一种体外培养软骨细胞和软骨以获得治疗关节软骨缺损材料的方法与流程

1.本发明涉及一种用于治疗人类或动物组织如软骨，特别是受损组织的新方法。本发明尤其涉及一种获得治疗受损组织的材料的方法，其中受损组织例如为任何软骨损伤，特别是由于外伤或退行性软骨损伤引起的软骨损伤。


背景技术：

2.骨关节炎(oa)是一种退行性关节疾病，其特征是由于关节软骨的进行性和不可逆的损失所的导致关节疼痛和功能障碍。它是美国人口中第五大致残原因，仅次于心血管、脑血管和呼吸系统疾病。oa的主要风险因素是年龄。还有其他因素，例如肥胖、关节损伤、剧烈的体力活动，例如竞技体育。
3.在许多国家，诊断出的oa病例数量仍在增长，例如1995-2005期间，美国新增约600万例新病例(lawrence rc,felson dt,helmick cg,et al.estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the united states.part ii.arthritis rheum.2008；58(l):26-35；lawrence rc,helmick cg,arnett fc,et al.estimates of the prevalence of arthritis and selected musculoskeletal disorders in the united states.arthritis rheum.1998；41:778-799)。与此同时，普通人群中患有退行性疾病和风湿性疾病的人越来越多。到2030年，美国的退行性疾病确诊病例数预计将达到6700万，占成年人口的25％，其中2500万或9.3％的成年人口将出现行动不便(hootman jm,helmick cg.projections of u.s.prevalence of arthritis and associated activity limitations.arthritis rheum.2006；54:226-229)。这些趋势导致生活质量下降，同时导致医疗保健系统成本大幅增加。
4.几乎每个因广泛退行性关节病变接受手术治疗的患者，这里的关节尤其是膝关节、髋关节、肩关节和踝关节，都会经历这样一段时期，即软骨关节表面的破坏仅限于单个部位，然后才会发展为全身性关节病变。它是退化过程缓慢蔓延到关节的根源。由于患者可以接触到高度专业化的诊断工具(如mri和关节镜检查)，因此检测炎症灶所需的时间也减少了。目前，无法根据x射线图像上可见的放射学变化水平来诊断骨关节炎-它们通常覆盖关节的重要部分并且需要使用全关节假体进行治疗。然而，由于缺乏适当的工具来治疗中小型关节软骨损伤，患者仍然不能想着避免关节成形术。因此，下一阶段的治疗是部分或表面关节成形术，不幸的是，这并不能保证患者无需重复多次进行这种手术就可以完全康复。
5.全内置假体仍然不能解决患者的活动能力、体质问题，也不能预防术后并发症。假体置换术后患者的体能在3个月内明显下降，患者很少能完全恢复。通过疼痛减轻程度和手术肢体功能改善程度来衡量的患者满意度水平各不相同。关节成形术的主要术后问题包括疼痛程度、肢体功能以及对手术本身效果的接受程度。关节切除是指关节的彻底破坏——下一步只能是更广泛的组织切除和植入更大的植入物——这通常会在第二次或第三次手术后导致永久性残疾。
6.关节治疗中新开发的方法之一是自体软骨细胞植物(aci)，它包括从关节未受损部分收集患者的软骨片段，分离软骨细胞，在体外繁殖，然后将软骨细胞悬液植入在软骨损伤部位。
7.然而，目前可用的方法不允许获得具有与天然组织非常相似的适当结构和生物学特征的组织。
8.可用的方法，包括胶原基质上的软骨细胞移植，与长期的治疗和恢复有关。这些可用的方法的失败率通常高达50％以上，这是因为缺损没有被均质组织取代，而只是部分被其成分取代。手术的价格非常高。治疗效益价格比似乎对患者不利。
9.用于自体移植的体外软骨细胞培养的已知方法，即培养物中的细胞增殖和对关节的悬浮培养物的施用不能保证关节的恢复，并且与传统的手术方法相比成本高且效果有限。很难在体内重建组织。因此，它们主要适用于轻伤的治疗。本发明解决了上述问题。
10.可用的软骨细胞培养物不允许繁殖的细胞转化为软骨组织。这是由于难以建立细胞间连接——这需要时间、细胞营养的理想条件以及机械限制。
11.由于上述原因，寻求新的有效治疗方案。本发明人已经发现了基于细胞培养的有效方法，尤其在从细胞培养获得材料的移植领域中基于细胞培养的方法，所述移植例如为自体软骨细胞移植。本发明尤其提供了一种体外培养软骨细胞的方法，该软骨细胞可用于上述早期疾病的移植方法中，因此降低了需要手术的风险，从而减少了术后并发症，此外，与现有技术方法相比，发现的方法对医疗保健系统的负担更轻。


技术实现要素：

12.第一方面，本发明提供了一种在体外生产软骨组织植入物的方法，其特征在于以下特征：
13.i)提供至少第一和第二软骨组织碎片，每个碎片具有至少一个边缘；
14.ii)将片段置于培养基中，使得第一碎片的至少一个边缘与第二碎片的至少一个边缘间隔开1cm或更小的距离；
15.iii)将软骨细胞悬液添加到碎片中；和
16.iv)在细胞培养条件下培养碎片和软骨细胞。
17.第二方面，本发明涉及可通过第一方面所述的方法获得的用于修复有需要的患者组织的组织植入物。
18.第三方面，本发明涉及可通过根据第一方面的方法获得的用于治疗患有疾病的患者的受损组织的组织植入物。
附图说明
19.接下来对本说明书中包含的附图内容进行说明。在本文中，还请参考上文和/或下文对本发明的详细描述。
20.图1：优选部分和布置示例。a)直线部分；b)直线部分c)拱形部分d)角和几何组织碎片，它们的组合。
21.图2：非首选废料排列示例-沿切向部分的整个长度边缘不互补，并且组织边缘之间存在较大空间。缺点：填充空间比较困难，机械阻力降低。
klbl,h.eds.(1995),helvetica chimica acta,ch-4010basel,switzerland)以及如下所述"pharmaceutical substances:syntheses,patents,applications"by axel kleemann and jurgen engel,thieme medical publishing,1999；the"merck index:an encyclopedia of chemicals,drugs,and biologicals",由susan budavari et al.编写,crc press,1996,和the united states pharmacopeia-25/national formulary-20,published by the united states pharmcopeial convention,inc.,rockville md.,2001”。
27.在整个说明书和所附的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则“包含”一词以及诸如“包含”和“包括”之类的变体将被理解为暗示包含所陈述的整数或步骤或整数组或步骤，但不排除任何其他整数或步骤或整数或步骤组。在以下段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非清楚地指出相反意见，否则如此定义的每个方面可以与任何其他一个方面或多个方面组合。特别地，指示为可选、优选或有利的任何特征可以与指示为可选、优选或有利的任何其他一个或多个特征组合。
28.下面将描述本发明的要素。这些要素以具体实施例列出；然而，应当理解，这些要去可以以任何方式和任何数量组合以创建附加实施例。各种描述的示例和优选实施例不应被解释为将本发明仅限于明确描述的实施例。该描述应被理解为支持和涵盖将明确描述的实施例与任何数量的公开和/或优选元件组合的实施例。此外，除非上下文另有说明，否则本技术中所有描述的元素的任何排列和组合都应该被认为是由本技术的描述所公开的。
29.定义
30.在下文中，提供了本规范中经常使用的术语的一些定义。这些术语在其使用的每种情况下，在说明书的其余部分中将具有分别定义的含义和优选含义。
31.如在本说明书和所附权利要求中使用的，除非内容另有明确规定，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物。如本文所用，“细胞培养”或“细胞培养条件”是指细胞在其自然环境之外的受控条件下生长的过程。具体而言，它是指来源于多细胞真核生物的细胞的生长，多细胞真核生物尤指动物细胞(另见下文细胞的定义)。典型的生长条件包括35℃-38℃之间的温度、3-7％co2和高于80％、优选90-99％的相对湿度。本发明的细胞培养物可以包含细胞和组织。术语“细胞培养基”、“培养基”或简称“培养基”是指用于支持细胞和/或组织，尤其是源自多细胞真核生物的细胞，特别是动物细胞和/或动物组织，的存活或生长的液体或凝胶。此类培养基包含支持此类细胞和/或组织存活或生长至少1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天所需的所有营养素。术语“细胞培养基组合物”是指细胞培养基所包含的成分。这些成分不一定都是营养素，也可能有其他用途，例如调整细胞培养条件，例如在所需范围内的ph值或同渗重摩。此外，这些成分不一定都是支持细胞存活或生长或重组蛋白生产所必需的，但有些成分可能是可有可无的，但仍能改善支持细胞存活或生长或重组蛋白生产的培养基。细胞培养基组合物可以是干粉组合物、液体组合物或固体(例如凝胶或琼脂)组合物。在一个特定实施例中，该组合物是无菌的，即它不含所有形式的生命和/或感染/复制剂，例如真菌、细菌、原生动物、寄生虫、病毒、异常蛋白质例如朊病毒等。
32.细胞培养的培养基可以包含盐、氨基酸、其他成分，例如半乳糖、硫酸葡聚糖、亚精胺、β-甘油磷酸酯和腺嘌呤；和缓冲液。盐可以选自氯化钙、磷酸钠、柠檬酸铁-(iii)铵、硫
酸镁、氯化钾、碳酸氢钠、亚硒酸钠、硫酸锌和氯化钠。氨基酸可以选自精氨酸、天冬酰胺酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、青霉胺、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、胱氨酸、甘氨酸和鸟氨酸。维生素可以选自l-抗坏血酸盐、d-(+)生物素、d-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺素和维生素b12。其他成分可以选自右旋糖、谷胱甘肽、次黄嘌呤、硫辛酸、乙醇胺、尿苷、精胺、普朗尼克f68、腐胺、胸苷、丙酮酸钠、半乳糖、葡聚糖硫酸盐、亚精胺、β-甘油磷酸酯和腺苷。缓冲液可以选自hepes、mops、mes、bes、mopso、aces、taps、甘氨酸、tricine。此外，培养基可以包含生长因子，例如包含在人和/或小牛血清中，优选fbs。或者，培养基可以不含血清。
33.术语“不含”是指培养基不含某些组分，这些组分通常是本领域细胞培养基的成分。一般而言，它指的是这些组分并未被有意地制成组合物的一部分，并且它包括污染的可能性，例如由于处理培养基、其容器或用于处理培养基或其容器的工具而造成的污染。特别地，它排除了这些组分的所有可测量的痕量，例如通过现有技术的方法如色谱法，特别是高效液相色谱法(hplc)测量。
34.术语“血清”是指含有电解质、抗体、抗原、激素和外源性物质以及血液中包含的所有其他物质的血液部分，除了血细胞、凝血因子和所有其他参与血液凝固或凝血的蛋白质(前提是它们形成血凝块的一部分)。具体而言，该术语是指通常用于细胞培养应用的血清，例如牛、鸡、山羊、人、绵羊、猪或兔血清。
35.具体而言，该术语指的是未定义的(就其组成和/或其组分的浓度而言未定义或已知的)细胞培养组分。因此，它的排除不排除本发明的培养基组合物的任何组分，尤其是如本文所述的，即使血清可能含有这些组分中的一种或多种。
36.如本文所用，“单层培养”是一种培养类型，其中细胞在含有培养基的烧瓶或培养皿上以单层生长。“悬浮培养”是一种培养类型，其中细胞在培养基中保持悬浮状态，以便它们在其中均匀分布。术语“蛋白质”是指包含一种或多种多肽的生物分子。多肽是通过肽键连接的氨基酸的单个线性聚合物链，肽键为例如长度为至少50、60、70、80、90或100个氨基酸。
37.如本文所用，疾病或病症的“治疗”或“疗法”是指完成以下一项或多项：(a)降低病症的严重性；(b)限制或预防所治疗疾病特征性症状的发展；(c)抑制所治疗疾病特征性症状的恶化；(d)限制或预防先前患有该疾病的个体的疾病复发；(e)限制或预防先前有该疾病症状的个体的症状复发。
38.如本文所用，“细胞”或“组织”可以是动物或人类细胞或组织。动物细胞或组织可以是灵长类动物、小鼠、大鼠、兔、狗、猫、仓鼠、牛、昆虫等的细胞或组织。细胞可以是悬浮细胞或贴壁细胞。悬浮细胞是可以在悬液中自然存活的细胞(即不附着在表面上)，或经过修饰以能够在悬浮培养物中存活，以例如生长到比贴壁条件能够允许的更高密度的细胞。贴壁细胞是需要表面的细胞，例如组织培养塑料或微载体，其可以涂有细胞外基质成分(例如胶原蛋白和层粘连蛋白)以增加粘附特性并提供生长和分化所需的其他信号。在一个实施例中，贴壁细胞是单层细胞。例如，细胞选自软骨细胞、杂交瘤细胞、原代上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、单核细胞/巨噬细胞、淋巴细胞、造血干细胞、成纤维细胞和肝细胞。更具体地，它可以是选自异源、同源和自体软骨细胞的软骨细胞。具体而言，它是一种自体软骨
细胞。特别地，该组织是软骨组织，更具体地，透明软骨组织。
39.如本文所用，“组织碎片”是一块组织。在本发明的上下文中，在形状上彼此“互补”的组织碎片是指可以以类似锁和钥匙的方式放在一起的碎片，或者换言之，因为它们的形状而像拼图。“互补”形状是指组织碎片的边缘，它们是平行的，因此特别很好地拼凑在一起。
40.如本文所用，“植入物”或“组织植入物”是用于器官移植的生物医学组织。生产这种植入物是为了替换缺失的生物结构、支持受损的生物结构或增强现有的生物结构。与身体接触的植入物表面可能由生物医学材料制成，例如钛、硅树脂或磷灰石。在本发明的一个实施例中，组织植入物由通过用组织培养细胞获得的组织制成，其中细胞优选地是软骨细胞并且组织优选地是软骨。
41.本发明的若干方面和优选实施例。
42.在下文中更详细地定义了本发明的不同方面。如此定义的每个方面可以与任何其他方面或多个方面组合，除非明确指出相反。特别地，被指示为优选或有利的任何特征可以与被指示为优选或有利的任何其他一个或多个特征组合。
43.在达成本发明的工作中，令人惊讶地表明可以通过体外方法生产组织植入物，该方法包括培养软骨和软骨细胞，软骨和软骨细胞可以有效地用于早期疾病移植的方法中，因此，减少了需要手术的风险，从而减少了术后并发症，此外，与现有技术方法相比，所发现的方法对医疗保健系统的负担更低。第一方面，本发明提供了一种体外制备软骨组织植入物的方法，其特征在于以下几个特征：
44.i)提供至少第一和第二软骨组织碎片，每个碎片具有至少一个边缘；
45.ii)将片段置于培养基中，使得第一碎片的至少一个边缘与第二碎片的至少一个边缘间隔开1cm或更小的距离；
46.iii)将软骨细胞悬液添加到碎片中；和
47.iv)在细胞培养条件下培养碎片和软骨细胞。
48.关于软骨组织碎片的术语“边缘”是指软骨组织碎片的外部界限。边缘可能是软骨组织的自然外部界限，也可能是用手术刀切割分离的软骨组织所得到的边缘，在这种情况下，边缘是人造边缘。由于边缘围绕整个软骨碎片，因此边缘可能在其整个长度上都是天生的(在这种情况下，“碎片”并不是真正的碎片，而是自然发生的一块软骨组织。或者，边缘可能部分是天然来源，部分是人造来源，或者可能完全是人造的。如果从较大的软骨组织中切下软骨碎片，则边缘完全是人造的。如果在手术过程中从一大块软骨组织上切下该碎片或在手术摘除后将该大块软骨切成两个或多个碎片时，可能就是这种情况。可以将软骨组织从接下来要治疗的患者身上取出(自体软骨)或可以来自不同的人-供体-(异源软骨)。因此，在本发明的上下文中使用的术语“边缘”也指软骨组织碎片的边缘的一部分。优选地，彼此邻近放置的两个碎片边缘的部分具有对应的形状，例如两个边缘的部分是直的或一个向内弯曲，另一个向外弯曲。
49.如上所述，术语“软骨组织碎片”可以指天然存在的一块软骨组织或已经被切割成比天然存在的尺寸更小的软骨组织。软骨碎片可具有其自然厚度，优选在0.01mm至10mm之间，更优选在0.1至6mm之间。在某些情况下，最好从一块较厚的天然软骨组织上切下较薄的软骨片。这种软骨碎片的厚度优选在0.1mm至5mm之间、更优选0.1至4mm之间、更优选1至3mm
之间。更优选的是，碎片的厚度在整个碎片上基本上是均匀的。
50.可用于本发明方法的优选软骨来源是异源或自体来源，优选自体来源。优选地，来源是任何关节，更优选地是被治疗者的受损关节。优选地，其中组织源是健康组织源。
51.在步骤ii)中，第一碎片的至少一个边缘与第二碎片的至少一个边缘之间的空间为0.9cm、0.8cm、0.7cm、0.6cm、0.5cm、0.4cm、0.3cm、0.2cm,0.1厘米。优选地，空间小于等于0.5cm，优选地小于等于0.1cm，优选没有空间。
52.在步骤iii)中，软骨细胞是异源的、同源的或自体的软骨细胞。优选地，软骨细胞是自体软骨细胞。
53.在第一方面的优选实施例中，碎片的边缘，优选地如果它们彼此接触，则沿着切向部分接触，优选地在如图1所示的布置中的一个中。优选地，接触的切向部分的长度至少为0.1cm，更优选至少为0.5cm，更优选至少为1cm。
54.在优选实施例中，至少三个、更优选至少四个、至少五个或至少六个碎片如上文针对第一和第二碎片所示的那样间隔开。通过这种方式，可以从几个碎片中生成更大的软骨片。
55.在一个优选的实施例中，培养基包含一种或多种盐、氨基酸、其他组分，例如半乳糖、硫酸葡聚糖、亚精胺、β-甘油磷酸酯和腺嘌呤；和缓冲液。
56.该盐可以选自氯化钙、磷酸钠、柠檬酸铁-(iii)铵、硫酸镁、氯化钾、碳酸氢钠、亚硒酸钠、硫酸锌和氯化钠。
57.氨基酸可以选自精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、青霉胺、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、胱氨酸、甘氨酸和鸟氨酸。
58.维生素可以选自l-抗坏血酸盐、d-(+)生物素、d-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺素和维生素b12。
59.其他组分可以选自右旋糖、谷胱甘肽、次黄嘌呤、硫辛酸、乙醇胺、尿苷、精胺、普朗尼克f68、腐胺、胸苷、丙酮酸钠、半乳糖、葡聚糖、亚精胺、β-甘油磷酸酯和腺苷。
60.缓冲液可以选自hepes、mops、mes、bes、mopso、aces、taps、甘氨酸和tricine。
61.此外，培养基可以包含生长因子，例如包含在人和/或小牛血清中，优选fbs。或者，培养基可以不含血清。在一个优选的实施例中，培养基还包含胰岛素生长因子(igf)和/或转化生长因子(tgf)，以及任选的软骨素和/或胰岛素。优选地，培养基包含至少0.01wt％的igf，和/或至少0.01wt％的tgf，和可选地至少0.01wt％的软骨素和/或至少0.1wt％的胰岛素。优选地，培养基包含至少0.01wt％的igf、至少0.01wt％的tgf、至少0.01wt％的软骨素和至少0.1wt％的胰岛素。
62.在一个优选的实施例中，在步骤(ii)之后将碎片在培养基中培养至少14天，然后在步骤(iii)中加入软骨细胞悬液。优选地，将碎片培养14-18天，优选18-25天，优选25-30天，优选30-42天和至多至少五个月。
63.在一个优选的实施例中，在第一方面的方法的步骤(iii)中将软骨细胞添加到培养基中至终浓度为每ml培养基有至少4,000个，优选4,000个至0,000个，优选10,000个至40,000个，优选16,000个至40,000个软骨细胞。优选地，在第一方面的方法的步骤(iii)中添加到培养基中的软骨细胞的最终浓度为每ml培养基16,000个软骨细胞。
64.在一个优选的实施例中，通过酶消化，优选通过用蛋白酶消化获得软骨细胞的悬液。优选地，酶消化是用胶原酶、胰蛋白酶、透明质酸酶和/或甲苯磺酰氯甲烷，更优选用胶原酶，甚至更优选用胶原酶ii进行的。
65.在一个优选的实施例中，软骨细胞悬液在悬浮之前培养在粘附单层中。优选地，培养温度为35-38℃和/或co2浓度为4-6％，更优选温度为37℃且co2浓度为5％。
66.在一个优选的实施例中，第一碎片的一个边缘与第二碎片的一个边缘互补，例如，第一碎片的一个边缘刚好适合于第二碎片的一个边缘，类似于锁和钥匙模型。碎片的形状可以是椭圆形、圆形、正方形、矩形或大块，形状优选为椭圆形。碎片的至少一个边缘的形状可以是弯曲的或笔直的，优选笔直的。
67.第二方面，本发明提供了一种可通过根据本发明第一方面所述的方法获得的组织植入物，用于修复有需要的患者的组织，优选地，其中待修复的组织是受损组织，更优选地是受损软骨组织。
68.第三方面，本发明提供可通过根据本发明第一方面所述的方法获得的组织植入物，用于治疗患有疾病的患者的受损组织。优选地，所述疾病包括关节疾病，例如骨关节炎、类风湿性关节炎、脊柱关节炎、幼年特发性关节炎狼疮、痛风和滑囊炎。优选地，该疾病是骨关节炎。
69.在一个优选的实施例中，治疗包括将组织植入物植入缺损部位。换言之，在实验研究的结果中，开发了一种透明软骨细胞培养的方法，以获得用于治疗软骨病症的材料。开发了一种方法，包括同时使用天然组织碎片进行培养，在体外将这些天然组织碎片组合成较大的碎片和软骨细胞悬液，作为连接组织碎片的粘合剂。
70.因此，进行了适当计划的实验研究，以开发进行软骨细胞培养的方法，除此之外，还测试了各种细胞密度、连接碎片的接触面长度、各种类型的补充剂和培养基，以产不容易被破坏的细胞间连接。
71.根据本发明，细胞在粘附到培养基的表面，例如培养板的同时生长和分裂。仅当它们从表面剥离到通道时它们才处于悬浮状态，并且当它们悬浮在培养基中时，它们用于淹没组织。
72.本发明涉及允许体外培养细胞和组织碎片的方法，从而可以获得接近天然形式的软骨组织，而不是如现有技术中所知的，为放置在基质中的细胞或细胞悬液形式。在体外培养细胞和透明软骨碎片，并将获得的组织形式的材料植入缺损部位。本发明在于从患者关节中负荷较少或未负荷的位置收集较小的正常软骨组织碎片，然后将它们置于适合细胞/组织培养的培养基中，在培养过程中，通过将至少两个，优选至少三个至十个组织碎片近距离放置使较小的碎片合并为具有较大表面的补片，使每个碎片的至少一个边缘与另一个接触。至少两个，优选至少三个到十个组织碎片的平行边缘根据它们的形状匹配，从而可以通过沿着接触部分将匹配的边缘连接在一起来连接补片，其中整个边缘的碎片平行布置。
73.根据本发明，进行体外软骨细胞培养以获得用于治疗关节软骨缺损的材料的方法包括将获得的透明软骨切割成至少两个组织碎片并将这些碎片彼此相邻地放置在培养板上，在含有至少2mm谷氨酰胺、至少2％fbs、至少4.5g/1葡萄糖的培养基中，具有匹配的组织碎片形状至少沿着每个碎片的边缘的一部分，
74.使得在将碎片紧密排列后，至少两个组织碎片之间的空间尽可能小，使得充满组
织碎片的培养板的面积尽可能小。将边缘调整成在培养过程中，碎片至少沿着与另一部分接触的部分连接在一起。将软骨细胞悬液添加到培养物中并培养具有软骨细胞的组织碎片。通过将软骨细胞添加到培养基中，在设定的时间段内更换培养基，并培养细胞直到组织碎片与同另一个部分接触的部分的至少一部分接合。优选地，至少两个接合的组织碎片之间的切向截面最小为0.1cm，最优选地至少为0.5cm。优选地，组织碎片应该具有类椭圆形状。优选地，选择组织碎片的形状以使培养中的组织碎片沿着切向部分彼此非常紧密地粘附。
75.优选地，培养基含有浓度为最低0.01％的igf和/或0.01％tgf和/或0.01％软骨素和/或最低0.1％胰岛素的补充剂。优选地，培养基含有55-75mg/1丙酮酸钠和碳酸氢钠，2mm-4mm谷氨酰胺，2％-10％fbs，和至少4.5g/1葡萄糖以及乙醇胺和/或谷胱甘肽和/或抗坏血酸和/或胰岛素和/或转铁蛋白和/或硫酸铜和/或氯化锰。
76.优选地，在加入软骨细胞之前，组织碎片本身在培养基中培养，优选至少培养14天，之后将软骨细胞加入培养物中。优选地，将软骨细胞悬液以这样的量添加到组织碎片中，即每2.5ml培养基中存在至少40,000个软骨细胞。优选地，用于培养具有0.1cm-1cm切向部分长度的两个碎片的最小软骨细胞浓度为每2.5ml培养基存在40,000个软骨细胞。
77.优选地，培养的软骨细胞通过酶消化获得，之后通过在贴壁培养中单层培养软骨细胞获得所需数量的细胞。优选地，细胞在37℃和5％co2中培养。
78.在实验研究过程中，确定沿连接边缘的最小切向部分，即切向部分，必须至少为0.1cm长；边缘可以沿着平行部分靠得更近。切向部分可以是组织补片边缘的片段或组织补片的整个边缘。要连接的边缘应该是直的或圆的。在培养过程中，使用从同一供体的组织获得的软骨细胞悬浮培养物组合补片。软骨含有软骨细胞和细胞外基质。重要的是选择组织碎片的形状-补片，以便软骨碎片的连接边缘之间的空间尽可能小-边缘或边缘碎片应沿着至少0.1cm长的部分相互接触。在添加软骨细胞之前，最晚在将其放置在培养板的最近附近阶段需要匹配补片-组织碎片的切向边缘的形状。
79.由于这一点，培养允许获得透明软骨，而不仅仅是细胞。在培养的组织补片的连接处，获得的组织可能具有机械强度较弱或成熟度较低的特点，但它将是具有细胞间连接提供的坚固结构的组织。
80.根据本发明，该过程包括：
81.1.从患者身上采集透明软骨
82.2.将组织切割成适当的补片-碎片
83.3.对一些补片进行酶消化，获得软骨细胞并建立细胞培养物-软骨细胞培养物
84.4.将剩余的补片(未消化)置于培养基中-培养加入软骨细胞的组织碎片
85.5.在培养物中获得适量的软骨细胞后，获得细胞用于组织和细胞碎片的联合培养，同时细胞允许连接未消化的组织补片
86.6.将悬浮的软骨细胞与组织碎片一起添加到培养板中。
87.悬浮细胞将自己定位在裂缝中并帮助至少两个组织碎片的至少两个边缘融合，和/或细胞将粘附到细胞培养板并增殖并释放促进软骨碎片彼此融合的因子。
88.在联合培养中，未消化的补片-培养的组织碎片彼此靠近放置，调整沿切向部分的边缘形状，使连接边缘之间的空间尽可能小，即可以连接组织碎片的切向边缘。
89.重要的是选择碎片的形状-切向边缘，以使彼此接触的软骨碎片边缘之间的空间尽可能小。在添加软骨细胞之前，最晚在将其放置在培养板的最近附近阶段需要匹配补片-组织碎片的切向边缘的形状。
90.本发明是长期实验研究的结果。实施例1-3显示了培养细胞以获得用于重建受损关节软骨的透明软骨材料的尝试。
91.使用准备和附图的示例来说明本发明。图1显示了连接组织碎片的原理-a-b-切向部分，c-组织碎片的形状。图2显示了连接组织碎片的原理-组织碎片的形状不正确。图3-5-显微图像。
92.非优选的连接示例是所有类型的弧线连接以及具有不同角度的几何连接，其中碎片之间的空间相对较大，并且没有长度至少为0.1cm的切向部分，并且补片的边缘彼此平行。它们在图2中示出。图2示出了非优选废料排列的示例-边缘沿切向部分的整个长度不是互补的，并且边缘之间有很大的空间。缺点：填充空间比较困难，机械阻力降低。
93.实施例
94.实施例1-尝试仅培养根据本发明所述的透明软骨组织碎片
95.为了使用体外方法创建一个均匀的软骨组织瓣，以获得治疗关节软骨缺损的材料。首先，临床材料是从成年人身上以透明软骨组织碎片的形式获得的，该碎片是从膝关节的最小承重部位收集的。收集患者身体负荷低的位置的组织。这种组织应该是健康的。因此，收集的一个或多个软骨瓣的形状可能不同。可以收集一个或多个软骨碎片。一个或几个碎片可以通过横穿或沿着软骨-骨线切割而分成较小的碎片。接下来，在采集大块关节软骨的情况下，在无菌条件下将其切成小碎片。
96.从患者身上采集材料后，立即将采集到的材料转移到装有生理盐水溶液(0.90％nacl)的无菌50ml管中，使组织完全浸入溶液中。然后将软骨切成，最大厚度为3mm的薄片，具有各种形状和尺寸，长度或宽度或厚度低于1cm。
97.将完全浸入生理盐水(0.90％nacl)中的获得的组织碎片用无菌的50ml试管运送到细胞培养实验室。在2-8℃的无菌条件下进行组织运输。用组织进行的所有操作均在层流条件下进行。在准备好大小合适的补片后，所得材料作为获得最终组织瓣的起始基础。
98.用于治疗关节软骨缺损的最终组织瓣补片将在组织切片的基质上形成，该组织切片在培养板表面上相对彼此适当排列，在适当的条件和培养基成分下培养。
99.一个重要的步骤是正确调整组织切片切向边缘的形状。通过沿切向边缘连接组织碎片，组织碎片在培养板上尽可能靠近。
100.使用沿至少一个直线部分——0.1-1cm长的切向边缘——彼此接触的2-4个组织碎片进行培养试验。
101.如前所述，形状是根据至少两个组织碎片—补片—连接边缘的切向边缘来匹配的。碎片-补片的最大长度/宽度和最多数量根据培养板的大小而定。
102.在所有收集的组织补片中，有必要选择至少两个补片，数量至多到可以装在培养板的孔表面上。如果由于相邻补片边缘的不匹配而无法使用上述已经准备好的补片系统，则在从患者身上收集材料后将它们切割并赋予其所需的形状。
103.假设在组织培养的这些阶段，根据先前收集和制备的组织碎片计划形成新的组织碎片，将至少两个组织碎片彼此相邻放置是至关重要的。这些碎片的排列方式应使连接的
碎片的切向边缘尽可能长，并与相邻的碎片/碎片在形状上兼容，以使培养板的填充空间尽可能小。这种效果既可以在通过收集合适形状的碎片从患者身上收集组织阶段来实现，也可以在之后的体外实验室中实现。边缘形状兼容性——它们彼此相邻放置成使得一个组织碎片的至少一个边缘接触另一个碎片的边缘，这确保了软骨细胞悬液更容易填充它们之间的区域，因为软骨碎片之间的自由空间体积最小化，以及连接部位的新获得的组织碎片的机械阻力增大。
104.在培养过程中，观察组织瓣-补片-是否会增加它们的面积以及边缘之间的空间是否会被填充。将约1mm x 1.2cm x 0.7cm的相容组织补片切片转移到6孔无菌细胞培养板的孔中，该培养板装有2.5ml细胞培养基2，细胞培养基2含有：无水氯化钙、五水硫酸铜、七水硫酸亚铁、镁氯化物、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、无水磷酸氢二钠、七水硫酸锌、l-丙氨酸、l-精氨酸盐酸盐、l-天冬酰胺一水合物、l-天冬氨酸、l-半胱氨酸盐酸盐、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、甘氨酸、l-组氨酸三盐酸盐一水合物、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸盐酸盐、l-蛋氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸二水合物、l-缬氨酸、d-生物素、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、d-泛酸(半钙)、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素、维生素b12、d-葡聚糖臭氧、次黄嘌呤、亚油酸酸、酚红、盐酸腐胺、丙酮酸单钠、胸苷，并添加1倍浓缩的glutamax补充剂溶液。将细胞在37℃和5％co2中培养7天。使用10倍和40倍光学放大率监测两个组织碎片之间的连接、它们的活力和增殖。组织修饰：在每次后续传代和培养基更换之前，使用倒置光学显微镜在10倍和40倍放大率下定期观察连接、活力和增殖。培养基和补充剂每周更换一次。
105.每个后续培养基更换都涉及：
106.1)去除旧培养基
107.2)将组织补片切片轻轻转移到新的培养板上
108.3)加入新鲜培养基。
109.在培养过程中，观察组织瓣-补片-是否会增加面积以及边缘之间的空间是否会被填充。根据本发明，在没有软骨细胞悬液的情况下单独培养组织碎片五个月后，在放置在一个孔中的成对的软骨组织碎片之间没有观察到连接。旧组织表面也没有新组织生长。
110.实施例2-尝试仅培养根据本发明的软骨组织碎片
111.培养过程与实施例1中所述的相似。
112.将相容的组织补片转移到装有2.5ml细胞培养基2的6孔无菌细胞培养板的孔中，并添加有1倍浓度的glutamax补充剂和葡萄糖[4.5g/1]。
[0113]
经过五个月的培养，放置在一个孔中的成对软骨组织碎片之间没有观察到任何连接。旧组织表面也没有新组织生长。
[0114]
实施例3-尝试仅培养根据本发明的软骨组织碎片
[0115]
培养过程如实施例1所述进行，不同之处在于将相容的组织切片转移到6孔无菌细胞培养板中，该培养板装有2.5ml细胞培养基1，培养基1含有：无水氯化钙、硝酸铁、氯化硝酸钾、镁无水硫酸盐、氯化钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钾一水合物、d-葡萄糖、l-精氨酸盐酸盐、l-胱氨酸二盐酸盐、l-谷氨酰胺、甘氨酸、l-组氨酸盐酸盐一水合物、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸盐酸盐、l-蛋氨酸、l-苯丙氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸二钠二水合物、l-缬氨酸、d-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸和-肌醇、烟酰胺、核黄素、盐酸硫胺素、盐酸
吡哆醇)与4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸钠盐，具有高葡萄糖浓度[4.5g/l]。
[0116]
经过五个月的培养，没有在放置在一个孔中的成对软骨组织碎片之间观察到连接。旧组织表面也没有新组织生长。
[0117]
实施例4-根据本发明的方法的一般描述
[0118]
为了使用体外方法创建一个均匀的软骨组织瓣，以获得治疗关节软骨缺损的材料。首先，从成年人的膝关节中获取透明软骨碎片形式的临床材料。透明软骨最好从治疗过的关节(可以是膝关节、髋关节、踝关节、肩关节或任何其他关节)采集。当经治疗的关节较小或难以提取透明软骨时，可以从另一个关节采集透明软骨。它应该始终是承重最小的部位。从身体负荷低的地方采集患者的组织。这种组织应该是健康的。因此，采集的一个或多个软骨瓣的形状可能不同。可以采集一个或多个软骨碎片。一个或几个碎片可以通过越过或沿着软骨-骨线切割而分成较小的碎片。
[0119]
接下来，在采集大块关节软骨的情况下，在无菌条件下将其切成小块。
[0120]
从患者身上采集材料后，立即将其转移到装有生理盐水溶液(0.90％nacl)的无菌50ml试管中，使组织完全浸入溶液中。然后将软骨切成薄的，最大3mm的各种形状和尺寸的长/宽小于1cm的补片(这适用于以下两种类型的碎片，即，将成为获得最终组织补片的基础的碎片和培养游离软骨细胞的碎片)。
[0121]
碎片的优选厚度/长度/宽度：i mm x 0.5cm x 0.5cm、i mm x 0.6cm x 0.6cm、i mm x 0.7cm x 0.7cm、i mm x 0.8cm x 0.8cm、i mm x 0.9cm x 0.9cm，1mm x 1cm x 1cm，2mm x 1cm x 1cm，3mm x 1cm x 1cm。将得到的大约1mm x 1cm x 1cm的组织碎片完全浸入生理盐水(0.90％nacl)中，在无菌50ml试管中将其运送到细胞培养实验室。在2-8℃的无菌条件下进行组织运输。
[0122]
连接的连接的瓣补片的尺寸和形状无关紧要。重要的是要使它们沿至少两个组织碎片的切向部分的连接边缘之间的空间尽可能小，以便边缘沿切向部分长度的至少0.1cm连接。碎片本身的大小还取决于损伤的大小和形状以及采集的健康软骨的大小和形状，其中采集的健康软骨用于获得根据本发明的重构的软骨组织碎片形式的生物假体。切向部分至少长0.1cm。使用组织或细胞进行的所有操作均在层流条件下进行。准备好大小合适的补片后，将所有碎片分成两部分。两部分碎片中的其中一部分碎片用于获得软骨细胞悬液，即在细胞培养中用作组织构建材料与组织碎片的混合物。其它部分构成用于培养组织瓣补片的碎片，并构成获得重组组织的最终瓣的基础。
[0123]
根据下述步骤获得用于治疗关节软骨缺损的最终组织瓣补片，即在“组织-细胞”培养中使用软骨细胞组合固定形状的组织切片，这些组织切片彼此布置在培养板的壁的表面上。
[0124]
1)制备软骨组织碎片以进一步培养组织碎片。
[0125]
一个重要的阶段是正确选择这些组织补片，组织补片的边缘将允许它们在培养板上尽可能靠近。组织碎片必须沿至少一个直线段相互接触。必须至少有2个组织碎片。任何形状的组织片段的最小长度：最小：0.1cm，优选至少0.5cm。任何形状的组织碎片的最小宽度：至少：0.1cm，优选至少0.5cm。组织厚度：至少1mm和4mm或更小。
[0126]
如前所述，该形状与至少两个组织碎片-补片的切向边缘-切向部分的连接的边缘匹配。连接边缘的切向部分的长度应至少为0.1cm，优选至少为0.5cm，不用考虑该部分是直
线的还是弯曲的，因为该长度指的是切线——切向部分而不是直线。碎片-补片的最大长度/宽度以及最大数量取决于培养板的大小和治疗目标。
[0127]
在所有采集的组织补片中，有必要选择至少两个补片，以及补片数量至多至可刚好放置在培养板壁的表面上。如果由于相邻补片边缘不匹配而导致无法使用上述已经准备好的补片系统，则在从患者身上采集完材料后将它们进行切割并赋予所需的形状。
[0128]
在组织培养的这些阶段，根据先前采集和准备好的组织碎片计划形成新的组织碎片，将至少两个组织碎片彼此相邻放置是至关重要的。这些碎片在排列时应使连接的碎片的切向边缘尽可能长，至少0.1cm，并且在形状上与相邻的一个碎片/多个碎片兼容，以尽量减少软骨碎片之间的自由空间，以便填充培养板的空间尽可能小。可以在以下两个阶段实现这种效果，即，通过采集合适形状的碎片从患者身上采集组织的阶段以及之后的体外实验室阶段。边缘形状兼容性——它们彼此相邻放置使得一个组织碎片的至少一个边缘或其部分接触另一个组织碎片的边缘，这确保了软骨细胞悬液更容易填充它们之间的区域，这要归功于软骨碎片之间的自由空间体积减到了最小，以及在连接部位新获得的组织碎片的机械阻力增加。边缘形状的可能示例和连接方式如图1所示，示例并未穷尽所有可能性。在培养过程中，重要的是要获得并连接至少两个沿相邻边缘部分直接相邻的组织碎片，其中在直线和弯曲部分的情况下，最小切向部分长度为0.1cm。
[0129]
该值适用于碎片的切向部分或组织碎片的整个边缘的长度，无论其形状如何。
[0130]
图1示出了整个组织碎片或组织碎片-补片的边缘-通过将形状匹配的边缘沿切向部分放在一起来显示它们之间的连接。
[0131]
根据本发明，重要的是通过规划平行相邻边缘的走向来调整组织补片-组织碎片-至少两个组织碎片的接合部位的形状。这种形状存在于所有有直边的附图中。这种形状也可以在某个点部分是直的，部分是拱形的。因此，组织碎片-补片可以具有任何形状。边缘的路线应该是兼容的——在两个连接的组织碎片上沿切向部分平行设置，以便两个组织碎片可以沿着这些边缘连接。沿着切向部分——在至少两个组织碎片的接合处——连接的组织碎片的边缘部分或整个边缘被称为切向部分。
[0132]
原则是连接的组织边缘的切向部分上的长度-碎片沿切向部分的部分或整个边缘的长度-组织碎片的接合长度-切向部分的长度至少应为0.1cm。图1示出了切向部分形状的示例：a-直线部分，b-拱形部分，以及连接组织碎片的形状示例：c-角形和几何组织碎片，它们的组合。
[0133]
不优选的连接示例是所有类型的弧线连接以及具有不同角度的几何连接，其中碎片之间的空间相对较大，并且没有切向部分，且补片的至少为0.1cm长的边缘彼此平行。它们如图2所示，图2示出了非优选废料排列的示例-沿切向部分的整个长度边缘不是互补的，并且边缘之间有很大的空间。缺点：填充空间比较困难，机械阻力降低。
[0134]
2)仅预培养组织碎片。
[0135]
使用镊子将如前所述的选定的或经过适当修剪的补片-组织碎片-切片转移到1孔、6孔或12孔无菌细胞培养板中。将选定或经过适当修剪的组织补片置于预先填充有10ml、2.5ml或1.25ml细胞培养基1的孔中，其中培养基1含有4.5g/1葡萄糖，也称为商品名dmem，或置于培养基2或培养基1和的孔中，而培养基2添加有1倍浓缩的谷氨酰胺补充剂(也称为商品名f12)溶液，或置于比例为1:1的培养基1和培养基2的混合物中，或置于10％fbs
血清和2mm-4mm谷氨酰胺。
[0136]
在该实施例中，使用商品名为dmem的培养基1，其含有：无水氯化钙、硝酸铁水合物、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、碳酸氢钠、一水合磷酸二氢钾、d-葡萄糖、l-精氨酸盐酸盐、l-胱氨酸二盐酸盐、l-谷氨酰胺、甘氨酸、l-组氨酸盐酸盐一水合物、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸盐酸盐、l-蛋氨酸、l-苯丙氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸二水合物、l-缬氨酸、d-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、异肌醇、烟酰胺、核黄素、硫胺素盐酸盐、盐酸吡哆醇与4-(2-羟乙基)哌嗪-加入葡萄糖的1钠盐-乙砜。
[0137]
在该实施例中，使用培养基2，其含有：无水钙、五水硫酸铜、七水硫酸亚铁、氯化镁、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、无水氢二钠、七水硫酸锌、l-丙氨酸、l-精氨酸盐酸盐、l-天冬酰胺一水合物、l-天冬氨酸、l-半胱氨酸盐酸盐、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、甘氨酸、l-组氨酸三盐酸盐一水合物、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸盐酸盐、l-蛋氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸二水合物、l-缬氨酸、d-生物素、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、d-泛酸(半钙)、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素、维生素b12、d-葡萄糖、次黄嘌呤、亚油酸、酚红、盐酸腐胺、丙酮酸单钠、添加1倍浓缩的glutamax补充溶液的胸苷。
[0138]
在本实施例中，还检查了两种培养基1:1混合物的作用。
[0139]
优选地，培养基含有最少4.0g/1葡萄糖，优选4.5g/1葡萄糖，最少10％fbs和最少2mm谷氨酰胺。
[0140]
优选地，培养基应含有55-75mg/1丙酮酸钠和碳酸氢钠、2mm-4mm谷氨酰胺、2％-10％fbs和至少4.5g/1葡萄糖以及乙醇胺、谷胱甘肽、抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硫酸铜、氯化锰。
[0141]
将至少两个大小约为1mm x 1cm x 1cm的组织瓣补片放置在培养板的每个孔中，并排列成使得它们沿着其最大长度的边缘的其中一个边缘或沿着如本例中的长度至少为0.1cm的切向部分的不变的碎片彼此粘附。使用具有0.1-0.5-1cm切向部分的2-4个碎片进行了几个实验。软骨在37℃和5％co2中孵育7天。此后，进行显微镜观察并用新鲜的培养基更换培养基。在本实验中使用的6孔板的情况下，每7天更换一次新鲜培养基的体积为2.5ml。倒置显微镜用于评估组织补片的活力；培养物的微生物纯度；由组织中存在的细胞分裂引起的可能的新细胞结构的出现。使用10倍和40倍光学放大率监测两个组织碎片之间的连接、它们的活力和增殖。
[0142]
培养组织碎片直到获得足够数量的软骨细胞(分离培养-贴壁培养)以使组织碎片充满增殖的软骨细胞的悬液。在这个实验中，它是17天。组织碎片培养涉及一种孵育，旨在将组织碎片保持在活性状态，使其随时可用于已经进行的游离软骨细胞的合适培养的下一步中。
[0143]
3)仅获得软骨细胞悬液和软骨细胞的初始贴壁培养。
[0144]
可以使用已知方法获得和培养软骨细胞以使其增殖。
[0145]
在选择作为未来新组织瓣基础的组织补片后，剩余的用于分离软骨细胞的补片(占所有补片重量的15％至50％)用于获得软骨细胞悬液。组织碎片的形状在获得软骨细胞时并不重要。为此，使用手术刀将用于酶消化的组织另外切成小块(不大于3mm x 3mm x 3mm)。以这种方式制备的材料用胶原酶ii处理。
[0146]
将得到的组织片转移到体积为15ml至50ml的无菌试管中。在这种情况下，它是一个50ml的试管。用1倍浓缩磷酸盐缓冲盐水(1x pbs)冲洗组织块3次。酶消化时间和酶量根据组织碎片的质量以及反应后获得适当的细胞活力进行调整。在这项研究中，使用了以下组织与酶重量比范围：1g：1mg、1g：2mg、1g：3mg和1g：4mg。在商品名为dmem的培养基1中进行消化反应，培养基1含有：无水氯化钙、水合硝酸铁、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、碳酸氢钠、一水合磷酸二氢钾、d-葡萄糖、l-精氨酸盐酸盐、l-胱氨酸二盐酸盐、l-谷氨酰胺、甘氨酸、l-组氨酸盐酸盐一水合物、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸盐酸盐、l-蛋氨酸、l-苯丙氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸,l-色氨酸、l-酪氨酸二水合物、l-缬氨酸、d-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、异肌醇、烟酰胺、核黄素、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇)与添加了葡萄糖的4-(2-羟乙基)哌嗪钠盐1-乙砜；或在培养基2中进行消化反应，培养基2含有：无水钙、五水硫酸铜、七水硫酸亚铁、氯化镁、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、无水磷酸氢二钠、七水硫酸锌、l-丙氨酸、l-盐酸精氨酸、l-天冬酰胺一水合物,l-天冬氨酸、l-半胱氨酸盐酸盐、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、甘氨酸l-组氨酸三盐酸盐一水合物、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸盐酸盐、l-蛋氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸二水合物、l-缬氨酸、d-生物素、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、d-泛酸(半钙)、吡哆醇盐酸盐、核黄素、盐酸硫胺素、维生素b12、d-葡萄糖、次黄嘌呤、酚亚油酸红、腐胺盐酸盐、丙酮酸一钠、并添加1倍浓缩的glutamax补充剂溶液的胸苷；或在添加有葡萄糖的上述两种培养基的混合物中进行消化反应，这两种培养基的比例为1:1。
[0147]
将组织按以下比例置于培养基中：3ml培养基：0.1g组织或3ml培养基：0.2g组织或3ml培养基：0.3g组织或3ml培养基：0.5g组织)，含有适当的浓度的胶原酶ii。以克为单位的组织质量是由使用的组织补片的质量组成的总值。补片总共消化至最大0.5g。消化总重量为0.5g的补片。在细胞培养箱中在37℃、5％co2下进行消化。反应进行最少16小时，直到组织被完全消化。消化后，除去含有游离软骨细胞的上清液并在室温下以300x g的转速离心至少10分钟。所得细胞沉淀物，含有的软骨细胞量为1g组织中0.3百万至1g组织中1.5百万，在1倍浓缩的pbs中冲洗3次。经消化的组织量通常平均约为0.1-0.2g。最终，将细胞沉淀物重新悬浮在具有4.5g/1葡萄糖的培养基1中或添加有1倍浓缩的glutamax补充液的培养基2中或比例为1:1的培养基1和培养基2，含有2％或4％或5％或10％fbs和最少2mm谷氨酰胺溶液的混合物中，用于观察和定性和定量评估消化。评估消化后细胞是否表现出良好的活力(定性评估)以及整个组织碎片是否被消化(定量评估)。对细胞存活率(最低活力80％视为阳性)、消化后细胞的形状和整体状况(有可见核的圆形视为状况良好的细胞)进行定性评估。将活力不低于80％的细胞以每2ml培养基150,000个细胞或每2ml培养基200,000个细胞或每2ml培养基250,000个细胞的密度接种到25cm2或75cm2培养瓶中。在培养过程中，每隔一天，使用倒置光学显微镜观察细胞，以评估生长速度并确定细胞传代的时刻，这与融合程度密切相关。培养基每周更换两次。当细胞达到适当的汇合度(最大85％)时，在37℃下用2ml 0.05％(w/v)的胰蛋白酶/edta的pbs溶液将它们胰蛋白酶消化5分钟。通过添加具有4.5g/1葡萄糖的培养基1或添加有1倍浓缩的glutamax补充液的培养基2或比例为1:1的培养基1和培养基2，含有2％或4％或5％或10％fbs混合物来进行胰蛋白酶消化抑制，其中2％或4％或5％或10％fbs的体积为所用的胰蛋白酶/edta溶液的1倍，1.5倍或2倍。根据标准程序，使用显微镜和台盼蓝溶液测定细胞数和活力。
[0148]
在软骨细胞培养过程中主要监测细胞生长和活力。继续培养直到在80％的细胞活力时出现85％融合。这种培养的目的是增殖足够数量的细胞，用于组织碎片与软骨细胞的下一次联合培养，即“组织淹没”，其中软骨细胞悬液用作连接组织碎片的粘合剂。一些细胞用于“淹没”组织，一些细胞用于建立另一种培养物，以便细胞材料仍然可用。
[0149]
细胞保持连续培养，用于刺激a)点所述的软骨组织片之间的连接。
[0150]
为了使软骨细胞增殖而培养软骨细胞的操作总是在单层贴壁培养中进行。当细胞从板表面分离后，进行洗涤和离心步骤，以及软骨细胞在目标缓冲液中的悬浮和在联合培养中淹没瓣组织补片时，我们谈论细胞悬浮。
[0151]
4)根据第3点联合培养-组织碎片与软骨细胞悬液。
[0152]
假设使用两个大小约为1mm x 1cm x 1cm的组织补片，将至少40,000个软骨细胞添加到含有2.5ml培养基的孔中是很重要的。培养两个切向部分长度为0.1cm的碎片的最大软骨细胞浓度为每2.5ml培养基8000个软骨细胞。
[0153]
软骨组织补片在以下集中培养基中培养，即，含有4.5g/1葡萄糖的培养基1或添加1倍浓缩的glutamax补充溶液的培养基2或如上所述的培养基1和培养基2，其中培养基1和培养基2的比例为1:1且具有2％或4％或5％或10％fbs，最少2mm谷氨酰胺和最少0.01％igf-1和/或最少0.01％tgf-bi和/或最少0.01％软骨素和/或最少0.1％胰岛素，如此培养的软骨组织补“淹没有”在消化后从培养物中获得的软骨细胞(活力大于等于最少85％)。
[0154]
培养基中含有最少4.5g/1葡萄糖、最少10％fbs和最少2mm谷氨酰胺，这一点很重要。
[0155]
优选地，培养基应含有55-75mg/1丙酮酸钠和碳酸氢钠、2mm-4mm谷氨酰胺、2％-10％fbs、至少4.5g/1葡萄糖以及乙醇胺、谷胱甘肽、抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硫酸铜、氯化锰和最少0.01％igf-1和/或最少0.01％tgfβ1和/或最少0.01％软骨素和/或最少0.1％胰岛素。
[0156]
在如上所述离心和预先定量和定性评估后，将细胞悬浮在含有4.5g/1葡萄糖的培养基1或添加有1倍浓缩的glutamax补充溶液的培养基2或比例为1:1的培养基1和培养基2中，其中在至少500ml的体积中至少40,000个细胞，然后将它们添加到具有最少两个组织碎片的孔中。培养基含有55mg/1-75mg/1丙酮酸钠、碳酸氢钠、2mm-4mm谷氨酰胺、2％-10％fbs和4.5g/1-5.0g/1葡萄糖，这一点很重要。
[0157]
将得到的组织碎片和软骨细胞的组合培养物在细胞培养箱中在37℃、5％co2下培养至少12周，直到在组织碎片之间获得新的组织连接。每周重复一次用含有恒定量软骨细胞的悬液“淹没”组织的过程。以指定频率更换培养基取决于在组织培养中获得的经验。在将组织碎片轻轻转移到6孔板的新孔中后，加入软骨细胞。当时也更换了培养基，在6孔板的情况下，最终体积为2.5ml，包括补充剂。
[0158]
组织修饰：在随后的每次组织“淹没”细胞之前，使用10倍和40倍放大倍率的倒置光学显微镜定期观察连接、活力和增殖。培养基和补充剂每周更换一次。
[0159]
随着新软骨细胞的每次“淹没”，执行以下操作：
[0160]
1)去除旧培养基
[0161]
2)将组织切片轻轻转移到新的培养板上
[0162]
3)加入新鲜培养基
[0163]
4)用细胞淹没补片(如上所述的细胞数和细胞悬浮在其中的培养基-根据现有提供的新鲜培养基的量)-如上所述。
[0164]
经过几天的测试培养，软骨组织出现了明显的变化。确定了旧组织碎片之间的新组织连接。几周后，旧组织之间的空隙被新组织填满并长满了。获得了新组织的瓣补片，其由定期提供给培养物的软骨补片和游离软骨细胞形成。从最初的两个组织补片获得的一个新的组织瓣补片在中间有一个“沟”，可能是新组织，由以悬液形式定期提供给培养物的软骨细胞参与形成。组织瓣约为1mm x 2.1cm x 1cm。可以将其从板孔转移到另一个目的地，而无需使用两对镊子，也没有损坏的风险。与旧组织相比，初始组织补片之间的新连接颜色略浅，如图3所示-使用具有切向部分的两个组织碎片进行细胞组织培养当天的倒置显微镜图像(图3a)，培养17天后的倒置显微镜图像(图3b)和培养52天后的倒置显微镜图像(图3c,d)。
[0165]
在如上所述的组织补片和细胞悬液的组合培养的适当培养期间，同时进行单独的软骨细胞悬液培养。细胞悬浮培养对于持续维持用于“淹没”组织补片的细胞材料来源是必要的。以40倍放大倍率进行观察。
[0166]
图3显示了培养基1中组织补片培养的显微图像，其中培养基1含有4.5g/1葡萄糖、10％fbs、2mm谷氨酰胺-通过显微图像看到新组织慢慢形成。a：在培养的第一天，沿约1cm长的切向部分尽可能靠近彼此靠近的两个组织补片的图像(记录培养基线的图像，第1天)。两个组织补片的接触表面之间清晰可见的自由空间。b：在培养基1中培养的第17天，沿约1cm长的切向部分彼此靠近的两个组织补片的碎片图像，在添加有4.5g/1葡萄糖、10％fbs、2mm谷氨酰胺的培养基1中在两个组织补片的接触表面之间形成可见的组织填充。c、d：在添加有4.5g/1葡萄糖、10％fbs、2mm谷氨酰胺的培养基1中培养的第52天，沿约1cm长的切向部分彼此靠近的两个组织补片的碎片和在两个组织补片的接触表面之间形成可见的组织填充的图像。培养五十二天后形成的新组织明显划伤了在培养第一天出现的两个组织补片的交界处的自由空间。在组织补片碎片的两个接触表面的一端可见新旧组织颜色明显对齐。使用10倍放大(a、b、c)和40倍放大(d)拍摄的图像。
[0167]
实施例5-本发明应用的变体
[0168]
如实施例4所述进行培养，在一定程度上改变以下条件：
[0169]
1)获取软骨组织碎片用于进一步培养。
[0170]
获得了八块椭圆形组织补片，但每瓣的一侧均被切割，以使两个相邻碎片之间的接触面积最大。获得的补片很薄，只有约1mm厚。它们长约0.9cm，宽约0.5-0.6cm。
[0171]
2)仅预培养组织碎片
[0172]
如上所述，用镊子将选定的并经适当修剪的补片转移到孔或6孔无菌细胞培养板中。将两个选定的组织补片(约1mm厚、0.9cm长和0.6cm宽)置于预先填充有2.5ml培养基1和具有4.5g/1葡萄糖的培养基2、10％fbs血清、55mg/1丙酮酸钠和2mm谷氨酰胺的孔中。切向部分是直线的。前面的示例已对培养基1和2进行了描述。
[0173]
将每孔的两个组织补片放置在培养板的三个孔中，以使长度约为0.6cm的每个补片的一个边缘(切向边缘)尽可能紧密地粘附在另一个边缘上。这些是同一测试的生物学重复。软骨在37℃和5％co2中孵育7天。每7天更换一次培养基，每次使用倒置显微镜评估组织补片的活力；培养物的微生物纯度，并分析组织中存在的细胞分裂可能产生的新细胞结构
的外观。使用了10倍和40倍的光学放大倍率。在更换培养基之前进行观察。
[0174]
3)获得软骨细胞悬液和培养物
[0175]
另外两个补片(尺寸：约1mm x 0.9cm x 0.5cm)用于分离软骨细胞，它们的总重量约为所有补片重量的25％。为此，使用手术刀将用于酶消化的组织另外切成小块(大小约为2mm x 2mm x 2mm)。通过这种方式制备的材料用胶原酶ii处理。将得到的组织片转移到30ml无菌试管中。用1倍浓缩的磷酸盐缓冲盐水(1x pbs)冲洗组织块3次。在这项研究中，使用了以下组织与酶的重量比：1g：1mg。在以下条件下进行消化反应：培养基1和培养基2的混合物，添加有4.5g/1葡萄糖(按每0.3g组织3ml培养基的比例-即2ml)，含有适量的胶原酶ii，即0.2mg。以克为单位的组织质量是所用组织补片质量的总值。在细胞培养箱中在37℃、5％co2下进行消化。反应进行20小时过夜。消化后，收集含有游离软骨细胞的上清液并在室温(21℃)下以300x g的转速离心10分钟。将得到的含有软骨细胞的细胞沉淀物在1倍浓缩的pbs中冲洗3次。最后，将细胞沉淀物重悬于1ml培养基1和培养基2，添加有4.5g/1葡萄糖、10％fbs和2mm谷氨酰胺的混合物中，用于观察和定性评估(主要是评估消化后的细胞活力和细胞状况-例如，评估形状规律性)和定量消化反应。获得了含有49万个活细胞的活力为98％的软骨细胞悬液。然后将获得的细胞以每平方厘米10,000个细胞的密度进行接种。将细胞接种在6孔板和25cm2培养瓶中。
[0176]
细胞保持持续培养，用于刺激软骨组织片之间的连接。
[0177]
4)联合培养-组织碎片与软骨细胞悬液
[0178]
在添加了4.5g/1葡萄糖、10％fbs、2mm谷氨酰胺、55mg/1丙酮酸盐的培养基1和培养基2的混合物中生长的本实施例的第2点中所述的软骨组织补片被消化后(活力在85％-92％的范围内)培养所得的软骨细胞所“淹没”。
[0179]
在如上所述的离心和之前的定量和定性评估之后(本实施例的第3点)，将细胞悬浮在最终容量为1000μl的添加有4.5g/1葡萄糖的培养基1和培养基2的混合物中，且将含有80,000个细胞的悬液添加到具有两个组织补片的每孔中。接着加入补充剂。在这项研究中，它们是igf-1和tgf，其在孔中的最终浓度为两种补充剂的0.01％。
[0180]
将得到的组织碎片和软骨细胞的组合培养物在细胞培养箱中在37℃、5％co2下培养5周，直到在组织碎片之间获得新的组织连接。每周(每7天)重复用含有恒定量软骨细胞(每孔2.5ml培养基80,000个细胞，每孔含有两个组织补片)的悬液“淹没”组织。在组织转移和添加新鲜培养基和软骨细胞之前，对组织补片进行观察(如实施例4中所述)。在将组织碎片轻轻转移到6孔板的新孔中后，加入软骨细胞。
[0181]
在测试培养7天后，软骨组织出现了明显的变化。19天后，识别出了旧组织碎片之间的组织连接，如图4所示—使用具有0.6cm切向部分的两个组织碎片在开始培养当天拍摄的倒置显微镜图像(图4a)和细胞-组织培养19天后拍摄的倒置显微镜图像(图4b)。补片之间的新连接看起来像粘合补片的纤维。五周后，旧组织之间的空隙被新组织填满并长满了。两个组织补片的接合处充满了新的细胞连接。软骨补片之间的新组织呈一种“疤痕”的形式。在显微图像上，新组织比原始软骨补片的组织更亮。获得了由定期提供给培养物的软骨补片和游离软骨细胞形成的新组织的皮瓣补片。获得约1mm x 1.8cm x 0.6cm的新组织瓣。
[0182]
图4显示了在培养基1和培养基2的混合物中培养组织补片的显微图像。-随着时间的推移看到新组织连接形成。a：在培养的第一天，沿0.6cm长的部分尽可能靠近彼此的两个
组织补片的图像(记录培养基线的图像)。两个组织补片的接触表面之间清晰可见的自由空间。b：在添加有4.5g/1葡萄糖、10％fbs、2mm谷氨酰胺和补充剂(igf-i和tgf的浓度为0.01％)的培养基1和培养基2的混合物中培养的第19天，沿约0.6cm长的部分彼此靠近的两个组织补片的碎片，和在两个组织补片的接触表面之间形成可见的组织连接的图像。在相邻碎片之一的表面上和组织补片的碎片之间都可以看到新组织。由此产生的连接具有将两个接触表面彼此连接起来的纤维的性质。使用10倍放大率拍摄的图像。
[0183]
实施例6-本发明应用的变体
[0184]
如实施例4和5所述进行培养，除了以下几点不同：
[0185]
1)获取软骨组织碎片用于进一步培养：
[0186]
获得了十块椭圆形组织补片，但每个皮瓣的两侧(最长的一侧)均被切割。获得的补片大约3mm厚。它们长约1cm，宽约0.2cm。
[0187]
2)仅预培养组织碎片：
[0188]
如上所述，用镊子将选定的并经适当修剪的补片转移到孔或6孔无菌细胞培养板中。将四个选定的组织补片，大约3mm厚，大约1cm长(切向表面的长度，在每个碎片中，表面的形状提供最大兼容的接触表面，大多数为直线的)和大约0.2cm，置于于预先填充有1.25ml培养基1和培养基2、4.5g/1葡萄糖、2％fbs血清和2mm谷氨酰胺的孔中。
[0189]
每对之间的切向部分约为1cm。
[0190]
将每孔的四个组织补片放置在12孔培养板的三个孔中，以使长度约为1cm的每个补片的一个边缘(切向边缘)尽可能紧密地粘附在另一个边缘上。
[0191]
3)获得软骨细胞悬液和培养物：
[0192]
在这项研究中，使用了以下组织与酶的重量比：1g：2mg。在以下条件下进行消化反应：培养基1和培养基2的混合物，添加有4.5g/1葡萄糖(按每0.3g组织3ml培养基的比例-即2ml)，含有适量的胶原酶ii，即0.4mg。反应进行14小时。最后，将细胞沉淀物重悬于1ml培养基1和培养基2，添加有4.5g/1葡萄糖、2％fbs和2mm谷氨酰胺的混合物中，用于观察和定性评估(主要是评估消化后的细胞活力和细胞状况-例如，评估形状规律性)和定量消化反应。获得了含有42万个活细胞的92％活力的软骨细胞悬液。
[0193]
4)联合培养-组织碎片与软骨细胞悬液
[0194]
在添加了4.5g/1葡萄糖、2％fbs和2mm谷氨酰胺的培养基1和培养基2的混合物中生长的本实施例的第2点中所述的软骨组织补片被消化后(活力在85％-92％的范围内)培养所得的软骨细胞所“淹没”。将含有1.25ml培养基80,000个细胞的适当体积的悬液添加到带有组织补片的孔中。接着加入补充剂。在这项研究中，孔中培养基中软骨素的最终浓度为0.01％。
[0195]
将得到的组织碎片和软骨细胞的组合培养物在细胞培养箱中在37℃、5％co2下培养8周，直到在组织碎片之间获得新的组织连接。每周(每7天)重复用含有恒定量软骨细胞(每孔80,000个细胞，每孔含有两个组织补片)的悬液“淹没”组织。在组织转移和添加新鲜培养基和软骨细胞之前，对组织补片进行观察(如实施例4中所述)。在将组织碎片轻轻转移到12孔板的新孔中后，加入软骨细胞。
[0196]
在测试培养14天后，软骨组织出现了明显的变化。19天后，识别出了旧组织碎片之间的组织连接，如图5所示—使用具有1cm切向部分的四个组织碎片在开始培养当天拍摄的
倒置显微镜图像(图5a)和细胞-组织培养7天后拍摄的倒置显微镜图像(图5b，c)。
[0197]
补片之间的新连接看起来像粘合补片的纤维。七周后，旧组织之间的空隙被旧组织填满并长满了。两个组织补片的接合处充满了新的细胞连接。获得了由定期提供给培养物的软骨补片和游离软骨细胞形成的新组织的皮瓣补片。获得约3mm x 1cm x 0.8cm的新组织瓣。
[0198]
图5显示培养基1中培养组织补片(第1和第2补片)的显微图像-随着时间的推移看到新组织连接形成。a：在培养的第一天，两个组织补片(第一个补片和第二个补片)碎片沿1cm长的部分尽可能靠近彼此的图像(记录培养基线的图像)。在最靠近板边缘的第一个组织补片和下一个相邻的组织补片之间存在自由空间。第一碎片在切向表面的边缘被轻轻切割，以便在后续实验阶段进行识别(第一个补片碎片位于图像底部)。b，c：在添加有4.5g/1葡萄糖、10％fbs、2mm谷氨酰胺和浓度为0.01％的软骨素的培养基1中培养的第27天，两个组织补片(第一和第二补片)碎片和沿约1cm长的两个组织补片的接触表面之间形成可见的组织连接的图像。在组织补片的接触表面之间形成纤维状连接。在接下来的培养日子里，将在其间形成永久粘合两个组织补片的新组织。在第二个和第三个补片之间以及第三个和第四个补片之间也分别观察到了相同类型的连接。使用10倍放大率拍摄的图像[a,b]，使用40倍放大率拍摄的图像[c]。
[0199]
实施例7-本发明应用的变体
[0200]
如实施例5所述进行培养，除了以下几点不同：
[0201]
1)获取软骨组织碎片用于进一步培养：
[0202]
获得了五块矩形组织补片。获得的补片大约2mm厚。它们长约0.5cm，宽约0.4cm。
[0203]
2)仅预培养组织碎片：
[0204]
如上所述，用镊子将选定的并经适当修剪的补片转移到孔或6孔无菌细胞培养板中。将三个选定的组织补片，约2mm厚、0.5cm长和0.4cm宽(接触表面长度)置于预先填充有2.5ml培养基2的孔中，培养基2含有4％fbs血清丙酮酸盐和2mm谷氨酰胺。上述组织补片呈椭圆形，三个补片中有两个补片具有凸接触面，一个补片具有两个凹面。所有接触面都相互兼容，即它们尽可能地靠近。
[0205]
将每孔的三个组织补片放置在6孔培养板的三个孔中，以使长度约为0.4cm的每个补片的一个边缘(切向边缘)尽可能紧密地粘附在另一个边缘上。
[0206]
3)获得软骨细胞悬液和培养物：
[0207]
在这项研究中，使用了以下组织与酶的重量比：1g：4mg。在以下条件下进行消化反应：培养基1和培养基2的混合物，添加有4.5g/1葡萄糖(按每0.3g组织6ml培养基的比例-即4ml)，含有适量的胶原酶ii，即0.8mg。反应进行8小时。最后，将细胞沉淀物重悬于1ml培养基2中，其添加有4.5g/1葡萄糖、4％fbs和2mm谷氨酰胺，用于观察和定性评估(主要是评估消化后的细胞活力和细胞状况-例如，评估形状规律性)和定量消化反应。获得了含有32万个活细胞的86％活力的软骨细胞悬液。
[0208]
4)联合培养-组织碎片与软骨细胞悬液
[0209]
在添加了4.5g/1葡萄糖、4％fbs和2mm谷氨酰胺的培养基2中生长的本实施例的第2点中所述的软骨组织补片被消化后(活力在85％-92％的范围内)培养所得的软骨细胞所“淹没”。将含有60,000个细胞的适当体积的悬液添加到带有组织补片的孔中。接着加入补
充剂。在这项研究中，孔中培养基中胰岛素的最终浓度为0.2％。
[0210]
将得到的组织碎片和软骨细胞的组合培养物在细胞培养箱中在37℃、5％co2下培养11周，直到在组织碎片之间获得新的组织连接。每周(每7天)重复用含有恒定量软骨细胞(每孔60,000个细胞，每孔含有三个组织补片)的悬液“淹没”组织。在组织转移和添加新鲜培养基和软骨细胞之前，对组织补片进行观察(如实施例4中所述)。在将组织碎片轻轻转移到6孔板的新孔中后，加入软骨细胞。
[0211]
在测试培养二十一天后，软骨组织出现明显变化。四十三天后，在所有组织补片中，即第一个补片和第二个补片以及第二个补片和第三个补片之间，都发现了旧组织碎片之间的新组织连接。十一周后，旧组织之间的空隙被新组织填满并长满了。三个组织补片的接合处充满了新的细胞连接。获得了由定期提供给培养物的软骨补片和游离软骨细胞形成的新组织的皮瓣补片。获得约2mm x 1.5cm x 0.4cm的新组织瓣。
[0212]
本发明还涉及以下项：
[0213]
1.一种进行体外软骨细胞培养以获得用于治疗关节软骨缺损的材料的方法，其特征在于，包括将获得的透明软骨切割成至少两个组织碎片，然后将这些碎片彼此相邻地放置在培养板上，在含有最少2mm谷氨酰胺、最少2％fbs、最少4.5g/1葡萄糖的培养基中，至少沿着每个碎片的一个边缘部分调整组织碎片形状，使得在将碎片紧密排列后，至少两个组织碎片之间的空间尽可能小，使得含有组织碎片的培养板的空间尽可能小，以便在培养过程中，通过将软骨细胞悬液添加到培养物中，继续用软骨细胞细胞培养组织碎片以及固定时间更换培养基和将软骨细胞添加到培养基中的方式沿着至少一个切向部分接合碎片。一直继续培养直到组织碎片沿着切向部分形成接合部。
[0214]
2.根据项1所述的方法，其特征在于，培养基含有浓度为最低0.01％igf和/或0.01％tgf和/或0.01％软骨素和/或最低0.1％胰岛素的补充剂。
[0215]
3.根据项1或2所述的方法，其特征在于，所述培养基含有55-75mg/1丙酮酸钠和碳酸氢钠、2mm-4mm谷氨酰胺、2％-10％fbs和至少4.5g/1葡萄糖以及乙醇胺和/或谷胱甘肽和/或抗坏血酸和/或胰岛素和/或转铁蛋白和/或硫酸铜和/或氯化锰。
[0216]
4.根据项1或2或3所述的方法，其特征在于，仅在培养基中培养组织碎片，优选在将软骨细胞加入培养物之前培养至少14天。
[0217]
5.根据项1或4所述的方法，其特征在于，将添加到组织碎片中的软骨细胞悬液的量为使得每2.5ml培养基中存在至少40,000个软骨细胞。
[0218]
6.根据项1或4或5所述的方法，其特征在于，用于培养具有长度为0.1cm-1cm的切向部分的两个碎片的软骨细胞的最小浓度为每2.5ml培养基有40,000个软骨细胞。
[0219]
7.根据项1所述的方法，其特征在于，通过酶消化获得培养的软骨细胞，然后通过贴壁培养单层培养软骨细胞获得所需数量的细胞。
[0220]
8.根据项1所述的方法，其特征在于，在升高到37℃的温度下和5％co2下培养细胞。
[0221]
9.根据项1-8中任一项所述的方法，其特征在于，至少两个接合的组织碎片之间的切向部分最小为0.1cm，最优选至少为0.5cm。
[0222]
10.根据项1-19中任一项所述的方法，其特征在于，所述组织碎片具有类似椭圆形的形状。
[0223]
11.根据项1-10中任一项的方法，其特征在于，选择组织碎片的形状，使得培养中的组织碎片沿着切向部分非常紧密地粘附在一起。