一种基于苯并噻唑类希夫碱荧光探针的制备方法及应用

1.本发明属于金属离子检测的荧光探针技术领域，具体涉及一种基于苯并噻唑类希夫碱荧光探针的制备方法及应用。


背景技术：

2.锌是生物体所需的重要微量元素，以二价阳离子的形式存在，在人体内是仅次于铁的第二丰富的金属元素，在生物体的多种生命活动过程中扮演着至关重要的角色，包括神经传递、基因表达、细胞代谢以及dna和rna的合成等都有着重要的影响。然而，由于人为的增加，锌的浓度正在不断地上升，大多数锌来自于工业活动，如采矿、煤炭、废物燃烧和钢铁加工。过量的锌离子不仅会污染环境，而且在人类健康方面，锌离子的不平衡引起了许多精神疾病，包括阿尔茨海默病、帕金森病、前列腺癌、癫痫病等。因此，设计一种对锌离子具有高选择性的检测探针对人类健康和环境至关重要。
3.荧光探针是最有力的检测分析物的工具之一，而已报道的锌离子分子荧光探针大多数存在成本较高、合成工艺比较复杂、反应条件苛刻、抗干扰能力弱、响应时间长、灵敏度差等问题，从而在实际应用中受到极大的限制。因此，这就迫切需要合成简单、灵敏度高、选择性好、检出限低、光稳定性好的荧光探针用于检测锌离子。


技术实现要素：

4.针对上述问题本发明提供了一种基于苯并噻唑类希夫碱荧光探针的制备方法及应用。
5.为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
6.一种基于苯并噻唑类希夫碱荧光探针，分子式为c
34
h
31
n5o2s2，结构式为：
[0007][0008]
一种基于苯并噻唑类希夫碱荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0009]
(1)将2
‑
羟基
‑5‑
甲基苯甲醛和2
‑
氨基苯硫酚溶解于无水甲醇溶剂中，加入催化剂碘单质，在氮气保护下加热回流4h，反应完成后冷却至室温，有黄色固体析出，过滤后用冷甲醇洗涤，真空干燥，得到淡黄色固体，即为化合物a；反应过程如下：
[0010][0011]
(2)将化合物a和六亚甲基四胺溶解于三氟乙酸中，在氮气保护下加热回流12h；反应完成后冷却至室温，加入盐酸溶液，冰浴条件下搅拌5h，混合物用二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，柱层析法得到淡黄色固体，即为化合物b；反应过程如下：
[0012][0013]
(3)将二亚乙基三胺溶液逐滴加入到溶有化合物b的二氯甲烷溶液中，滴入3滴冰醋酸，室温搅拌30分钟后，回流反应8h，冷却至室温过滤，用冷的甲醇溶液洗涤，得到深橘色固体，为探针l，即为基于苯并噻唑类希夫碱荧光探针，反应过程如下：
[0014][0015]
进一步，所述步骤1中2
‑
羟基
‑5‑
甲基苯甲醛和2
‑
氨基苯硫酚的摩尔比为1:1。
[0016]
进一步，所述步骤1中2
‑
羟基
‑5‑
甲基苯甲醛和催化剂碘单质的摩尔比为1:0.5。
[0017]
进一步，所述步骤2中化合物a和六亚甲基四胺的摩尔比为1:1.3。
[0018]
进一步，所述步骤3中二亚乙基三胺和化合物b的摩尔比为1:2.2。
[0019]
一种基于苯并噻唑类希夫碱荧光探针的应用，在无水乙醇：tris
‑
hcl＝3:2的溶液中检测锌离子。
[0020]
进一步，所述在无水乙醇：tris
‑
hcl＝3:2的溶液中检测锌离子的方法是：在无水乙醇：tris
‑
hcl＝3:2的溶液中将荧光探针与锌离子进行反应，利用480nm处的荧光强度变化来检测锌离子是否存在；在未加入锌离子前，探针溶液在552nm处有荧光信号，当加入锌离子后，荧光发射蓝移，在480nm处的荧光信号增强。
[0021]
进一步，所述检测锌离子的线性范围为0
‑
8.00
×
10
‑6m，检出限为6.04
×
10
‑8m。
[0022]
一种基于苯并噻唑类希夫碱荧光探针的应用，用于细胞内锌离子的检测。
[0023]
与现有技术相比本发明具有以下优点：
[0024]
1、本发明荧光探针合成步骤简单、成本低廉、反应时间短、条件温和。
[0025]
2、检测手段简单，只需要借助荧光光谱仪即可实现；
[0026]
3、本发明荧光探针化合物能够高灵敏度、高选择性识别zn
2+
，且响应时间短，在zn
2+
的检测中具有很好的应用前景。
[0027]
4、本发明荧光探针化合物可用于水体、土壤以及生物体系中锌离子的定性或定量检测。
附图说明
[0028]
图1实施例2荧光探针随zn
2+
变化的紫外吸收光谱图；
[0029]
图2实施例3荧光探针对金属离子的选择性实验；
[0030]
图3实施例4荧光探针对zn
2+
响应的工作曲线；
[0031]
图4实施例5荧光探针对金属离子的竞争性实验；
[0032]
图5实施例6 hella细胞成像图。
具体实施方式
[0033]
实施例1
[0034]
化合物a的合成：将2
‑
氨基苯硫酚(2g，16.1mmol)和2
‑
羟基
‑5‑
甲基苯甲醛(2.45g，16.1mmol)加入到装有20ml无水甲醇的圆底烧瓶中，向溶液中加入i2(2.04g，8.05mmol)，混合物在氮气保护下加热回流4h。待反应完成后冷却至室温，有黄色固体析出，收集固体，用布氏漏斗过滤并用冷的甲醇洗涤。进一步在真空中干燥，得到淡黄色固体，即为化合物a，(1.63g，42.1％)。表征结果如下：1h nmr(600mhz,cdcl3)δ12.21(s,1h),7.92(d,j＝8.2hz,1h),7.84(d,j＝8.0hz,1h),7.54
–
7.43(m,2h),7.34(t,j＝7.2hz,1h),7.19(d,j＝8.4hz,1h),7.13(d,j＝8.4hz,1h),2.29(s,3h)。
[0035]
化合物b的合成：将化合物a(1.40g,5.82mmol)，六亚甲基四胺(1.22g,8.73mmol)加入到装有8ml三氟乙酸(tfa)的圆底烧瓶中，随后在氮气保护下加热回流15h(110℃)。反应完成后冷却至室温，加入盐酸溶液酸化(35ml,4mmol)，冰浴条件下持续搅拌5h。然后将混合物依次用二氯甲烷萃取，饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，最后减压浓缩，用硅胶柱纯化(乙酸乙酯:石油醚＝1:5)，得到淡黄色固体，即为化合物b(0.970g,62.0％)。表征结果如下：1h nmr(600mhz,cdcl3)δ13.06(s,1h),10.52(s,1h),8.06(s,1h),7.97(s,1h),7.92(s,1h),7.74(s,1h),7.57(s,1h),7.47(s,1h),2.43(s,3h).
13
c nmr(151mhz,cdcl3)δ190.88(s),158.58(s),151.52(s),135.23(s),133.13(s),132.64(s),128.96(s),126.90(s),125.86(s),123.74(s),122.42(s),121.63(s),118.71(s),20.37(s)。
[0036]
探针l的合成：将二亚乙基三胺(6.50μl,99％)逐滴加入到溶有化合物b(30.2mg,0.112mmol)的二氯甲烷(5ml)溶液中，滴入3滴冰醋酸，室温搅拌30min后，回流反应8h，反应完成后冷却至室温，收集固体，用布氏漏斗过滤并用冷的甲醇溶液洗涤，干燥，得到深橘色固体，即为探针l(22.3mg,65.4％)。表征结果如下：1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.42(s,1h),8.33(s,1h),8.05(s,1h),7.90(s,1h),7.49(s,1h),7.35(s,1h),7.26(s,1h),7.12(s,1h),5.32(s,1h),3.77(s,2h),3.11(s,2h),2.29(s,3h).
13
c nmr(151mhz,cdcl3)δ165.78(s),163.20(s),162.11(s),151.93(s),135.91(s),134.34(s),133.71(s),126.51(s),125.91
(s),124.40(s),122.39(s),121.80(s),121.37(s),117.96(s),57.07(s),49.18(s),20.27(s).hrms(esi)：c
34
h
31
n5o2s
2 for[l+h]
+
，calculated 606.1999,found 606.1989。
[0037]
实施例2
[0038]
探针分子随zn
2+
浓度变化的紫外吸收光谱图
[0039]
为测试探针分子对不同浓度zn
2+
条件下紫外吸收光谱的研究，在相同实验条件下，向1ml无水乙醇与tris
‑
hcl的缓冲溶液(ch3ch2oh:tris
‑
hcl＝3:2,v/v,20mmol,ph＝7.4)中加入10μl探针分子储备液(1mmol/l)，进行zn
2+
紫外滴定实验，并测试其紫外吸收光谱(图1)。由图1可知，加入zn
2+
后，探针分子在421nm处出现新的吸收峰，且随着溶液中锌离子的浓度逐渐增大，421nm处的吸收峰逐渐增强，同时探针分子在363nm处的吸收峰红移到373nm，在383nm处出现等吸收点。
[0040]
实施例3
[0041]
探针分子与zn
2+
作用前后的荧光光谱研究
[0042]
为测试探针分子与zn
2+
作用前后的荧光光谱，在相同实验条件下，向1ml无水乙醇与tris
‑
hcl的缓冲溶液(ch3ch2oh:tris
‑
hcl＝3:2,v/v,20mmol,ph＝7.4)中加入1μl探针分子储备液(1mmol/l)，随后滴加1μl不同金属离子储备液(10mmol/l)，测试其荧光光谱(图2)。由图2可知，只有在探针分子溶液中加入zn
2+
后，在480nm处的发射峰会显著增强，并且伴随着明显的荧光颜色变化，由黄色变为青蓝色，表明探针分子可选择性的检测锌离子。
[0043]
实施例4
[0044]
探针分子对不同浓度zn
2+
条件下荧光强度变化的研究
[0045]
为测试探针分子对不同浓度zn
2+
条件下荧光强度变化的研究，在相同实验条件下，向1ml无水乙醇与tris
‑
hcl的缓冲溶液(ch3ch2oh:tris
‑
hcl＝3:2,v/v,20mmol,ph＝7.4)中加入1μl探针分子储备液(1mmol/l)，进行zn
2+
荧光滴定实验，并测试其荧光光谱(图3)。由图3可知，随着锌离子浓度的增加，480nm处的荧光强度逐渐增强，以溶液在480nm处荧光发射强度对锌离子的浓度作图，锌离子浓度在0
‑
8μm范围内时，两者之间呈现良好的线性关系(插图)，能实现该浓度范围内锌离子的定量检测。检出限是60.4nm，低于who规定饮用水中最大zn
2+
浓度(76μm)，说明本发明荧光探针分子对不同浓度的锌离子表现出了较高的灵敏度。
[0046]
实施例5
[0047]
探针分子对zn
2+
的干扰性研究
[0048]
为测试探针分子作为荧光传感器检测zn
2+
的抗干扰性，在相同实验条件下，向1ml无水乙醇与tris
‑
hcl的缓冲溶液(ch3ch2oh:tris
‑
hcl＝3:2,v/v,20mmol,ph＝7.4)中加入1μl探针分子储备液(1mmol/l)和1μl锌离子储备液(10mmol/l)，随后向其中各滴加1μl不同金属离子储备液(10mmol/l)，测试其荧光光谱(图4)。绘制以480nm处的荧光强度为纵坐标，不同金属离子为横坐标的图，由图可知探针分子对zn
2+
检测不受其他具有潜在竞争性的金属离子的干扰，如k
+
,na
+
,ca
2+
,mg
2+
,ba
2+
,fe
3+
,al
3+
,zn
2+
,li
+
,cr
3+
,cd
2+
,co
2+
,pb
2+
,cu
2+
,ag
+
,hg
2+
，在上述金属离子存在的条件下，仍然不干扰体系对锌离子的检测。
[0049]
实施例6
[0050]
hella细胞成像图
[0051]
实验之前用dmso溶解配成浓度为1mm的荧光探针储备液。将培养好的hella细胞用
ph＝7.40的pbs缓冲液洗涤，然后向两个培养皿中加入含有10μl探针的1ml pbs(ph 7.40)缓冲溶液，置于37℃的5％co2培养箱中孵育15min后，用pbs缓冲液轻轻清洗三次，以除去培养基中过量的未进入细胞的探针储备液。向其中一个孵有探针的培养皿中加入含有9μl(1
×
10
‑2m)zn
2+
的1ml，pbs(ph 7.40)缓冲溶液，同样的方法进行孵化、洗涤。
[0052]
最后将只孵过探针和孵过探针又孵过锌离子的细胞分别置于培养皿中加入1.0ml ph＝7.40的pbs溶液在激光共聚焦显微镜下成像观察。固定激发波长为412nm，收集发射波段为蓝色通道(420
‑
490nm)和黄色通道(500
‑
600nm)。从图5可看出，在只加入探针时，细胞内呈现较强黄色荧光，蓝色通道没有荧光，加入zn
2+
后黄色荧光减弱，而蓝色荧光增强。
[0053]
本发明说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。尽管上面对本发明说明性的具体实施方式进行了描述，以便于本技术领的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。