一种黄瓜疫霉菌拮抗菌的培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种能安全、无毒、有效的防治黄瓜疫霉菌（Phytophthora?melonis）的拮抗放线菌绛红褐链霉菌（Streptomyces?purpeofuscus?X418）的培养方法，其是在高氏一号培养基的基础上改进的液体培养方法。按本发明筛选的培养方法得到的发酵液抑制黄瓜疫霉菌（Phytophthora?melonis）的效果更好，抑制率比改进前的发酵液提高9%。
【专利说明】一种黄瓜疫霉菌括抗菌的培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物防治领域，具体涉及黄瓜疫霉菌拮抗菌，更具体为绛红褐链霉菌(Strep tomyces purpeofuscus ) X418 的培养方法。
【背景技术】
[0002]黄瓜疫病(CucumberPhytophthora Blight)是由黄瓜疫霉菌
me I on is)引起的一种土传病害,发生时来势凶猛，蔓延迅速，常年造成大面积黄瓜死亡，对黄瓜生产的影响很大。该病原菌不仅能够危害黄瓜，还能够侵染南瓜、丝瓜、西瓜以及葫芦、甜瓜、哈密瓜、苦瓜等葫芦科植物。
[0003]通过选用抗病品种、加强肥水管理等措施，可以有效地减少和推迟黄瓜疫病的发生，化学药剂也是防治黄瓜疫病的主要方法。但是长期单一使用某一化学药剂，容易产生抗药性，影响防治效果。同时，化学药剂对环境影响大以及对人体健康的潜在危害。因此，筛选对黄瓜疫霉菌有抑制作用的微生物是防治黄瓜疫病的最佳途径。
[0004]绛红褐链霉菌purpeofuscus)X418 (参见 CN2Ol2IO3822OL 3,保藏号为CGMCC N0.6191)是本发明人2011年8月从湖南省张家界国家森林公园的土壤中分离到的一种放线菌，通过初步筛选和高士一号液体发酵证实，绛红褐链霉菌i^treptomycespurpeofuscus ) X418对黄瓜疫霉菌Mora 有很好的抑制作用，同时对稻瘟病菌、辣椒疫霉病菌、烟草黑胫病菌、柑橘炭疽病菌也有一定的抑制作用。绛红褐链霉菌iStreptomyces purpeof uscusyfAU在氣氏一号(可淀溶性20g、硝钾酸Ig、磷酸氢二钾
0.5g、MgSO4.7H20 0.5g、氯化钠 0.5g、FeSO4.7H20 0.01g、琼脂粉 15_20g、去离子水1000mL pH 7.0~7.2)培养发酵液稀释5倍后，对黄瓜疫霉菌的菌丝生长抑制率为大致在75%~76%这个范围。
【发明内容】
[0005]本发明解决的技术问题是提高X 4 I 8菌株发酵液对黄瓜疫霉菌的抑制作用，通过改变培养的组成，以及发酵条件等的措施，来进一步提高X 4 I 8菌株发酵液对黄瓜疫霉菌的抑制作用。
[0006]本发明提供的技术方案是:一株防治黄瓜疫霉菌的拮抗菌绛红褐链霉菌iStreptomyces /w/rpeo/iAsciAs) X418的发酵培养方法,采用培养基为:葡萄糖40 g/L、硫酸铵 4.5 g/L、K2HPO4 0.2 g/L、NaCl 0.1 g/L、MgSO4 0.5 g/L、FeSO4.7H20 0.01 g/L、水1000mL、pH 6.0。
[0007]一种用于培养拮抗菌绛红褐链霉菌(Streptomyces purpeofuscus)X418的的培养基，其特征在于，其组成为:葡萄糖40 g/L、硫酸铵4.5 g/L、K2HP04 0.2 g/L、NaCl 0.1 g/L、MgS04 0.5 g/L、FeS04.7H20 0.01 g/L、水 1000mL、pH 6.0
为了进一步提高绛红褐链霉菌{Streptomyces purpeofuscus) X418的发酵液对黄瓜疫霉菌的抑制作用，以高氏一号(可淀溶性20g、硝钾酸Ig、磷酸氢二钾0.5g、MgSO4*7H20 0.5g、氯化钠 0.5g、FeSO4.7H20 0.01g、琼脂粉 15_20g、去离子水 1000mL pH
7.0~7.2)为基础，通过选择最佳摇瓶装量、发酵时间、pH、温度、转速、接种量等影响发酵的主要因素，每个因素设置2个水平，共8个处理，设计U8 (26)的均匀设计表。结果发现，对于发酵产物抑制率来说，影响最大的PH，其次依次是发酵时间、摇瓶装量、转速、温度、接种量。根据正交试验得到的各个发酵条件下的滤液对黄瓜疫霉菌抑制效果，该菌丝生长抑制率最高达到84.89%，比优化前提高了 9.09%。最佳培养条件是:葡萄糖40 g/L、硫酸铵4.5g/L,K2HPO4 0.2 g/L,NaCl 0.1 g/L、MgS04 0.5 g/L、FeS04.7H20 0.01 g/L、水 1000mL、pH6.0、摇瓶装量70ml、发酵时间7d、温度28°C、转速180r/min、接种量4%。
[0008]进一步地，所述的培养方法，种子液龄24h、pH6.0。
[0009]进一步地，所述的培养方法，摇瓶装量70ml/250ml、发酵时间7d、温度28°C、转速180r/min,优选接种量为4%。
[0010]本发明具有以下有益效果:通过一系列实验筛选得到最佳培养基，使所述菌对黄瓜疫霉菌抑制效果提高了大约9%，进一步还筛选了培养的具体条件，提高其抑菌效果。这是此前按常规培养方式不能获得的优异效果，体现了本发明的显著进步。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1不同碳源对发酵液抑菌活性的影响。
[0012]图2不同氮源对发酵液抑菌活性的影响。
[0013]图3碳氮比对 发酵液抑菌活性的影响。
[0014]图4种子液菌龄对抑菌活性的影响。
[0015]图5摇瓶装液量对抑菌活性的影响。
[0016]图6接种量对抑菌活性的影响。
[0017]图7初始pH对抑菌活性的影响。
[0018]图8不同温度对菌株发酵抑菌活性的影响。
[0019]图9不同摇瓶时间对菌株抑菌活性的影响。
[0020]图10不同转速对菌株抑菌活性的影响。
【具体实施方式】【具体实施方式】
[0021]实施例一:培养基的优化
1、液体基础培养基的选择
选择下述6种不同的培养基:
【权利要求】
1.一株防治黄瓜疫霉菌的拮抗菌绛红褐链霉菌(5?/.--/7?ο?_7----5.purpeofuscus) X418的培养方法，其特征在于:培养采用的液体培养，其培养基为:葡萄糖40 8/1、硫酸铵4.5g/L、K2HPO4 0.2 g/L、NaCl 0.1 g/L、MgSO4 0.5 g/L、FeSO4.7H20 0.01 g/L、水 1000mL、pH 6.00
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于:种子液龄为24h，pH6.0。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于:摇瓶装量为70ml/250ml、发酵时间为7d、温度为28°C、振荡培养转速为180r/min。
4.根据权利要求1至3任一项所述的培养方法，其特征在于:液体培养时的接种量4%。
5.一种用于培养拮抗菌绛红褐链霉菌Χ418的液体培 养基，其特征在于，其组成为:葡萄糖40 g/L、硫酸铵4.5 g/L,K2HPO4 0.2 g/L,NaCl 0.1 g/UMgSO4 0.5 g/L、FeSO4.7H20 0.01 g/L、水 1000mL、pH 6.0。
【文档编号】C12N1/20GK103756938SQ201410019705
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月16日 优先权日:2014年1月16日
【发明者】易图永, 刘双清, 解娜, 王运生 申请人:湖南农业大学