用于转基因表达的工程化腺相关(aav)载体1.优先权声明2.本技术要求2019年3月28日提交的美国临时申请系列号62/825,703的权益。前述的完整内容通过引用结合在此。3.联邦赞助的研究或开发4.本发明借助美国政府支持在美国国立卫生研究院授予的授权号ag047336和dc017117下做出。美国政府享有本发明的一定的权利。
技术领域：
：5.本文描述了用于例如cns、pns、内耳、心脏、或视网膜中的转基因表达的工程化aav载体、及其使用方法。还提供了开发在期望的细胞类型中介导转基因表达的新工程化aav载体的方法。
背景技术：
：：6.尽管aav9载体在全身递送后已显示对于递送至cns的显著潜力，在患有脊髓型肌肉萎缩症1的儿科患者中取得临床上的成功，但全身注射高剂量的aav载体可导致可消除转导的细胞的t细胞应答的诱导2。在猴中，存在一例高全身剂量的aav9样载体导致毒性和归因于全身性炎症的动物死亡的报道3。由于一位患者中的载体输注后的免疫反应，fda暂停使用高剂量aav9治疗肌肉萎缩症的近期i期临床试验。需要高剂量的原因是，以每载体基因组拷贝计的aav的相对低效率，无法在大量靶细胞中提供充分的转基因表达。因此，开发允许低剂量下的更有效的转导的新aav衣壳可产生更好的治疗功效，同时减少例如免疫毒性等安全问题。技术实现要素：7.本文描述了使用具有两部分表达盒的腺相关病毒(aav)载体基因组以识别新型病毒克隆的方法。首先是感兴趣的启动子下的cre重组酶盒。第二部分是aav启动子以驱动工程化衣壳基因的表达，“顺式(incis)”克隆至病毒基因组的第一区段。选择病毒载体用于使用表达具有上游loxp/stop位点的报告基因(例如，绿色荧光蛋白)的细胞的转基因表达(高灵敏度cre表达)，由此防止报告基因表达直至aav载体递送的cre移除终止位点。可分离报告基因阳性细胞，回收的aav衣壳序列将具有更高的介导有效转基因表达的可能性。本文还描述了在中枢神经系统(cns)和周围神经系统(pns)、心脏、肝、和内耳中驱动有效表达的工程化病毒序列。8.因此，本文提供了包括含有来自序列sttlysp(seqidno:1)或fvvgqsy(seqidno:2)的至少四个连续氨基酸的氨基酸序列的aav衣壳蛋白。在一些实施方案中，aav衣壳蛋白包括含有来自序列sttlysp(seqidno:1)或fvvgqsy(seqidno:2)的至少五个连续氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，aav衣壳蛋白包括含有来自序列sttlysp(seqidno:1)或fvvgqsy(seqidno:2)的至少六个连续氨基酸的氨基酸序列。可选地，aav衣壳蛋白包括含有来自图2a或7c中所示的序列(seqidnos:17‑150)的至少四个、五个、或六个连续氨基酸的氨基酸序列。9.在一些实施方案中，aav是aav9。10.在一些实施方案中，aav衣壳蛋白包括aav9vp1。11.在一些实施方案中，序列在对应于seqidno:6的氨基酸588和589的位置处、在vp1/vp2界面(氨基酸138)或583‑590之间的任何位点处插入至衣壳。12.本文还提供了编码如本文所描述的aav衣壳蛋白的核酸。13.此外，本文提供了包括本文所描述的衣壳蛋白的aav，优选地不包含野生型vp1、vp2、或vp3衣壳蛋白。在一些实施方案中，aav进一步包含转基因，优选地治疗性转基因。14.还提供了将转基因递送至细胞、例如体内或体外/离体细胞的方法。所述方法包括使细胞与本文所描述的aav相接触。在一些实施方案中，细胞为神经元(任选地，背根神经节神经元或螺旋神经节神经元)、星形胶质细胞、心肌细胞、或肌细胞、星形胶质细胞、神经胶质细胞、内毛细胞、外毛细胞、支持细胞、内耳的纤维细胞、光感受器、中间神经元、视网膜神经节、或视网膜色素上皮细胞。15.在一些实施方案中，细胞在活受试者中，例如，哺乳动物受试者，优选人类。在一些实施方案中，细胞在选自脑、脊髓、背根神经节、心脏、内耳、眼、或肌肉、及其组合的组织中。在一些实施方案中，受试者患有阿尔茨海默症；帕金森氏症；x‑连锁肾上腺脑白质营养不良；canavan病；尼曼匹克症；脊髓型肌肉萎缩症；亨廷顿病；connexin‑26；usher综合征3a型；usher综合征2d型；毛细胞相关听力丧失；毛细胞相关听力丧失(dfnb7/11)；内毛细胞相关听力丧失(dfnb9)；usher综合征1f型；usher综合征1b型；视网膜色素变性(rp；非综合征)；莱伯氏先天性黑蒙症；莱伯氏遗传性视神经病变；usher综合征(rp；伴有耳聋的综合征)；杜兴氏肌肉营养不良；同种异体移植血管病变；或血友病a和b。本文所描述的方法和组合物可通过施用足以减轻病况的一种或多种症状、降低病况的一种或多种症状的风险、或延迟病况的一种或多种症状的发作的治疗有效量的携带治疗性转基因的aav用于治疗这些病况。16.在一些实施方案中，细胞在受试者脑中，aav通过肠胃外递送；脑内；或鞘内递送施用。17.在一些实施方案中，鞘内递送是通过腰椎注射、小脑延髓池注射、或实质内注射。18.在一些实施方案中，aav通过肠胃外递送、优选地通过静脉内、动脉内、皮下、腹腔内、或肌内递送来递送。19.在一些实施方案中，细胞在受试者眼中，aav通过视网膜下或玻璃体内注射来施用。20.在一些实施方案中，细胞在受试者的内耳中，aav通过在圆窗膜上或通过圆窗膜应用、通过邻近圆窗的外科手术钻孔耳蜗造口术、骨卵圆窗中的膜孔、或半规管来施用至耳蜗。21.本文还提供了包括以下的文库构建体aav：22.(i)由启动子驱动的编码cre重组酶的序列；23.(ii)cre盒下游的、由启动子驱动的、编码具有插入在编码衣壳的氨基酸(aa)588‑589的序列之间的例如七聚体肽等如本文所描述的肽的aav9衣壳蛋白的序列。在一些实施方案中，肽包括随机肽序列或预选的肽序列。24.还提供了包括多个如本文所描述的文库构建体的文库。在一些实施方案中，其中所述肽序列为随机的，所述文库包括具有编码七聚体的所有可能变体的序列的文库构建体。25.本文还提供了识别在预选的细胞类型中介导转基因表达的工程化衣壳的方法。所述方法包括：(a)将权利要求23或24所述的文库施用至非人模型动物，优选哺乳动物，其中所述模型动物的细胞表达报告序列的上游的loxp‑侧翼的stop盒；(b)分离预选的细胞类型的细胞；(c)选择表达报告序列的细胞；(d)从来自步骤(c)的表达报告序列的所选细胞分离文库构建体的至少一部分，优选地包括七聚体的部分；和(e)确定步骤(d)中分离的文库构建体中的七聚体的身份，其中分离的七聚体可在预选的细胞类型中介导转基因表达。26.在一些实施方案中，报告序列编码荧光报告蛋白。27.在一些实施方案中，模型动物对于具有报告序列的上游的loxp‑侧翼的stop盒是转基因的，或其中报告序列的上游的loxp‑侧翼的stop盒可由第二构建体表达。28.在一些实施方案中，确定文库构建体中的七聚体的身份包括使用dna测序分析。29.在一些实施方案中，方法还在步骤(e)之前和/或之后包括：使用pcr从步骤(d)中分离的文库构建体扩增包括七聚体序列、任选地包括完整衣壳序列的序列；将扩增的序列克隆回第二组文库载体；重新包装第二组文库载体；和对第二组文库载体进行步骤(a)‑(d)或(a)‑(e)。30.除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语具有与本发明所属
技术领域：
：普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文所描述的方法和材料用于本发明；也可使用本领域已知的其它合适的方法和材料。材料、方法、和实例仅为说明性的而不旨在进行限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目、和其它参考文献以其整体引用结合在此。在冲突的情况下，本说明书，包括定义，将占主导。31.本发明的其它特征和优点将从以下详细说明和附图、以及从权利要求书中显而易见。附图说明32.图1a‑b.用于选择能够在靶组织中有效转基因表达的新aav衣壳的itransduce文库。a.文库构建体的双组分系统。1.由最小鸡β肌动蛋白(cba)启动子驱动的cre重组酶。2.克隆在cre盒的下游的、具有插入在aa588‑589之间的随机七聚体肽的p41启动子驱动的aav9衣壳。b.选择策略。i.将由在衣壳上表达的不同肽插入物(由不同颜色表示)构成的itransduce文库静脉注射至具有tdtomato报告基因的上游的loxp‑侧翼的stop盒的ai9转基因小鼠中，插入至gt(rosa)26sor基因座。aav衣壳能够进入感兴趣的细胞，但不功能性地转导细胞(无cre表达)，不启动tdtomato表达。可介导功能性转导(表达cre)的衣壳将启动tdtomato表达。ii.从感兴趣的器官(例如，脑)分离细胞，并对于tdtomato表达和任选地细胞标志物分选转导的细胞。iii.衣壳dnapcr扩增自分选的细胞，克隆回文库载体并重新包装用于另一轮的选择。在每一轮后采用dna测序分析以监测选择过程。33.图2a‑b.对于全身注射后脑转导的两轮体内选择后的aav‑s和aav‑f的识别。环形图表示通过下一代测序确定的特定肽插入物的频率。a.生产之后但注射前的第2轮载体序列的表格(seqidnos:17‑86)。b.第2轮注射后，itransduce分离中出现的肽频率的环形图(seqidnos.1‑3)。“其它”表示以小于总池的1％出现的序列变体((a)中，还强调了在第2轮筛选后分离的变体，以小于1％出现)。*表示终止密码子。34.图3a‑f.全身注射后，aav‑f有效转导小鼠的脑。a.用于比较衣壳的转导潜力的单链aav‑gfp表达盒。itr，反向末端重复；cba，杂交cmv增强子/鸡β肌动蛋白启动子；wpre，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件；pa，polya信号(sv40和牛生长激素二者衍生的)。b.来自由1x1011vg(低剂量)的aav9、aav9‑php.b、aav‑s、或aav‑f转导的c57bl/6小鼠(雄性)的完整脑矢状切片的代表性低放大率图像。c.在c57bl/6雄性中注射8x1011vg(高剂量)的各个载体后的脑的矢状切片的代表性图像。d.通过以高剂量(8x1011vg/小鼠)静脉内施用四种载体的每一种而转导的脊髓的示例性切片。e.在低(左图)和高(右图)剂量下，通过由荧光覆盖的切片的百分比来定量来自每种载体的天然gfp表达。f.在更高剂量下，脑中的转导的多区域比较。具有tukey多重比较检验的单因素方差分析后(one‑wayanova)(n＝3各组)，***，p<0.001；****，p<0.0001。35.图4a‑e.神经元和星形胶质细胞转导和生物分布的aav载体比较。对于a.神经元(neun)和b.星形胶质细胞(谷氨酰胺合成酶，gs)，由标志物共免疫染色后的aav9、aav‑php.b、aav‑s和aav‑f转导的细胞(gfp阳性)的高放大率图像，融合的细胞(mergedcell)还包括由dapi的细胞核染色。c.在静脉注射递送1x1011vg的每种载体后，转导的皮层星形胶质细胞和神经元的百分比的体视学评价。p<0.0001，单因素方差。(*)和(**)表示tukey多重比较检验后各载体组之间的显著差异(n＝3只小鼠/组)。d.由载体基因组的qpcr测定的、由gapdh基因组dna水平(输入dna)归一化的脑和肝中的载体的生物分布。e.在c57bl/6雄性中静脉内施用8x1011vg后，周围器官中的aav9、aav9‑php.b、aav‑s、和aav‑f的转导。视网膜图像：rpe，视网膜色素上皮细胞；onl；外细胞核层；opl，外丛状层；inl，内细胞核层；ipl，内丛状层；gcl，神经节细胞层。****，p<0.0001(n＝3只小鼠/组，具有tukey多重比较检验的单因素方差).36.图5a‑c.aav‑f在雄性和雌性c57bl/6小鼠和在balb/c小鼠中介导高转导效率。a.1x1011vg/小鼠下、由aav‑f转导的雄性和雌性小鼠(n＝3)中跨矢状脑切片的gfp信号的代表图。b.以1x1011vg/小鼠、用aav‑f(左)或aav9‑php.b(右)注射的雄性balb/c小鼠的矢状脑切片。dapi作为复染剂与gfp一起提供以可视化php.b处理的脑切片。c.通过由荧光覆盖的切片的百分比来定量来自每种载体的内源gfp表达。**，p<0.01。非配对t检验(n＝3只小鼠/组)。37.图6a‑b.在人皮层神经元中，aav‑f比aav9介导更高的转导效率。a.由aav‑f转导的胚胎来源的原代人神经元中的gfp表达。由针对β‑微管蛋白的抗体共标记神经元以定量转导。b.定量由aav9、aav‑s和aav‑f的人神经元的转导效率。*，p<0.05。38.图7a‑c.可从组织拯救功能性引起cre重组和cap基因中编码7聚体肽的插入物的pcr扩增的itransduce文库。a.在ai9floxed/stoptdtomato转基因小鼠中，由未经选择的itransduce文库转导后的组织中的tdtomatodab染色的实例(右图)。注射pbs作为对照(左图)。红色箭头表示转导的细胞的实例。b.与野生型和转基因未转导的小鼠相比较，从各组织、包括脑拯救cap基因的含有插入物的区域的pcr的实例。c.表明在第一轮的选择后看到的变体的谱的表格，强调了最频繁的变体(seqidnos:87‑150)。“其它”表示成组的序列变体，其各自以小于总池的1％出现。*表示终止密码子。39.图8a‑b.第2轮中基于cre的选择揭露能够转导的aav。a.tdtomato‑阳性细胞的流式细胞术分析。在分解小鼠大脑后，分析细胞悬液并对tdtomato阳性细胞分选，基于前向和侧向散射(fsc，ssc)设门以排除不存活细胞(总事件(totalevent))，以仅捕获单个细胞(singlet)，和最终对于tdtomato表达(tdtomato+/‑细胞)。为了从aav文库转导的脑分选tdtomato阳性细胞，基于阴性对照(pbs注射的ai9)和阳性对照(由携带hsyn‑cre神经元特异性盒的aav9‑php.b转导的ai9小鼠)进行设门。b.在注射第2轮文库后，在对于肝和脑中的tdtomato进行dab免疫染色后，检测cre依赖性重组事件(与pbs或aav9‑php.bhsyn‑cre注射相比较)。箭头表示aav文库注射的小鼠的脑中的阳性细胞(星形胶质细胞)。40.图9a‑b.在静脉内递送高(1x1011vg)或低剂量(8x1011vg)的载体后，由aav‑f和aav‑s的脑的转导。在n＝3只小鼠中，由aav9、aav9‑php.b、aav‑s和aav‑f转导后的脑中的转导谱，表明矢状切片中的内源(未染色的)gfp荧光。由1x1011vg(a)或8x1011vg(b)施用小鼠。从单个小鼠获得各组中的各个切片。41.图10a‑b.(a)aav‑f在小鼠脑中转导多种亚型的神经元。在脑和cns的不同区中的多种神经元亚型中，检测由aav‑f驱动的gfp表达。camkii，兴奋性神经元。gad67，抑制性神经元。酪氨酸羟化酶(th)，浦肯野神经元(purkinjeneuron)。胆碱乙酰转移酶(chat)，运动神经元(白色箭头表示对于每一种亚型的转导的神经元的代表性实例)。(b)在1x1011vg/小鼠下，aav‑f介导有效的转导，而aav9不介导有效的转导。来自图3b的小鼠的代表性10x图像显示来自用aav‑f和aav9注射的小鼠的纹状体、海马、和小脑中的gfp表达。42.图11.全身递送后的aav‑f的生物分布。在骨骼肌、心脏、和脊髓组织中显示aav‑f与aav9相比较的生物分布。通过载体基因组的qpcr来测定生物分布，并针对gapdh基因组dna归一化样品用于相等输入。n.s，不显著。*，p<0.05(n＝3只小鼠/组，对各小鼠样品以一式三份进行，双尾t检验)。43.图12a‑e.通过透射电子显微镜(tem)定量空衣壳。a‑d.aav9和aav‑f制剂(prep)的电子图像的代表性图像片段。通过在对于每种制剂的五个图像中计数完整衣壳对空衣壳来定量aav9(a,b)和aav‑f(c,d)各自的两个制剂(箭头指示空衣壳的实例)。e.对于aav9和aav‑f制剂的空衣壳百分比的定量。n.s：不显著(p＝0.54，非配对t检验)。44.图13.直接颅内注射aav‑f和aav‑s后的持续神经转导。在直接皮层内和海马内注射aav‑f(上图)或aav‑s(下图)(对于aav‑f和aav‑s分别为1.65x1010和5.6x1010gc/注射位点)后，小鼠脑矢状切片中的gfp荧光信号(和dapi)的代表图。比例尺：对于全脑的低放大率图像为1000μm，对于皮层和海马的更高放大率图像为200μm。45.图14a‑f.在腰椎鞘内注射aav‑f载体后，脊髓和脑的广泛转导。在成年小鼠的腰区中鞘内注射10微升的包装单链aav‑cba‑gfp表达盒的aav9(1.25x1011vg)或aav‑f(8.8x1010vg)(n＝2/载体)。三周后，杀死小鼠，并在抗gfp免疫染色后对于gfp表达分析脊髓和大脑。(a)上图：完整冠状脑切片扫描显示由aav‑f、而不是aav9的脑的强力转导。下图：具有aav‑f和aav9的脊髓的完整切片扫描。aav‑f注射的小鼠显示非常高的gfp信号。aav9在两种小鼠中显示非常低的表达。在33ms的曝光时间下取得所有图像；对于aav‑f在4ms下取得另外的图像以更好的解析特征。在切片不清楚的地方，包括了切片界限的白色轮廓。未列出的，比例尺等于250μm。(b‑d)来自由aav9(b)和aav‑f(c,d)处理的小鼠的脊髓的高放大率图像。gfap表示星形胶质细胞特异性染色，neun表示神经元。在各图的右上表示出脊髓的区域。下图中的图像是上图中矩形区域的较高放大率图像。(e，f)鞘内注射后，aav‑f转导的脑的高放大率图像。(e)描述由aav‑f转导的星形胶质细胞(f)神经元。在鞘内注射后，aav9不介导可检测的脑的转导。sc，脊髓；cc，胼胝体，cp，尾壳核。46.图15a‑d.aav‑s‑cba‑gfp施用至内耳后的gfp荧光。(a,b)：由aav‑s转导的耳蜗感觉上皮细胞的代表图(63x放大率)。(c)：螺旋缘中的诱导。(d)：螺旋神经节区中的转导。z和箭头表示z‑stack的不同层。ohc：外毛细胞。ihc：内毛细胞。47.图16a‑b.在非转基因nhp中使用itransduce文库以选择有效转导内耳纤维细胞和脊髓的aav衣壳。(a)i.用aav衣壳文库和编码gjb2驱动的floxed‑stop‑tdtomato盒的aav9‑php.b共注射食蟹猴(cynomolgusmonkey)(或其它非人灵长类动物)。ii.当aav文库衣壳表达cre时，aav9‑php.b将在纤维细胞(由阴影表示)中选择性表达tdtomato。iii.分离内耳和iv.流式分选tdtomato阳性纤维细胞。v.从回收自分选的细胞的dnapcr扩增潜在的功能性衣壳，重新包装文库并进行另一轮的选择。在每轮后使用下一代dna测序分析以监测选择过程。缩写：tm，盖膜；oc，科蒂氏器官(organofcorti)；sl，螺旋韧带。(b).i.用aav衣壳文库和编码cba驱动的floxed‑stop‑mplum盒的aav9共注射食蟹猴(或其它非人灵长类动物)。ii.、iii.当aav文库衣壳表达cre时，aav9将在脊髓(由阴影表示)中表达mplum。分离脊髓和流式分选mplum阳性细胞。iv.从回收自分选的细胞的dnapcr扩增潜在的功能性衣壳，重新包装文库并进行另一轮的选择。在每轮后使用下一代dna测序分析以监测选择过程。具体实施方式48.将转基因有效递送至靶细胞的一种有前途的方法是通过将aav载体衣壳变体的池、或文库提供至体内选择过程的过程–真正的“适者生存”方法4‑8。使用随机低聚物核苷酸来将短(6‑9个氨基酸)随机肽插入至衣壳表面上暴露的区域的aav文库方法，已表明在识别具有例如增强的靶组织的转导等独特性质的新aav衣壳变体中取得成功9,10。aav文库的一个主要限制是选择过程的结束读出(readout)不总是将介导功能性转基因表达的衣壳与不介导功能性转基因表达的那些衣壳区分。aav转导是涉及多个步骤的过程，从细胞受体结合和进入核转运、第二链合成和最终的基因和蛋白质表达11。常规aav文库方法中的新进展，称为create，工程化cre敏感性aav基因组，其能够选择性分离在表达cre的转基因动物的背景中成功运输至细胞核的衣壳12。本文描述了衣壳选择系统，所述系统的一个实例称为itransduce，利用cre/loxp系统的力量。代替使用cre转基因小鼠，工程化aav以编码具有肽插入物的衣壳、以及cre表达盒。然后在具有cre敏感性荧光报告基因的小鼠中进行选择，以能够选择其介导包括转基因表达的完整转导过程的衣壳。文库的体内选择导致识别介导cns的显著转导效率的aav衣壳、和在内耳中介导转导的另一衣壳。49.使用itransduce系统，我们分离了两种新aav衣壳，本文称为aav‑f和aav‑s，其分别在鼠cns(试验了两种品系)和内耳中介导高度有效的转基因表达。aav‑f衣壳还介导原代人神经元的强力转导。50.有趣地，使用基于表达的选择，识别了表示ngs读长(read)的97％的3种肽克隆(sttlysp(seqidno:1)、fvvgqsy(seqidno:2)、和fqpcp*(seqidno:3)。由于fqpcp*具有终止密码子，推断该基因组在生产期间在另一衣壳中交叉包装，这是一种由aav文库发生的现象15。对于sttlysp(seqidno:1,“aav‑s”)而言可能也是这样的情况(图2)。aav‑s不是缺陷型载体，因为其介导周围器官(图4e)和内耳(图15)的强力转导。由于其具有如此高的生产效率(表4)，aav‑s可具有被交叉包装的倾向。另一方面，aav‑f(fvvgqsy(seqidno:2))在转导方面极其有效并且是来自ngs的仅两个准候选者之一(图2)。这些候选者在第2轮文库池中在非常低的水平下为可检测的(图2)–因此，我们可确认它们的富集不是由于先前存在的偏见。51.由于我们使用对细胞类型(完整脑)的不可知方法进行itransduce系统的说明，令人惊讶地，aav‑f高度亲星形胶质细胞和神经元，这些是由aav9转导的细胞。在未来的研究中，我们将组合细胞特异性启动子以驱动来自aav文库载体的cre表达以及磁性细胞分选以分离可转导对于常规aav载体转导为困难的细胞的衣壳。52.除了itransduce系统选择临床候选aav载体的潜力以外，其可用于识别用作研究工具的载体。最近识别的aav‑php.b衣壳起到基因修饰鼠脑的有效载体的作用12。然而，其不可转导balb/c或balb/c相关小鼠谱系13,1416。有趣地，在静脉内注射aav‑f后，观察到balb/c和c57bl/6鼠脑的强力转导。这表明aav9增强转导的机理在aav‑php.b和aav‑f之间有所不同。这还可以使得aav‑f用作用于普遍的balb/c品系中的cns研究的有效工具(labome.com/method/laboratory‑mice‑and‑rats.html)。此外，如本文所示，aav‑f还可在直接或鞘内浓注后在cns中介导强力转基因表达，aav‑s可在内耳中介导转基因表达。53.可在大量动物中进行未来的研究以进一步试验aav‑f，例如在临床前研究中。可进行剂量递增研究以试验aav‑f的剂量相关毒性，如在由nhp中的php.b观察到的14。可在不同物种中进行迭代轮次选择(例如，小鼠然后大鼠)以允许转导效率的更好的跨物种转换。例如，可以在小鼠中进行、接着在floxedstoptdtomato转基因大鼠中进行17。可选地，可在转基因狨猴(marmoset)中18,19或者甚至在其它非人非转基因灵长类动物中进行itransduce文库的直接选择(图16a和b)。54.识别优化的衣壳序列的方法[0055]“病毒载体文库”是合并的病毒的变体，其在选择性压力(体内或体外)下可驱动对于感兴趣的靶细胞/组织/器官为特异性的病毒的克隆的分离。目前文库技术的一个限制是，许多候选病毒克隆不介导转基因表达(载体所需的最终功能)。此限制的主要原因是，未提出策略以允许基于载体介导的转基因表达的载体选择。本文描述了使用具有两部分表达盒的腺相关病毒(aav)载体基因组的方法。首先是感兴趣的启动子下的cre重组酶盒。第二部分是aav启动子以驱动衣壳基因的表达，“顺式”克隆至病毒基因组的第一部分。目前可选择病毒载体用于使用表达具有上游loxp/stop位点的报告基因(例如，绿荧光蛋白)的细胞的转基因表达(高灵敏性cre表达)，由此防止报告基因表达直至aav载体递送的cre移除终止位点。可分离报告基因阳性细胞，回收的aav衣壳序列将具有更高的介导有效转基因表达的可能性。[0056]因此，本文提供了包括以下的文库构建体aav：(i)由例如最小鸡β肌动蛋白(cba)启动子等启动子驱动的cre重组酶；(ii)cre盒下游的、启动子(例如，p41启动子)驱动的、编码具有插入至衣壳蛋白的例如随机七聚体肽或选定的七聚体肽等如本文所描述的肽的序列的aav9衣壳序列。优选地，肽插入至编码衣壳的氨基酸(aa)588‑589的序列之间，还可将其插入至其它地方，只要其不干扰病毒的功能并且维持其在促进选定的细胞的感染中的活性即可，例如，在vp1/vp2界面(氨基酸138)或583‑590之间的任何位点。cba启动子为强、活性启动子以在大多数细胞类型中驱动cre。p41启动子是aav特异性天然启动子，其驱动cap基因表达。可使用的其它启动子包括但不限于，突触蛋白启动子、gfap启动子、cd68启动子、f4/80启动子、cx3cr1启动子、cd3或cd4启动子、cmv启动子、肝特异性启动子；在下文中列出其它实例。构建体还可在crecdna的末尾处和capdna的末尾处包含终止密码子。在cre盒和cap盒后，存在polya信号。本领域已知cre重组酶，参见，例如，vanduyne,microbiolspectr.2015feb；3(1):mdna3‑0014‑2014。图1a提供示例性文库构建体。[0057]本文还提供了文库(即，包含多个文库构建体的组合物)。其中使用了随机七聚体序列，优选地，文库包括具有编码七聚体的所有或几乎所有可能的变体的序列的构建体)。[0058]图1b(i)中说明的方法可包括将由在衣壳上表达的不同肽插入物(由不同灰色阴影表示)构成的文库施用至模型动物，例如，诸如小鼠(例如，ai9转基因小鼠)、兔、大鼠、或猴等哺乳动物。模型动物包括例如荧光报告蛋白序列等报告蛋白的上游的loxp‑侧翼的stop盒，例如tdtomato报告基因，任选地插入至gt(rosa)26sor基因座。模型动物可为转基因的，或报告序列的上游的loxp‑侧翼的stop盒可由第二构建体表达，例如施用至动物模型的第二aav(例如，在文库构建体之前、之后、或同时施用)。进入感兴趣的细胞但不功能性转导细胞(无cre表达)的任何aav衣壳不启动报告子的表达。可介导功能性转导(表达cre)的衣壳将启动tdtomato表达。如图1b(ii)所示，从感兴趣的器官(例如，脑、眼、耳、视网膜、心脏等)分离细胞，然后可对于报告基因表达和任选地细胞标志物分选转导的细胞。如图1b(iii)所示，获得并分析衣壳dna，例如，任选地通过来自分选的细胞的pcr扩增的序列，将它们克隆回文库载体并重新包装用于另一轮的选择。在每轮后可采用dna测序分析以监测选择过程。[0059]启动子[0060]本文所描述的文库构建体包括两种启动子；一种驱动cre重组酶，第二种驱动aav衣壳序列。[0061]本领域已知许多启动子序列，包括在大部分细胞类型中驱动表达的称为“泛素”启动子，例如，巨细胞病毒(cmv)启动子(任选地具有cmv增强子)、鸡β肌动蛋白(cba)启动子、劳氏肉瘤病毒(rsv)ltr启动子(任选地具有rsv增强子)、sv40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、磷酸甘油激酶启动子、磷酸甘油激酶(pgk)启动子、ef1α启动子、泛素c(ubc)、b‑葡萄糖醛酸酶(gusb)、和cmv立即/早期基因增强子/cba启动子。[0062]cre重组酶的表达还可由组织特异性启动子驱动，例如，尤其，对于cns、肝、心脏、耳蜗、视网膜或t细胞的组织特异性启动子。在一些实施方案中，对于cns的组织特异性启动子包括神经元的、巨噬细胞/小神经胶质细胞启动子和星形胶质细胞启动子。本领域已知许多组织特异性启动子，包括突触蛋白启动子(神经元)、神经元特异性烯醇化酶(nse)(神经元)、mecp2(甲基‑cpg结合蛋白2)(神经元)、神经胶质纤维酸性蛋白(gfap)(星形胶质细胞)、少突胶质细胞转录因子1(olig1)(少突胶质细胞)、cnp(2',3'‑环核苷酸3'‑磷酸二酯酶)(broad)、或cbh(杂合cba或具有cba启动子的mvm内含子)(broad)。参见，例如，us20190032078。巨噬细胞/小神经胶质细胞启动子包括但不限于，c‑x3‑c基序趋化因子受体1(cx3cr1)启动子、cd68启动子、离子钙结合衔接分子1(iba1)启动子、跨膜蛋白119(tmem119)启动子、婆罗双树样转录因子1(spaltliketranscriptionfactor1)(sall1)启动子、粘附g蛋白偶联受体e1(f4/80)启动子、骨髓增殖性肉瘤病毒增强子、负控制区删除的、d1587反向引物结合位点取代的(mnd)启动子；整合素亚单元αm(itgam；cd11b‑骨髓细胞(中性粒细胞、单核细胞、和巨噬细胞))启动子。对于在内耳中表达，启动子可为，例如，pkg、cag、动力蛋白(prestin)、atoh1、pou4f3、lhx3、myo6、α9achr、α10achr、oncomod、或myo7a启动子；参见ryan等人,advotorhinolaryngol.2009；66:99–115[0063]报告蛋白[0064]本领域已知多种报告蛋白，并且包括绿色荧光蛋白(gfp)、绿色荧光蛋白的变体(gfp10)、增强的gfp(egfp)、turbogfp、gfps65t、taggfp2、mukgemeraldgfp、superfoldergfp、gfpuv、不稳定egfp(degfp)、azamigreen、mwasabi、clover、mclover3、mneongreen、nowgfp、sapphire、t‑sapphire、mametrine、photoactivatablegfp(pa‑gfp)、kaede、kikume、mkikgr、tdeos、dendra2、meosfp2、dronpa、蓝色荧光蛋白(bfp)、ebfp2、azuritebfp、mtagbfp、mkalamal、mtagbfp2、shbfp、青色荧光蛋白(cfp)、ecfp、ceruliancfp、scfp3a、不稳定ecfp(decfp)、cypet、mturquoise、mturquoise2、mtfpi、光转换cfp2(ps‑cfp2)、tagcfp、mtfp1、mmidoriishi‑cyan、aquamarine、mkeima、mberfp、lss‑mkate2、lss‑mkatel、lss‑morange、cyofp1、sandercyanin、红色荧光蛋白(rfp)、erfp、mraspberry、mruby、mapple、mcardinal、mstable、mmaroonl、mgarnet2、tdtomato、mtangerine、mstrawberry、tagrfp、tagrfp657、tagrfp675、mkate2、hcred、t‑hcred、hcred‑tandem、mplum、mneptune、nirfp、kindling、远红荧光蛋白、黄色荧光蛋白(yfp)、eyfp、不稳定eyfp(deyfp)、tagyfp、topaz、venus、syfp2、mcherry、pa‑mcherry、citrine、mcitrine、ypet、ianrfp‑as83、mpapayal、mcyrfp1、mhoneydew、mbanana、morange、kusabiraorange、kusabiraorange2、mkusabiraorange、morange2、mkok、mko2、mgrapel、mgrape2、zsyellow、eqfp611、sirius、sandercyanin、shbfp‑n158s/l173i、近红外蛋白、ifp1.4、irfp713、irfp670、irfp682、irfp702、irfp720、ifp2.0、mifp、tdsmurfp、mirfp670、brilliantviolet(bv)421、bv605、bv510、bv711、bv786、percp、percp/cy5.5、dsred、dsred2、mrfpl、pocilloporin、renillagfp、monstergfp、pagfp、或藻胆蛋白，或其任一者的生物学活性变体或片段。[0065]试剂盒[0066]本文还提供了包含具有或不具有随机七聚体序列的、如本文所描述的一种或多种文库构建体aav的试剂盒。所述试剂盒还可包括含有报告序列的loxp‑侧翼的stop盒上游的构建体。[0067]工程化aav衣壳蛋白[0068]本方法识别了两种肽序列，所述序列在插入至例如aav1、aav2、aav8、或aav9等aav的衣壳中时，改变了aav在特定细胞中介导转基因表达的能力。在一些实施方案中，所述肽包括至少7个氨基酸的序列。在一些实施方案中，所述氨基酸序列包括序列(sttlysp(seqidno:1)或fvvgqsy(seqidno:2)的至少4个、例如5个、6个、或7个连续氨基酸。[0069]还可使用包括反向序列的肽，例如psyltts(seqidno:4)和ysqgvvf(seqidno:5)。可选地，肽可包括来自图2a或7c中所示的序列(seqidnos:17‑150)的至少4个、5个、或6个连续氨基酸。[0070]aav[0071]用于本方法、试剂盒和组合物的病毒载体包括重组逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、甲病毒、和慢病毒，优选包含如本文所描述的衣壳肽并任选地包含转基因用于在靶组织中表达。[0072]用于在本方法中递送核酸的优选病毒载体系统是腺相关病毒(aav)。aav是具有25nm衣壳的微小非包膜病毒。无疾病已知或已显示与野生型病毒相关。aav具有单链dna(ssdna)基因组。aav已显示表现长期游离基因转基因表达，并且aav已表明在脑中、特别在神经元中的优异的转基因表达。外源dna的大小限制在约4.7kb。例如tratschin等人,mol.cell.biol.5:3251‑3260(1985)中所描述的aav载体可用于将dna导入细胞。已使用aav载体将各种核酸导入不同细胞类型(参见，例如，hermonat等人,proc.natl.acad.sci.usa81:6466‑6470(1984)；tratschin等人,mol.cell.biol.4:2072‑2081(1985)；wondisford等人,mol.endocrinol.2:32‑39(1988)；tratschin等人,j.virol.51:611‑619(1984)；和flotte等人,j.biol.chem.268:3781‑3790(1993)。存在许多可选的aav变体(已克隆超过100种)，并且已基于期望的特征识别aav变体。在一些实施方案中，aav是aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、av6.2、aav7、aav8、rh.8、aav9、rh.10、rh.39、rh.43或csp3；对于cns用途，在一些实施方案中，aav是aav1、aav2、aav4、aav5、aav6、aav8、或aav9。作为一个实例，aav9已显示在某些程度上有效地跨越血脑屏障。使用本方法，通过将如本文所描述的肽序列插入至衣壳蛋白，例如插入至氨基酸588和589之间的aav9衣壳蛋白vp1，可基因工程化aav衣壳以增加跨bbb的渗透、或至特定组织中的渗透。[0073]示例性野生型aav9衣壳蛋白vp1(q6jc40‑1)序列如下所示：[0074][0075]因此，本文提供了包括一个或多个本文所描述的肽序列的aav，例如包括含有如本文所描述的序列的衣壳蛋白的aav，例如含有seqidno:1或seqidno:2的衣壳蛋白，其中已将肽序列插入至序列，例如氨基酸588和589之间。[0076]在下文提供了aav的示例性序列。蛋白质序列中加粗并双下划线强调了插入的肽序列，并在dna序列中加粗和大写。[0077]aav‑f衣壳蛋白序列[0078][0079]aav‑f衣壳dna序列[0080][0081][0082]aav‑s衣壳蛋白序列[0083][0084]aav‑s衣壳dna序列[0085][0086][0087]aav序列可与本文记载的参考aav序列为例如至少80、85、90、95、97、或99％同一性，例如可包括变体，优选不降低aav在细胞中介导转基因表达的能力。为了确定两条氨基酸序列、或两条核酸序列的同一性百分比，出于最佳比较的目的对齐序列(例如，为了最佳对齐，可在第一条和第二条氨基酸或核酸序列的一者或两者中导入空位，并且为了比较目的，可忽略非同源序列)。在优选实施方案中，出于比较目的对齐的参考序列的长度为参照序列的长度的至少80％，并且在一些实施方案中为至少90％或100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一条序列中的位置由与第二条序列中相应位置处的相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则该位置处的分子为同一性的(如本文所用，氨基酸或核酸“相同”等同于氨基酸或核酸“同源”)。两条序列之间的同一性百分比是由序列分享的相同位置的数量的函数，考虑为了最佳比较两条序列而需要导入的空位的数量、和各个空位的长度。[0088]可使用数学算法完成序列的比较和两条序列之间的同一性百分比的确定。例如，可使用已整合至gcg软件包中gap程序的needleman和wunsch((1970)j.mol.biol.48:444‑453)算法(可在万维网gcg.com上获得)来确定两条氨基酸序列之间的同一性百分比，使用默认参数，例如具有12的空位罚分、4的空位延伸罚分、和5的移码空位罚分的blossum62评分矩阵。[0089]转基因[0090]在一些实施方案中，aav还包括转基因序列(即，异源序列)，例如诸如编码治疗剂的转基因，例如本文所描述的或本领域已知的，或报告蛋白，例如荧光蛋白(催化产生可检测产物的酶)，或细胞表面抗原。转基因优选连接至在靶组织中促进/驱动转基因的表达的序列。[0091]用于治疗的示例性转基因包括神经元细胞凋亡抑制蛋白(naip)、神经生长因子(ngf)、神经胶质源性生长因子(gdnf)、脑源性生长因子(bdnf)、睫状神经营养因子(cntf)、酪氨酸羟化酶(th)、gtp‑环水解酶(gtpch)、氨基酸脱羧酶(aadc)、天冬氨酸酰基转移酶(aspa)，血液因子，例如β‑珠蛋白、血红蛋白、组织型溶纤酶原激活剂、和凝血因子；集落刺激因子(csf)；白细胞介素，例如il‑1、il‑2、il‑3、il‑4、il‑5、il‑6、il‑7、il‑8、il‑9等；生长因子，例如角质细胞生长因子(kgf)、干细胞因子(scf)、成纤维细胞生长因子(fgf，例如碱性fgf和酸性fgf)、肝细胞生长因子(hgf)、胰岛素样生长因子(igfs)、骨形态发生蛋白(bmp)、表皮生长因子(egf)、生长分化因子‑9(gdf‑9)、肝癌衍生生长因子(hdgf)、肌肉生长抑制素(gdf‑8)、神经生长因子(ngf)、神经营养因子、血小板衍生生长因子(pdgf)、血小板生成素(tpo)、转化生长因子α(tgf‑α)、和转化生长因子β(tgf‑β)，等；可溶受体，例如可溶tnf‑α受体、可溶vegf受体、可溶白细胞介素受体(例如，可溶il‑1受体和可溶ii型il‑1受体)、可溶γ/δt细胞受体、和可溶受体的配体结合片段，等；酶，例如α‑葡萄糖苷酶、imiglucarase、和β‑葡糖脑苷脂酶；酶活化剂，例如组织型溶纤酶原激活剂；趋化因子，例如ip‑10，由干扰素‑γ诱导的单核因子(mig)、groa/il‑8、rantes、mip‑1α、mip‑1β、mcp‑1、和pf‑4等；血管生成剂，例如血管内皮细胞生长因子(vegf，例如vegf121、vegf165、vegf‑c、vegf‑2)、转化生长因子‑β、碱性成纤维细胞生长因子、神经胶质瘤衍生生长因子、血管生成素、和血管生成素‑2；抗血管生成剂，例如可溶vegf受体；蛋白质疫苗；神经活性肽，例如神经生长因子(ngf)、缓激肽、胆囊收缩素、胃泌素、胰泌素、催产素、促性腺激素释放激素、β‑内啡肽、脑啡肽、物质p、生长激素抑制素、催乳素、甘丙肽、生长激素释放激素、蛙皮素、强啡肽、华法林、神经降压素、胃动素、促甲状腺激素、神经肽y、黄体化激素、降钙素、胰岛素、胰高血糖素、加压素、血管紧张素ii、促甲状腺激素释放激素、血管活性肠肽、和睡眠肽，等；血栓溶解剂；心房利钠肽；松弛素；胶质纤维酸性蛋白；促卵泡激素(fsh)；人α‑1抗胰蛋白酶；白血病抑制因子(lif)；转化生长因子(tgfs)；组织因子、黄体化激素；巨噬细胞活化因子；肿瘤坏死因子(tnf)；嗜中性粒细胞趋化因子(ncf)；神经生长因子；金属蛋白酶的组织抑制剂；血管活性肠肽；血管生成素；血管调理素；纤维蛋白；水蛭素；il‑1受体拮抗剂；等。感兴趣的蛋白质的一些其它实例包括睫状神经营养因子(cntf)；神经营养因子3和4/5(nt‑3和4/5)；胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)；芳香族氨基酸脱羧酶(aadc)；血友病相关凝血蛋白，例如因子viii、因子ix、因子x；肌肉萎缩蛋白或微小肌肉萎缩蛋白(nini‑dystrophin)；溶酶体酸性脂肪酶；苯丙氨酸羟化酶(pah)；糖原贮积症相关酶，例如葡萄糖‑6‑磷酸酶、酸性麦芽糖酶、糖原脱支酶、肌糖原磷酸化酶、肝糖原磷酸化酶、肌肉磷酸果糖激酶、磷酸化酶激酶(例如，phka2)、葡萄糖转运蛋白(例如，glut2)、醛缩酶a、β‑烯醇化酶、和糖原合成酶；溶酶体酶(例如，β‑n‑乙酰氨基己糖苷酶a)；及其任何变体。[0092]转基因还可编码抗体，例如免疫检查点抑制抗体，例如针对pd‑l1、pd‑1、ctla‑4(细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4；cd152)；lag‑3(淋巴细胞激活基因3；cd223)；tim‑3(t细胞免疫球蛋白结构域和mucin结构域3；havcr2)；tigit(具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体)；b7‑h3(cd276)；vsir(v‑set免疫调节受体，又称为vista、b7h5、c10orf54)；btla30(b‑和t‑淋巴细胞衰减因子，cd272)；garp(糖蛋白a重复序列；主导；pvrig(pvr相关免疫球蛋白结构域包含)；或vtcn1(包含t细胞激活抑制剂的vset结构域，又称为b7‑h4)。[0093]其它转基因可包括改变/降低靶基因的表达的小的或抑制性核酸，例如，改变基因表达的sirna、shrna、mirna、反义寡核苷酸、或长非编码rna(参见，例如，wo2012087983和us20140142160)、或crisprcas9/cas12a和指导rna。[0094]病毒还可包括一种或多种促进转基因表达的序列，例如，一种或多种启动子序列；增强子序列，例如，5’非翻译区(utr)或3’utr；聚腺苷酸化位点；和/或绝缘子序列。在一些实施方案中，启动子是脑组织特异性启动子，例如，神经元特异性或神经胶质细胞特异性启动子。在某些实施方案中，启动子是选自以下的基因的启动子：神经元核(neun)、胶质纤维酸性蛋白(gfap)、mecp2、腺瘤性息肉病基因(adenomatouspolyposiscoli(apc))、离子钙结合衔接分子1(iba‑1)、突触蛋白i(syn)、钙/钙调素依赖性蛋白激酶ii、微管蛋白αi、神经元特异性烯醇化酶和血小板衍生生长因子β链。在一些实施方案中，启动子是泛细胞类型启动子，例如巨细胞病毒(cmv)、β葡萄糖醛酸酶、(gusb)、泛素c(ubc)、或劳氏肉瘤病毒(rsv)启动子。还可使用土拨鼠肝炎病毒转录后应答元件(wpre)。[0095]在一些实施方案中，aav还具有增加递送至例如cns等靶组织、或减少组织外靶向的一种或多种另外的突变，例如当预期cns、心脏、或肌肉递送时，降低肝递送的突变(例如，如pulicherla等人(2011)molther19:1070‑1078中所述)；或添加其它肽，例如如chen等人(2008)natmed15:1215‑1218或xu等人,(2005)virology341:203‑214或us9102949；us9585971；和us20170166926中所述。还参见gray和samulski(2011)“vectordesignandconsiderationsforcnsapplications,”ingenevectordesignandapplicationtotreatnervoussystemdisordersed.gloriosoj.,editor.(washington,dc:societyforneuroscience；)1–9，可获得自sfn.org/～/media/sfn/documents/short％20courses/2011％20short％20course％20i/2011_sc1_gray.ashx。[0096]使用方法[0097]本文所描述的方法和组合物可用于将例如感兴趣的序列等任何组合物递送至组织，例如递送至中枢神经系统(脑)、心脏、肌肉、周围神经系统(例如，背根神经节或脊髓)、或至内耳或视网膜。在一些实施方案中，方法包括递送至特定脑区域，例如皮层、小脑、海马、黑质、杏仁核。在一些实施方案中，方法包括腰椎递送，例如至蛛网膜下腔或硬膜外腔。在一些实施方案中，方法包括递送至神经元、星形胶质细胞、或神经胶质细胞。在一些实施方案中，方法包括递送至内和/或外毛细胞、螺旋神经节神经元、支持细胞、或内耳的纤维细胞。在一些实施方案中，方法包括递送至视网膜的光感受器、中间神经元、视网膜神经节细胞(例如，使用aav‑f)、或视网膜色素上皮细胞(rpe)(例如，使用aav‑s)。[0098]在一些实施方案中，方法和组合物，例如aav，用于将核酸序列递送至患有例如cns的疾病等疾病的受试者；参见，例如us9102949；us9585971；和us20170166926。在一些实施方案中，受试者患有表1‑3中列出的病况；在一些实施方案中，载体用于递送表1‑3中列出的治疗剂用于治疗表1‑3中列出的相应的疾病。治疗剂可例如通过病毒载体等作为其中所述核酸编码治疗性蛋白的核酸、或例如反义寡核苷酸、sirna、和shrna等其它核酸递送；或作为与如本文所描述的肽的融合蛋白/复合体。[0099]本文所描述的方法和组合物可用于治疗有需要的受试者中的这些病况，通过施用治疗有效量的携带治疗性转基因的aav，足以减轻病况的一种或多种症状、降低病况的一种或多种症状的风险、或延迟病况的一种或多种症状的发作。[0100]表1.cns靶标(aav‑f,aav‑s)[0101][0102]表2.内耳靶标(aav‑s)[0103][0104]*usher综合征导致如上所述的耳聋，并导致由于视网膜色素变性的失明。[0105]表3.周围靶标(aav‑f,aav‑s)[0106][0107]药物组合物和使用方法[0108]本文所描述的方法包括使用含有aav作为活性成分的药物组合物。[0109]药物组合物通常包括药学上可接受的载体。如本文所用，语言“药学上可接受的载pharmaceuticals,inc.。脂质体悬浮液(包括靶向具有针对细胞抗原的单克隆抗体的选定的细胞的脂质体)也可用作药学上可接受的载体。这些可根据本领域技术人员已知的方法制备，例如，如美国专利号4,522,811中所述。[0115]药物组合物可与施用说明一起包含在试剂盒、容器、小包(pack)、或分配器中。例如，试剂盒可包括含有aav的组合物，所述aav包含如本文所描述的肽。[0116]实施例[0117]在以下实施例中进一步描述了本发明，以下实施例不旨在限制权利要求书中所描述的本发明的范围。[0118]材料和方法[0119]除非另外说明，以下材料和方法用于下文中的实施例。[0120]aav文库构建[0121]itransduce质粒：paav‑cba‑cre‑mut‑p41‑cap9del[0122]我们构建了称为paav‑cba‑cremut‑p41‑cap9del的itransduce文库骨架质粒，顺式包含两个表达盒：1)cba‑cremut，其中我们导入了泛素启动子cba下的突变crecdna(编码pro15氨基酸的ccg‑>cct以消除原始存在的agei位点)，2)p41‑cap9del，其由aav5p41启动子下的aav9衣壳基因(genbankaf085716.1的残基1680‑1974)和aav2rep基因的剪接片段(与12中所描述的类似)构成。[0123]通过genscript合成两侧为kpni和sali限制性位点的突变crecdna(cremut)和p41‑cap9(del)‑polya片段，并克隆至puc57骨架。首先，我们通过亚克隆突变crecdna(片段kpni‑blunt，sali)代替我们paav‑cba‑wpre骨架中的egfp‑wpre以构建paav‑cba‑cremut‑polya质粒(起始于ncoi‑blunt/sali，其消除了原始存在的egfp‑wpre片段)。然后，我们导入了具有cap9序列中的k449r突变的p41‑cap9del片段，允许产生独特的xbai位点，并且其中已删除xbai和agei限制性位点之间的447bpcap序列。[0124]通过pcr回收用于产生随机7聚体肽cap片段和亚克隆cap9片段的质粒：puc57‑cap9‑xbai/kpni/agei。[0125]首先，我们通过genscript(piscataway,nj)合成xbai/agei位点之间的aav9衣壳序列的447bp区(paav‑cba‑cremut‑p41‑cap9del中丢失的序列)并亚克隆至puc57‑kan质粒。该衣壳序列在该447bp区wtaav9cap中包含相同的eari位点的去除，允许wtaav9的限制性消化去除，如deverman等人2015所述。这还产生了独特的kpni位点。puc57‑cap9‑xbai/kpni/agei的cap片段用于产生插入在编码aav9vp1的氨基酸588和589的核苷酸之间的随机21聚体核苷酸序列(编码7聚体肽)的初始文库。我们使用了与deverman等人(2015)类似的策略。简言之，使用正向和反向引物、puc57‑cap9‑xbai/kpni/agei用作模板以扩增capdna和插入物随机21聚体序列。引物信息：xf‑extend(5’gtactatctctctagaactattaacggttc3’；seqidno:11)和反向引物588irev5’(gtattccttggttttgaacccaaccggtctgcgcctgtgcxmnnmnnmnnmnnmnnmnnmnnttgggcactctggtggtttgtg3’；seqidno:12)，其中mnn重复是指随机的21聚体核苷酸(购自idt)。xf‑extend和588irev用于使用phusion聚合酶(neb)且puc57‑cap9‑xbai/kpni/agei作为模板的pcr。在37℃下由xbai和agei消化447bppcr产物过夜，然后凝胶纯化产物(qiagen)。类似地，由xbai和agei消化paav‑cba‑cre‑mut‑p41‑cap9del并凝胶纯化。然后，使用3:1cap插入物对载体摩尔比进行由t4dna连接酶(neb)的连接反应(室温下1小时)。其后连接的质粒称为paav‑cba‑cre‑mut‑p41‑cap9‑7mer并包含一池的具有插入在编码aav9vp1的588和589的核苷酸之间的cap基因中的随机7聚体肽的质粒。[0126]该质粒(puc57‑cap9‑xbai/kpni/agei)还作为我们的接受者质粒(recipientplasmid)用于亚克隆来自脑组织的通过pcr扩增的cap9片段。我们通过用saci和nsii消化和连接以去除puc57质粒中的上游kpni位点。这允许衣壳片段中的kpni位点为唯一的。参见下文。[0127]rep表达质粒。[0128]我们使用与deverman等人12类似的策略构建了称为par9‑cap9‑stop/aap/rep的rep表达质粒。通过genscript合成完整的cdna并克隆至puc57‑kan质粒。插入终止密码子代替vp1、vp2、vp3的起始密码子，使得不产生亲代aav9衣壳，同时维持aap和rep表达。[0129]aav文库生产和纯化。[0130]对于各生产，我们用1.5x107个293t细胞/皿接种15cm组织培养皿。次日，使用磷酸钙法、由腺病毒辅助质粒(padδf6，26μg每板)、rep质粒(par9‑cap9‑stop/aap/rep，12μg每板)和itr侧翼的aav文库(paav‑cba‑cre‑mut/p41‑cap9‑7mer，1μg每板)转染细胞以诱导生产aav。转染后次日，将培养基改变为含有2％fbs的dmem。使用碘克沙醇密度梯度超速离心法从细胞裂解物纯化aav。使用zeba离心柱(7kmwco；thermofisherscientific)将缓冲液改变为pbs，并使用amiconultra100kdamwco超滤离心仪器(millipore)进行进一步的浓缩。将载体贮存在‑80℃下直至使用。我们使用具有itr序列特异性引物和探针的taqmanqpcr定量aav制剂中的aav基因组拷贝(vg)20,21。[0131]文库的下一代测序。[0132]对质粒aav9文库池进行下一代测序以及以下的衣壳的包装。还在cap片段(来自脑组织或来自由流式细胞术分选的分离的tdtomato阳性细胞)的pcr拯救后进行测序。对于每一轮的选择，通过使用来自newenglandbiolabs的phusion高保真pcr试剂盒的pcr扩增对应于含有插入物的区域的病毒dna(正向引物：5’‑aatcctggacctgctatggc‑3’(seqidno:13)，反向引物：5’‑tgccaaaccatacccggaag‑3’(seqidno:14))。使用q5聚合酶(newenglandbiolabs)进行pcr扩增。将独特的条码衔接子(barcodeadapter)退火至各样品，并在illuminamiseq(150bp读长)上测序样品。分析约50‑100,000读长每样品。初始使用fastqc(bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)质量检查序列输出文件，并在用python自定义编写的程序中分析。简言之，基于存在或不存在插入物来拣选序列，然后将含有插入物的序列与基线参考序列相比较，并基于各检测的独特插入物的发生率对无误读长制表。翻译和归一化插入物。[0133]动物。[0134]所有动物实验由马萨诸塞州总医院研究动物护理附属委员会批准，遵循美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南(nationalinstitutesofhealthguideforthecareanduseoflaboratoryanimal)中记载的指导原则。我们使用的成年(8‑10周龄)ai9(品系#007909)、c57bl/6(品系#000664)、和balb/c(品系#000651)小鼠全部来自美国杰克逊实验室(thejacksonlaboratory,barharbor,me)。注射后三周安乐死全部动物，心脏灌注并收获组织，在pbs中4％多聚甲醛中固定、在液氮中快速冷冻或分离用于流式细胞术。[0135]亲脑(brain‑tropic)衣壳的体内选择。[0136]以结果部分中所示的以vg计的剂量静脉内(尾静脉)注射ai9小鼠，注射后3周安乐死小鼠并收获组织。[0137]用异氟醚深度麻醉小鼠并斩首。对于第1轮，快速解剖脑并收获两个冠状切片(2mm厚)。一个切片用于提取全脑dna(dneasybloodandtissuekits,qiagen,hilden,germany)。将另一冠状切片在4％pfa中固定并石蜡包埋用于免疫组织学(在通过使用来自rocklandimmunochemicals的兔抗rfp抗体的dab染色的每轮选择后，检测tdtomato阳性细胞)。对于第2轮，用剃须刀片将脑组织切为1mm3片并根据制造商的说明、通过木瓜蛋白酶解离(papaindissociationsystem,worthington)分离神经细胞。解离后，去除髓磷脂(myelinremovalbeadsii，人，小鼠，大鼠来自miltenyi)并通过s3etm细胞分选仪(bio‑rad)分选td‑tomato阳性细胞。首先，通过设门来分选细胞以排除细胞碎片并仅选择单细胞。将来自aav9‑php.b‑cre注射的ai9(阳性对照)和pbs注射的ai9小鼠(阴性对照)的细胞悬浮液用于设门以分选tdtomato阳性和阴性细胞。分选后，通过离心立即沉淀tdtomato阳性细胞，并使用arcturuspicopuredna提取试剂盒(thermofisher)提取dna。[0138]dna提取后，使用以下引物扩增cap9插入物(含有编码7聚体肽的21聚体序列)：cap9_kpn/age_for：5’‑agctaccgacaacaacgtgt‑3’(seqidno:15)和cap9_kpn/age_rev：5’‑agaagggtgaaagttgccgt‑3’(seqidno:16)(phusion高保真pcr试剂盒,newenglandbiolabs)。然后，纯化扩增子(monarchpcr&dna清除试剂盒,newenglandbiolabs)，由kpni、agei和banii消化，并且在puc57‑cap9‑xbai/agei/kpni质粒(起始于kpni和agei，由小牛肌醇磷酸酶(calfinositolphosphatase)，newenglandbiolabs去磷酸化)中连接前，琼脂凝胶纯化(monarchdna凝胶提取试剂盒,newenglandbiolabs)cap9kpni‑agei片段(144bp)。将连接产物转化为电转感受态(electrocompetent)dh5α细菌(newenglandbiolabs)，整个转化物在lb氨苄青霉素培养基中生长过夜。由maxiprep(qiagen)纯化puc57‑cap9‑xbai/agei/kpni质粒。由xbai/agei消化质粒以释放447bpcap片段，将其凝胶纯化并与类似切割的paav‑cba‑cre‑mut/p41‑cap9del连接用于下一轮的aav文库生产。[0139]含有aav‑f和aav‑s肽插入物的aavrep/cap质粒用于载体生产[0140]为了产生编码显示感兴趣的肽插入物的aav9衣壳的rep/cap质粒用于生产编码感兴趣的转基因(例如gfp)的载体，我们用bsiwi和baei消化aav9rep/cap质粒，这移除了vp3氨基酸588位点两侧的片段用于肽序列的插入。然后，我们从integrateddnatechnologies(idt,coralville,ia)订购了997bpdsdna片段，其包含与bsiwi/baei切割的aav9重叠的gibson同源臂以及编码vp3的氨基酸588后的框架中的感兴趣的肽的21聚体核苷酸序列。最后，我们使用gibsonmastermix(neb,ipswich,ma)进行gibson组装以将含有插入物的肽连接至aav9rep/cap质粒。[0141]aav载体用于转导分析。[0142]对于各生产，我们用1.5x107个293t细胞/皿接种15cm组织培养皿。次日，使用磷酸钙法、由腺病毒辅助质粒(padδf6，26μg每板)、rep/cap质粒(aav9、aav‑f、aav‑s；12μg每板)和itr侧翼的转基因盒质粒(单链aav‑cba‑gfp‑wpre22，10μg/板)转染细胞以诱导生产aav。转染后次日，将培养基改变为含有2％fbs的dmem。使用碘克沙醇密度梯度超速离心法从细胞裂解物纯化aav。使用zeba离心柱(7kmwco；thermofisherscientific)将缓冲液改变为pbs，并使用amiconultra100kdamwco超滤离心仪器(millipore)进行进一步的浓缩。将载体贮存在‑80℃下直至使用。我们使用具有bghpolya序列特异性引物和探针的taqmanqpcr定量aav制剂中的aav基因组拷贝23。[0143]动物安乐死和组织收获[0144]通过侧面尾静脉、用200μl的无菌pbs中稀释的试验的aav载体缓慢注射小鼠(品系如各图中所示)(低剂量：4x1012vg/kg，和高剂量：3.2x1013vg/kg)，之后轻柔地指夹注射位点直至停止出血。注射后三周，安乐死小鼠并用无菌冷磷酸盐缓冲盐水(pbs)进行心脏灌注。然后，将脑纵向分为两个脑半球。一个脑半球在15％甘油/pbs中稀释的4％多聚甲醛中后固定(post‑fixed)48小时，接着由30％甘油冷冻保存另外的48‑72小时。对于高剂量组，还对一小片的心脏、肌肉(腓肠肌)和视网膜进行免疫组织学。我们制备了aav‑s、aav‑f、和aav9的3个独立的制剂(表1)。小鼠中的转导结果来自每种载体的一个制剂，然而，我们在另外两个独立的实验中重复这些结果。[0145]aav‑cba‑gfp转导的神经细胞群和神经元细胞群的免疫组织学和高放大率图像[0146]使用冷冻切片机切割管状浮动切片(40μm)。在tris缓冲盐水(tbs)缓冲液中冲洗掉甘油后，在室温下用tbs中0.5％tritonx‑100(americanbio)渗透化冷冻切片30分钟，并在室温下用5％正常山羊血清(或正常驴血清)和tbs中0.05％triton阻断1小时。在4℃下、在2.5％ngs和tbs中0.05％triton中培养一抗过夜，在第二天培养alexafluor488或‑cy3缀合的二抗(jacksonimmunoresearchlaboratories,baltimore,usa)1小时。用于本研究的一抗为：鸡抗gfp(aveslabs,tigard,usa)、小鼠抗neun(emdmillipore,burlington,usa)；兔抗谷氨酰胺合成酶(abcam,cambridge,usa)；兔抗olig2(emdmillipore,burlington,usa)；兔抗iba1(wako,japan)；兔抗camkii(abcam,cambridge,usa)；小鼠抗gad67(emdmillipore,burlington,usa)；兔抗chat(emdmillipore,burlington,usa)；小鼠抗钙结合蛋白(abcam,cambridge,usa)和兔抗th(novusbiologicals,littleton,usa)。用具有dapi的vectashield封固剂(vectorlaboratories,burlingame,usa)封固切片。[0147]为了识别由每种载体转导的神经细胞类型和调查aav‑f靶向的各种神经元亚型，使用装配有axiovision软件和60x目镜的zeissaxioimagerz辐射荧光显微镜以取得显示gfp和各细胞标志物之间的共定位的高分辨率图像。[0148]整体gfp信号覆盖的成像和定量[0149]为了定量脑和肝切片中的整体天然gfp荧光信号，使用olympusuplsapo10x目镜、机械玻片扫描仪virtualslidemicroscopevs120(olympus)用于一次性成像整批玻片。为了降低变异性，一次成像整批玻片。设定用于gfp的初始曝光时间，使得荧光信号在所有实验组中既不未饱和也不过饱和，并且在整批扫描中维持不改变。随机化玻片的顺序并且保持盲态直至最终的统计学分析。然后使用olympuscellsens标准软件以分析各脑切片中的gfp覆盖百分比。使用“roi‑polygon”工具初始限定感兴趣的区域(roi)，并且在gfp通道上对于分析的所有玻片应用类似的检测阈值后，我们在该初始roi中定量了gfp阳性区域(对于所有小鼠脑切片的分析，将阈值设定在类似的水平，但对于所有小鼠肝切片和所有大鼠脑切片的分析，应用不同的阈值)。然后计算相对于roi的整个表面的gfp阳性区域的百分比。由于我们设定对于egfp荧光强度的阈值高于自体荧光水平，在我们的分析中考虑自体technologies)，100u的青霉素，100μg/ml的链霉素(lifetechnologies)，和2.5μg/ml的两性霉素(lifetechnologies)。然后通过40μm细胞过滤器(corninglifescience)过滤上清液。由accutase(10分钟)分离直径大于40μm的神经球。神经分化培养基由1×neurobasalmedium、2％b‑27无血清补充剂、和2mmglutamax‑i补充剂(全部来自invitrogen)组成，并且补充有人重组脑源性神经营养因子(bdnf)(10ng/ml；peprotech)。[0156]在腔室玻片中在分化培养基中生长分化的nsc2周，然后用编码gfp的指定aav载体处理(添加7x109vg/孔，150vg/细胞)。转导后一周，用4％多聚甲醛固定细胞并用1x磷酸盐缓冲盐水(pbs；invitrogen)中0.05％tritonx‑100(sigma‑aldrich)渗透化。用针对神经元特异性iii类β微管蛋白(1:50；abcam)的单克隆一抗(tu‑20)染色细胞。添加缀合至alexafluor594(1:200稀释；invitrogen)的二抗1小时，接着添加dapi30分钟。然后，用prolong防褪色试剂(antifadereagent)(invitrogen)封固玻片。使用nikona1r共聚焦显微镜从捕获的z‑stack产生最大保护图像(maxprojectionimage)。[0157]在imaris中加载z‑stack，表面模块用于将图像渲染为3d体积。计数gfp+神经元(在通道1‑绿色下)和iii类β‑微管蛋白阳性神经元(在通道2‑红色下)。使用imaris的共定位模块，确定了对于上述为双阳性的神经元的群体。[0158]统计学[0159]使用graphpadprism软件(版本8.00)进行数据的统计学分析。在不同组aav9、aav9‑php.b、aav‑s和aav‑f中，进行单因素方差分析、接着进行tukey多重比较检验。认为p<0.05的值是统计学显著的。结果显示为平均值±s.e.m。对脑和肝中aav基因组的生物分布以及人神经元的转导进行了类似的分析。[0160]载体的直接立体定向注射[0161]通过腹腔内注射氯胺酮/赛拉嗪(分别地100mg/kg体重和50mg/kg体重)以麻醉成年c57bl/6小鼠，并置于立体定向框架(kopfinstruments,tujunga,usa)中。在皮层(躯体感觉皮层)和海马中进行载体的注射。以0.15μl/分钟的速率)并使用附接至10μlhamilton注射器(sigma‑aldrich,st.louis,usa)的33号尖针注射总计3μl的病毒悬浮液(对于aav‑f和aav‑s，分别为1.65x1010gc每注射位点和5.6x1010gc每注射位点)。自前囟计算注射位点的立体定位坐标(皮层坐标：前后‑1mm，中侧±1mm和背腹侧‑0.8mm；海马坐标：前后‑2mm，中侧±1.7mm和背腹侧‑2.5mm)。[0162]鞘内浓注递送(it浓注)[0163]用异氟醚麻醉成年c57bl/6小鼠。在将腰区上的皮肤剃毛并清洁后，经皮肤制成3～4cm中央矢状切口暴露肌肉和脊髓。在l4‑l5脊髓区之间插入导管并附接至具有33号尖针的气密性hamilton注射器。以2μl/分钟的速率缓慢注射10微升的aav9‑cba‑gfp(1.25x1011vg)载体或aav‑f‑cba‑gfp(8.8x1010vg)。注射后三周杀死小鼠。[0164]对于完整脊髓和脑切片的低分辨率图像，我们用抗gfp(invitrogen，商品目录号g10362，稀释1:250)染色过夜，接着进行二抗染色，图像如图3。[0165]对于脑和脊髓中的细胞类型的免疫染色，用pbs洗涤固定的组织切片，用山羊血清阻断并用pbs中0.3％triton渗透化。在阻断缓冲液中稀释靶抗体并且在4℃下培养过夜。[0166]一抗：抗gfp：商品目录号ab1218(abcam)：稀释，1:1000[0167]gfap：商品目录号catz0334,(dako)；稀释，1:500[0168]neun：商品目录号ab177487,(abcam)；稀释，1:300[0169]过夜培养后，用具有0.1％tween的pbs彻底洗涤玻片。添加荧光物(fluorochrome)缀合的二抗(1:500稀释)并在室温下培养1小时。在用pbs洗涤玻片后，使用dapi封固溶液(thermofisher，商品目录号p36931)封固。使用zeisslsm800共聚焦激光扫描显微镜成像玻片。[0170]透射电子显微镜[0171]通过暴露于25ma辉光放电20s以赋予碳包覆的网格(电子显微镜科学，ems)亲水性。对于各aav载体制剂，将5μl吸附至网格1分钟，并用1％乙酸铀(ems#22400)染色20s。在tecnaig2spiritbiotwin中检查网格并用amt2kccd照相机成像。在哈佛医学院电子显微镜设施(harvardmedicalschoolelectronmicroscopyfacility)中进行工作。如下进行计数：取得各载体制剂的5个代表性图像；使用photoshop(cs6)中的计数工具(counttool)计数所有完整衣壳和空衣壳。对于各图像计算空衣壳百分比并绘图。[0172]实施例1.基于itransduce和表达的aav文库的设计[0173]首先，我们构建了aav文库质粒，其由包含鸡β肌动蛋白(cba)驱动的cre重组酶和p41启动子驱动的aav9衣壳的aav2itr侧翼的表达盒组成(示意于图1a)。通过pcr将伪随机21碱基核苷酸插入在编码氨基酸588/589的aav9vp1核苷酸之间。在病毒包装前，我们使用低深度下一代测序(ngs)对该质粒文库测序，确证了在绝大部分的质粒中存在21聚体插入物并且无变体偏见(数据未显示)。然后，我们包装了衣壳文库并进行ngs以验证载体产生过程维持充分的多样性用于选择。itransduce依赖于携带其自己的cap基因以及cre表达构建体的各个独特衣壳(图1b)。用aav文库静脉内注射携带floxed‑stoptdtomato盒的转基因小鼠(ai9)(图1b‑i)。成功转导细胞的那些衣壳使得任何靶器官或细胞类型中的tdtomato表达成为可能(而不依赖于特定cre转基因小鼠种系的可用性)；然后，从感兴趣的组织流式分选这些tdtomato阳性细胞(任选地，与细胞特异性标志物一起，图1b‑ii)。从这些细胞拯救的病毒dna应对应于可有效克服所有的细胞外和细胞内生物屏障以转基因表达的衣壳变体(图1b‑iii)。[0174]实施例2.使用转基因表达以识别功能性衣壳的新aav9衣壳的选择[0175]为了试验itransduce文库策略，在全身注射后，我们进行了概念验证(proof‑of‑concept)选择以试图分离具有转导脑细胞的能力的aav9衣壳变体。通过一只成年雄性和一只雌性ai9小鼠的尾静脉静脉内注射1.27x1011文库的载体基因组(vg，5x1012vg/kg)，并在注射后三周杀死小鼠；切出肝、脑、脾、和肾的切片并进行tdtomato的免疫染色。我们容易地检测了肝中的tdtomato阳性细胞(可能地，肝细胞)，脑以及其它器官中的分散的tdtomato阳性细胞(神经元和星形胶质细胞)(图7a)。我们还试验了我们是否可以通过pcr拯救含有21碱基插入物的capdna，并且我们在注射有文库的小鼠中、在10器官/组织中检测到了特异性条带，但未在对照、非注射小鼠中检测到(图7b)。我们合并了来自雌性和雄性小鼠的剩余脑组织，并提取dna，最初从用于第一轮的选择的总脑组织中提取。我们扩增了含有21聚体插入物的capdna并使用ngs分析它们的身份和读出计数。与未选择的文库和从肝回收的变体相比，我们观察到收获自单轮选择后的脑组织的文库群体中的特定肽的大量富集(图7c，数据未显示)。然后，我们分离了病毒dna的含插入物的区域并将其重新克隆回aav质粒骨架并重包装衣壳(“脑富集的衣壳文库”)用于第二轮选择。[0176]对于第二轮选择，由拯救自第1轮(1.91x1010vg、7.64x1011vg/kg的剂量)的文库注射两只ai9小鼠(一只雄性，一只雌性)并在三周后处死。注射前，扩增含有变体区的序列并由ngs测序以确保不将预先存在的偏见导入载体池(图2)。解离脑组织以获得细胞悬浮液用于通过流式细胞术分选tdtomato阳性细胞。我们流式分选了3,834个tdtomato阳性细胞(初始细胞悬浮液的0.043％)，其表示了成功转导(图8a‑b)。扩增来自tdtomato分选的细胞的病毒dna并如上所述进行测序(图2)。分离自tdtomato阳性细胞的病毒dna显示读长的97％仅由三种肽sttlysp、fvvgqsy、和fqpcp*(其中*表示终止密码子)表示(图2b)。我们选择了其中的两种sttlysp(称为aav‑s)和fvvgqsy(称为aav‑f)用于体内功能性评价(我们排除了fqpcp*的评价，因为那可能是交叉包装的产物)。如图2中所见，这些序列均在第2轮文库中以低水平(各变体的读出的～0.4％)被检测到，但在选择后在脑中高度富集。[0177]实施例3.aav‑f衣壳在小鼠cns中介导有效的转基因表达。[0178]为了试验在aav的衣壳上表达的这些肽是否可通过aav载体介导有效的转基因表达，我们产生了这些衣壳(aav‑s和aav‑f)，包装单链cba启动子驱动的gfp表达盒(图3a)。为了比较，我们包含了亲代aav9载体和aav9‑php.b，通过定向进化产生的具有7聚体肽插入(tlavpfk)的最广泛研究的aav9变体12。所有载体良好产生并给出略低于aa9的生产效率(表4)。[0179]表4.aav衣壳*的生产效率[0180][0181]*所有衣壳包装单链aav2itr侧翼的aav‑cba‑gfp‑wpre转基因盒[0182]用低剂量或高剂量(分别地，1x1011vg和8x1011vg的载体；约4x1012和3.2x1013vg/kg)的以下载体的一种，通过侧面尾静脉注射成年雄性c57bl/6j小鼠：aav9、aav9‑php.b、aav‑s和aav‑f(各n＝3)。注射后三周，杀死小鼠并收获器官用于内源(非染色)gfp荧光分析。我们定量了系列矢状脑切片中的gfp信号的覆盖率(每动物分析3个切片)。显著地，分别地在1x1011vg和8x1011vg下，与亲代aav9载体相比，aav‑f表现119倍(p<0.0001)和68倍(p＝0.0004)增加的gfp荧光覆盖(图3b、c、e、f；图9a‑b)。aav9和aav‑s显示类似的gfp覆盖水平(图3b、c、e、f)。与aav‑f相比，aav9‑php.b在低剂量下给出略微更高的gfp覆盖，而在8x1011vg剂量下观察到类似水平的gfp覆盖(图3b、c、e、f)。类似于aav9‑php.b，aav‑f以显著效率转导脊髓(图3d)。aav‑f有效靶向脑的大部分区域，并且在皮层、海马、纹状体、小脑和嗅球中观察到强力gfp信号(图3f)。[0183]然后，为了得到由aav‑s和aav‑f靶向的细胞类型的详细说明，我们进行了由gfp和神经元(neun)、星形胶质细胞(谷氨酰胺合成酶，gs)、小神经胶质细胞(iba‑1)和少突细胞(olig2)的标志物的一系列共免疫染色。aav‑f和aav‑s，类似于其它两种参考载体，主要转导神经元和星形胶质细胞(无变体看起来有效转导小神经胶质细胞或少突小胶质细胞(oligodendromicroglia)，图4a、b)。1x1011vg剂量下的皮层中的神经元和星形胶质细胞的体视学定量确证了aav‑f的有效转导潜力，与常规aav9相比，在星形胶质细胞中的因子为65和神经元中的因子为171，同时aavs和aav9之间的差异不显著(分别地，gfp阳性星形胶质细胞的百分比对于aav9为0.63％±0.24％和对于aav‑s为0.36±0.15％；并且gfp阳性神经元对于aav9为0.039％±0.0.02％和对于aav‑s为0.029±0.002％；所有±数字表示平均数标准误差，sem)。应注意，aav‑f比aav9‑php.b(28.21±0.25％)更显著地靶向星形胶质细胞(40.78±0.73％)，对于神经元则相反(对于aav‑f为6.67±0.5％和对于aav9‑php.b为10.59±0.16％，图4c)，表明小鼠中这两种载体之间略微不同的向性。另外，aav‑f转导各种神经元亚类，包括兴奋性(camkii阳性)和抑制性(gad67阳性)皮层神经元、纹状体中多巴胺层神经元(表达酪氨酸羟化酶，th)、小脑中浦肯野神经元(钙结合蛋白阳性)和脊髓中的运动神经元(表达胆碱乙酰转移酶标志物，chat，图10a)。与皮层中的体视学计数(图4c)和高剂量的aav‑f对aav9的图像(图3f)相一致，我们在纹状体、海马、和小脑中观察到在1x1011vg/小鼠的剂量下、通过aav‑f而不是aav9的神经元和星形胶质细胞的有效转导(图10b)。[0184]为了更好的理解由aav‑f的脑中gfp转基因表达的高水平是否对应于脑中aav基因组的更高水平，我们从肝和脑分离了载体和小鼠基因组dna并对给予8x1011vg剂量的小鼠进行qpcr。与aav9相比，aav‑f在脑中显示20倍增强的aav基因组(p<0.0001)(图4d)。如所报告的，aav9‑php.b与aav9相比在脑中具有高得多(25倍)的量的aav基因组，同时aav‑s具有低水平，类似于gfp荧光数据(图3)。php.b显示的肝中的表达水平略低于aav9和aav‑f(尽管不低于aav‑s；图4d)。aav‑f显示的肝中的水平类似于aav‑9，aav‑s显示较低的但不显著的下降趋势。我们还在多种其它器官–骨骼肌、心脏、和脊髓中检验了aav‑f与aav9相比的生物分布(图11)。我们在肌肉和心脏中未观察到两种载体之间的显著差异(尽管在心脏中看到关于aav‑f的向上趋势)。如从脑中的表达所预期的，aav‑f与aav9相比在脊髓中显示显著更高的表达水平(p<0.05，t检验)。[0185]为了调查全身注射后的周围器官中的转基因表达，我们分析了肝、心脏、骨骼肌、和视网膜中的gfp荧光(图4e)。毫不奇怪，所有载体有效转导肝。在心脏和骨骼肌中，aav‑s比aav9和aav‑f产生更高数量的明亮gfp信号/切片。所有衣壳介导低视网膜转导，如由静脉内递送所预期的。有趣地，尽管aav‑9和aav‑s不转导神经元视网膜，在视网膜色素上皮细胞(rpe)中观察到一致的表达。aav9‑php.b和aav‑f二者在视网膜中转导多个层，最特别地神经节细胞层(gcl)中的细胞。还在内核层中观察到gfp表达，外丛状层(opl)中显示大量表达，这可反应双极性或抑制性水平细胞转导。[0186]由于小鼠中通过aav载体的转导在性别和小鼠品系之间可实质上变化，我们检验了最有效的衣壳aav‑f是否可在全身注射雌性c57bl/6以及雄性balb/c后有效转导脑。用1x1011vg(4x1012vg/kg)注射小鼠，我们观察到不依赖于品系或性别的强力且有效的转导(图5a‑c)。这些结果与如先前所报告的、aav9‑php.b在balb/c品系中全身递送后缺乏转导中枢神经系统的功效形成对比(图5b、c)13,14。[0187]尽管碘克沙醇浓度梯度纯化去除了大部分的空衣壳，为了检验aav‑f中过量的空衣壳是否可以解释其与aav9相比对脑增加的生物分布，我们对aav‑f的两个分别的制剂进行了透射电子显微镜法(tem)，并且将它们与aav9的两个独立制剂相比较。如图12a‑e中所示，我们在aav‑f和aav9之间未观察到空衣壳水平的显著差异(对于aav9和aav‑f分别为平均值4.63±1.99％对5.2±2.18％空衣壳，平均值±sd，p＝0.54，非配对t检验)。[0188]然后，我们试验了aav‑f是否可具有作为通过其它施用途径的cns转导的载体的效用。首先，我们试验了aav‑s和aav‑f在成年c57bl/6小鼠的直接海马注射后的脑中介导转基因表达。我们发现两种衣壳在直接注射后实现了广泛的gfp表达，主要是在神经元中(图13)。鞘内注射aav载体以转导脊髓，已显示治疗该隔室的潜力。一个缺点是，在腰椎注射载体后，载体至脑的有限的传播。我们在将载体浓鞘内注射至成年c57bl/6小鼠中脊髓的腰区后，比较了aav9和aav‑f。注射后三周，杀死小鼠并分析脊髓和脑。显著地，与aav9相比，aav‑f在整个脊髓中导致更加强烈的gfp表达，转导白质和灰质二者。然而aav9主要受限于白质。显著地，我们还检测了由aav‑f而不是aav9注射的小鼠的脑中的星形胶质细胞和神经元的转导(图14)。[0189]实施例4.aav‑f介导增强的人神经元的转导[0190]由于选择在小鼠中进行，我们分析了aav‑f的强力转导特性是否还转换至人细胞。由同等剂量的全部编码gfp的aav9、aav‑s和aav‑f转导原代人干细胞衍生神经元。一周后，将其固定，用iii类β微管蛋白染色并分析gfp阳性神经元的百分比。显著地，aav‑f转导62％的神经元，是aav9的三倍以上(p<0.05)(图6a、b)。aav‑s产生超过aav9的少量但仍统计学上显著(p<0.05)的转导效率的增加(图6a)。[0191]实施例5.aav‑s高效率地转导内耳[0192]近年来已出现新aav载体的开发，设计成高效率地靶向特定器官和细胞类型。其中许多利用修饰特定aav血清型的转导性质的7聚体肽插入。然而，通常可将这些载体重新用于转导其它组织，包括例如内耳等难以治疗的组织。转导内耳中的某些细胞类型–例如毛细胞–仍为挑战，因为许多常规aav载体未能始终靶向一类毛细胞，即外毛细胞(ohc)。[0193]如上所示，一种(aav‑f)在全身注射后显示更有前途的且高cns表达，而另一种(aav‑s)则没有。尽管全身注射aav‑s不有效跨越血脑屏障，但其转导各种组织，包括心脏、肝、和肌肉。在直接注射至脑后，即使在相对低的剂量下，aav‑s在神经元中也显示高的局部转导效率。为了检验其在内耳中的转导性能，我们产生了编码在cba启动子下驱动egfp的单链表达盒的aav‑s，并通过圆窗将其注射在新生(p1)小鼠中。我们发现aav‑s非常良好的转导耳蜗的毛细胞。在试验的剂量(2x1010vg)下，以多至100％和99％的效率转导内毛细胞和外毛细胞二者(图15a、b)。我们还观察到螺旋缘和螺旋神经节的显著转导(图15c、d)。总体上，我们在此显示aav‑s可用于内耳的基因治疗。[0194]实施例6.使用itransduce系统在非转基因成年灵长类动物中选择以分离有效转导纤维细胞的衣壳[0195]在例如食蟹猴等非人灵长类动物中进行了2‑3轮的对于靶向纤维细胞的aav衣壳的选择。为了识别纤维细胞选择性、能够转导的aav衣壳，通过将itransduceaav文库与编码gjb2‑floxed‑stop‑tdtomato盒(尺寸适合aav衣壳内)的aav9‑php.b一起共注射来进行选择。在nhp内耳中，aav9‑php.b‑cba‑gfp转导许多耳蜗细胞，包括纤维细胞、hc、和螺旋神经节神经元区。在该选择策略中(参见图16a)，tdtomato表达限于gjb2驱动子下的纤维细胞，实质上产生内耳转基因nhp。从分离的耳蜗流式分选进入纤维细胞并启动tdtomato的aav衣壳，对于ngs拯救衣壳dna并克隆以识别允许aav介导纤维细胞中的表达的肽序列。然后，对单个肽富集进行如上所述的深度测序以告知何时停止另外的选择轮次(可能地，当特定肽占>25％的读长时)。[0196]可选地或另外地，在例如食蟹猴等非人灵长类动物中进行了2‑3轮的对于靶向脊髓细胞的aav衣壳的选择。为了识别脊髓选择性、能够转导的aav衣壳，通过将itransduceaav文库与编码cba‑floxed‑stop‑mplum盒(尺寸适合aav衣壳内)的aav9一起共注射来进行选择。在nhp脊髓中，aav9转导细胞，包括神经元和星形胶质细胞。在该选择策略中(参见图16b)，从分离的脊髓流式分选进入脊髓细胞并启动mplum荧光的aav衣壳，对于ngs拯救衣壳dna并克隆以识别允许aav介导脊髓细胞中的表达的肽序列。然后，对单个肽富集进行如上所述的深度测序以告知何时停止另外的选择轮次(可能地，当特定肽占>25％的读长时)。[0197]一旦识别了候选衣壳克隆，衣壳如前所述载体化，编码gfp盒。然后，在直接圆窗膜(rmw)注射(例如，如图16a中所示)、或鞘内注射(例如，如图16b中所示)后，试验衣壳对于靶细胞的转导。[0198]参考文献[0199]1.mendell,j.r.,s.al‑zaidy,r.shell,w.d.arnold,l.r.rodino‑klapac,t.w.prior,l.lowes,l.alfano,k.berry,k.church,j.t.kissel,s.nagendran,j.l'italien,d.m.sproule,c.wells,j.a.cardenas,m.d.heitzer,a.kaspar,s.corcoran,l.braun,s.likhite,c.miranda,k.meyer,k.d.foust,a.h.m.burghes,andb.k.kaspar,single‑dosegene‑replacementtherapyforspinalmuscularatrophy.nengljmed,2017.377(18):p.1713‑1722.[0200]2.manno,c.s.,g.f.pierce,v.r.arruda,b.glader,m.ragni,j.j.rasko,m.c.ozelo,k.hoots,p.blatt,b.konkle,m.dake,r.kaye,m.razavi,a.zajko,j.zehnder,p.k.rustagi,h.nakai,a.chew,d.leonard,j.f.wright,r.r.lessard,j.m.sommer,m.tigges,d.sabatino,a.luk,h.jiang,f.mingozzi,l.couto,h.c.ertl,k.a.high,andm.a.kay,successfultransductionofliverinhemophiliabyaav‑factorixandlimitationsimposedbythehostimmuneresponse.natmed,2006.12(3):p.342‑7.[0201]3.hinderer,c.,n.katz,e.l.buza,c.dyer,t.goode,p.bell,l.k.richman,andj.m.wilson,severetoxicityinnonhumanprimatesandpigletsfollowinghigh‑doseintravenousadministrationofanadeno‑associatedvirusvectorexpressinghumansmn.humgenether,2018.29(3):p.285‑298.[0202]4.paulk,n.k.,k.pekrun,g.w.charville,k.maguire‑nguyen,m.n.wosczyna,j.xu,y.zhang,l.lisowski,b.yoo,j.g.vilches‑moure,g.k.lee,j.b.shrager,t.a.rando,andm.a.kay,bioengineeredviralplatformforintramuscularpassivevaccinedeliverytohumanskeletalmuscle.molthermethodsclindev,2018.10:p.144‑155.[0203]5.paulk,n.k.,k.pekrun,e.zhu,s.nygaard,b.li,j.xu,k.chu,c.leborgne,a.p.dane,a.haft,y.zhang,f.zhang,c.morton,m.b.valentine,a.m.davidoff,a.c.nathwani,f.mingozzi,m.grompe,i.e.alexander,l.lisowski,andm.a.kay,bioengineeredaavcapsidswithcombinedhighhumanlivertransductioninvivoanduniquehumoralseroreactivity.molther,2018.26(1):p.289‑303.[0204]6.gray,s.j.,b.l.blake,h.e.criswell,s.c.nicolson,r.j.samulski,humanneuralstemcells.stemcellsdev,2015.24(12):p.1377‑89.[0225]27.akil,o.,dyka,f.,calvet,c.,emptoz,a.,lahlou,g.,nouaille,s.,demonvel,j.b.,hardelin,j.p.,hauswirth,w.w.,avan,p.,petit,c.,safieddine,s.,andlustig,l.r.(2019).dualaav‑mediatedgenetherapyrestoreshearinginadfnb9mousemodel.proc.natl.acad.sci.u.s.a.doi:10.1073/pnas.1817537116.[0226]28.al‑zaidy,s.a.,kolb,s.j.,lowes,l.,alfano,l.n.,shell,r.,church,k.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