提高外源蛋白表达的增强子样基因及其应用的制作方法

提高外源蛋白表达的增强子样基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种能够在原核细胞提高外源蛋白表达的原核增强子样基因，该基因具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列或其截短序列；通过构建融合表达报告基因重组载体筛选出该基因，融合报告基因由人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因的截短序列L11和氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）组成，将待筛选基因片段和用于筛选的重组载体进行连接、转化并构建基因文库，通过提高氯霉素抗性筛选出含有增强子样基因序列的重组菌株，从而获得增强子样序列，该序列能提高融合报告基因重组菌株的氯霉素抗性及外源蛋白的表达水平。
【专利说明】提高外源蛋白表达的增强子样基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种提高外源蛋白表达的增强子样基因序列，用于提高外源蛋白在原核细胞中的表达水平。
【背景技术】
[0002]目前，已经开发出的蛋白表达系统有多种，常用的有大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统等。大肠杆菌表达系统虽然研究较为成熟，但某些目的蛋白在其中的表达水平仍然很低；酵母表达系统也存在外源基因拷贝数低的问题；哺乳动物细胞表达系统更是存在外源基因不能持久表达、成本高及技术复杂的问题。因此，在这些常用的表达系统中，某些外源基因表达水平低仍然是亟待解决的难题。
[0003]增强子(enhancer，ER)是一类包含转录因子结合位点的顺式作用元件，对靶基因表达具有激活及增强作用，它的发现为提高外源基因表达水平提供了一个新的方向。随着对原核生物基因表达调控研究的深入，人们发现原核生物基因组中也存在着一些具有转录增强作用的调控模式，这类序列即称为增强子样序列(enhancer-Like sequence, ERLS)0常用于提高外源蛋白表达水平的方法主要有增加蛋白表达标签、优化外源基因表达所需的密码子以及增加表达系统中外源 基因的拷贝数等，采用增强子样基因序列提高外源蛋白表达水平使用的还较少，而且很多未知的增强子样序列尚未被发现。
[0004]增强子长度通常为100_200bp，与启动子、绝缘子及沉默子等协同作用调控基因的时空表达。无方向性是它的一个重要作用特点，即无论位于启动子的上游或下游，均能激活其相应的启动子。这种增强活性主要体现在基因表达的水平上，目前已有少数增强子样序列应用于提高蛋白表达水平。
[0005]基因陷阱(gene trap)是研究基因调控元件与基因功能的一个有力工具。该方法已成功地应用于果蝇、小鼠、拟南芥等重要模式动植物功能基因组的研究(O’ Brochta DAet aL, Proc NatL Acad Sci USA, 2011，108(39): 16339-16344)，并发现了大量新基因。本发明中，增强子样基因序列的筛选即采用了融合报告基因和基因陷阱的方法，将人乳头瘤病毒(Human Papilloma virus, HPV)58型主要衣壳蛋白LI基因的截短序列Lll和氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)融合作为增强子样序列诱捕载体的报告基因，当增强子样序列插入后，菌株的氯霉素抗性提高，由此，通过增加氯霉素浓度进行大规模筛选，从而获得相应的能增强基因表达的序列。
[0006]现在已发现的增强子样序列主要应用于增强低分子量蛋白的表达上，如干扰素、白细胞介素等。本发明中所使用的融合报告基因可表达出较大的融合蛋白(55KDa)，利用该报告基因筛选的序列也可构建出一种高分子量蛋白表达系统，从而解决一些高分子量蛋白在外源表达系统中产率低 的难题。大肠杆菌是重要的基因工程菌，遗传背景清楚、操作简便、快速且成本低廉，成为筛选增强子样序列的首选。

【发明内容】
[0007]本发明旨在提供一种能够提高外源蛋白表达水平的原核增强子样基因，主要目的是要改进外源基因的原核表达系统，该基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或如SEQID NO:1中的I~27Ibp所示的核苷酸序列。
[0008]本发明首先对来自于昆明市呈贡区居民生活污水样品和昆明市第四十三解放军总医院附近污水处理厂污水样品中的细菌进行富集，然后抽提细菌基因组样品并对其进行酶切，获得500bp以下的DNA片段，再将其构建到增强子样序列筛选重组质粒pET21a-CAT-Lll的启动子上游，构建基因文库，通过融合的氯霉素抗性报告基因筛选含增强子样序列的菌株，最后对菌株的氯霉素抗性和增强子样序列来源进行分析并对其增强外源蛋白表达的能力进行检测。
[0009]本发明通过以下技术方案实现本发明目的:
(O构建含融合报告基因的重组筛选菌株
对云南省第一人民医院(云南省昆华医院)宫颈癌患者的肿瘤组织样品进行处理后，抽提DNA，通过PCR方法获得人乳头瘤病毒HPV58型LI基因的截短序列LI I，并构建成重组质粒PMD18T-L11，将Lll片段从pMD18T_Lll上酶切下来并通过胶回收纯化后，连接至含有报告基因CAT的重组质粒pET21a-CAT上，经酶切鉴定及测序验证，重组质粒pET2Ia-CAT-L11构建正确。然后采用热休克法将重组质粒pET21a-CAT-Lll转化至大肠杆菌表达菌株中，获得重组筛选菌株 pET2 Ia-CAT-Ll I/BL21 (DE3)。
[0010]大肠杆菌表达菌株可选用万.BL21 (DE3) coZiBL21 (DE3) pLys、Origam1、Rosetta以及其它可用于表达外源蛋白的原核菌株；
(2)重组菌株抗氯霉素阈值和CAT- Lll融合蛋白表达水平检测在一定氯霉素浓度梯度的固体A`mp+-LB培养基中，使用IPTG诱导重组筛选菌株pET2Ia-CAT-LlI/BL21 (DE3)，通过记录生长的菌落数测定菌株的抗氯霉素阈值。同时也使用IPTG诱导液体培养的重组筛选菌pET2Ia-CAT-Ll 1/BL21(DE3)，通过SDS-PAGE检测融合蛋白CAT-Lll的表达。
[0011](3)基因文库构建与含增强子样基因序列菌株的筛选
对待筛选的各污水样品进行细菌富集后，获得菌体，按照《精编分子生物学实验指南》(科学出版社)中的细菌基因组DNA提取方法得到细菌基因组。利用限制性内切酶将得到的细菌基因组酶切至500bp以下的DNA片段，经胶回收后，将所得片段与重组质粒pET21a-CAT-Lll CBgl Π酶切后再去磷酸化)连接，即利用同尾酶互补连接，将待筛选序列构建到重组质粒的启动子上游，然后将其电转化到疋BL21 (DE3)感受态，构建细菌基因组文库。之后，使用含高于抗氯霉素阈值的氯霉素选择性LB培养基筛选出含增强子样基因序列的重组菌株，对所得菌株进行提质粒并酶切鉴定，再使用氯霉素浓度梯度测定菌株的抗氯霉素阈值，含增强子样基因序列菌株的筛选即完成。
[0012]发明中所使用的表达载体可以是pET系列、PQE系列、pGEX系列、pMAL系列，以及其他原核表达载体。
[0013](4)序列测定，同源性分析序列来源及其诱导蛋白表达增强活性分析
在增强子样基因插入位点的下游设计引物ENHP2，并将质粒和引物送至测序公司测序。利用DNAMAN (5.2.2版)对所测序列和原始载体序列进行比对，以确定插入序列。此外,再将所测序列在NCBI BlastN中进行同源性序列检索，分析序列来源。[0014]使用IPTG 诱导构建好的重组菌 pET2 Ia-CAT-Ll 1-ER3/BL21 (DE3)和pET2Ia-CAT-LlI/BL21 (DE3)表达蛋白，经SDS-PAGE再次检测ER3序列是否能够提高融合蛋白CAT-Lll的表达水平。
[0015]本发明另一目的是将增强外源蛋白表达的原核增强子样基因应用在增强外源蛋白表达中，将所述增强子样基因插入到表达载体启动子的上游或下游的邻近位置，使其作用于该表达载体启动子。
[0016]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
1、在目前的表达系统中，经常会出现某些外源基因表达水平低的问题，使得这些基因工程产品的进一步开发受到限制，本发明ER3序列能够明显提高重组筛选菌株pET2Ia-CAT-LlI对氯霉素的抗性，且能够显著增加人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白LI基因截短序列Lll蛋白的表达。该序列具有增加较大外源基因在原核表达系统中蛋白表达水平的特性。
[0017]2、所用表达载体来自pET系列,ER3序列可用于原核表达系统的所有表达载体,提高了这一序列在各原核表达系统中应用的可能性，这对提高ER3序列的实用性具有重要意义。
【专利附图】

【附图说明】
[0018]图1是本发明中重组质粒pET21a_CAT酶切鉴定电泳示意图，其中，泳道1:DNAMarker DL5000 ;泳道 2 -.BamHl、Xho I 双酶切 I 号菌落质粒 pET21a_CAT ;泳道 3 -.BamHl、Xho I双酶切2号菌落质粒pET2 Ia-CAT。
[0019]图2是本发明中重组质粒DET21a-CAT_Lll酶切鉴定电泳示意图，其中，泳道1:DNAMarker DL5000 ;泳道 2`-5 I和沿ο I双酶切 1-4 号菌落质粒 pET21a_CAT_Lll ;泳道 6:M/e I 和 Xho I双酶切 pET2Ia-CAT。
[0020]图3是本发明中诱导重组菌pET21a-CAT-Lll/BL21 (DE3)表达CAT-L11融合蛋白的SDS-PAGE示意图，其中，泳道1:Protein Marker ;泳道2:诱导前的pET2Ia-CAT-LlI/BL21 (DE3);泳道 3:诱导后的 pET21a-CAT-Lll/BL21 (DE3);泳道 4:诱导前的 BL21 (DE3)；泳道5:诱导后的BL21 (DE3)。
[0021]图4是本发明中I酶切基因组并胶回收后的电泳示意图，其中，泳道1:DNAMarker DL2000 ;泳道2:回收的500bp以下DNA片段。
[0022]图5是本发明中重组质粒pET2Ia-CAT-L11-ER3的酶切鉴定图，图5A中，泳道1:DNA Marker DL5000 ;泳道 2 -.EcoR ? 和 We I 双酶切 pET2 Ia-CAT-L11 ;图 5B 中，泳道 I:DNAMarker DL5000 ;泳道2_4 WcoW和M/e I 分别双切 1、2 和 3 号单菌的 pET21a_CAT-Lll_ER3
重组质粒。
[0023]图6是本发明中ER3增强CAT-Lll融合蛋白表达的SDS-PAGE电泳图，其中，泳道I =Protein Marker ;泳道 2:诱导前的 pET21a-CAT-L11-ER3/BL21 (DE3);泳道 3:诱导 4h 后的 pET21a-CAT-Lll-ER3/BL21 (DE3);泳道 4:诱导前的 pET21a_CAT_Lll/BL21 (DE3);泳道5:诱导 4h 后的 pET2Ia-CAT-LlI/BL21 (DE3);泳道 6:诱导前的 BL21 (DE3);泳道 7:诱导4h 后的 BL21 (DE3)。[0024]图7是本发明中重组质粒pET21a-Lll_ER34的酶切鉴定图，其中，泳道1:DNAMarker DL5000 ;泳道 2_3 JcoTP V和MZe I 双酶切 I 号和 2 号菌的 pET2Ia-Ll 1-ER34 重组质粒；泳道4 WcoW和_We I双酶切pET21a-Lll重组质粒。
[0025]图8是本发叨屮诱导重组菌pET21a-Lll-ER34/BL21 (DE3)表达Lll蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中，泳道1:诱导前的pET21a-Lll-ER34/BL21 (DE3);泳道2:诱导后的pET21a-Lll-ER34/BL21 (DE3);泳道 3:诱导前的 pET21a_Lll/BL21 (DE3);泳道 4:诱导后的 pET21a-Lll/BL21 (DE3)。
【具体实施方式】[0026]下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述的内容；实施例中主要采用常规的基因工程分子克隆的生物学方法，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的。按照以下实施例，不难根据具体情况略做修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。
[0027]实施例1:构建pET21a- CAT-Lll增强子样序列检测载体
取云南省第一人民医院宫颈癌患者的肿瘤组织，按《精编分子生物学实验指南》(科学出版社)动物组织基因组DNA提取方法提取样品基因组，经鉴定，该样品为人乳头瘤病毒即￥58型感染，使用引物1^11卩1:5’-GGA ATT CCA TAT GTC TGT TTG GAG ACC TTC_3’;L11P2:5’ -CCG CTC AGA CAG TGA GTC TCC ATA AGG TTC-3’，通过 PCR 扩增获得 HPV58 型 LI 基因的截短序列LI I，构建成pMD18T-Ll I重组质粒(pMD18T载体购买于TAKARA公司，CK5601C),将该质粒转化至大肠杆菌DH5a (DH5a购买于TAKARA公司，D9057)，并于37°C振荡培养重组菌PMD18T-L11/DH5 a，16h后使用质粒小量提取试剂盒(购买于北京庄盟国际生物基因科技有限公司，ZP101-2)，按照质粒抽提说明抽提质粒。
[0028]氯霉素抗性基因CAT来自pACYC184载体(购买于New England BioLabs公司，VKN0287)，通过 PCR 扩增获得，其上游引物为 CAT Pl:5’ -TAG CGC GGC CGC AGA GCT CATGGA GAA AAA AAT CAC TG- 3’，其下游引物为 CAT P2:5’ -CCG CTC GAG TTA CGC CCC GCCCTG CCA CTC- 3’，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。将所获得的PCR产物纯化后回收，取I μ g于37°C利用限制性内切酶及丽71 (购买于TAKARA，CKB701A)和沿ο I (购买于TAKARA, CK2401B)各IOU进行双酶切，酶切过夜后，通过琼脂糖胶回收试剂盒(购买于北京庄盟国际生物基因科技有限公司，ZP202-02)回收CAT基因，然后利用相同的酶切位点将回收的CAT基因连接至pET21a (购买于Novagen，69740-3)，经酶切鉴定及测序验证，重组载体pET21a-CAT构建正确(见图1)。
[0029]分别用IOU BamHl (来源于 TAKARA，CKB701A)和 IOU Ndel (来源于 TAKARA 公司，CKB701A)于37°C酶切质粒pMD18T_Lll和pET2Ia-CAT,酶切4h后，分别进行胶回收；取Lll和pET21a-CAT酶切纯化片段各IOOng以及I μ L T4 DNA连接酶(来源于TAKARA，CK5021B)于20 μ L体系中，16°C连接过夜；通过热休克法将连接产物转化至CaCl2法制备的E.colimh α，转化产物涂布于Amp+-LB选择性平板上，37°C培养16h，挑取单菌落并接种于Amp+-LB抗性培养液中增菌,使用质粒抽提试剂盒提取质粒，最后使用Me I和ZAo I (来源于TAKARA，1094A)双酶切鉴定重组质粒，琼脂糖凝胶电泳观察，获得了预期大小的片段(见图2)，同时，测序结果也表明重组质粒pET21a-CAT-Lll构建成功。
[0030]实施例2:重组菌抗氯霉素阈值和Lll-CAT融合蛋白表达水平检测
取IOng增强子样序列检测质粒pET21a-CAT-Lll与100 μ L Ε.coli BL21(DE3)(购买于Novagen公司，69450-3)感受态混匀，冰水浴30min，42°C温水浴2min进行热休克，然后加入Iml LB培养液，37°C振荡培养45min，离心后弃掉大部分上清并重悬菌体，涂布于Amp+-LB固体培养皿中，于37°C培养12-16h，获得重组筛选菌株pET21a-CAT-Lll/BL21 (DE3);挑取该单菌落接种到Amp+-LB液体培养基中，于37°C振荡培养过夜，再按I %的比例接种到Amp+-LB液体培养基，37°C振荡培养至0D_约为0.5，对菌液进行IO5倍和IO6倍稀释后，取100 μ L直接涂布在含有ImM IPTG、50y g/ml Amp+以及不同氯霉素(Cam+)浓度梯度的双抗性固体培养基上，经三次以上重复测定pET2Ia-CAT-Ll I/BL21 (DE3)重组菌株的抗氯霉素阈值在34μ g/ml (见表1重组菌氯霉素抗性生长终浓度检测结果)。
[0031]另外再挑取上述单菌落，将其接种到Amp+-LB液体培养基，37°C振荡培养过夜，再按I %的比例接种到Amp+-LB液体培养基，37°C振荡培养至OD6tltl约为0.5，取适量菌液作为诱导前样品，之后，在剩余的菌液中加入IM IPTG至终浓度为lmM，37°C继续培养，诱导蛋白表达，诱导4h后取出适量样品进行SDS-PAGE检测融合蛋白CAT-Lll的表达水平，结果显示该蛋白有明显的表达(见图3)。
[0032]实施例3:基因组提取、酶切及文库构建
来自于昆明市呈贡区居民生活污水和昆明市第四十三解放军总医院附近污水处理厂的污水样品经振荡混匀后，取150 μ L加入15ml牛肉膏蛋白胨液体培养基内，于37°C振荡培养16h，培养液分装至I Oml离心管，12000gX2min离心，弃上清，并用2ml TE缓冲液将菌体重悬，加入10%的SDS 180yL以及20mg/ml的蛋白酶K 12 μ L，混匀后于37°C孵育lh，再加入5M的NaCl 600 μ L并充分混匀，加入CTAB/NaCl溶液400 μ L，于65°C孵育IOmin ；加入等体积的氯仿，充分混匀后，12000gX5min离心,取上清,加入等体积的酹/氯仿混合液混匀，12000gX5min离心，取上清并分装至1.5ml的离心管中，700 μ L/管，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后，于_40°C静置30min，12000gX IOmin离心，弃上清，然后依次用70%和100%的冰乙醇各Iml漂洗所得沉淀，在室温条件下，乙醇挥发完全后，再加入50μ L TE缓冲液将沉淀溶解，最后加入2μ L RNase (5mg/ml)消化20min，基因组制备完成。
[0033]取上述制备的基因组DNA 1“8，用限制性内切酶5'故/1^1 (购买于TAKARA，CKA1018) 0.5U于37°C部分酶切lh，回收500bp以下DNA片段(见图4);取10 μ L酶切并回收的基因组片段，以及300ng经沒貧7 II酶切、FastAP (来源于Fermentas，00087733)去磷酸化后回收的pET21a-CAT-Lll片段，用I μ L T4 DNA连接酶于16°C连接过夜；连接产物经乙醇沉淀纯化后，通过电穿孔法将其转化至疋co7iBL21 (DE3)感受态，电穿孔条件如下:电压
1.8KV，电极杯1mm，电容2.5 μ F、电阻200 Ω，电转化后立即加入900 μ L冰冷的SOC培养基，混匀，于37°C振荡培养30min，将转化产物涂布于6个Amp+-LB抗性平板上，37°C培养16h后记录菌落生长数目，再利用IOml Amp+-LB液体培养基将平板上菌落洗脱下来并装入15ml离心管，即文库细菌，于_40°C保存。
[0034]实施例4:含增强子样序列的菌株筛选及其抗抗生素活性增强测定
取保存的文库细菌10 μ L，利用LB液体培养基进行10倍梯度稀释，取稀释了 1000倍的菌液100 μ L涂布于含有ImM IPTG、50 μ g/ml Amp+和102 μ g/ml Cam+的LB固体选择性培养基进行筛选，同时涂布新鲜培养的pET2Ia-CAT-LlI/BL21 (DE3)作为阴性对照；37°C培养过夜后，获得能够在高于抗氯霉素阈值条件下生长的单菌落，命名为pET21a-CAT-Ll 1-ER3/BL21 (DE3)。挑取该单菌落并接种于Amp+-LB培养基中，于37°C振荡培养过夜，保存菌株。
[0035]采用与实施例2检测抗氯霉素阈值相同的方法测定通过氯霉素抗性筛选出的菌株 pET2Ia-CAT-Ll1-ER3/BL21 (DE3)的抗氯霉素阈值，结果测出 pET2la-CAT-Ll1-ER3/BL21(DE3)的抗氯霉素阈值为374 μ g/ml，对氯霉素的抗性提高了 10倍(见表1)。提取该菌株的质粒pET2la-CAT-Ll 1-ER3，使用EcoRV (购买于TAKARA，1042A)和Nde I双酶切鉴定重组
质粒是否已插入基因序列，琼脂糖凝胶电泳观察表明，重组质粒中含有ER3插入序列(见图5)。
[0036]表1:重组菌氯霉素抗性生长终浓度检测结果
【权利要求】
1.一种提闻外源蛋白表达的增强子样基因，其核昔酸序列选自: (I)如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列； 或者(2)如SEQ ID NO:1中的I~27Ibp所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的提高外源蛋白表达的增强子样基因在增强外源蛋白表达中的应用，其特征在于:将所述增强子样基因插入到表达载体启动子的上游或下游的邻近位置，使其作用于该表达载体启动子。`
【文档编号】C12N15/113GK103602684SQ201310591154
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月22日 优先权日:2013年11月22日
【发明者】井申荣, 闫沁男, 王应明, 曾韦锟, 黄芬 申请人:昆明理工大学