1.一种制备用于单分子表征的核酸构建体的方法,所述方法包括使靶多核苷酸与以下接触:
多核苷酸引导的效应蛋白;
引导多核苷酸;
转座酶;以及
包括经修饰的多核苷酸的可转座元件,
其中所述多核苷酸引导的效应蛋白将所述转座酶引导到所述靶多核苷酸内的所关注区域,并且所述转座酶将所述可转座元件插入到所述多核苷酸中,由此产生用于单分子表征的核酸构建体。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述多核苷酸引导的效应蛋白通过蛋白质-蛋白质相互作用与所述转座酶结合。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述多核苷酸引导的效应蛋白在基因上与所述转座酶融合。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述多核苷酸引导的效应蛋白通过连接子部分连接到所述转座酶。
5.一种制备核酸构建体的方法,所述方法包括使靶多核苷酸与以下接触:
多核苷酸引导的效应蛋白;
引导多核苷酸;
转座酶;以及
可转座元件,
其中所述多核苷酸引导的效应蛋白和所述转座酶通过连接子部分在基因上融合或连接,使得所述转座酶被引导到所述靶多核苷酸内的所关注区域,并且将所述可转座元件插入到所述靶多核苷酸中,由此制备核酸构建体。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述可转座元件包括经修饰的多核苷酸。
7.根据权利要求4到6中任一项所述的方法,其中所述连接子部分是与所述多核苷酸引导的效应蛋白和所述转座酶结合的连接子多核苷酸。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述连接子多核苷酸是tracrRNA、CRISPR RNA或单引导RNA。
9.根据权利要求4到8中任一项所述的方法,其中连接子部分序列长度决定紧邻所述多核苷酸引导的效应蛋白接触的所述靶多核苷酸内的序列上游的原间隔子相邻基序(PAM)与所述转座酶将所述可转座元件插入到所述所关注区域的位点之间的序列长度。
10.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述靶多核苷酸首先与所述多核苷酸引导的效应蛋白接触,并且然后与所述转座酶接触。
11.根据权利要求1、2和10中任一项所述的方法,其中所述靶多核苷酸在不利于转座酶活性的条件下并且在所述转座酶与所述多核苷酸引导的效应蛋白结合之后与所述多核苷酸引导的效应蛋白、所述引导多核苷酸、所述转座酶和所述可转座元件接触,其中所述方法包括改变所述条件使得所述条件有利于转座酶活性。
12.根据权利要求11所述的方法,其中在改变所述条件使得所述条件有利于转座酶活性之前,去除未与所述多核苷酸引导的效应蛋白结合的所述转座酶。
13.根据权利要求11或12所述的方法,其中所述不利于转座酶活性的条件包括不超过50mM或至少250mM的盐浓度和/或存在金属离子螯合剂。
14.根据权利要求11到13中任一项所述的方法,其中所述有利于转座酶活性的条件包括超过50mM但小于250mM的盐浓度和/或不存在金属离子螯合剂和/或存在游离Mg2+离子。
15.根据权利要求1到9中任一项所述的方法,其中使所述靶多核苷酸与包括所述多核苷酸引导的效应蛋白、所述引导多核苷酸、所述转座酶和所述可转座元件的复合物接触。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述引导多核苷酸是引导RNA并且所述多核苷酸引导的效应蛋白是RNA引导的效应蛋白。
17.根据权利要求17所述的方法,其中所述RNA引导的效应蛋白是RNA引导的核酸内切酶或RNA引导的核酸内切酶,其中所述RNA引导的核酸内切酶的核酸酶活性失效。
18.根据权利要求18所述的方法,其中所述RNA引导的核酸内切酶的一个或多个催化性核酸酶位点失活。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述多核苷酸引导的效应蛋白是多种蛋白质组分的组装。
20.根据权利要求19所述的方法,其中所述多核苷酸引导的效应蛋白是包括Cas6-Cas7-Cas8蛋白组装的级联。
21.根据权利要求19所述的方法,其中所述多核苷酸引导的效应蛋白包括包含Cas、Cpf1或C2c2的一种或多种组分。
22.根据权利要求19所述的方法,其中所述多核苷酸引导的效应蛋白是Cas12k。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述转座酶是多聚体蛋白。
24.根据权利要求23所述的方法,其中所述多聚体蛋白包括玉米Ac转座子、果蝇P元件、Tn5、Tn7、Tn10、Mariner、IS10、IS50或MuA。
25.根据权利要求1到4和6到24中任一项所述的方法,其中所述经修饰的多核苷酸包括点击反应性基团、荧光团、缀合剂、下拉基团、拴系部分、标志物、经修饰的碱基、脱碱基残基和/或间隔子。
26.根据权利要求25所述的方法,其中所述标志物或下拉剂是生物素,和/或所述经修饰的多核苷酸包括碱基-碱基缀合物和/或蛋白质-碱基缀合物,和/或所述拴系部分是包括疏水区域、脂质、脂肪酸、甾醇、碳纳米管、多肽、蛋白质或氨基酸、胆固醇、棕榈酸酯或生育酚的多肽。
27.根据权利要求25或26所述的方法,其中所述可转座元件为衔接子,如测序衔接子、中间衔接子、扩增衔接子、发夹衔接子、唯一分子标识符或滚环扩增模板。
28.一种用于制备用于单分子表征的核酸构建体的系统,所述系统包括:
多核苷酸引导的效应蛋白;
引导多核苷酸;
转座酶;以及
包括经修饰的多核苷酸的可转座元件,
其中所述多核苷酸引导的效应蛋白将所述转座酶引导到所述靶多核苷酸内的所关注区域,并且进一步其中所述转座酶将所述可转座元件插入到所述多核苷酸中,由此产生用于单分子表征的核酸构建体。
29.根据权利要求28所述的系统,其中所述多核苷酸引导的效应蛋白通过蛋白质-蛋白质相互作用与所述转座酶结合。
30.根据权利要求28所述的系统,其中所述多核苷酸引导的效应蛋白在基因上与所述转座酶融合。
31.根据权利要求28所述的系统,其中所述多核苷酸引导的效应蛋白通过连接子部分连接到所述转座酶。
32.一种用于制备核酸构建体的系统,所述系统包括:
多核苷酸引导的效应蛋白;
引导多核苷酸;
转座酶;以及
可转座元件,
其中所述多核苷酸引导的效应蛋白和所述转座酶通过连接子部分在基因上融合或连接,使得所述转座酶被引导到所述靶多核苷酸内的所关注区域,并且将所述可转座元件插入到所述靶多核苷酸中,由此制备核酸构建体。
33.根据权利要求32所述的系统,其中所述可转座元件包括经修饰的多核苷酸。
34.根据权利要求31到33中任一项所述的系统,其中所述连接子部分是与所述多核苷酸引导的效应蛋白和所述转座酶结合的连接子多核苷酸。
35.根据权利要求34所述的系统,其中所述连接子多核苷酸是tracrRNA、CRISPR RNA或单引导RNA。
36.根据权利要求31到35所述的系统,其中连接子部分长度决定紧邻所述多核苷酸引导的效应蛋白接触的所述靶多核苷酸内的核苷酸序列上游的原间隔子相邻基序(PAM)与所述转座酶将所述可转座元件插入到所述所关注区域的位点之间的核苷酸序列长度。
37.根据权利要求28到36中任一项所述的系统,其中所述引导多核苷酸是引导RNA并且所述多核苷酸引导的效应蛋白是RNA引导的效应蛋白。
38.根据权利要求37所述的系统,其中所述RNA引导的效应蛋白是RNA引导的核酸内切酶或RNA引导的核酸内切酶,其中所述RNA引导的核酸内切酶的核酸酶活性失效。
39.根据权利要求28到38中任一项所述的系统,其中所述多核苷酸引导的效应蛋白是多种蛋白质组分的组装。
40.根据权利要求39所述的系统,其中所述多核苷酸引导的效应蛋白是包括Cas6-Cas7-Cas8蛋白组装的级联。
41.根据权利要求39所述的系统,其中所述多核苷酸引导的效应蛋白包括包含Cas、Cpf1或C2c2的一种或多种组分。
42.根据权利要求39所述的系统,其中所述多核苷酸引导的效应蛋白是Cas12k。
43.根据权利要求28到42中任一项所述的系统,其中所述转座酶是多聚体蛋白。
44.根据权利要求43所述的系统,其中所述多聚体蛋白包括玉米Ac转座子、果蝇P元件、Tn5、Tn7、Tn10、Mariner、IS10、IS50或MuA。
45.根据权利要求28到31和33到44中任一项所述的系统,其中所述经修饰的多核苷酸包括点击反应性基团、荧光团、缀合剂、下拉基团、拴系部分、标志物、经修饰的碱基、脱碱基残基和/或间隔子。
46.根据权利要求48所述的系统,其中所述标志物或下拉剂是生物素,和/或所述经修饰的多核苷酸包括碱基-碱基缀合物和/或蛋白质-碱基缀合物,和/或所述拴系部分是包括疏水区域、脂质、脂肪酸、甾醇、碳纳米管、多肽、蛋白质或氨基酸、胆固醇、棕榈酸酯或生育酚的多肽。
47.根据权利要求46所述的系统,其中所述衔接子是:
测序衔接子、中间衔接子、扩增衔接子;
发夹衔接子;
唯一分子标识符;或者
滚环扩增模板。
48.根据权利要求28到47中任一项所述的系统,其中所述系统进一步包括:
盐溶液;
金属离子螯合剂;和/或
游离Mg2+离子。
49.一种检测和/或表征样品中的靶多核苷酸的方法,所述方法包括:
(v)根据权利要求1到27中任一项所述的方法制备用于单分子表征的核酸构建体;
(vi)使所述核酸构建体与包括跨膜孔的膜接触;
(vii)跨所述膜施加电位差;以及
(viii)进行由所述核酸构建体与所述孔接触产生的一种或多种测量,由此检测和/或表征所述靶多核苷酸以确定所述靶多核苷酸的存在或不存在和/或所述靶多核苷酸的一个或多个特性。
50.根据权利要求49所述的方法,其中所述靶多核苷酸的所述一个或多个特性选自:(i)所述多核苷酸的长度;(ii)所述多核苷酸的同一性;(iii)所述多核苷酸的序列;(iv)所述多核苷酸的二级结构;以及(v)所述多核苷酸是否被修饰。