纤维蛋白片的制造方法

1.本发明涉及纤维蛋白片，更详细而言，涉及在纤维蛋白凝胶中含有选自细胞和药剂中的至少1种的纤维蛋白片的制造方法。


背景技术：

2.在再生医疗领域中，从补充失去的脏器功能的观点考虑，对将细胞构建成3维组织、脏器而进行移植的治疗方法期待提高了(例如，kawamura m.et al.，circulation，2012；126：s29-37(非专利文献1)，miyagawa s.et al.，current gene therapy，2016，vol.16，no.1，p.5-13(非专利文献2))。在3维组织、脏器的构建中，为了获得更好的治疗效果，也需要制作包含达到数层的充分量的细胞的组织。因此近年来，研究了使用3d打印机将细胞叠层化的layer by layer法(lbl法)(例如，takagi d.et al.，ricoh technical report，2016，no.41，p.118-127(非专利文献3))、制作纳米纤维而在其上接种细胞的方法(例如，li j.et al.，stem cell reports，2017，vol.9，1-14，p.1546-1559(非专利文献4))、制作特殊的模并对其接种上述生物体亲和性材料和细胞的方法(nakane t.et al.，scientific report，2017，7：45641(非专利文献5)，gao l.et al.，circulation，2018；137：1712-1730(非专利文献6)，shadrin iy.et al.，nature communications，2017；8：1825(非专利文献7))等。
3.然而，对于上述lbl法，需要可以接种细胞的特殊的3d打印机，对于上述使用纳米纤维的方法，需要制作该纳米纤维的装置、在接种后直到细胞充分植入为止的时间，对于上述使用特殊的模的方法，需要该特殊的模的制作和将细胞在模中培养的时间，——对于这些现有方法，具有需要特殊且昂贵的装置、时间这样的问题。
4.此外，在再生医疗领域，已知为了将组织再生而在病灶部、缺损部使用含有细胞的细胞片的细胞补充疗法，进一步也研究了将该细胞片三维叠层而构建上述3维组织、脏器，用于移植、药物开发研究等。相关地，已知在外科手术中，为了补缀/增强切开部和/或病变除去后的组织缺损部而使用由生物体亲和性材料形成的片，也已知使该片进一步含有用于治疗的药剂而制成药剂片。作为这些细胞片、药剂片的基材(支架)、上述生物体亲和性材料，广泛已知纤维蛋白、胶原、和聚乳酸等。其中，由纤维蛋白形成的纤维蛋白凝胶具有通过组织胶合性而作为生物体粘接剂也发挥作用这样的优点，但另一方面，由于为糊状，因此如果为了使操作比较容易而使纤维蛋白的浓度浓，则使所含有的细胞生存变得困难。相反，如果将纤维蛋白稀释直到细胞可以生存的浓度为止，则不易维持凝胶的形状，因此操作变得困难。进一步，由于粘接性强，因此具有在细胞片的回收时对细胞带来损伤，或难以制造/维持均匀且任意形状的细胞片这样的问题。此外，假定今后的细胞片、药剂片等的制造采用装置的自动化成为主流，从装置的维护性的提高、小型化等观点考虑，预想要求更简便的制造方法。
5.现有技术文献
6.非专利文献
7.非专利文献1：kawamura m.et al.，circulation，2012；126：s29-37
8.非专利文献2：miyagawa s.et al.，current gene therapy，2016，vol.16，no.1，p.5-13
9.非专利文献3：takagi d.et al.，ricoh technical report，2016，no.41，p.118-127
10.非专利文献4：li j.et al.，stem cell reports，2017，vol.9，1-14，p.1546-1559
11.非专利文献5：nakane t.et al.，scientific report，2017，7：45641
12.非专利文献6：gao l.et al.，circulation，2018；137：1712-1730
13.非专利文献7：shadrin iy.et al.，nature communications，2017；8：1825


技术实现要素：

14.发明所要解决的课题
15.本发明是鉴于上述现有技术所具有的课题而提出的，其目的是提供即使纤维蛋白浓度为细胞能够生存的程度的低浓度，也能够在抑制对细胞和药剂带来的损伤的同时，均匀并且以任意的形状简便地制造的在纤维蛋白凝胶中含有选自细胞和药剂中的至少1种的纤维蛋白片的、纤维蛋白片的制造方法。
16.用于解决课题的方法
17.本发明者们对于在纤维蛋白凝胶中含有选自细胞和药剂中的至少1种的纤维蛋白片的制造方法，为了达到上述目的而反复进行了深入研究，结果发现，通过在由明胶水凝胶形成的基材表面上，滴加含有上述细胞和/或药剂以及血纤蛋白原的血纤蛋白原溶液，接着，在上述基材表面上在上述血纤蛋白原溶液中添加凝血酶而制成纤维蛋白前体液，使支撑膜与其上表面接触而载置该支撑膜，从而可以不使用涂开这样的可能对细胞带来机械损伤的操作，而将上述纤维蛋白前体液在上述基材和上述支撑膜的均匀的面间通过表面张力而摊开，以及通过血纤蛋白原与凝血酶的反应，从而可以均匀地形成上述纤维蛋白片。进一步发现，通过在使上述纤维蛋白片形成后，在上述明胶水凝胶的熔解温度以上的温度使上述基材熔解，从而无论上述纤维蛋白片中的纤维蛋白浓度如何，即使该浓度为细胞能够生存的程度的低浓度，也可以将上述纤维蛋白片与上述基材容易地分离。进一步也发现，通过调整上述支撑膜的形状而能够容易地获得任意的形状的纤维蛋白片，从而完成了本发明。
18.即，本发明包含以下方案。
19.1.20.一种纤维蛋白片的制造方法，是在纤维蛋白凝胶中含有选自细胞和药剂中的至少1种的纤维蛋白片的制造方法，包括下述工序：
21.工序1，在由明胶水凝胶形成的基材表面上，滴加含有选自细胞和药剂中的至少1种以及血纤蛋白原的血纤蛋白原溶液；
22.工序2，在上述基材表面上的上述血纤蛋白原溶液中添加凝血酶；
23.工序3，使支撑膜与添加了上述凝血酶的血纤蛋白原溶液的上表面接触而载置该支撑膜；
24.工序4，在上述基材与上述支撑膜之间，通过血纤蛋白原与凝血酶的反应，而形成在纤维蛋白凝胶中含有上述选自细胞和药剂中的至少1种的纤维蛋白片；以及
25.工序5，在上述明胶水凝胶的熔解温度以上的温度使上述基材熔解，将被上述支撑膜支撑着的上述纤维蛋白片从上述基材分离。
26.2.27.根据[1]所述的纤维蛋白片的制造方法，上述纤维蛋白片为在上述纤维蛋白凝胶中至少含有细胞的细胞片，上述基材为细胞培养用基材。
[0028]
[3]
[0029]
根据[1]或[2]所述的纤维蛋白片的制造方法，在上述工序1之前，进一步包括：将含有明胶和水的明胶水溶液加热后冷却而获得上述明胶水凝胶的工序。
[0030]
[4]
[0031]
根据[1]～[3]中任一项所述的纤维蛋白片的制造方法，上述支撑膜为聚丙烯片。
[0032]
[5]
[0033]
根据[1]～[4]中任一项所述的纤维蛋白片的制造方法，在上述工序5中，在30～40℃使上述基材熔解。
[0034]
发明的效果
[0035]
根据本发明，能够提供即使纤维蛋白浓度为细胞能够生存的程度的低浓度，也能够在抑制对细胞和药剂带来的损伤的同时，均匀并且以任意的形状简便地制造在纤维蛋白凝胶中含有选自细胞和药剂中的至少1种的纤维蛋白片的、纤维蛋白片的制造方法。
[0036]
此外，通过使用通过本发明而获得的纤维蛋白片(细胞片和/或药剂片)将其叠层等，从而能够简便地在短时间构建3维组织、脏器等3维生物体材料。上述纤维蛋白片、上述3维生物体材料可以用于针对慢性期疾病、急性期疾病的细胞补充疗法、治疗，此外，也能够用于生物化学现象的理解、用于产生有用物质的细胞培养。
附图说明
[0037]
图1是显示实施例1的工序4中的基材、纤维蛋白片、和支撑膜的形态的照片。
[0038]
图2是显示实施例1的工序5中的熔解基材、纤维蛋白片、和支撑膜的形态的照片。
[0039]
图3是显示在实施例1中获得的纤维蛋白片的形态的照片。
[0040]
图4是显示使面积大而获得的纤维蛋白片的形态的照片。
[0041]
图5是显示在实施例1中获得的纤维蛋白片的评价中的心功能的评价结果的图。
[0042]
图6是显示在实施例1中获得的纤维蛋白片的评价中的vegf基因的表达量的测定结果的图。
具体实施方式
[0043]
以下，按照其适合的实施方式详细地说明本发明，以下实施方式为用于说明本发明的例示，不意味着将本发明限定于以下内容。本发明可以在其宗旨的范围内适当地变形而实施。
[0044]
本发明的纤维蛋白片的制造方法的特征在于，
[0045]
是在纤维蛋白凝胶中含有选自细胞和药剂中的至少1种的纤维蛋白片的制造方法，包括下述工序：
[0046]
工序1，在由明胶水凝胶形成的基材表面上，滴加含有选自细胞和药剂中的至少1
种以及血纤蛋白原的血纤蛋白原溶液；
[0047]
工序2，在上述基材表面上的上述血纤蛋白原溶液中添加凝血酶；
[0048]
工序3，使支撑膜与添加了上述凝血酶的血纤蛋白原溶液的上表面接触而载置该支撑膜；
[0049]
工序4，在上述基材与上述支撑膜之间，通过血纤蛋白原与凝血酶的反应，而形成在纤维蛋白凝胶中含有上述选自细胞和药剂中的至少1种的纤维蛋白片；以及
[0050]
工序5，在上述明胶水凝胶的熔解温度以上的温度使上述基材熔解，将被上述支撑膜支撑着的上述纤维蛋白片从上述基材分离。
[0051]
(纤维蛋白片)
[0052]
在本发明中，所谓“纤维蛋白片”，是包含纤维蛋白凝胶、以及上述纤维蛋白凝胶中所含有的选自细胞和药剂中的至少1种的片。在本发明中，所谓“纤维蛋白凝胶”，是通过血纤蛋白原与凝血酶的反应而形成的聚合物。纤维蛋白凝胶主要具有使细胞彼此粘接的功能。
[0053]
上述血纤蛋白原为血液中的蛋白质，通常，可以使用由人或人以外的动物的血浆获得的。从生物相容性方面考虑，期望在以人作为使用纤维蛋白片的对象的情况下使用由人的血浆获得的血纤蛋白原作为原料，此外，在以人以外的动物作为对象的情况下使用由该动物的血浆获得的血纤蛋白原作为原料。作为这样的血纤蛋白原，可举出例如，按照厚生劳动省的生物学的制剂基准(令和元年(2019年)6月)而制造的干燥人血纤蛋白原，此外，可以适当使用市售品。
[0054]
上述凝血酶为催化使上述血纤蛋白原变成纤维蛋白的反应的酶，通常，可以使用由人或人以外的动物的血浆获得的。作为这样的凝血酶，可举出例如，在ca
2+
的存在下使促凝血酶原激酶、蛇毒等与由人或牛的血浆纯化出的凝血酶原作用而制备出的凝血酶，可以适当使用市售品。
[0055]
作为本发明涉及的纤维蛋白片，可举出在上述纤维蛋白凝胶中含有细胞的细胞片、在上述纤维蛋白凝胶中含有药剂的药剂片、在上述纤维蛋白凝胶中含有细胞和药剂的细胞/药剂片(本说明书中，根据情况将它们总称为“细胞片和/或药剂片”)。
[0056]
在本发明中，作为上述纤维蛋白凝胶中所含有的细胞，只要可进行细胞移植，就没有特别限制，可以根据目的来适当选择，可以为万能细胞、成体干细胞、前体细胞、和成熟细胞之中的任一者，可以为它们之中的仅1种，也可以为2种以上的组合。
[0057]
作为上述万能细胞，可举出例如，es细胞、gs细胞、和ips细胞。作为上述成体干细胞，可举出例如，间充质干细胞(msc)、造血干细胞、羊膜细胞、脐带血细胞、来源于骨髓的细胞、心肌干细胞、来源于脂肪的干细胞、和神经干细胞。作为前体细胞和成熟细胞，可举出例如，软骨细胞、软骨前体细胞、来源于滑膜的细胞、来源于脂肪的细胞、心肌细胞、血管内皮细胞，此外，可以为由上述万能细胞、成体干细胞、或前体细胞诱导的细胞(例如，来源于ips细胞的细胞(心肌细胞、血管内皮细胞)等)。作为上述细胞的来源，可举出人、和人以外的哺乳类(黑猩猩、猴等灵长类；牛、猪、马、鸡、猫、犬等家畜、宠物)、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类，可以为来源于移植纤维蛋白片的对象的自体细胞，也可以为来源于进行移植的对象以外的同种异体细胞。
[0058]
在上述纤维蛋白片为上述细胞片或上述细胞/药剂片的情况下，作为上述纤维蛋
白凝胶中所含有的细胞的含量(为2种以上的情况下为它们的合计含量)，优选相对于上述纤维蛋白片的体积100μl，以细胞数计为1
×
106～1
×
107个。另外，在上述纤维蛋白凝胶中，除了上述细胞(目标细胞)以外，还可以包含在分离时混入的细胞等。
[0059]
在本发明中，作为上述纤维蛋白凝胶中所含有的药剂，可举出例如，抗肿瘤剂(烷基化药、铂化合物、抗代谢药、拓朴异构酶(
ポイソメラーゼ
)抑制药、抗癌抗生素、微管作用抗癌剂等)、抗菌剂(青霉素系、头孢烯系、碳青霉烯系、氨基糖苷系、喹诺酮系、大环内酯系、四环素系、糖肽系等)、抗炎剂(类固醇、nsaids等)、抗病毒剂、激素等低分子药物；成骨因子、骨生长因子等生理活性肽；蛋白质；糖蛋白质；多糖类；核酸；营养(柠檬酸等)；维生素剂；阿片样物质，可以为它们之中的仅1种，也可以为2种以上的组合。
[0060]
在上述纤维蛋白片为上述药剂片或上述细胞/药剂片的情况下，作为上述纤维蛋白凝胶中所含有的药剂的含量(在为2种以上的情况下为它们的合计含量)，根据其使用的目的等来适当调整，因此不能一概而论，例如，相对于上述纤维蛋白片总量，优选为1～40质量％，更优选为1～30质量％，进一步优选为1～20质量％。
[0061]
作为本发明涉及的纤维蛋白片，除了上述纤维蛋白凝胶、上述细胞、和上述药剂以外，可以进一步含有其他成分。作为这样的其他成分，可举出来源于下述血纤蛋白原溶液、凝血酶溶液的溶剂的成分，具体为来源于注射用生理盐水、缓冲液(pbs等磷酸系缓冲液、柠檬酸系缓冲液等)、细胞培养培养基(dmem等)等溶剂的成分；下述血纤蛋白原溶液、凝血酶溶液的添加成分，具体为表面活性剂等助溶剂、血清白蛋白(人血清白蛋白等)、糖、糖醇、氨基酸(精氨酸、异亮氨酸、谷氨酸等)或其盐、柠檬酸钠、氯化钠等。此外，在上述纤维蛋白片为上述细胞片或上述细胞/药剂片的情况下，作为上述其他成分，也可举出构成细胞外基质的蛋白质和/或糖蛋白质(层粘连蛋白(例如，层粘连蛋白-221)等)、细胞生长因子。作为上述其他成分，可以为它们之中的单独1种，也可以为2种以上的组合。这些其他成分的组成和含量可以根据纤维蛋白片所含有的细胞、药剂和该其他成分的种类、该纤维蛋白片的使用目的等来适当调整。
[0062]
作为本发明涉及的纤维蛋白片，没有特别限制，例如，优选为成为100～300μl/1cm2左右的厚度，更优选厚度在1～3mm的范围内。然而，本发明涉及的纤维蛋白片通过将其叠层，可以形成所希望的厚度的3维生物体材料。此外，在本发明中，作为上述纤维蛋白片的面积，也没有特别限制，可以根据使用目的等来适当调整。
[0063]
(工序1)
[0064]
在本发明的纤维蛋白片的制造方法中，首先，在由明胶水凝胶形成的基材表面上，滴加含有选自细胞和药剂中的至少1种以及血纤蛋白原的血纤蛋白原溶液(工序1)。
[0065]
本发明涉及的基材由明胶水凝胶形成。在本发明中，所谓“明胶水凝胶”，是至少含有明胶和水的凝胶，在上述明胶分子间形成了交联。
[0066]
作为本发明涉及的“明胶”，只要具有交联性，就没有特别限制，可以为由牛、猪、鲸、鱼类等动物种的皮、骨、韧带、腱等制造的天然明胶，也可以为通过基因重组技术而制作的具有明胶类似的氨基酸序列的多肽或蛋白样物质(重组明胶)。此外，作为上述天然明胶，可以为来源于所谓的酸固化组织的a型明胶(等电点：8～9)，也可以为来源于所谓的石灰固化组织的b型明胶(等电点：4.8～5.0)。作为这样的明胶，可以适当使用市售品。
[0067]
在上述明胶水凝胶中，上述明胶分子间的交联也可以通过使用了交联剂等的化学
方法、使用了紫外线等的物理方法进行，但作为本发明涉及的明胶水凝胶，从利用加热的再熔解性的观点、基材表面的均匀性的观点考虑，优选为通过在将含有明胶和水的明胶水溶液加热后冷却的方法(热处理法)，而使上述明胶分子间形成交联而获得的物质。
[0068]
作为上述明胶水溶液，可举出例如，将明胶添加于水性溶剂而得的溶液，作为上述水性溶剂，可以使用至少含有水的溶剂，可举出例如，注射用蒸馏水、注射用生理盐水、缓冲液(pbs等磷酸系缓冲液、柠檬酸系缓冲液等)、细胞培养培养基(dmem等)，可以为它们之中的单独1种，也可以为2种以上的组合。它们之中，在本发明涉及的纤维蛋白片为上述细胞片或上述细胞/药剂片的情况下，作为上述水性溶剂，优选含有适于所含有的细胞的细胞培养培养基，更优选上述基材为至少含有明胶和上述细胞培养培养基的基材，即细胞培养用基材。
[0069]
作为上述明胶水溶液中的明胶的浓度，优选为1～12质量％，更优选为2～10质量％，进一步优选为3～8质量％。
[0070]
作为通过上述热处理法而制备上述明胶水凝胶时的条件，例如，优选将上述明胶水溶液在30～40℃、优选35～40℃下加热5～40分钟、优选10～30分钟后，在0～20℃、优选4～10℃下冷却5～120分钟、优选10～60分钟。作为上述加热方法，可举出例如，采用水浴、培养箱的方法，作为上述冷却方法，可举出在室温(25℃左右)环境或冷处静置的方法。
[0071]
上述明胶水凝胶例如通过在培养皿、多孔板、烧瓶、微载体等器材中放入加热后的上述明胶水溶液后冷却，从而可以在上述器材上获得。作为本发明涉及的基材，从操作容易性的观点考虑，优选直接使用这样的器材上的明胶水凝胶，但可以将上述明胶水凝胶从上述器材剥离而使用，也可以适当切断为所希望的大小后使用。
[0072]
本发明涉及的血纤蛋白原溶液含有选自细胞和药剂中的至少1种以及血纤蛋白原。作为上述细胞、药剂、和血纤蛋白原，包括其优选的方案在内如上所述。
[0073]
作为上述血纤蛋白原溶液中的细胞和药剂的含量，分别优选以所得的纤维蛋白片中的它们的含量成为上述优选的各含量范围内的方式适当调整。
[0074]
作为上述血纤蛋白原溶液中的血纤蛋白原的含量，以蛋白质量换算计，优选为0.4～2质量％，更优选为0.4～1质量％。如果上述血纤蛋白原的含量小于上述下限，则具有纤维蛋白凝胶的形成变得困难的倾向，另一方面，如果超过上述上限，则具有纤维蛋白凝胶的纤维蛋白浓度变高，使细胞含有的情况下生存变得困难的倾向。
[0075]
作为上述血纤蛋白原溶液的溶剂，可以使用通常作为使血纤蛋白原溶解的溶剂而使用的溶剂，可举出例如，注射用蒸馏水、注射用生理盐水、ph5～8的缓冲液(pbs等磷酸系缓冲液、柠檬酸系缓冲液等)、细胞培养培养基(dmem等)等水性溶剂，可以为它们之中的单独1种，也可以为2种以上的组合。它们之中，在上述纤维蛋白片为上述细胞片或上述细胞/药剂片的情况下，作为上述溶剂，优选含有适于所含有的细胞的细胞培养培养基。
[0076]
作为上述血纤蛋白原溶液，除了上述细胞、药剂、和血纤蛋白原以外，在不损害本发明的效果的范围内，可以进一步含有表面活性剂等助溶剂、血清白蛋白(人血清白蛋白等)、糖、糖醇、氨基酸(精氨酸、异亮氨酸、谷氨酸等)或其盐、柠檬酸钠、氯化钠、构成细胞外基质的蛋白质和/或糖蛋白质(层粘连蛋白等)、细胞生长因子等添加成分。
[0077]
作为在上述基材表面上滴加上述血纤蛋白原溶液的方法，没有特别限制，可举出例如，通过移液管滴加的方法、用注射器滴加的方法。作为此时的滴加量，从所得的纤维蛋
白片的均匀性的观点考虑，优选为60～180μl，更优选为80～160μl，进一步优选为100～140μl。
[0078]
(工序2)
[0079]
在本发明的纤维蛋白片的制造方法中，在工序1之后，在上述基材表面上的上述血纤蛋白原溶液中添加凝血酶(工序2)。作为上述凝血酶，包含其优选的方案在内如上所述。
[0080]
作为凝血酶对上述血纤蛋白原溶液的添加量，相对于血纤蛋白原100mg(蛋白质量换算)，优选为0.75～375单位(u)。如果上述凝血酶的添加量小于上述下限，则具有纤维蛋白凝胶的形成变得困难的倾向，另一方面，如果超过上述上限，则具有纤维蛋白凝胶的纤维蛋白浓度变高，使细胞含有的情况下生存变得困难的倾向。另外，在本发明中，凝血酶的定量法可以援用日本药典
“トロンビンの
定量法(凝血酶的定量法)”。
[0081]
在本发明中，作为凝血酶，可以作为含有凝血酶的凝血酶溶液而添加。作为上述凝血酶溶液的溶剂，可以使用通常使用的溶剂，可举出例如，注射用蒸馏水、注射用生理盐水、ph5～8的缓冲液(pbs等磷酸系缓冲液、柠檬酸系缓冲液等)、细胞培养培养基(dmem等)等水性溶剂，可以为它们之中的单独1种，也可以为2种以上的组合。它们之中，在上述纤维蛋白片为上述细胞片或上述细胞/药剂片的情况下，作为上述溶剂，优选含有适于所含有的细胞的细胞培养培养基。
[0082]
此外，作为上述凝血酶溶液，除了凝血酶以外，在不损害本发明的效果的范围内，可以进一步含有表面活性剂等助溶剂、血清白蛋白(人血清白蛋白等)、糖、糖醇、氨基酸(精氨酸、异亮氨酸、谷氨酸等)或其盐、柠檬酸钠、氯化钠、构成细胞外基质的蛋白质和/或糖蛋白质(层粘连蛋白等)、细胞生长因子等添加成分。
[0083]
作为在上述血纤蛋白原溶液中添加凝血酶的方法，没有特别限制，可举出例如，通过移液管将上述凝血酶溶液添加于上述血纤蛋白原溶液(优选为上述血纤蛋白原溶液的滴)的方法、使上述凝血酶溶液附着在下述支撑膜下表面后载置于上述血纤蛋白原溶液的上表面的方法、和将它们组合了的方法。作为此时的上述凝血酶溶液的添加液量，从所得的纤维蛋白片的均匀性的观点考虑，优选为1～25μl，更优选为2～20μl，进一步优选为2～15μl。
[0084]
在工序2中，上述血纤蛋白原溶液与上述凝血酶可以通过冲吸等进行搅拌，但作为添加了上述凝血酶的血纤蛋白原溶液(在本说明书中，根据情况而称为“纤维蛋白前体液”)，优选在上述基材上直接形成滴。在本发明中，作为“滴”，不覆盖基材表面全部，并且，滴的体积(μl)与基材的接触面积(mm2)之比优选为0.5μl/mm2以上，更优选为1μl/mm2以上。
[0085]
(工序3)
[0086]
在本发明的纤维蛋白片的制造方法中，使支撑膜与添加了上述凝血酶的血纤蛋白原溶液的上表面接触而载置该支撑膜(工序3)。在工序3中，仅将上述支撑膜以接触的方式载置于上述纤维蛋白前体液(优选为上述纤维蛋白前体液的滴)的上表面，就可以通过上述支撑膜的自重、和上述纤维蛋白前体液的滴与支撑膜之间的表面张力而将上述纤维蛋白前体液均匀地摊开，此外，可以使所得的纤维蛋白片与上述支撑膜之间密合。在工序2之后进行工序3的情况下，优选在工序2后，下述工序4的纤维蛋白片的形成同时进行，因此在该工序3中，优选在上述血纤蛋白原溶液中添加凝血酶之后立即、优选在5分钟以内、更优选在2分钟以内，使支撑膜载置于上述纤维蛋白前体液的上表面。此外，工序2(凝血酶对血纤蛋白
原溶液的添加)与工序3可以为同时，例如，通过使上述凝血酶溶液附着在上述支撑膜下表面后(优选滴加上述凝血酶溶液而摊开后)载置于上述血纤蛋白原溶液(优选为上述纤维蛋白溶液的滴)的上表面等，从而可以同时进行工序2和工序3。
[0087]
在本发明中，作为“支撑膜”，只要是可以支撑所得的纤维蛋白片，并维持其形状的膜，就没有特别限制，优选为在纤维蛋白片的使用时从该纤维蛋白片剥离容易的膜，此外，与上述纤维蛋白前体液相接的面优选为凹凸少的均匀的面。作为这样的支撑膜，可举出例如，聚丙烯片、聚乙烯、纸、钛、铝等金属、玻璃、和它们之中的2种以上的组合。它们之中，作为上述支撑膜，从表面的均匀性、操作的容易性、和与纤维蛋白片的剥离容易性的观点考虑，优选为聚丙烯片。
[0088]
此外，作为上述支撑膜，从通过其自重而获得适合厚度的纤维蛋白片的观点考虑，其每单位面积的重量优选为0.01～0.2g/cm2，更优选为0.01～0.1g/cm2，进一步优选为0.01～0.05g/cm2。
[0089]
作为上述支撑膜的面积，相对于上述纤维蛋白前体液的液量100μl，与这样的溶液相接的面的面积优选为50～200mm2，更优选为50～150mm2，进一步优选为75～100mm2。作为上述支撑膜的形状，没有特别限制，可以选择圆、椭圆、正方形、长方形等多边形、开了孔的形状、以弯折的方式在与纤维蛋白片相接的面相反侧的面引入了切口的形状等任意形状。通过使用在与纤维蛋白片相接的面相反侧的面引入了切口的形状的支撑膜，可以折叠纤维蛋白片，例如，能够以小切开而移植更大面积的纤维蛋白片。进一步，作为上述支撑膜的厚度，没有特别限制，但从操作容易性的观点考虑，优选为0.05～0.4μm。
[0090]
(工序4)
[0091]
在本发明的纤维蛋白片的制造方法中，在上述基材与上述支撑膜之间，通过血纤蛋白原与凝血酶的反应，而形成在纤维蛋白凝胶中含有上述选自细胞和药剂中的至少1种的纤维蛋白片(工序4)。作为上述纤维蛋白片、和其所含有的细胞、药剂、纤维蛋白凝胶、根据需要的其他成分，包含其优选的方案在内分别如上所述。在本发明中，通过工序2而开始纤维蛋白片的形成，因此工序4的一部分可以与工序2和/或工序3同时进行。
[0092]
在工序4中，作为血纤蛋白原与凝血酶的反应条件，例如，优选在4～25℃、优选4～20℃下静置5～20分钟，优选5～15分钟。通过使血纤蛋白原与凝血酶反应从而形成纤维蛋白凝胶，通过这样的工序4，可以在上述基材与上述支撑膜之间获得上述纤维蛋白片。
[0093]
(工序5)
[0094]
在本发明的纤维蛋白片的制造方法中，在工序4之后，在上述明胶水凝胶的熔解温度以上的温度使上述基材熔解，将被上述支撑膜支撑着的上述纤维蛋白片从上述基材分离(工序5)。
[0095]
在工序5中，作为使上述基材熔解的温度，只要是上述明胶水凝胶的熔解温度以上的温度、即构成该明胶水凝胶的明胶的凝固后熔解温度以上的温度即可。作为使上述基材熔解的温度，具体而言，从抑制细胞的死亡、药剂的失活的观点和使纤维蛋白片与基材的分离更容易的观点考虑，优选为30～40℃，更优选为35～40℃。此外，作为在上述温度下使上述基材熔解的时间，没有特别限定，例如，优选为10～60分钟，更优选为10～30分钟。
[0096]
在工序5中，作为使上述基材熔解的方法，没有特别限制，可举出例如，在水浴上、培养箱内，将上述工序4后的基材、纤维蛋白片、和支撑膜在上述条件下静置的方法。通过这
样的工序5，构成上述基材的明胶水凝胶熔解，因此上述纤维蛋白片与上述基材表面的粘接被解除，通过回收上述支撑膜，从而可以回收被叠层并担载于上述支撑膜的上述纤维蛋白片。
[0097]
根据本发明，即使纤维蛋白浓度为细胞能够生存的程度的低浓度，也能够简便地制造纤维蛋白片，因此在上述纤维蛋白片为上述细胞片或上述细胞/药剂片的情况下，可以在纤维蛋白片内使细胞在生存的状态下含有。此外，在纤维蛋白浓度为低浓度的纤维蛋白片内，能够进行细胞的移动，因此根据本发明，能够制成细胞被3维分散了的纤维蛋白片、使细胞集聚于片表层的纤维蛋白片。
[0098]
通过本发明而获得的纤维蛋白片可以直接作为细胞片和/或药剂片而使用，可以适合用于采用细胞移植的疾病的治疗(细胞补充疗法)、外科手术中的切开部和/或病变除去后的组织缺损部的补缀/增强。此外，关于通过本发明而获得的纤维蛋白片，也可以将其叠层而制成3维生物体材料，也可以用于移植、药物开发研究等。
[0099]
作为使用了通过本发明而获得的纤维蛋白片的治疗方法的一例，以下举出使用了通过本发明的制造方法而获得的细胞片的、采用细胞移植的心脏病的治疗方法为例进行说明。此外，作为使用了通过本发明而获得的纤维蛋白片的治疗方法，此外，例如，从对缺损组织/功能降低脏器的细胞补充、增强这样的观点考虑，肝硬化、病毒性肝炎等肝功能降低、消化道溃疡、消化道穿孔、上皮溃疡、上皮缺损、角膜损伤、伴随血管/脏器损伤的出血部位的止血也能够成为治疗对象。
[0100]
作为成为进行上述治疗方法的对象的“心脏病”，可举出例如，选自心力衰竭、缺血性心脏病、心肌梗死、心肌病、心肌炎、肥厚型心肌病、扩张期肥厚型心肌病、和扩张型心肌病中的疾病。
[0101]
上述心脏病的治疗方法可以对人和人以外的对象应用。成为应用对象的生物只要具有作为治疗目标的心脏，就没有特别限制，可举出例如，人、人以外的哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类。作为人以外的哺乳类，除了黑猩猩、猴等灵长类以外，还可举出例如，牛、猪、马、鸡、猫、犬等家畜、宠物，但不限制于它们。作为上述细胞片所含有的细胞，只要使用适合于成为这些治疗的对象的生物的来源的细胞即可，但从排斥反应的抑制等观点考虑，优选为同种来源、特别优选为自体来源的细胞。
[0102]
在上述心脏病的治疗方法中，优选用上述细胞片被覆罹患了心脏病的对象的心表面(优选为病灶(例如，心肌梗死灶))。在上述细胞片向心表面的移植中，由于该细胞片为纤维蛋白片，因此可以通过将该细胞片粘贴于心表面而容易地固定。
[0103]
上述心脏病的治疗方法可以与其他治疗适当联合使用。作为这样的其他治疗，例如，在慢性心肌梗死中，可举出冠状动脉搭桥手术、经皮腔内冠状动脉成形术、左室成形术等，在急性心肌梗死中，可举出冠状动脉搭桥手术、经皮腔内冠状动脉成形术等。除此以外，也可以与瓣置换术、幼儿心脏手术联合使用。
[0104]
实施例
[0105]
以下说明本发明的实施例，但本发明不受这些实施例任何限制。
[0106]
(实施例1)
[0107]
＜材料＞
[0108]
ips-cms：来源于人ips细胞的心肌细胞
[0109]
dmem：dmem高葡萄糖(nacalai tesque，code 08458-16)，
[0110]
pbs：d-pbs(-)(nacalai tesque，code 14249-24)，
[0111]
明胶：来源于猪皮的明胶(sigma，g1890-100g)，
[0112]
血纤蛋白原：beriplast p combi-set溶液a(csl behring，87799)，
[0113]
凝血酶：beriplast p combi-set溶液b(csl behring，87799)，
[0114]
聚丙烯片(pp片)：面积：10mm
×
10mm，厚度：0.3μm。
[0115]
＜纤维蛋白片的制造＞
[0116]
首先，将明胶1.6g添加于40ml的dmem，用37℃的水浴使其熔解10～20分钟，制作出4w/v％(g/ml％，以下同样)明胶溶液。接着，在6孔板的各孔中加入上述明胶溶液各3ml，在4℃下冷却20分钟而使明胶水凝胶形成，制作出由明胶水凝胶形成的基材。此外，用70μm的过滤器除去异物，将混合了利用离心而调整了浓度的ips-cms 100μl(5
×
106细胞)、将beriplast p溶液a用dmem进行了2倍稀释的血纤蛋白原10μl、和pbs 10μl的血纤蛋白原溶液120μl混合，立即迅速地滴加在上述基材表面(约4℃)上(工序1)。接着，将beriplast p溶液b(0.03u/μl)用dmem进行了10倍稀释的凝血酶溶液2μl添加于上述基材表面上的血纤蛋白原溶液(工序2)，以与添加了上述凝血酶溶液的血纤蛋白原溶液的上表面接触的方式，迅速地载置聚丙烯片(支撑膜)(工序3)。将其在4℃下静置10分钟，确认了上述血纤蛋白原溶液变硬而形成了纤维蛋白凝胶(纤维蛋白片)(工序4)后，在37℃培养箱内使由上述明胶水凝胶形成的基材熔解20分钟(工序5)，与聚丙烯片一起回收了上述纤维蛋白凝胶(在纤维蛋白凝胶中含有细胞数为5
×
106的ips-cms的纤维蛋白片)(工序6)。所得的纤维蛋白片的面积为1cm2，厚度为约1.2mm。将工序4中的基材、纤维蛋白片、和支撑膜的形态示于图1中，将工序5中的熔解基材、纤维蛋白片、和支撑膜的形态示于图2中。进一步，将在工序6中获得的纤维蛋白片的形态示于图3中。如图3所示那样，所得的纤维蛋白片为没有凹凸的均匀的片。此外，在所得的纤维蛋白片中，细胞集聚于表层，形成了100～150μm厚的组织。
[0117]
进一步，使上述血纤蛋白原溶液和凝血酶溶液增量并且使聚丙烯片的面积变大，确认了面积大的纤维蛋白片也可以同样地而均匀地获得。将使面积大而获得的纤维蛋白片的形态示于图4中。
[0118]
＜纤维蛋白片的评价＞
[0119]
在使裸大鼠心肌梗死模型发生心肌梗死后2周后，将上述纤维蛋白片粘贴于心肌的旁梗死部位的表面而进行了移植。移植后每隔1周利用超声心动图显象进行了心功能(收缩能、收缩末期直径、舒张末期直径)的评价直到第4周。此外，通过qpcr测定了移植后第4周的旁梗死部位中的vegf(细胞因子)基因的表达量。
[0120]
在图5中，显示移植了上述纤维蛋白片的裸大鼠心肌梗死模型(移植组n：8)和未移植的裸大鼠心肌梗死模型(对照n：5)中的心功能的评价结果。图5的纵轴(ef(％))为左室射血分数(ejection fraction)。如图5所示那样，对于移植了上述纤维蛋白片的大鼠(移植组)，在移植后4周期间确认到心功能的显著的改善。
[0121]
此外，在图6中显示移植了上述纤维蛋白片的裸大鼠心肌梗死模型(移植组n：8)和未移植的裸大鼠心肌梗死模型(对照n：5)中的vegf基因的表达量的测定结果。图6的纵轴显示相对于对照组的vegf基因的表达量。如图6所示那样，对于移植了上述纤维蛋白片的大鼠(移植组)，在旁梗死部位中，确认到作为与血管新生相关的细胞因子的vegf基因的表达的
增强。此外，在上述移植组中，确认到旁梗死部位中的心肌的大小显著小，抑制了心肌的肥大，进一步，也确认了血管新生提高了。
[0122]
产业可利用性
[0123]
如以上说明的那样，根据本发明，能够提供即使纤维蛋白浓度为细胞能够生存的程度的低浓度，也能够在抑制对细胞和药剂带来的损伤的同时，均匀并且以任意的形状简便地制造在纤维蛋白凝胶中含有选自细胞和药剂中的至少1种的纤维蛋白片的、纤维蛋白片的制造方法。