中国对虾comt重组蛋白的生产方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因产品开发与应用领域，涉及中国对虾COMT重组蛋白的生产方法及其应用。本发明的技术方案为：中国对虾COMT重组蛋白的生产方法，包括以下步骤：1）构建comt/pPIC9K重组表达载体；2）获得转化子高拷贝的毕赤酵母表达菌株comt/pPIC9K/KM71；3）转化子的发酵培养与诱导表达；4）COMT纯化。该法用真核——毕赤酵母生产与制备的儿茶酚-氧位-甲基转移酶（COMT）有翻译后的修饰，结构更天然，酶活性更高，直接用酵母液纯化，省去了原核菌体回收、破碎的繁琐步骤，降低了生产成本，提高了纯化效率。
【专利说明】中国对虾COMT重组蛋白的生产方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因产品开发与应用领域，涉及中国对虾COMT重组蛋白的生产方法及其应用。
【背景技术】
[0002]儿茶酌-氧位-甲基转移酶(CatechoK-methyltransferase,简称C0MT,E.C.2.1.1.6)，是1958年首先在人体发现的一种转甲基酶，主要代谢儿茶酚型的化合物，其反应机制如附图1所示，COMT酶(E.C.2.1.1.6)在有二价镁离子(Mg++)存在时，催化S腺苷蛋氨酸(SAM)的一个甲基转移到底物DHBAc分子的一个羟基上，形成甲基化产物香草酸(VA)和异香草酸(IVA)的反应机理。
[0003]在体内，COMT底物广泛，包括儿茶酚胺、多巴胺、肾上腺素、二羟苯甲酸(DHBAc)等。在体外检测时，底物DHBAc要比儿茶酚胺、多巴胺、肾上腺素相对稳定。COMT可以将DHBAc甲基化，产生香草酸(VA)和异香草酸(IVA)。高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)是检测COMT酶活性最为灵敏、快速的方法。
[0004]COMT在脊椎动物和无脊椎动物中都有发现，它不仅对生物的生长、发育有调控作用，而且与人类的精神疾病和肿瘤的发生有一定的联系。据报道，人有COMT酶活性高、中、低三种多态=COMT低活性的人似乎与强迫症、冲动好斗、燥狂抑郁等精神分裂症以及帕金森病和乳腺癌等疾病的发生有关；而COMT高活性的人与神经性厌食症、吸毒和自杀有一定的联系。显然，COMT已 经成为一个有用的药物发展的靶标。
[0005]2006年,我们首次克隆了中国对虫下{Fenneropenaeus chinensi51)的COMT基因，公开了该基因编码蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列(GenBank登录号为DQ091255)。Northernblot和原位杂交显示COMT基因在对虾组织中广为分布，在肝胰腺中高表达，在心脏和鳃中低表达，而且在细菌刺激的肝胰腺和胃中呈上调表达，说明中国对虾COMT基因对对虾可能有多种功能，尤其可能参与了对细菌感染的免疫反应。序列比对发现中国对虾的COMT与人的COMT具有较高的的同源性,具体见论文(Dian-Xiang Li, Xin-Jun Du, Xiao-Fan Zhao,Jin-Xing Wang.Cloning and expression analysis of an o-methyltransferase (OMT)gene from Chinese shrimp, Fenneropenaeus chinensis.Fish & Shellfish Immunol.2006;21:284 - 292.(SCI))。
[0006]2010年，我们将中国对虾COMT基因的表达框(ORF)重组到原核表达载体pET-30a (+)中，构建了重组表达质粒/pET-30a (+)，并成功地在大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中进行了重组蛋白的表达。表达的重组蛋白为可溶性的，用His-Bind亲和层析柱纯化，得到了高纯度的重组蛋白rCOMT。该重组蛋白经SDS-PAGE检测，其分子量约为30 kDa，与预计的重组蛋白的分子量一致。同时，用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)技术检测到了纯化的中国对虾COMT重组蛋白甲 基化底物二羟苯甲酸形成的产物-香草酸，证明了纯化的中国对虾COMT重组蛋白具有儿茶酚-氧位-甲基转移酶(COMT)活性。具体见论Dian-XiangLi, Xin-Jun Du, Xiao-Fan Zhao, Jin-Xing Wang.Expression, Purification andActivity Assay of the Recombinant Protein of CatechoI—O—MethyItransferasefrom Chinese White Shrimp (Fenneropenaeus chinensis).Am J Biochem & Biotech.2010;6(3):148-154.)
目前，中国对虾COMT重组蛋白的生产仅有我们2006、2010年的报道，该法是借用大肠杆菌原核表达系统表达重组的C0MT，该重组COMT缺乏翻译后的修饰会降低酶活性，而且要纯化重组COMT必须经过菌体离心回收、破碎和亲和层析等繁琐的步骤，生产成本高、效率低，限制了它的工业化生产。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于，克服现有技术的不足，提供了一种儿茶酚-氧位-甲基转移酶真核生产与制备的方法。本发明为一种真核重组生产儿茶酚-氧位-甲基转移酶(COMT)的方法，以克服大肠杆菌表达蛋白缺乏翻译后修饰而使其表达量和活性大大降低的缺点，该法容易通过亲和层析获得COMT纯品，具有很好的工业化生产前景。
[0008]为解决上述技术问题，本发明的技术方案为:
Cl)表达载体的构建:依据中国对虾COMT基因ORF的两端序列设计一对上下游引物COMT ExF和COMT ExR，并在引物的5’端引入&oR I与I酶切位点，同时，在下游引物COMT ExR的5’端引入6个组氨酸密码子标签。用鳗弧菌(KiArio anguiIIarum)取金黄色葡萄球菌{Staphylococcus aareiAs)混合液诱导的中国对奸cDNA为模板,PCR钓取comt片段，利用I与I两个酶切位点，与pPIC9K质粒定向连接，构建COffii/pPIC9K表达载体，测序证明重组质粒中的comt序列正确。
【权利要求】
1.中国对虾COMT重组蛋白的生产方法，包括以下步骤: O构建cofi?i/pPIC9K重组表达载体； 2)获得转化子高拷贝的毕赤酵母表达菌株coffii/pPIC9K/KM71； 3)转化子的发酵培养与诱导表达；
4)COMT 纯化。
2.根据权利要求1所述的中国对虾COMT重组蛋白的生产方法，其特征在于:所述步骤I)构建cofi?i/pPIC9K重组表达载体: 用獲弧菌(Vibrio aflgwiWara?)和金黄色葡萄球菌{Staphylococcus aareiAs)混合液诱导的中国对虾cDNA为模板，合成包含&oR I (GAATTC)与Not I iGCGGCCGC、内切酶位点的正反向引物，引物序列为:
COMT ExF:5’ -TACTCAfi^77TATGTCTTCTCTGAAGAGTTAC-3，
COMT ExR:5’ -TACTCAGCGGCCGCYCA ATG ATG ATG ATG ATG ATG
TTTTTTAAAACAGAGAGACAAGC-3， 经聚合酶链式反应(PCR)，扩增出666bp的COMT 0RF,将其克隆入pPIC9K质粒(Invitrogen),构建 co?i/pPIC9K 重组表达载体。
3.根据权利要求1所`述的中国对虾COMT重组蛋白的生产方法，其特征在于:所述步骤2)将构建好的COffii/pPIC9K表达载体用I酶切线性化，电转化毕赤酵母G0ZcAiapastorismil感受态细胞，线性化的载体将利用AOX基因同源重组到酵母的基因组中，获得高拷贝的表达菌株cofi?i/pPIC9K/KM71。
4.一种cofi?i/pPIC9K重组表达载体，所述表达的comt基因序列是编码SEQ N0.1所示的核苷酸序列。
5.权利要求4所述的一种co?i/pPIC9K重组表达载体,其特征在于:所述表达的comt基因编码的氨基酸序列是SEQ N0.2所示的氨基酸序列。
6.权利要求1所述的方法在治疗对细菌感染的免疫反应、人类的精神疾病和肿瘤中的应用。
7.权利要求4所述的表达载体在治疗对细菌感染的免疫反应、人类的精神疾病和肿瘤中的应用。
【文档编号】C12N15/81GK103602642SQ201310591259
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2013年12月13日
【发明者】李殿香, 王金星, 赵小凡, 王蕾, 齐梅 申请人:济南大学