一种区别鸭圆环病毒和鹅圆环病毒的pcr-rflp方法
【专利摘要】本发明公开了一种区别鸭圆环病毒和鹅圆环病毒的PCR-RFLP方法，该方法是利用Rep蛋白基因序列酶切位点差异来进行区别的，包括DNA的提取，PCR扩增得到Rep蛋白基因片段，XhoⅠ酶切后进行RFLP分析。本发明鉴定方法简单，效率和准确率较高。
【专利说明】—种区别鸭圆环病毒和觀圆环病毒的PCR-RFLP方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学【技术领域】，具体涉及一种利用水禽圆环病毒(鸭圆环病毒和鹅圆环病毒)Rep蛋白基因序列酶切位点差异区别鸭圆环病毒和鹅圆环病毒的聚合酶联反应(PCR)-限制性片段长度多态性(RFLP)方法。
【背景技术】
[0002]鸭感染圆环病毒(duck circovirus, DuCV)最早由Hattermann等于2003年报道。我国台湾学者Chen等对2002~2003年在我国台湾地区采集的样品检测表明，圆环病毒检出率为38.2 %。傅光华等首先在我国大陆地区报道有鸭圆环病毒感染，Jiang等有从鸭体内检测到鸭圆环病毒的报道，其阳性率为33.29%，并伴有鸭I型病毒性肝炎(DHV-1)，鸭传染性浆膜炎(RA)和鸭大肠杆菌病(E.coli)共感染。目前，几乎所有的品种鸭均见有DuCV感染阳性的检测报道。
[0003]鹅圆环病毒(GoCV)最早于1999年由德国学者Soike等从患病鹅病理组织中观察到。病鹅主要表现发育不良、体重下降、羽毛凌乱等，病理组织学检查发现法氏囊、脾脏和胸腺的淋巴细胞减少，其中法氏囊病变最明显，甚至出现整个囊结构的破坏，并可观察到嗜碱性的包含体。2001年Todd等根据BFDV和PCV的R印蛋白的保守序列设计简并引物，测定了 GoCV的全基因组序列。2002年中国台湾学者Chen等应用9对引物分别扩增基因组不同片段，测序拼接后获得了 12株GoCV的全基因组序列，并发现GoCV基因组序列间存在一定的差异。余旭平等最早在我国浙江检测到鹅圆环病毒，并对浙江省鹅圆环病毒的基因组结构和流行病学情况进行分析。万春和等首次从朗德鹅中检测到有GoCV感 染，并进行全基因测序。有报道DuCV和GoCV的ORF-Vl所编码的蛋白(Itep蛋白)核苷酸同源性可达80.0%以上可设计一种引物来检测DuCV和GoCV感染。
[0004]目前，已有研究报道多种鸭病毒性传染病跨种传播感染鹅的报道，如鸭肝炎病毒、番鸭呼肠孤病毒和黄病毒；也有鹅病毒性传染病感染跨种传播感染鸭的报道，如鹅细小病毒和鹅出血性多瘤病毒感染番鸭和半番鸭等报道。
[0005]目前，有报道DuCV和GoCV的0RF-V1所编码的蛋白(Itep蛋白)核苷酸同源性可达80.0%以上可设计一种引物来检测DuCV和GoCV感染，但对可能出现的跨种传播仍无相应储备检测方法。本研究针对水禽圆环病毒(鸭圆环病毒和鹅圆环病毒)Rep蛋白基因差异特征建立区别鸭圆环病毒和鹅圆环病毒PCR-RFLP方法相关报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种利用水禽圆环病毒(鸭圆环病毒和鹅圆环病毒)Rep蛋白基因序列酶切位点差异区别鸭圆环病毒和鹅圆环病毒的PCR- RFLP方法。该方法能有效区分鸭圆环病毒和鹅圆环病毒感染(或共感染)，为水禽健康养殖提供技术保证。
[0007]本发明根据鸭圆环病毒和鹅圆环病毒基因组中Rep蛋白基因特征，设计一组引物能同时对鸭圆环病毒和鹅圆环病毒进行阳性扩增，根据鹅圆环病毒扩增PCR产物中有特异性的Xho I酶切位点，而鸭圆环病毒扩增PCR产物中没有Xho I酶切位点来对建立一种对鸭圆环病毒和鹅圆环病毒进行快速检测的PCR-RFLP方法。
[0008]本发明采用以下技术方案:
一种区别鸭圆环病毒和鹅圆环病毒的PCR-RFLP方法，其特征在于包括以下步骤:
(1)提取鸭圆环病毒和鹅圆环病毒基因组DNA；
(2)用引物Pl和P2同时对鸭圆环病毒和鹅圆环病毒进行PCR扩增，得到相应的Rep蛋白(replication protein,复制蛋白)基因片段；
(3)取PCR产物经XhoI酶切后进行RFLP分析。
[0009]其中，PCR引物需满足如下要求:
(1)该PCR产物需选择鸭圆环病毒和鹅圆环病毒Rep蛋白基因中的保守区域进行设计，以便能一个PCR反应能对鸭圆环病毒基因组DNA和鹅圆环病毒基因组DNA均能阳性扩增；
(2)该PCR产物需选择鸭圆环病毒和鹅圆环病毒Rep蛋白基因中的保守区域进行设计时必须跨过鹅圆环病毒R印蛋白基因基因中309位的Xho I酶切位点，以便对胶回收产物能够进行限制性片段长度多态性分析。
[0010]根据以上要求，所述的步骤(2)的扩增引物Pl和P2的序列为:
上游引物 Pl:5’ -CATGA TGGGCAGTGGCTTCCT-3’，
下游引物 P2:5’ -ACCTCCGTCTTCCAATCA-3’。
[0011]其中，所述的步骤(2) PCR扩增产物经胶回收大小为623bp。
[0012]其中，所述的步骤(3)Xho I酶切位点位于鹅圆环病毒基因组Rep蛋白基因序列的309位，鹅圆环病毒可被Xho I酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测片段为2段，大小为364bp和259bp ;而鸭圆环病毒基因组Rep蛋白基因中没有Xho I酶切位点，鸭圆环病毒经Xho I酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变。
[0013]本发明的有益效果:鉴定方法简单，效率和准确率较高。使用本方法对本临床送检20份(其中鸭和鹅组织病料各10份)疑似水禽圆环病毒(鸭圆环病毒和鹅圆环病毒)进行PCR- RFLP检测，其中鸭圆环病毒阳性4份、鹅圆环病毒3株，没有检测到鸭圆环病毒和鹅圆环病毒共感染。根据建立的PCR- RFLP方法，可在5小时内对确定感染的水禽圆环病毒类型，同时还能对鸭圆环病毒和鹅圆环病毒类型进行正确分析。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为鸭圆环病毒和鹅圆环病毒进行快速检测的PCR-RFLP方法的电泳图。M为DL2000 DNA Marker, I为鸭圆环病毒PCR胶回收产物，2为鹅圆环病毒CR胶回收产物，3为经Xho I酶切鸭圆环病毒PCR胶回收产物，4为经Xho I酶切鹅圆环病毒PCR胶回收产物。
【具体实施方式】
[0015]下面实施例对本发明做进一步的描述。
[0016]实施例1
1、毒株:鸭圆环病毒(GenBank登录号:GQ423744)和鹅圆环病毒(GenBank登录号:⑶320569)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定和保存。[0017]2、引物设计与合成
根据鸭圆环病毒和鹅圆环病毒NS基因特征设计引物Pl和P2，其中引物Pl和P2序列为:上游引物Pl:5’_ CATGATGGGCAGTGGCTTCCT _3’，下游引物P2:5’_ ACCTCCGTCTTCCMTCA-3，。
[0018]3、PCR 扩增
以常规方法提取鸭圆环病毒和鹅圆环病毒基因组DNA。用所设计的特异性引物Pl和P2进行PCR扩增，扩增片段大小约623bp。扩增体系为50 μ L，其中2 XGoTaq Master GreenMix 25 μ L、上下游引物(20 μ M/mL)各I μ L、DNA模板I μ L,补充灭菌去离子水至终体积50 μ L0反应条件为94°C预变性5min，随后进行94°C 50s,53°C 35s、72°C 45s，进行35个循环后，72°C延伸lOmin。 [0019]4、RFLP 分析
PCR反应结束后，将鸭圆环病毒和鹅圆环病毒PCR产物分别经胶回收试剂盒纯化后进行Xho I酶切。酶切体系为20yL，其中IOXH Buffer 2 μ L，胶回收产物10 μ L，Xho I酶2yL、补充灭菌去离子水至终体积20yL。混匀后，经37°C水浴I小时，加入2 μ LlOXLoading Buffer终止,进行琼脂糖凝胶电泳分析,对检测样品进行分析鸭圆环病毒和鹅圆环病毒类型。Xho I酶切位点位于鹅圆环病毒基因组R印蛋白基因序列的309位，鹅圆环病毒可被Xho I酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测片段为2段，大小为364bpbp和259bp ;而鸭圆环病毒基因组R印蛋白基因中没有Xho I酶切位点，鸭圆环病毒经Xho I酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变。
[0020]5、临床应用
使用本方法对本临床送检20份(其中鸭和鹅组织病料各10份)疑似水禽圆环病毒(鸭圆环病毒和鹅圆环病毒)进行PCR- RFLP检测，其中鸭圆环病毒阳性4份、鹅圆环病毒3株，没有检测到鸭圆环病毒和鹅圆环病毒共感染。根据建立的PCR- RFLP方法，可在5小时内对确定感染的水禽圆环病毒类型，同时还能对鸭圆环病毒和鹅圆环病毒类型进行正确分析。
【权利要求】
1.一种区别鸭圆环病毒和鹅圆环病毒的PCR-RFLP方法，其特征在于包括以下步骤: (1)提取鸭圆环病毒和鹅圆环病毒基因组DNA； (2)用上游引物Pl和下游引物P2同时对鸭圆环病毒和鹅圆环病毒进行PCR扩增，得到相应的R印蛋白基因片段；上游引物Pl和下游引物P2的序列分别为:
上游引物 Pl:5’ -CATGATGGGCAGTGGCTTCCT-3’，
下游引物 P2:5’ -ACCTCCGTCTTCCAATCA-3’ ； (3)取PCR扩增产物经XhoI酶切后进行RFLP分析，可被酶切的为鹅圆环病毒，不可酶切的则为鸭圆环病毒。
2.根据权利要求书I中所述的区别鸭圆环病毒和鹅圆环病毒的PCR-RFLP方法，其特征在于:所述的步骤(2)PCR扩增产物经胶回收大小为623bp ;所述的步骤(3)中RFLP分析具体为:Xho I酶切位点位于鹅圆环病毒Rep蛋白序列的309位,鹅圆环病毒可被Xho I酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测片段为2段，大小为364bp和259bp ;而鸭圆环病毒基因组R印蛋白基因中没有Xho I酶切位点，鸭圆环病毒经Xho I酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变。`
【文档编号】C12Q1/68GK103602759SQ201310591203
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月22日 优先权日:2013年11月22日
【发明者】万春和, 黄瑜, 陈红梅, 施少华, 傅光华, 程龙飞 申请人:福建省农业科学院畜牧兽医研究所