专利名称：一种提高体细胞增殖活性的细胞共培养方法
技术领域：
本发明属于细胞工程和组织工程领域，具体涉及一种提高体细胞增殖活性的细胞共培养方法。
背景技术：
细胞工程和组织工程领域中，需要使用一定数量的种子细胞-体细胞，并且要求体细胞有一定的增殖活性，这两者对生物工程领域中恢复和重建组织和器官的结构和功能有着至关重要的影响。但由于体细胞体外增殖能力有限，少量的体细胞不能通过增殖获取足量的体细胞，而且体细胞在体外长时间培养后，随着分裂次数的增加，增殖能力逐渐下降，细胞的增殖活性下降，严重影响了细胞工程和组织工程体外构建的成功。由于体细胞增殖能力受到自身和环境等许多因素的影响，通过调节这些相关因素，可以提高体细胞的增殖活性，并在短时间内获得足够数量的体细胞。
目前许多研究表明，使用增殖活性强的细胞与增殖活性弱的细胞共同培养，能有效促进增殖能力弱的细胞的增殖性能。干细胞是一种增殖能力极强的细胞，具有很强的细胞增殖、自我更新的特性，它能提供干细胞微环境，分泌可溶性蛋白，细胞表面分子，以及细胞外基质等营养和支持细胞，提高体细胞增殖能力。将干细胞与体细胞共同培养，能提供有利于细胞增殖的体外微环境，通过直接和间接两方面的作用提高体细胞的增殖活性。首先干细胞通过与体细胞直接接触，直接促进体细胞的增殖；其次干细胞通过旁分泌作用分泌各种有利于细胞生长的因子，包括脑源性神经生长因子(⑶NF)、胶质细胞源性神经生长因子(⑶NF)、肝细胞生长因子、转化生长因子β 1、表皮生长因子、血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子、角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子和肝细胞生长因子等提高体细胞的增殖活性。通过以上两点，体细胞与干细胞混合共培养最终能在提高体细胞增殖活力的同时，快速获得满足需要量的体细胞。但该方法具有以下缺陷1.移植细胞中存在的未分化的胚胎干细胞会在被移植体内形成肿瘤。由于干细胞具有很强的增殖能力，并能多向分化为不同的细胞，移植后可以形成多种肿瘤，主要包括畸胎癌和畸胎瘤。2.干细胞在体外细胞培养中容易出现分化，可以转化为不需要的其他各个胚层的细胞，成为混杂细胞，无法去除。所以当我们获得了需要的足够量的高活性体细胞后，如何去除不再需要的干细胞，仅得到单纯的体细胞，是目前尚待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种在既能在保留体细胞的原有特性的同时提高体细胞增殖活性，又能避免干细胞的影响，仅获得单纯的体细胞的提高体细胞增殖活性的细胞共培养方法。
本发明的提高体细胞增殖活性的细胞共培养方法，其特征在于，包括以下步骤
a、将自杀基因转染入干细胞中；
b、将体细胞与已经转染了自杀基因的干细胞共培养；
C、体细胞完成增殖目的后，启动干细胞中的自杀基因，去除干细胞。
在体细胞与已经转染了自杀基因的干细胞共培养过程中，当干细胞分化后或不再具有促进体细胞增殖的作用时，可以通过特定的药物前体启动自杀基因去除干细胞，再次添加新鲜的已经转染了自杀基因的干细胞，新鲜的已经转染了自杀基因的干细胞可以继续提高体细胞的增殖活性，促进体细胞的快速增殖，如此可重复若干次，直至达到所需要的体细胞的量，并提高体细胞的增殖活性。
所述的自杀基因是指某些能表达特定的酶类的基因，这些酶类能将某些无毒或者低毒性的药物前体转化为细胞毒物质，从而导致携带该基因的细胞凋亡。所述的自杀基因包括胸苷激酶(Thymidine kinase, TK)基因、胞嘧啶脱氨酶(Cytosine deaminase，CD)基因、Ε· coli-gpt、细胞色素 P450 (Cytochrome P450/cytochrome P450 reductase)基因、硝基还原酶(Nitroreductase)基因、羧肽酶(Carboxyp印tidase G2)基因、e.coli-DeoD 基因(表达嘌呤核苷磷酸化酶)、白喉毒素基因(DTA基因)和FAS基因等自杀基因中的一种或一种以上。
所述的转染方法包括病毒或非病毒的转染方法，其中所述的病毒转染方法包括利用逆转录病毒载体，腺病毒载体，单纯疱疹病毒载体，EB病毒载体，细小病毒载体，痘病毒载体等载体介导的转染方法中一种或一种以上；所述的非病毒转染方法包括化学和物理的方法，包括阳离子聚合物，磷酸钙共沉淀转染法，人工脂质体法，DEAE葡聚糖介导转染法，直接注射法，电穿孔法，激光辐射法，磁性微粒法和基因枪等转染方法中的一种或一种以上。
所述的干细胞可以为胚胎干细胞，成体干细胞或其他任何干细胞中的一种或一种以上。可以使用多种干细胞，利用不同干细胞对体细胞的不同支持、营养作用，从而促进体细胞的增殖。
所述的体细胞包括组织器官中各种胚层细胞，具体可为皮肤、心血管、膀胱、韧带、 骨、神经、肝、肠道、血液、角膜、结膜或巩膜细胞的任何一种或一种以上。
所述的共培养是指将体细胞与干细胞混合接触培养。
所述的启动自杀基因方法为使用能与细胞中携带的自杀基因编码的特异性酶类起作用的低毒或无毒的药物前体而导致携带该基因的干细胞凋亡的方法。所述的药物前体包括无环鸟苷(acyclovir，ACV)、更昔洛韦(ganciclovir，GCv)、5_氟胞嘧啶、6-巯基黄嘌呤、环磷酰胺、6-甲基嘌呤-2-脱氧核糖核苷、ara-M、BVDU, CPA、IF0、CB1954, MeP_dR、 F-araA、CMDA、6-Thiopurines、ara-C、dFdC、异环磷酰胺和 MTX-α -ρ印tides 中的一种或一种以上。本领域技术人员可根据转染的自杀基因来选择其相对应的药物前体，再与自杀基因编码的特异性酶类其作用，从而引起携带该基因的干细胞凋亡。根据自杀基因选择药物前体的知识属于本领域的常规知识。可以通过使用一种或者多种自杀基因，分别使用一种或者多种不同的药物前体来启动各自相应的自杀基因的方法，或者启动自杀基因时，药物前体使用不同的浓度或者不同的使用次数的方法，达到调整干细胞凋亡的时间、速度和数量的目的，最终通过调节这些参数来灵活控制干细胞的生长和凋亡数量，影响体细胞的增殖，以适应不同的细胞工程或组织工程的需求。
本发明将携带有自杀基因的干细胞与体细胞混合共同培养，干细胞的存在提高了体细胞的增殖活性，从而使少量的体细胞能在短时间内快速生长，获得足够数量的体细胞， 当体细胞的数量足够时，启动干细胞携带的自杀基因，诱导干细胞凋亡，从而避免现有技术中干细胞与体细胞共培养时，由于干细胞的高增殖能力，并能多向分化为不同的细胞，移植后可以形成多种肿瘤的缺点和干细胞在体外细胞培养中容易出现分化，可以转化为不需要的其他各个胚层的细胞，成为混杂细胞，无法去除的缺点，最终得到单纯的，具有高增殖活性的体细胞，并且移植后无成瘤性，或者移植后可以有效去除。这不仅是细胞工程和组织工程的重大突破，而且也为下一代临床应用开拓了新的途径。本发明可以使用一种或者多种干细胞，一次或者多次添加干细胞，一次或者多次启动自杀基因，并可以通过随时灵活调整这些参数，调整获得需要数量的体细胞的时间和增殖活性以满足不同需求。本发明原理可靠，步骤简便，结果稳定，极易应用于各种生物工程领域的实验研究和临床治疗。
具体实施例方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
本发明的提高体细胞增殖活性的细胞共培养方法的具体步骤为
a.将干细胞转染入自杀基因采用病毒转染或非病毒转染的方法，将胸苷激酶 (Thymidine kinase,TK)基因、胞嘧啶脱氨酶(Cytosine deaminase,CD)基因、Ε· coli-gpt、 细胞色素 P450 (Cytochrome P450/cytochrome P450 reductase)基因、硝基还原酶 (Nitroreductase)基因、羧肽酶(Carboxyp印tidase G2)基因、E. coli-DeoD 基因(表达嘌呤核苷磷酸化酶)、白喉毒素基因(DTA基因)和FAS基因等自杀基因中的任何一种或一种以上导入干细胞中。
b.使用的干细胞可以为胚胎干细胞或者成体干细胞的一种或者一种以上。
c.使用的体细胞可以为各种胚层来源的细胞。包括皮肤、心血管、膀胱、韧带、骨、 肝、肠道、血液、神经、角膜、结膜或巩膜细胞中的任何一种或一种以上。
d.将导入了自杀基因的干细胞与体细胞行直接混合接触共培养。
e.体细胞的增殖活性升高，并快速获得足够的细胞量。
f.使用特异性的药物前体，能和自杀基因表达的特异性酶类起反应，将无毒性的特定药物前体成分代谢为细胞毒性产物，最终导致干细胞凋亡。这种药物前体包括无环鸟苷(acyclovir，ACV)、更昔洛韦(ganciclovir，GCv)、5_氟胞嘧啶、6-巯基黄嘌呤、环磷酰胺、6-甲基嘌呤-2-脱氧核糖核苷、ara-M、BVDU, CPA、IF0、CB1954、MeP-dR、F_araA、CMDA, 6-Thiopurines、ara_C、dFdC、异环磷酰胺和MTX- α -peptides等所有可以与相应自杀基因编码的特异性酶类起作用，从而导致携带该基因的干细胞凋亡的药物前体的一种或一种以上。
g.使用特异性药物前体的次数可以为一次或一次以上，浓度可以为高浓度也可以为低浓度，目的都是在去除干细胞成分，保留单纯的体细胞的同时，提高体细胞的增殖活性，并快速获得需要的细胞量。
h.所述的基因转染方法包括病毒和非病毒的转染方法的一种或一种以上。
i.其中所述的病毒转染方法包括逆转录病毒载体，腺病毒载体，单纯疱疹病毒载体，EB病毒载体，细小病毒载体，痘病毒载体等载体介导的转染方法中的一种或一种以上， 所述的非病毒转染方法包括化学和物理的方法，包括阳离子聚合物，磷酸钙共沉淀转染法， 人工脂质体法，DEAE葡聚糖介导转染法，直接注射法，电穿孔法，激光辐射法，磁性微粒法和基因枪等转染方法中的一种或一种以上。
实施例1
本实施例的目的是短时间内获得足够量的高活性角膜上皮细胞注本实施例所用的自杀基因包括胸苷激酶(Thymidine kinase, TK)基因、胞嘧啶脱氨酶(Cytosine deaminase, CD)基因、Ε·coli—gpt、细胞色素 P450 (Cytochrome P450/cytochrome P450reductase)基因、石肖基还原 Bl (Nitroreductase)基因、幾月太Bl (Carboxypeptidase G2)基因、e. coli-DeoD基因(表达嘌呤核苷磷酸化酶)、白喉毒素基因(DTA基因)和 FAS基因等任何一种自杀基因的一种或一种以上，干细胞为胚胎干细胞或成体干细胞的一种或一种以上，转染办法包括病毒和非病毒的转染方法的一种或一种以上，启动自杀基因的时间为一次或一次以上，启动自杀基因的药物为无环鸟苷(acyclovir，ACV)、更昔洛韦 (ganciclovir, GCv)、5_氟胞嘧啶、6-巯基黄嘌呤、环磷酰胺、6-甲基嘌呤_2_脱氧核糖核苷、ara-M、BVDU, CPA、IF0、CB1954、MeP-dR、F-araA、CMDA、6_Thiopurines、ara_C、dFdC、异环磷酰胺和MTX-α -ρ印tides等所有可以与相应自杀基因编码的特异性酶类起作用，从而导致携带该基因的干细胞凋亡的药物前体的一种或一种以上。其效果和以下相同。
1.将小鼠胚胎干细胞转染自杀基因采用脂质体转染的方法，将胸腺嘧啶核苷激酶基因(TK基因)导入小鼠胚胎干细胞中。
2.将兔角膜上皮细胞与带有自杀基因的小鼠胚胎干细胞行直接混合接触共培养， 培养液为小鼠胚胎干细胞培养液。
3.体外培养获得需要的兔角膜上皮细胞细胞量的增殖时间从14天缩短到5天，并且结果显示，兔角膜上皮细胞的增殖活性提高。其中代表兔角膜上皮增殖功能的角膜上皮细胞克隆形成率由9. 95%从提高到了 34.2%，流式细胞仪检测代表兔角膜上皮细胞低分化标志的P63从12%提高到了 72%左右，Κ 67从增长到60%，细胞进入S/&期的量从14%增加到32%。
4. 一次性添加使用针对TK自杀基因编码的特异性酶类起作用的特定的药物前体更昔洛韦20ymol/L到培养液中。更昔洛韦与自杀基因表达的特异性酶类起反应，将无毒性的更昔洛韦代谢为三磷酸化产物GCT-TP，产生细胞毒性，3天后小鼠胚胎干细胞全部凋亡。
5.经检测，培养皿中仅保留兔角膜上皮细胞，细胞量不减少，细胞增殖活性高，处于DNA合成期的细胞不变，免疫组化实验显示细胞表达的低分化标志p63不减少，克隆形成率实验证实细胞的增殖能力不影响。
实施例2
本实施例的目的是短时间内获得足够量的高活性人皮肤表皮细胞注本实施例所用的自杀基因包括胸苷激酶(Thymidine kinase, TK)基因、胞嘧啶脱氨酶(Cytosine deaminase, CD)基因、Ε·coli—gpt、细胞色素 P450 (Cytochrome P450/cytochrome P450reductase)基因、石肖基还原Bl (Nitroreductase)基因、幾月太Bl (Carboxypeptidase G2)基因、e. coli-DeoD基因(表达嘌呤核苷磷酸化酶)、白喉毒素基因(DTA基因)和 FAS基因等任何一种自杀基因的一种或一种以上，干细胞为胚胎干细胞或成体干细胞的一种或一种以上，转染办法包括病毒和非病毒的转染方法的一种或一种以上，启动自杀基因的时间为一次或一次以上，启动自杀基因的药物为无环鸟苷(acyclovir，ACV)、更昔洛韦 (ganciclovir, GCv)、5_氟胞嘧啶、6-巯基黄嘌呤、环磷酰胺、6-甲基嘌呤_2_脱氧核糖核苷、ara-M、BVDU, CPA、IFO、CB1954、MeP-dR、F-araA、CMDA、6_Thiopurines、ara_C、dFdC、异环磷酰胺和MTX- α -peptides等所有可以与相应自杀基因编码的特异性酶类起作用，从而导致携带该基因的细胞凋亡的药物前体的一种或一种以上。其效果和以下相同。
1.将人脐带血干细胞转染自杀基因采用腺病毒载体转染的方法，将胞嘧啶脱氨酶(Cytosine deaminase,⑶)基因，导入人脐带血干细胞中；将人胚胎干细胞转染自杀基因使用脂质体转染的方法，将胸腺嘧啶核苷激酶基因(TK基因)导入人胚胎干细胞中。
2.将带有自杀基因的人脐带血干细胞和人胚胎干细胞与人皮肤表皮细胞直接混合接触共培养，其培养液为胚胎干细胞培养液。
3.体外培养获得第一个需要的人皮肤表皮细胞细胞量的增殖时间从11天缩短到 4天，并且结果显示，人皮肤表皮细胞增殖活性增强，代表皮肤干细胞的(^/G1期细胞比例从 36%提高到55%，克隆形成率由11. 2%提高到23. 6%，流式细胞仪检测显示细胞表达的低分化标志K19从21%提高到32%。
4.添加药物前体5-氟胞嘧啶，该药物前体能与该人脐带血干细胞中的CD自杀基因表达的特异性酶类起反应，将无毒性的5-氟胞嘧啶代谢为5-氟尿嘧啶，产生细胞毒性， 最终导致人脐血干细胞1天后全部凋亡。
5.体外培养获得第二个需要的人皮肤表皮细胞细胞量的增殖时间从3天缩短到 2天，并且结果显示，人皮肤表皮细胞增殖活性增强，代表皮肤干细胞的(^/G1期细胞比例从 55%提高到85%，克隆形成率由23. 6%提高到36. 9%，流式细胞仪检测显示细胞表达的低分化标志K19从32%提高到41 %。
6. 一次性添加使用针对TK自杀基因编码的特异性酶类起作用的特定的药物前体更昔洛韦20ymol/L到培养液中。更昔洛韦与自杀基因表达的特异性酶类起反应，将无毒性的更昔洛韦代谢为三磷酸化产物GCT-TP，产生细胞毒性，3天后胚胎干细胞全部凋亡。
7.经检测，培养皿中仅保留人皮肤表皮细胞，不影响其增殖活性，代表皮肤干细胞的(^/G1期细胞比例不变，流式细胞仪检测显示细胞表达的低分化标志K19比例不减少克隆形成率实验证实细胞的增殖能力不影响。
实施例3
本实施例的目的是短时间内获得足够量的高活性猫角膜内皮细胞。注本实施例所用的自杀基因包括胸苷激酶(Thymidine kinase, TK)基因、胞嘧啶脱氨酶(Cytosine deaminase, CD)基因、Ε· coli—gpt、细胞色素 P450 (Cytochrome P450/cytochrome P450reductase)基因、石肖基还原Bl (Nitroreductase)基因、幾月太Bl (Carboxypeptidase G2)基因、e. coli-DeoD基因(表达嘌呤核苷磷酸化酶)、白喉毒素基因(DTA基因)和 FAS基因等任何一种自杀基因的一种或一种以上，干细胞为胚胎干细胞或成体干细胞的一种或一种以上，转染办法包括病毒和非病毒的转染方法的一种或一种以上，启动自杀基因的时间为一次或一次以上，启动自杀基因的药物为无环鸟苷(acyclovir，ACV)、更昔洛韦 (ganciclovir, GCv), 5-氟胞嘧啶、6-巯基黄嘌呤、环磷酰胺、6-甲基嘌呤_2_脱氧核糖核苷、ara-M、BVDU, CPA、IFO、CB1954、MeP-dR、F-araA, CMDA、6_Thiopurines、ara_C、dFdC、异环磷酰胺和MTX- α -peptides等所有可以与相应自杀基因编码的特异性酶类起作用，从而导致携带该基因的细胞凋亡的药物前体的一种或一种以上。其效果和以下相同。
1.将人骨髓间充质干细胞转染入自杀基因采用磷酸钙共沉淀的方法，将细胞色素P4502B1基因导入人骨髓间充质干细胞中。
2.将猫的角膜内皮细胞与带有自杀基因的人骨髓间充质干细胞直接混合接触共培养，其培养液为骨髓间充质干细胞培养液。
3.体外培养获得需要的猫角膜内皮细胞量的增殖时间从21天缩短到12天，并且结果显示，猫角膜内皮细胞增殖活性增强，流式细胞仪检测代表细胞增殖性的Ki67阳性细胞从3. 2%增殖到9. 4%，克隆形成率由1. 3%提高到2. 2%，细胞进入S/&期的细胞由 16. 4%±曾力口至Ij 30. 9%。
4. 一次性添加药物前体环磷酰胺，与人骨髓间充质干细胞中的自杀基因表达的特异性酶类起反应，将无毒性的环磷酰胺代谢为有细胞毒性的4-0HCPA，最终导致人骨髓间充质干细胞2天后全部凋亡。
5.经检测，培养皿中仅保留猫角膜内皮细胞，不影响其增殖活性，处于DNA合成期和&期的细胞量不变，克隆形成率实验证实细胞的增殖能力不影响。
实施例4:
本实施例的目的是短时间内获得足够量的高活性兔结膜上皮细胞注本实施例所用的自杀基因包括胸苷激酶(Thymidine kinase, TK)基因、胞嘧啶脱氨酶(Cytosine deaminase, CD)基因、Ε·coli—gpt、细胞色素 P450 (Cytochrome P450/cytochrome P450reductase)基因、石肖基还原Bl (Nitroreductase)基因、幾月太Bl (Carboxypeptidase G2)基因、E. coli-DeoD基因(表达嘌呤核苷磷酸化酶)、白喉毒素基因(DTA基因)和 FAS基因等任何一种自杀基因的一种或一种以上，干细胞为胚胎干细胞或成体干细胞的一种或一种以上，转染办法包括病毒和非病毒的转染方法的一种或一种以上，启动自杀基因的时间为一次或一次以上，启动自杀基因的药物为无环鸟苷(acyclovir，ACV)、更昔洛韦 (ganciclovir, GCv)、5_氟胞嘧啶、6-巯基黄嘌呤、环磷酰胺、6-甲基嘌呤_2_脱氧核糖核苷、ara-M、BVDU, CPA、IF0、CB1954、MeP-dR、F-araA、CMDA、6_Thiopurines、ara_C、dFdC、异环磷酰胺和MTX-α -ρ印tides等所有可以与相应自杀基因编码的特异性酶类起作用，从而导致携带该基因的细胞凋亡的药物前体的一种或一种以上。其效果和以下相同。
1.将人脂肪干细胞转染自杀基因采用脂质体转染的方法，将胸腺嘧啶核苷激酶基因(TK基因)导入人脂肪干细胞中。
2.将兔结膜上皮细胞与带有自杀基因的人脂肪干细胞直接混合接触共培养，其培养液为人脂肪干细胞培养液。
3.体外培养获得需要的兔结膜上皮细胞量的增殖时间从16天缩短到8天，并且结果显示，兔结膜上皮细胞增殖活性增强，代表细胞增殖性能的克隆形成率由14%提高到 22%，代表细胞增殖能力的MTT实验BrdU吸光度由1. 45提高到3. 65。组织学显示细胞规则排列，胞浆丰富。
4.分两次培养添加药物前体更昔洛韦。与干细胞中的TK自杀基因表达的特异性酶类起反应，将更昔洛韦代谢为三磷酸化产物GCT-TP，产生细胞毒性产物，最终导致人脂肪干细胞3天后全部凋亡。
5.经检测，培养皿中仅保留兔结膜上皮细胞，不影响其增殖活性，代表细胞增殖能力的MTT实验结果不变，克隆形成率实验不变，证实兔结膜细胞的增殖能力，保持高增长活性。
权利要求
1.一种提高体细胞增殖活性的细胞共培养方法，其特征在于，包括以下步骤a、将自杀基因转染入干细胞中；b、将体细胞与已经转染了自杀基因的干细胞共培养；C、体细胞完成增殖目的后，启动干细胞中的自杀基因，去除干细胞。
2.根据权利要求1所述的提高体细胞增殖活性的细胞共培养方法，其特征在于，在体细胞与已经转染了自杀基因的干细胞共培养过程中，当干细胞分化后或不再具有促进体细胞增殖的作用时，启动自杀基因去除干细胞，再次添加新鲜的已经转染了自杀基因的干细胞，如此可重复若干次，直至体细胞完成增殖目的。
3.根据权利要求1或2所述的提高体细胞增殖活性的细胞共培养方法，其特征在于，所述的自杀基因为胸苷激酶基因、胞嘧啶脱氨酶基因、E. coli-gpt、细胞色素P450基因、硝基还原酶基因、羧肽酶基因、E. coli-DeoD基因、白喉毒素基因和FAS基因中的一种或一种以上。
4.根据权利要求1或2所述的提高体细胞增殖活性的细胞共培养方法，其特征在于，所述的转染方法为病毒或非病毒的转染方法。
5.根据权利要求4所述的提高体细胞增殖活性的细胞共培养方法，其特征在于，所述的病毒转染方法为利用逆转录病毒载体，腺病毒载体，单纯疱疹病毒载体，EB病毒载体，细小病毒载体和痘病毒载体介导的转染方法中一种或一种以上。
6.根据权利要求4所述的提高体细胞增殖活性的细胞共培养方法，其特征在于，所述的非病毒转染方法为阳离子聚合物，磷酸钙共沉淀转染法，人工脂质体法，DEAE葡聚糖介导转染法，直接注射法，电穿孔法，激光辐射法，磁性微粒法和基因枪法中的一种或一种以上。
7.根据权利要求1或2所述的提高体细胞增殖活性的细胞共培养方法，其特征在于，所述的干细胞为胚胎干细胞，成体干细胞或其他任何干细胞中的一种或一种以上。
8.根据权利要求1或2所述的提高体细胞增殖活性的细胞共培养方法，其特征在于，所述的体细胞为皮肤、心血管、膀胱、韧带、骨、神经、肝、肠道、血液、角膜、结膜和巩膜细胞的任何一种或一种以上。
9.根据权利要求1或2所述的提高体细胞增殖活性的细胞共培养方法，其特征在于，所述的共培养是指将体细胞与干细胞混合接触培养。
10.根据权利要求1或2所述的提高体细胞增殖活性的细胞共培养方法，其特征在于， 所述的启动自杀基因是指利用低毒或无毒的药物前体与干细胞中携带的自杀基因编码的特异性酶类起作用而导致携带该基因的干细胞凋亡而去除干细胞，所述的药物前体为无环鸟苷、更昔洛韦、5-氟胞嘧啶、6-巯基黄嘌呤、环磷酰胺、6-甲基嘌呤-2-脱氧核糖核苷、 ara-M、BVDU、CPA、IF0、CB1954、MeP-dR、F-araA、CMDA、6-Thiopurines、ara-C、dFdC、异环磷酰胺和MTX-α -ρ印tides中的一种或一种以上。
全文摘要
本发明公开了一种提高体细胞增殖活性的细胞共培养方法。它是将自杀基因转染入干细胞中；将体细胞与已经转染了自杀基因的干细胞共培养；体细胞完成增殖目的后，启动干细胞中自杀基因，去除干细胞。本发明将携带有自杀基因的干细胞与体细胞共同培养，干细胞的存在提高了体细胞的增殖活性，使少量的体细胞能在短时间内快速生长，获得足够数量的体细胞，当体细胞的数量足够时，启动干细胞携带的自杀基因，诱导干细胞凋亡，得到单纯的具有高增殖活性的体细胞，移植后无成瘤性，这不仅是细胞工程和组织工程的重大突破，而且也为下一代临床应用开拓了新的途径。本发明原理可靠，步骤简便，结果稳定，极易应用于各种生物工程领域的实验研究和临床治疗。
文档编号C12N5/07GK102559578SQ20121004113
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月22日 优先权日2012年2月22日
发明者周强, 武征, 王智崇 申请人:中山大学中山眼科中心