草(作为转基因早花烟草的对照)。
[0026]图4:对照早花烟草与转化RrFLSl基因的早花烟草花瓣代谢物HPLC图。图中:图4A为早花烟草花瓣520nm下的HPLC图；图4B为早花烟草花瓣360nm下的HPLC图；图4C为转RrFLSl早花烟草花瓣520nm下的HPLC图；图4D为转RrFLSl早花烟草花瓣360nm下的HPLC图。
[0027]图5:对照早花烟草与转化RrFLSl基因的早花烟草花瓣代谢物含量图。图中:图5A为花青素含量比较图；图58为类黄酮含量比较图；图5八和图5B中标记说明:CK为早花烟草；FLS1-5、FLS1-10、FLS1-12为3个转基因烟草株系。
[0028]图6:表达载体pCAMBIA2300s-RrFLSl构建图(插入片段大小为1008bp)。
【具体实施方式】
[0029]实施例1:分离、克隆RrFLSl基因
[0030]本发明的前期工作对丰花玫瑰(又称“平阴一号”，http://tc.cctv.com/20100412/103621, shtml，丰花玫瑰的选育文献已经公开发表，见:吕传润(平阴玫瑰研究所)，玫瑰新品种-丰花玫瑰及栽培技术，山东林业科技，2007，5:77 ;华中农业大学园艺林学学院园艺植物生物学花卉实践教学基地从山东省平阴县平阴玫瑰研究所引种)不同时期的花朵进行了转录组测序(转录组测序由深圳华大基因科技有限公司完成)，在转录组测序结果中得到了 RrFLSl基因的全长序列。根据转录测序RrFLSl基因的已知序列全长，设计特异引物Pl (见序列表SEQ ID NO:3)正向引物5’ ATGGGGGTAGAGAGAGTTCAAG 3’和P2 (见序列表 SEQ ID NO:4)反向引物 5，TTACTGGGGGATCTTGTTGA 3’，将测序序列的 l_1008bp 的片段从玫瑰品种‘丰花’(即丰花玫瑰)花瓣RNA反转录得到的cDNA中扩增出来，扩增得到的片段如下所示(见序列表SEQ ID NO:1):
[0031]
【权利要求】
1.核苷酸序列如序列表SEQID NO:1所示的玫瑰功能基因RrFLSl在调控植物类黄酮代谢中的应用。
2.如权利要求1所 述的应用，其特征在于所述的植物是烟草。
【文档编号】C12Q1/68GK103789328SQ201410019736
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月16日 优先权日:2014年1月16日
【发明者】宁国贵, 罗平, 包满珠, 王桢, 肖晓 申请人:华中农业大学