用于制备核苷酸P(V)单体的新方法与流程

用于制备核苷酸p(v)单体的新方法
1.本发明涉及一种用于制备核苷酸p(v)单体的新方法。
2.核苷酸单体是寡核苷酸合成中的结构单元。锁核酸(lna)寡核苷酸是合成的寡核苷酸，其特别适合用作治疗性合成反义寡核苷酸。lna寡核苷酸作为治疗剂的用途近几十年来已经取得了显著的进步，导致对通过多种机制起作用的分子的开发，这些分子包括rnase h活化缺口聚物、剪接转换寡核苷酸、微rna抑制剂、sirna或适体(s.t.crooke,antisense drug technology:principles,strategies,and applications，第2版，编者boca raton，fl:crc press,2008)。在这方面，意指至少一些核苷间键是硫代磷酸酯而不是天然磷酸二酯的硫代磷酸酯寡核苷酸已显示出在药理学上特别令人感兴趣。
3.使用不是围绕磷手性定义的核苷酸单体的结果之一是发现每个硫代磷酸酯键都具有r和s立体构型(即立体无规硫代磷酸酯键)。这导致特定的硫代磷酸酯反义寡核苷酸可在同一序列内包含许多不同的非对映异构体。例如，在给定一组长度为16个核苷酸的序列的硫代磷酸酯寡核苷酸的情况下，存在多达2
15
种不同的非对映异构体。对于同一组16个寡核苷酸的序列，这可能产生超过32,000种药理学上不同的化合物。因此，非常希望从此类混合物中鉴定、合成和/或分离一种药理学上最佳的化合物或一组药理学上最佳的化合物。事实上，可以合理地推测，此类最佳化合物将比标准立体无规硫代磷酸酯寡核苷酸具有大得多的治疗潜力。
4.合成此类硫代磷酸酯寡核苷酸的关键步骤之一是制备其结构单元，即其单体。该步骤可适当地立体选择性地进行以指导反义寡核苷酸合成为一组优选的非对映异构体或甚至单一的非对映异构体。
5.传统上，硫代磷酸酯寡核苷酸单体的合成已使用基于磷/[p(iii)]的试剂系统进行。最近，baran等人，science,2018,361,1234
‑
1238提供了一种使用基于磷/[p(v)]的试剂系统的不同方法，被解读为“用于可编程、无痕迹、非对映选择性磷
‑
硫掺入的平台”。baran等人还提出“经由有效、低成本和操作简单的方案，通过各种核苷酸构架(包括aso和cdn)的稳健和立体控制的合成，证明了该试剂系统的效力”。
[0006]
不幸的是，baran等人没有描述本发明人感兴趣的lna核苷酸p(v)单体的制备，而仅描述了dna核苷酸p(v)单体的制备。在全面回顾了许多参数、试剂和工艺条件以及许多其他建议后，baran等人教导使用为核苷的1.3当量的1,8
‑
二氮杂二环[5.4.0]十一碳
‑7‑
烯(dbu)碱作为最佳条件。
[0007]
本发明人发现了一种通过基于p(v)试剂的系统利用令人惊讶地优化的条件制备lna核苷酸p(v)单体的新方法，产生了比现有技术中描述的产率相对更高的最便宜的方法。


技术实现要素：

[0008]
在第一方面，本发明涉及一种用于制备式(iiia)或(iiib)的p(v)单体的方法：
[0009][0010]
从使用1,8
‑
二氮杂二环[5.4.0]十一碳
‑7‑
烯(dbu)作为碱的核苷开始，其中dbu的用量为核苷的约0.8当量。
[0011]
在第二方面，本发明涉及一种式(iiia)或(iiib)的化合物：
[0012][0013]
其中r1、r2、r3和r4如本文所定义。
[0014]
在第三方面，本发明涉及根据本发明的方法制备的式(iiia)或(iiib)的化合物。
[0015]
在第四方面，本发明涉及根据本发明的方法制造的lna寡核苷酸。
[0016]
下面将更详细地描述本发明的其他方面。
[0017]
定义
[0018]
术语“烷基”，单独或组合地，表示具有1至8个碳原子的直链或支链烷基，特别地为具有1至6个碳原子的直链或支链烷基，并且更特别地为具有1至4个碳原子的直链或支链烷基。直链和支链c1‑
c8烷基的示例为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、异构戊基、异构己基、异构庚基和异构辛基，特别地为甲基、乙基、丙基、丁基和戊基。烷基的具体示例为甲基、乙基和丙基。
[0019]
术语“氨基”，单独或组合地，表示伯氨基(
‑
nh2)、仲氨基(
‑
nh
‑
)或叔氨基(
‑
n
‑
)。
[0020]
术语“氨基保护基团”表示氨基基团的保护基团。胺为在有机反应期间通常需要保护基团的官能团。氨基甲酸酯诸如叔丁氧羰基(boc，例如通过浓强酸(诸如hcl或cf3cooh)或加热至>80℃去除)、苄氧羰基(cbz，例如通过氢解去除)或9
‑
芴基甲氧羰基(fmoc，例如通过碱诸如哌啶去除)为常用的胺保护基团。可使用具有不同脱保护条件的保护基团的其他
选择，诸如美国宾夕法尼亚州匹兹堡大学的peter wipf和他的同事所述的，他们已经为伯胺、仲胺和杂环胺开发了有用的保护基团：2,2,6,6
‑
四甲基哌啶
‑1‑
基氧羰基(tempoc)。乙酰基(ac)基团在寡核苷酸合成中很常见，用于保护胞嘧啶中的n4和腺嘌呤核酸碱基中的n6，并且可通过用碱处理去除，最常见的为用氨水或气态氨或甲胺处理。ac太稳定以致于不能容易地从脂族酰胺中去除。苯甲酰基(bz)基团在寡核苷酸合成中也很常见，用于保护胞嘧啶中的n4和腺嘌呤核酸碱基中的n6，并且通过用碱处理去除，最常见的为用氨水或气态氨或甲胺处理。bz太稳定以致于不能容易地从脂族酰胺中去除。本领域技术人员也可考虑通常使用的其他合适的氨基保护基团，诸如dmf或ibu。
[0021]
术语“芳基”，单独或组合地，表示包含6至10个碳环原子的单价芳族碳环单环或双环环系，任选地被1至3个独立地选自卤素、羟基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基和甲酰基的取代基取代。芳基的示例包括苯基和萘基，具体地为苯基。
[0022]
当提及dbu时，表述“以核苷的约0.8当量的量”意指核苷的0.7当量至0.9当量的范围。在该上下文中，当量意指摩尔当量。换句话讲，它表示约0.7至0.9dbu:1核苷摩尔比。
[0023]
术语“卤素”或“卤代基”，单独或组合地，表示氟、氯、溴或碘并且特别地为氟、氯或溴，更特别地为氟。术语“卤代”与另一基团组合表示所述基团被至少一个卤素取代，特别地被一至五个卤素、特别地一至四个卤素即一个、两个、三个或四个卤素取代。
[0024]
术语“羟基”(hydroxyl/hydroxy)，单独或组合地，表示
‑
oh基团。
[0025]“羟基保护基团”为羟基基团的保护基团并且也用于保护硫醇基团。羟基保护基团的示例为乙酰基(ac)、苯甲酰基(bz)、苄基(bn)、β
‑
甲氧基乙氧基甲基醚(mem)、二甲氧基三苯甲基(或双
‑
(4
‑
甲氧基苯基)苯基甲基)(dmt)、三甲氧基三苯甲基(或三
‑
(4
‑
甲氧基苯基)苯基甲基)(tmt)、甲氧基甲基醚(mom)、甲氧基三苯甲基[(4
‑
甲氧基苯基)二苯基甲基(mmt)、对甲氧基苄基醚(pmb)、甲基硫代甲基醚、新戊酰基(piv)、四氢吡喃基(thp)、四氢呋喃(thf)、三苯甲基或三苯基甲基(tr)、甲硅烷基醚(例如三甲基甲硅烷基(tms)、叔丁基二甲基甲硅烷基(tbdms)、三异丙基甲硅烷氧基甲基(tom)和三异丙基甲硅烷基(tips)醚)、甲基醚和乙氧基乙基醚(ee)。羟基保护基团的具体示例为dmt和tmt，具体地为dmt。
[0026]
术语“lna单体”是指lna核苷酸，意指其核苷为如本文定义的lna核苷的核苷酸。
[0027]
术语“药用盐”是指保留游离碱或游离酸的生物效果和特性的那些盐，这些盐在生物学或其他方面不是不合需要的。这些盐用无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸(特别地盐酸)和有机酸诸如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、n
‑
乙酰基半胱氨酸形成。此外，这些盐可通过向游离酸中添加无机碱或有机碱来制备。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于以下物质的盐：伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺)、环胺和碱性离子交换树脂，诸如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、赖氨酸、精氨酸、n
‑
乙基哌啶、哌啶、聚胺树脂。本发明的寡核苷酸也可以两性离子的形式存在。本发明特别优选的药用盐为钠盐、锂盐、钾盐和三烷基铵盐。
[0028]
术语“保护基团”，单独或组合地，表示选择性地封闭多官能化合物中的反应性位点使得化学反应可在另一个未保护的反应位点选择性地进行的基团。保护基团可被去除。
示例性的保护基团为氨基保护基团、羧基保护基团或羟基保护基团。
[0029]“磷酸酯保护基团”为磷酸酯基团的保护基团。磷酸酯保护基团的示例为2
‑
氰乙基和甲基。磷酸酯保护基团的一个具体示例为2
‑
氰乙基。
[0030]
如果本发明的起始材料或化合物之一含有一个或多个在一个或多个反应步骤的反应条件下不稳定或有反应性的官能团，则可在应用本领域公知方法的关键步骤之前引入适当的保护基团(如例如在t.w.greene和p.g.m.wuts，第3版，1999,wiley,new york的“protective groups in organic chemistry
””
中所述)。此类保护基团可在合成的后期使用文献中描述的标准方法去除。保护基团的示例为叔丁氧羰基(boc)、9
‑
芴基甲基氨基甲酸酯(fmoc)、2
‑
三甲基甲硅烷基乙基氨基甲酸酯(teoc)、苄氧羰基(cbz)和对甲氧基苄氧羰基(moz)。
[0031]
本文所述的化合物可包含几个非对称中心，并且可以光学纯的对映异构体、对映异构体的混合物诸如例如外消旋体、非对映异构体的混合物、非对映异构外消旋体或非对映异构外消旋体的混合物的形式存在。
[0032]
寡核苷酸
[0033]
如本文所用，术语“寡核苷酸”如本领域技术人员通常理解的那样被定义为包含两个或更多个共价连接的核苷的分子。此类共价结合的核苷也可被称为核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常在实验室中通过固相化学合成然后纯化来制备。当提及寡核苷酸的序列时，是指共价连接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的寡核苷酸为人造的，并且为化学合成的，并且通常为纯化或分离的。本发明的寡核苷酸可包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸。
[0034]
反义寡核苷酸
[0035]
如本文所用，术语“反义寡核苷酸”被定义为能够通过与靶核酸、特别是与靶核酸上的连续序列杂交来调节靶基因的表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不为双链的，因此不为sirna或shrna。优选地，本发明的反义寡核苷酸为单链的。应当理解，只要序列内或序列间自身互补性的程度低于跨寡核苷酸全长的50％，本发明的单链寡核苷酸便可形成发夹或分子间双链体结构(同一寡核苷酸的两个分子之间的双链体)
[0036]
连续核苷酸序列
[0037]
术语“连续核苷酸序列”是指寡核苷酸的与靶核酸互补的区域。该术语在本文中与术语“连续核碱基序列”和术语“寡核苷酸基序序列”可互换使用。在一些实施方案中，寡核苷酸的所有核苷酸构成连续核苷酸序列。在一些实施方案中，寡核苷酸包含连续核苷酸序列，诸如f
‑
g
‑
f’缺口聚物区域，并且可任选地包含另外的核苷酸，例如可用于将官能团附接至连续核苷酸序列的核苷酸接头区域。核苷酸接头区域可与靶核酸互补或不互补。
[0038]
核苷酸
[0039]
核苷酸为寡核苷酸和多核苷酸的结构单元，并且出于本发明的目的，包括天然存在的和非天然存在的核苷酸。在自然界中，核苷酸，诸如dna和rna核苷酸包含核糖糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸基团(其不存在于核苷中)。核苷和核苷酸也可以可互换地称为“单元”或“单体”。
[0040]
修饰的核苷
[0041]
如本文所用，术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与等同的dna或rna核苷相比，
通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或多种修饰而被修饰的核苷。在一个优选实施方案中，修饰的核苷包含修饰的糖部分。术语修饰的核苷在本文中还可与术语“核苷类似物”或修饰的“单元”或修饰的“单体”互换使用。具有未修饰的dna或rna糖部分的核苷在本文中被称为dna或rna核苷。在dna或rna核苷的碱基区域中具有修饰的核苷如果允许沃森克里克(watson crick)碱基配对，则通常仍称为dna或rna。
[0042]
核碱基
[0043]
术语核碱基包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，它们在核酸杂交中形成氢键。在本发明的上下文中，术语核碱基还包括修饰的核碱基，其可不同于天然存在的核碱基，但在核酸杂交过程中为功能性的。在此上下文中，“核碱基”是指天然存在的核碱基，诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。此类变体例如描述于hirao等人(2012)，accounts of chemical research，第45卷第2055页和bergstrom(2009)current protocols in nucleic acid chemistry，增刊37 1.4.1中。
[0044]
在一些实施方案中，通过以下方式修饰核碱基部分：将嘌呤或嘧啶改变为修饰的嘌呤或嘧啶，诸如取代的嘌呤或取代的嘧啶，诸如选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5
‑
甲基胞嘧啶、5
‑
噻唑并
‑
胞嘧啶、5
‑
丙炔基
‑
胞嘧啶、5
‑
丙炔基
‑
尿嘧啶、5
‑
溴尿嘧啶、5
‑
噻唑并
‑
尿嘧啶、2
‑
硫代
‑
尿嘧啶、2
’‑
硫代
‑
胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6
‑
氨基嘌呤、2
‑
氨基嘌呤、2,6
‑
二氨基嘌呤和2
‑
氯
‑6‑
氨基嘌呤的核碱基。
[0045]
核碱基部分可由每个相应核碱基的字母代码来表示，例如a、t、g、c或u，其中每个字母可任选地包括具有同等功能的修饰的核碱基。例如，在示例性的寡核苷酸中，核碱基部分选自a、t、g、c和5
‑
甲基胞嘧啶。任选地，对于lna缺口聚物，可使用5
‑
甲基胞嘧啶lna核苷。
[0046]
修饰的寡核苷酸
[0047]
术语修饰的寡核苷酸描述了包含一个或多个糖修饰的核苷和/或修饰的核苷间键的寡核苷酸。术语“嵌合”寡核苷酸为已在文献中用于描述具有修饰的核苷的寡核苷酸的术语。
[0048]
立体限定的寡核苷酸
[0049]
立体限定的寡核苷酸为其中至少一个核苷间键为立体限定的核苷间键的寡核苷酸。
[0050]
立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸为其中至少一个核苷间键为立体限定的硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸。
[0051]
互补性
[0052]
术语“互补性”描述了核苷/核苷酸的沃森克里克碱基配对的能力。沃森克里克碱基对为鸟嘌呤(g)
‑
胞嘧啶(c)和腺嘌呤(a)
‑
胸腺嘧啶(t)/尿嘧啶(u)。应当理解，寡核苷酸可包含具有修饰的核碱基的核苷，例如经常使用5
‑
甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，因此，术语互补性涵盖未修饰的核碱基和修饰的核碱基之间的沃森克里克碱基配对(参见例如hirao等人(2012)accounts of chemical research，第45卷第2055页和bergstrom(2009)current protocols in nucleic acid chemistry，增刊37 1.4.1)。
[0053]
如本文所用，术语“互补性％”是指在核酸分子(例如寡核苷酸)中的连续核苷酸序列中在给定位置处与分离的核酸分子(例如靶核酸)的给定位置处的连续核苷酸序列互补
(即与之形成沃森克里克碱基对)的核苷酸的比例。通过计数在两个序列之间形成配对的比对碱基的数目(与靶序列5
’‑3’
和寡核苷酸序列从3
’‑5’
比对时)除以寡核苷酸中的核苷酸总数并乘以100来计算百分比。在此类比较中，未比对(形成碱基对)的核碱基/核苷酸被称为错配。优选地，在计算连续核苷酸序列的互补性％时不允许插入和缺失。
[0054]
术语“完全互补”是指100％互补性。
[0055]
同一性
[0056]
如本文所用，术语“同一性”是指在核酸分子(例如寡核苷酸)中的连续核苷酸序列的在给定位置处与分离的核酸分子(例如靶核酸)的给定位置处的连续核苷酸序列相同(即，在它们与互补核苷形成沃森克里克碱基对的能力方面)的以百分比计的核苷酸数目。通过计数两个序列之间相同的比对碱基的数目除以寡核苷酸中核苷酸的总数并乘以100来计算百分比。同一性百分比＝(匹配
×
100)/比对区域的长度。优选地，在计算连续核苷酸序列的互补性％时不允许插入和缺失。
[0057]
杂交
[0058]
如本文所用，术语“杂交”(hybridizing/hybridizes)应当理解为两条核酸链(例如寡核苷酸和靶核酸)在相反链上的碱基对之间形成氢键，从而形成双链体。两条核酸链之间结合的亲和力为杂交的强度。它通常根据解链温度(t
m
)来描述，该解链温度被定义为一半寡核苷酸与靶核酸形成双链体的温度。在生理条件下，t
m
与亲和力不是严格成比例的(mergny和lacroix，2003,oligonucleotides 13:515
–
537)。标准状态gibbs自由能δg
°
为结合亲和力的更精确表示，并且通过δg
°
＝
‑
rtln(k
d
)与反应的解离常数(k
d
)相关，其中r为气体常数并且t为绝对温度。因此，寡核苷酸和靶核酸之间反应的非常低的δg
°
反映了寡核苷酸和靶核酸之间的强杂交。δg
°
为与反应相关的能量，其中水性浓度为1m，ph为7并且温度为37℃。寡核苷酸与靶核酸的杂交为自发反应，并且对于自发反应，δg
°
小于零。例如，使用如hansen等人，1965,chem.comm.36
–
38和holdgate等人，2005,drug discov today中所述的等温滴定量热法(itc)方法，可实验确定δg
°
。本领域的技术人员将知道商业设备可用于δg
°
测量。δg
°
也可通过使用如santalucia,1998,proc natl acad sci usa.95:1460
–
1465所述的最近相邻模型，使用如sugimoto等人，1995,biochemistry 34:11211
–
11216和mctigue等人，2004,biochemistry 43:5388
–
5405所述的适当导出的热力学参数来数值估计。为了具有通过杂交调节其预期的核酸靶标的可能性，对于长度为10
‑
30个核苷酸的寡核苷酸，本发明的寡核苷酸与靶核酸以低于
‑
10kcal的估计δg
°
杂交。在一些实施方案中，杂交的程度或强度通过标准状态gibbs自由能δg
°
来测量。对于长度为8
‑
30个核苷酸的寡核苷酸，寡核苷酸可与靶核酸以低于
‑
10kcal、诸如低于
‑
15kcal、诸如低于
‑
20kcal和诸如低于
‑
25kcal的估计δg
°
杂交。在一些实施方案中，寡核苷酸与靶核酸以
‑
10kcal至
‑
60kcal、诸如
‑
12kcal至
‑
40kcal、诸如
‑
15kcal至
‑
30kcal或
‑
16kcal至
‑
27kcal、诸如
‑
18kcal至
‑
25kcal的估计δg
°
杂交。
[0059]
糖修饰
[0060]
本发明的寡聚物可包含一个或多个具有修饰的糖部分(即当与dna和rna中发现的核糖糖部分相比时糖部分的修饰)的核苷。
[0061]
已经制备了许多具有核糖糖部分的修饰的核苷，主要目的为改善寡核苷酸的某些特性，诸如亲和力和/或核酸酶抗性。
2004/046160，wo 00/047599，wo 2007/134181，wo 2010/077578，wo 2010/036698，wo 2007/090071，wo 2009/006478，wo 2011/156202，wo 2008/154401，wo 2009/067647，wo 2008/150729；morita等人，bioorganic&med.chem.lett.12,73
‑
76，seth等人，j.org.chem.2010，第75卷第5期，第1569
‑
1581页；以及mitsuoka等人，nucleic acids research 2009,37(4),1225
‑
1238。
[0072]2’‑4’
桥包含2至4个桥连原子，并且特别地具有式
‑
x
‑
y
‑
，x连接到c4’并且y连接到c2’，
[0073]
其中
[0074]
x为氧、硫、
‑
cr
a
r
b
‑
、
‑
c(r
a
)＝c(r
b
)
‑
、
‑
c(＝cr
a
r
b
)
‑
、
‑
c(r
a
)＝n
‑
、
‑
si(r
a
)2‑
、
‑
so2‑
、
‑
nr
a
‑
、
‑
o
‑
nr
a
‑
、
‑
nr
a
‑
o
‑
、
‑
c(＝j)
‑
、se、
‑
o
‑
nr
a
‑
、
‑
nr
a
‑
cr
a
r
b
‑
、
‑
n(r
a
)
‑
o
‑
或
‑
o
‑
cr
a
r
b
‑
；
[0075]
y为氧、硫、
‑
(cr
a
r
b
)
n
‑
、
‑
cr
a
r
b
‑
o
‑
cr
a
r
b
‑
、
‑
c(r
a
)＝c(r
b
)
‑
、
‑
c(r
a
)＝n
‑
、
‑
si(r
a
)2‑
、
‑
so2‑
、
‑
nr
a
‑
、
‑
c(＝j)
‑
、se、
‑
o
‑
nr
a
‑
、
‑
nr
a
‑
cr
a
r
b
‑
、
‑
n(r
a
)
‑
o
‑
或
‑
o
‑
cr
a
r
b
‑
；
[0076]
前提条件是
‑
x
‑
y
‑
不为
‑
o
‑
o
‑
、si(r
a
)2‑
si(r
a
)2‑
、
‑
so2‑
so2‑
、
‑
c(r
a
)＝c(r
b
)
‑
c(r
a
)＝c(r
b
)、
‑
c(r
a
)＝n
‑
c(r
a
)＝n
‑
、
‑
c(r
a
)＝n
‑
c(r
a
)＝c(r
b
)、
‑
c(r
a
)＝c(r
b
)
‑
c(r
a
)＝n
‑
或
‑
se
‑
se
‑
；
[0077]
j为氧、硫、＝ch2或＝n(r
a
)；
[0078]
r
a
和r
b
独立地选自氢、卤素、羟基、氰基、硫代羟基、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、烷氧基、取代的烷氧基、烷氧基烷基、烯氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲酰基、芳基、杂环基、氨基、烷基氨基、氨基甲酰基、烷基氨基羰基、氨基烷基氨基羰基、烷基氨基烷基氨基羰基、烷基羰基氨基、脲基、烷酰基氧基(alkanoyloxy)、磺酰基、烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫代羟基硫化烷基硫烷基(thiohydroxylsulfidealkylsulfanyl)、芳氧基羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、
‑
oc(＝x
a
)r
c
、
‑
oc(＝x
a
)nr
c
r
d
及
‑
nr
e
c(＝x
a
)nr
c
r
d
；
[0079]
或两个偕r
a
和r
b
一起形成任选地取代的亚甲基；
[0080]
或两个偕r
a
和r
b
与它们所附接的碳原子一起形成环烷基或卤代环烷基，其中
‑
x
‑
y
‑
仅有一个碳原子；
[0081]
其中取代的烷基、取代的烯基、取代的炔基、取代的烷氧基和取代的亚甲基为被1至3个独立地选自卤素、羟基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲酰基、杂环基、芳基和杂芳基的取代基取代的烷基、烯基、炔基和亚甲基；
[0082]
x
a
为氧、硫或
‑
nr
c
；
[0083]
r
c
、r
d
和r
e
独立地选自氢和烷基；并且
[0084]
n为1、2或3。
[0085]
在本发明的又一个具体实施方案中，x为氧、硫、
‑
nr
a
‑
、
‑
cr
a
r
b
‑
或
‑
c(＝cr
a
r
b
)
‑
，特别地为氧、硫、
‑
nh
‑
、
‑
ch2‑
或
‑
c(＝ch2)
‑
，更特别地为氧。
[0086]
在本发明的另一个具体实施方案中，y为
‑
cr
a
r
b
‑
、
‑
cr
a
r
b
‑
cr
a
r
b
‑
或
‑
cr
a
r
b
‑
cr
a
r
b
‑
cr
a
r
b
‑
，特别地为
‑
ch2‑
chch3‑
、
‑
chch3‑
ch2‑
、
‑
ch2‑
ch2‑
或
‑
ch2‑
ch2‑
ch2‑
。
[0087]
在本发明的一个具体实施方案中，
‑
x
‑
y
‑
为
‑
o
‑
(cr
a
r
b
)
n
‑
、
‑
s
‑
cr
a
r
b
‑
、
‑
n(r
a
)cr
a
r
b
‑
、
‑
cr
a
r
b
‑
cr
a
r
b
‑
、
‑
o
‑
cr
a
r
b
‑
o
‑
cr
a
r
b
‑
、
‑
cr
a
r
b
‑
o
‑
cr
a
r
b
‑
、
‑
c(＝cr
a
r
b
)
‑
cr
a
r
b
‑
、
‑
n(r
a
)cr
a
r
b
‑
、
‑
o
‑
n(r
a
)
‑
cr
a
r
b
‑
或
‑
n(r
a
)
‑
o
‑
cr
a
r
b
‑
。
[0088]
在本发明的一个具体实施方案中，r
a
和r
b
独立地选自由以下项组成的组：氢、卤素、羟基、烷基和烷氧基烷基，具体地为氢、卤素、烷基和烷氧基烷基。
[0089]
在本发明的另一个具体实施方案中，r
a
和r
b
独立地选自由以下项组成的组：氢、氟、羟基、甲基和
‑
ch2‑
o
‑
ch3，具体地为氢、氟、甲基和
‑
ch2‑
o
‑
ch3。
[0090]
有利地，
‑
x
‑
y
‑
的r
a
和r
b
中的一者如上文所定义并且另一者全部同时为氢。
[0091]
在本发明的又一个具体实施方案中，r
a
为氢或烷基，具体地为氢或甲基。
[0092]
在本发明的另一个具体实施方案中，r
b
为氢或烷基，具体地为氢或甲基。
[0093]
在本发明的一个具体实施方案中，r
a
和r
b
中的一者或两者为氢。
[0094]
在本发明的一个具体实施方案中，r
a
和r
b
中的仅一者为氢。
[0095]
在本发明的一个具体实施方案中，r
a
和r
b
中的一者为甲基并且另一者为氢。
[0096]
在本发明的一个具体实施方案中，r
a
和r
b
两者同时为甲基。
[0097]
在本发明的一个具体实施方案中，
‑
x
‑
y
‑
为
‑
o
‑
ch2‑
、
‑
s
‑
ch2‑
、
‑
s
‑
ch(ch3)
‑
、
‑
nh
‑
ch2‑
、
‑
o
‑
ch2ch2‑
、
‑
o
‑
ch(ch2‑
o
‑
ch3)
‑
、
‑
o
‑
ch(ch2ch3)
‑
、
‑
o
‑
ch(ch3)
‑
、
‑
o
‑
ch2‑
o
‑
ch2‑
、
‑
o
‑
ch2‑
o
‑
ch2‑
、
‑
ch2‑
o
‑
ch2‑
、
‑
c(＝ch2)ch2‑
、
‑
c(＝ch2)ch(ch3)
‑
、
‑
n(och3)ch2‑
或
‑
n(ch3)ch2‑
；
[0098]
在本发明的一个具体实施方案中，
‑
x
‑
y
‑
为
‑
o
‑
cr
a
r
b
‑
，其中r
a
和r
b
独立地选自由以下项组成的组：氢、烷基和烷氧基烷基，具体地为氢、甲基和
‑
ch2‑
o
‑
ch3。
[0099]
在一个具体实施方案中，
‑
x
‑
y
‑
为
‑
o
‑
ch2‑
或
‑
o
‑
ch(ch3)
‑
，特别地为
‑
o
‑
ch2‑
。
[0100]2’‑4’
桥可位于核糖环平面的下方(β
‑
d
‑
构型)，或位于该环平面的上方(α
‑
l
‑
构型)，分别如式(a)和式(b)中所示。
[0101]
应当认识到，除非另外说明，否则lna核苷可处于β
‑
d或α
‑
l立体异构形式。
[0102]
本发明的lna核苷的具体示例在方案1中给出(其中b如上所定义)。
[0103]
方案1
[0104]
[0105]
[0106][0107]
具体的lna核苷为β
‑
d
‑
氧基
‑
lna、6
’‑
甲基
‑
β
‑
d
‑
氧基lna诸如(s)
‑6’‑
甲基
‑
β
‑
d
‑
氧基
‑
lna((s)
‑
cet)和ena。
[0108]
rnase h活性和募集
[0109]
反义寡核苷酸的rnase h活性是指当其与互补rna分子形成双链体时募集rnase h的能力。wo01/23613提供了用于测定rnaseh活性的体外方法，其可用于确定募集rnaseh的能力。通常，如果寡核苷酸在提供有互补靶核酸序列时具有的起始速率(以pmol/l/min测量)为使用与所测试的修饰寡核苷酸具有相同碱基序列但仅含有在寡核苷酸中所有单体之间具有硫代磷酸酯键的dna单体并使用wo01/23613(据此以引入方式并入)的实施例91
‑
95提供的方法测定的起始速率的至少5％，诸如至少10％或超过20％，则认为寡核苷酸能够募集rnase h。为了用于测定rhase h活性，可从lubio science gmbh,lucerne,switzerland获得重组人rnase h1。
具体实施方式
[0110]
在一个方面，本发明涉及一种用于制备式(iiia)或(iiib)的p(v)单体的方法，该方法包括以下步骤：使式(i)的修饰的核苷：
[0111][0112]
其中pg为羟基保护基团，
[0113]
r1为h并且r2为
‑
o(ch2)2och3，或者
[0114]
r1和r2一起形成选自
‑
ch2‑
o
‑
或
‑
ch(ch3)o
‑
的2
’‑4’
桥，其中氧经由位置r2附接；
[0115]
与式(iia)或(iib)的化合物：
[0116][0117]
其中r3为被卤代基取代的c6‑
c
10
芳基，并且该卤代基选自f、cl和br，并且r4为直链或支链的c1‑
c6‑
烷基；
[0118]
以及作为碱的1,8
‑
二氮杂二环[5.4.0]十一碳
‑7‑
烯(dbu)反应，其中dbu的用量为式(i)的核苷的约0.8当量；
[0119]
以产生式(iiia)或(iiib)的单体：
[0120][0121]
在本发明的一个或所有实施方案中，式(iia)或(iib)的化合物为：
[0122][0123]
在本发明的一个或所有实施方案中，式i的核苷具有下式(ia)：
[0124][0125]
在本发明的一个或所有实施方案中，式i的核苷具有下式(ib)：
[0126][0127]
在本发明的一个或所有实施方案中，式i的核苷具有下式(ic)：
[0128][0129]
在本发明的一个或所有实施方案中，核碱基选自由a、t、g、c和5
‑
甲基胞嘧啶组成的组。
[0130]
在本发明的一个或所有实施方案中，核碱基选自由a、t和g组成的组。
[0131]
在本发明的一个或所有实施方案中，核碱基为a、g、c或5
‑
甲基胞嘧啶，其中环外氨基部分由氨基保护基团保护。氨基保护基团可选自由dmf和ibu组成的组。
[0132]
在一个或所有实施方案中，本发明的方法还包括将式(iiia)或(iiib)的化合物作为p(v)单体偶联以制备反义寡核苷酸的步骤。这可根据本领域已知的方法进行。
[0133]
在本发明的一个或所有实施方案中，r1为h并且r2为
‑
o(ch2)2och3。
[0134]
在本发明的一个或所有实施方案中，r1和r2一起形成选自
‑
ch2‑
o
‑
的2
’‑4’
桥，其中氧经由位置r2附接。
[0135]
在本发明的一个或所有实施方案中，r1和r2一起形成选自
‑
ch(ch3)o
‑
的2
’‑4’
桥，其中氧经由位置r2附接。
[0136]
在本发明的一个或所有实施方案中，r3为被1个至5个f取代的苯基，例如被1个、2个、3个、4个或5个f取代、例如被4个或5个f取代，例如被5个f取代的苯基。
[0137]
在本发明的一个或所有实施方案中，r4为甲基或乙基，例如甲基。
[0138]
在本发明的一个实施方案中，本发明的方法为一种用于制备式(iiia1)或(iiib1)的化合物的方法，该方法包括以下步骤：使式(i)的修饰核苷：
[0139][0140]
其中pg为羟基保护基团，
[0141]
与式(iia1)或(iib1)的化合物：
[0142][0143]
与作为碱的1,8
‑
二氮杂二环[5.4.0]十一碳
‑7‑
烯(dbu)在mecn中反应，其中dbu的用量为式(ia)的核苷的约0.8当量；
[0144]
以产生式(iiia1)或(iiib1)的单体：
[0145][0146]
在另一方面，本发明涉及1,8
‑
二氮杂二环[5.4.0]十一碳
‑7‑
烯(dbu)作为碱在从如本文所述的式(i)的核苷开始制备式(iiia)或(iiib)的化合物中的用途，其中dbu的用量为核苷的约0.8当量。
[0147]
在另一方面，本发明涉及式(iiia)或(iiib)的化合物：
[0148][0149]
其中r1、r2、r3和r4如本文所定义。
[0150]
在一个实施方案中，根据本发明的式(iiia)或(iiib)的化合物具有式(iiia1)或(iiib1)：
[0151][0152]
在一个实施方案中，根据本发明的式(iiia)或(iiib)的化合物选自由以下化合物组成的组：
[0153]
[0154][0155]
在一个实施方案中，根据本发明的式(iiia)或(iiib)的化合物为以下化合物：
[0156][0157]
在一个实施方案中，根据本发明的式(iiia)或(iiib)的化合物为以下化合物：
[0158][0159]
在一个实施方案中，根据本发明的式(iiia)或(iiib)的化合物为以下化合物：
[0160][0161]
在一个实施方案中，根据本发明的式(iiia)或(iiib)的化合物为以下化合物：
[0162][0163]
本发明的另一方面为一种根据本发明的方法制备的式(iiia)或(iiib)的化合物。在一个实施方案中，它为通过本发明的方法直接获得的式(iiia)或(iiib)的化合物
[0164]
另一方面，本发明涉及一种根据本发明的方法制造的寡核苷酸。
[0165]
在本发明的一个或所有方面或实施方案中，dbu可在mecn中的溶液中反应。本领域技术人员还可设想其他合适的溶剂。
[0166]
在本发明的一个或所有方面或实施方案中，反应可在mecn中的溶液中进行。本领域技术人员还可设想其他合适的溶剂。
[0167]
在一个实施方案中，式(i)的化合物选自由以下项组成的组：
[0168][0169]
如从下表6可以看出，本发明人发现了一种通过基于p(v)试剂的系统制备lna单体的新方法，该方法具有令人惊讶的优化条件，导致比现有技术中描述的方法更便宜和更高的产率。例如，当dbu以0.8当量用于制备lna
‑
t、lna
‑
a和lna
‑
g时，化合物iii的分离产率显著高于现有技术中推荐的使用1.3当量dbu时的产率。对于lna
‑
c的制备，与使用1.3当量dbu时相比，当使用0.8当量dbu时获得相同或更好的产率。这意味着该方法可以明显更便宜，因为需要的dbu当量更少。
[0170]
实施例
[0171]
(s
p
_lna
‑
a)的一般合成
[0172][0173]
(r
p
_lna)的一般合成
[0174][0175]
使用0.8当量dbu或1.3当量dbu进行的p(v)lna a单体的一般合成
[0176]
在室温下向5
′‑
odmtr
‑
lna
‑
a(500mg，0.73mmol)和(+)
‑
1(423mg，0.95mmol)于mecn(9ml)中的悬浮液添加dbu(87μl，0.58mmol，0.8当量)于mecn(2ml)中的溶液，然后在室温下搅拌40分钟(tlc
‑
完全转化)。将反应混合物通过硅胶塞过滤，用etoac(35ml)冲洗。将滤液用水(15ml)、10％na2hpo4(20ml)、水(20ml)、饱和nahco3(20ml)洗涤，经na2so4干燥并蒸发。将残余物通过柱色谱法(洗脱剂为50％
‑
70％etoac的己烷溶液)纯化。
[0177]
表1
[0178][0179]
使用0.8当量dbu或1.3当量dbu进行的p(v)lna t单体的一般合成
[0180]
在室温下向5'
‑
odmtr
‑
lna
‑
t(500mg，0.87mmol)和(
‑
)
‑
1(507mg，1.13mmol)于mecn(9ml)中的悬浮液添加dbu(104μl，0.58mmol，0.8当量)于mecn(2ml)中的溶液，随后在室温下搅拌40分钟(tlc
‑
完全转化)。将反应混合物通过硅胶塞过滤，用etoac(35ml)冲洗。将滤液用10％na2hpo4(20ml)、水(20ml)、饱和nahco3(20ml)洗涤，经na2so4干燥并蒸发。将残余物通过柱色谱法(洗脱剂为etoac/己烷+1/1)纯化。
[0181]
表2
[0182][0183]
使用0.8当量dbu或1.3当量dbu进行的p(v)lna c单体的一般合成
[0184]
在室温下向5'
‑
odmtr
‑
lna
‑
c(588mg，0.87mmol)和(+)
‑
1(505mg，1.13mmol)于mecn(11ml)中的溶液添加dbu(dbu 106μl，0.58mmol，0.8当量)于mecn(2ml)中的溶液，随后在室温下搅拌40分钟(tlc
‑
完全转化)。将反应混合物通过硅胶塞过滤，用etoac(35ml)冲洗。将滤液用10％na2hpo4(20ml)、水(20ml)、饱和nahco3(20ml)洗涤，经na2so4干燥并蒸发。将残余物通过柱色谱法(洗脱剂为etoac/己烷+1/2，然后1/1)纯化。
[0185]
表3
[0186]
[0187][0188]
使用0.8当量dbu或1.3当量dbu进行的p(v)lna g
‑
ibu单体的一般合成
[0189]
在室温下向5'
‑
odmtr
‑
lna
‑
g
ibu
(500mg，0.75mmol)和(+)
‑
1(434mg，0.97mmol)于mecn(11ml)中的溶液添加dbu(91.2μl，0.60mmol，0.8当量)于mecn(1ml)中的溶液，随后在室温下搅拌40分钟(tlc
‑
完全转化)。将反应混合物通过硅胶塞过滤，用etoac(35ml)冲洗。将滤液用10％na2hpo4(20ml)、水(20ml)、饱和nahco3(20ml)洗涤，经na2so4干燥并蒸发。将残余物通过柱色谱法(洗脱剂为50％至75％etoac的己烷溶液)纯化。
[0190]
表4
[0191][0192]
使用0.8当量dbu或1.3当量dbu进行的p(v)lna g
‑
dmf单体的一般合成
[0193]
向5'
‑
odmtr
‑
lna
‑
g
dmf
(500mg，0.77mmol)于mecn(6ml)和thf(13ml)中的悬浮液中添加(+)
‑
1(444mg，1.00mmol)的mecn(5ml)溶液，随后添加dbu(dbu 91.5μl，0.61mmol，0.8当量)的mecn(1ml)溶液。将反应混合物在室温下搅拌1小时(lna
‑
g
dmf
逐渐溶解)。将反应混合物通过硅胶塞过滤，用etoac(100ml)、etoac/thf(1/2 80ml)、thf(50ml)从塞中洗出产物。将滤液用10％na2hpo4(100ml)、水(100ml)、饱和nahco3(100ml)、盐水(100ml)洗涤，经na2so4干燥并蒸发。将残余物通过柱色谱法(洗脱剂为10％至30％thf的etoac溶液)纯化。
[0194]
表5
[0195][0196]
表6：产率概览
[0197][0198]
1.1分析数据
[0199][0200]1h nmr(300mhz,cdcl3,ppm):8.71(1h,s),7.64(1h,d,j＝1.2hz),7.46
‑
7.41(2h,m),7.36
‑
7.26(6h,m),7.25
‑
7.20(1h,m)6.87
‑
7.60(4h,m),5.70(1h,s),5.16(1h,d,j＝7.3hz),4.95(1h,s),4.85(1h,s),4.66(1h,s),4.39(1h,dt,j＝12.8 3.5hz),3.81(2h,s),3.78(6h,s),3.47(1h,d,j＝11.1hz),3.42(1h,d,j＝11.1hz),2.60
‑
2.52(1h,m),2.35
‑
2.25(1h,m),2.09
‑
1.62(5h,m),1.76(3h,s),1.67
‑
1.64(6h,m)
[0201]
13
c nmr(100mhz,cdcl3,ppm)163.7,158.8,149.9,145.0,144.2,135.3,135.2,134.2,130.3,128.3,128.2,127.2,113.5,111.8,111.0,87.7,87.6,87.2,86.9,85.6,78.4,74.3,74.2,72.4,66.6,57.7,55.4,39.0,33.8,27.7,27.6,23.6,22.6,22.0,12.7。
[0202]
31
p nmr(160mhz,cdcl3,ppm)101.4.
[0203]
[α]
d20
＝
‑
37.0(c.1,dcm)。
[0204]
lcms esi(m/z):817.3[m
‑
h]
‑
[0205][0206]1h nmr(300mhz,cdcl3,ppm):8.8
‑
8.6(1h,br.s),7.64(1h,d,j＝1.0hz),7.52
‑
7.46(2h,m),7.40
‑
7.33(4h,m),7.33
‑
7.26(2h.m),7.26
‑
7.19(1h,m)6.87
‑
7.79(4h,m),5.69(1h,s),5.25(1h,d,j＝11.0hz),4.90
‑
4.88(1h,m),4.57(1h,s),4.60(1h,s),4.29(1h,dt,j＝12.6 3.1hz),3.87(1h,d,j＝8.3hz),3.79
‑
3.76(1h,m),3.78(3h,s),3.78(3h,s),3.59(1h,d,j＝11.0hz),3.42(1h,d,j＝11.0hz),2.57
‑
2.48(1h,m),2.08
‑
1.65(6h,m),1.65(6h,s),1.58(3h,d,j＝1.0hz)
[0207]
13
c nmr(100mhz,cdcl3,ppm):163.7,158.8,149.9,144.9,144.2,135.3,135.2,134.2,130.5,130.4,128.5,128.1,127.2,113.4,113.4,111.9,111.1,87.4,87.1,86.1,78.3,78.3,74.6,74.6,72.2,65.9,57.9,55.3,39.0,33.8,33.7,27.8,27.6,23.5,22.7,21.8,12.6。
[0208]
31
p nmr(160mhz,cdcl3,ppm):100.9.
[0209]
[α]
d20
＝+94.9(c.1,dcm)。
[0210]
lcms esi(m/z):817.25[m
‑
h]
‑
[0211][0212]1h nmr(300mhz,cdcl3,ppm):13.5
‑
13.2(1h,br.s),8.35
‑
8.28(2h,m),7.82(1h,j＝1.0hz),7.55
‑
7.40(5h,m),7.39
‑
7.28(6h,m),7.27
‑
7.22(1h,m),6.86
‑
6.83(4h,m),5.75(1h,s),5.19(1h,d,j＝7.5hz),4.95(1h,s),4.86(1h,s),4.71(1h,s),4.40(1h,dt,j＝12.7,3.5hz),3.84
‑
3.79(7h,m),3.50(1h,d,j＝11.1hz),3.44(1h,d,j＝11.1hz),2.62
‑
2.52(1h,m),2.36
‑
2.25(1h,m),2.09
‑
1.66(6h,m),1.85(3h,d,j＝1.0hz),1.76(3h,s),1.65(3h,s)。
[0213]
13
c nmr(100mhz,cdcl3,ppm):159.8,158.8,147.7,145.0,144.2,137.3,135.4,135.3,135.2,132.6,130.3,130.3,130.1,128.3,128.4,127.2,113.5,112.2,111.8,87.9,87.8,87.5,87.6,85.6,78.3,74.1,74.0,72.4,66.7,57.7,55.4,39.0,33.8,33.7,27.7,27.6,23.6,22.7,22.0,13.8。
[0214]
31
p nmr(160mhz,cdcl3,ppm)101.4
[0215]
[α]
d20
＝+15.9(c.1,dcm)。
[0216]
lcms esi(m/z):):922.81[m+h]
+
[0217][0218]1h nmr(300mhz,cdcl3,ppm):13.5
‑
13.3(1h,br.s),8.33
‑
8.28(2h,m),7.82(1h,d,j＝1.0hz),7.55
‑
7.48(3h,m),7.46
‑
7.37(6h,m),7.35
‑
7.29(2h,m),7.27
‑
7.22(1h,m),6.89
‑
6.81(4h,m),5.74(1h,s),5.28(1h,d,j＝11.2hz),4.92
‑
4.88(1h,m),4.86(1h,s),4.65(1h,s),4.30(1h,dt,j＝12.7,3.2hz),3.89(1h,d,j＝8.2hz),3.81
‑
3.77(1h,m),3.79(3h,s),3.79(3h,s),3.62(1h,.d,j＝11.0hz),3.44(1h,d,j＝11.0hz),2.57
‑
2.48(1h,m),2.08
‑
1.62(6h,m),1.78(3h,d,j＝1.0hz),1.66(3h,s),1.65(3h,s)
[0219]
13
c nmr(100mhz,cdcl3,ppm):159.8,158.9,158.8,147.7,144.9,144.2,137.2,135.4,135.3,135.2,132.6,130.5,130.1,128.5,128.3,128.2,127.2,113.4,113.4,112.2,111.9,87.6,87.5,87.4,87.1,86.1,78.2,78.1,74.5,74.4,72.3,65.9,57.9,55.4,38.9,33.8,33.7,27.8,27.6,23.5,22.7,21.8,13.7。
[0220]
31
p nmr(160mhz,cdcl3,ppm):100.9.
[0221]
[α]
d20
＝+152.3(c.1,dcm)。
[0222]
lcms esi(m/z):922.79[m+h]
+
[0223]
[0224]1h nmr(300mhz,cdcl3,ppm):9.04(1h,s),8.82(1h,s),8.38(1h,s),8.06
‑
7.97(2h,m),7.63
‑
7.55(1h,m),7.55
‑
7.47(2h,m),7.46
‑
7.39(2h,m),7.36
‑
7.25(1h,m),7.24
‑
7.17(1h,m)6.88
‑
6.78(4h,m),6.22(1h,s),5.32(1h,d,j＝6.75hz),4.98(1h,s,),4.96(1h,s),4.88(1h,s),4.42(1h,dt,j＝12.7 3.5hz),4.05(1h,d,j＝8.4hz),3.96(1h,d,j＝8.4hz),3.78(6h,s),3.49(2h,s),2.62
‑
2.53(1h,m),2.35
‑
1.2.25(1h,m),2.11
‑
1.64(5h,m),1.78(3h,s),1.63(3h,s)
[0225]
13
c nmr(100mhz,cdcl3,ppm):164.6,158.7,153.2,151.2,149.7,145.0,144.3,140.2,135.4,135.3,133.7,132.9,130.2,129.0,128.2,128.1,128.0,127.1,123.4,113.4,111.8,87.5,87.4,86.7,85.9,85.6,78.7,75.7,75.6,73.0,66.6,58.5,55.4,39.0,33.8,33.7,27.7,27.6,23.5,22.6,22.0。
[0226]
31
p nmr(160mhz,cdcl3,ppm)101.6.
[0227]
[α]
d20
＝
‑
71.7(c.1,dcm)。
[0228]
lcms esi(m/z):932.7[m+h]
+
[0229][0230]1h nmr(300mhz,cdcl3,ppm):9.1
‑
9.0(1h,br,s),8.80(1h,s),8.33(1h,s),8.04
‑
7.98(2h,m),7.62
‑
7.56(1h,m)7.54
‑
7.43(4h,m),7.37
‑
7.26(6h,m),7.24
‑
7.18(1h,m)6.85
‑
6.80(4h,m),6.20(1h,s),5.42(1h,d,j＝10.4hz),4.95(1h,s,),4.84(1h,s),4.66(1h,s),4.31(1h,dt,j＝12.6 3.3hz),4.14(1h,d,j＝8.4hz),3.95(1h,d,j＝8.4hz),3.77(6h,s),3.59(1h,d,j＝11.0hz),3.53(1h,d,j＝11.0hz),2.56
‑
2.47(1h,m),2.10
‑
1.60(6h,m),1.64
‑
1.60(6h,m)。
[0231]
13
c nmr(100mhz,cdcl3,ppm):164.6,158.7,153.0,151.0,149.6,144.8,144.2,140.3,135.4,135.3,133.6,132.9,130.2,129.9,128.2,128.0,127.9,127.0,123.4,113.3,111.8,87.2,87.1,86.7,86.1,85.9,78.6,78.5,76.0,75.9,72.8,65.8,58.9,55.2,38.0,33.6,33.6,27.6,27.5,23.3,22.5,21.6。
[0232]
31
p nmr(160mhz,cdcl3,ppm):101.1.
[0233]
[α]
d20
＝+48.5(c.1,dcm)。
[0234]
lcms esi(m/z):932.7[m+h]
+
[0235][0236]1h nmr(400mhz,cdcl3,ppm):12.02(1h,s),8.97(1h,s),7.79(1h,s),7.44
‑
7.38(2h,m),7.34
‑
7.23(6h,m),7.22
‑
7.17(1h,m),6.84
‑
6.77(4h,m),5.99(1h,d,j＝10.3hz),5.83(1h,s),4.97(1h,s),4.91
‑
4.88(1h,m),4.73(1h,s),4.40(1h,dt,j＝12.6,3.2hz),4.15(1h,d,j＝8.7hz),3.95(1h,d,j＝8.7hz),3.78(3h,s),3.78(3h,s),3.55
‑
3.49(2h,m),2.64(1h,septet,j＝6.8hz),2.60
‑
2.53(1h,m),2.20
‑
2.11(1h,m),2.10
‑
1.65(5h,m),1.70(3h,s),1.69(3h,s),1.27(3h,d,j＝6.8hz),1.25(3h,d,j＝6.8hz)。
[0237]
13
c nmr(100mhz,cdcl3,ppm):178.7,158.7,155.5,147.5,147.2,144.8,144.4,138.6,135.4,130.3,128.3,128.0,127.0,122.3,113.30,111.9,87.1,87.0,86.6,86.5,78.4,73.0,66.5,59.3,55.3,38.9,36.7,33.9,33.8,27.8,27.7,23.5,22.7,21.8,19.2,19.0。
[0238]
31
p nmr(160mhz,cdcl3,ppm):100.3。
[0239]
[α]
d20
＝+85.3(c.1,dcm)。
[0240]
lcms esi(m/z):914.73[m+h]
+
[0241][0242]1h nmr(400mhz,cdcl3,ppm):11.99(1h,s),8.89(1h,s),7.81(1h,s),7.43
‑
7.37(2h,m),7.33
‑
7.23(6h,m),7.22
‑
7.17(1h,m),6.84
‑
6.78(4h,m),5.97(1h,j＝7.7hz),5.84(1h,s),
[0243]
5.01
‑
4.87(1h,m),4.93
‑
4.87(2h,m),4.51(1h,dt,j＝12.7 3.5hz),4.07(1h,j＝8.5hz),4.00(1h,j＝68.5hz),3.78(6h,s),3.48
‑
3.41(2h,m),2.63
‑
2.56(1h,m),2.57(1h,septet,j＝6.9hz),2.36
‑
2.25(1h,m),2.14
‑
1.64(5h,m),1.78(3h,s),1.68(3h,s),1.24(3h,d,j＝6.9hz),1.22(3h,d,j＝6.9hz)。
[0244]
13
c nmr(100mhz,cdcl3,ppm):178.5,158.7,155.5,147.5,147.3,144.8,144.4,138.5,135.4,130.2,128.2,128.0,127.0,122.2,113.3,111.9,87.2,87.1,86.6,86.5,86.1,79.2,73.0,66.6,58.9,55.3,39.0,36.6,33.7,33.6,27.9,27.8,23.5,22.7,22.0,19.1,18.9。
[0245]
31
p nmr(160mhz,cdcl3,ppm):103.3。
[0246]
[α]
d20
＝
‑
14.6(c.1,dcm)。
[0247]
lcms esi(m/z):914.77[m+h]
+
[0248][0249]1h nmr(400mhz,cdcl3,ppm):9.2
‑
9.0(1h,br.s),8.59(1h,s),8.0
‑
7.8(1h,br.s),7.44
‑
7.39(2h,m),7.34
‑
7.23(6h,m),7.22
‑
7.16(1h,m),6.75
‑
6.77(4h,m),5.97(1h,s),5.39(1h,d,j＝6.5hz),4.98
‑
4.92(2h,m),4.88
‑
4.85(1h,m),4.41(1h,dt,j＝12.5 3.5hz),4.03(1h,d,j＝8.2hz),3.93(1h,d,j＝8.2hz),3.77(6h,s),3.51(1h,d,j＝10.9hz),3.43(1h,d,j＝10.9hz),3.10(3h,s),3.05(3h,s),2.59
‑
2.52(1h,m),2.32
‑
2.22(1h,m),2.07
‑
1.65(5h,m),1.76(3h,s),1.62(3h,s)。
[0250]
13
c nmr(100mhz,cdcl3,ppm):158.7,158.5,157.1,149.6,145.1,144.3,135.5,135.4,130.2,128.3,128.1,127.0,113.4,111.8,87.1,87.1,86.6,86.1,85.7,79.1,75.9,75.8,73.0,66.3,58.8,55.4,41.4,39.0,35.3,33.8,33.7,27.8,27.6,23.5,22.7,21.9,21.3。
[0251]
31
p nmr(160mhz,cdcl3,ppm):100.6。
[0252]
[α]
d20
＝
‑
37.4(c.1,thf)。
[0253]
lcms esi(m/z):899.71[m+h]
+
[0254]
[0255]1h nmr(400mhz,cdcl3,ppm):9.2
‑
9.0(1h,br.s),8.55(1h,s),8.0
‑
7.8(1h,br.s),7.48
‑
7.41(2h,m),7.37
‑
7.34(6h,m),7.22
‑
7.16(1h,m),6.84
‑
6.74(4h,m),5.96(1h,s),5.39(1h,d,j＝9.5hz),4.96
‑
4.75(2h,m),4.85
‑
4.81(1h,m),4.27(1h,dt,j＝12.7 3.1hz),4.14(1h,d,j＝8.3hz),3.92(1h,d,j＝8.3hz),3.76(6h,s),3.64
‑
3.50(2h,m),3.12(3h,s),3.06(3h,s),2.55
‑
2.46(1h,m),2.09
‑
1.58(6h,m),1.53(3h,s),1.61(3h,s)。
[0256]
13
c nmr(100mhz,cdcl3,ppm):158.7,158.3,157.0,144.9,144.4,135.5,135.4,130.3,130.2,128.3,128.1,127.5,127.1,113.4,113.4,111.8,87.0,86.7,86.2,79.0,76.3,76.2,73.0,65.8,59.4,55.3,41.5,38.9,35.3,33.7,33.7,27.7,27.5,23.4,22.6,21.7。
[0257]
31
p nmr(160mhz,cdcl3,ppm):100.0。
[0258]
[α]
d20
＝+70.8(c.1,thf)。
[0259]
lcms esi(m/z):899.74[m+h]
+
。