专利名称：环介导等温扩增禽传染性支气管炎病毒的引物、检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及禽传染性支气管炎病毒检测技术领域，特别涉及环介导等温扩增禽传染性支气管炎病毒的引物，还涉及一种禽传染性支气管炎病毒的检测试剂盒，还涉及所述禽传染性支气管炎病毒的检测方法。
背景技术：
禽传染性支气管炎又称鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis, IB),是由禽传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus, IBV)引起的急性、高度接触性的呼吸道和泌尿生殖道疾病。该病的特征是以幼鸡器官罗音、咳嗽、呼吸困难等呼吸道症状为主；产蛋鸡则通常发生产蛋量和蛋的品质下降，输卵管受到永久性损伤而丧失产蛋能力。发生肾型传染性支气管炎的病鸡还常表现拉淀粉糊样粪便，肾脏苍白、肿大，肾小管和输尿管内有大量白色的尿酸盐沉积。禽传染性支气管炎病毒的血清型众多，交叉保护力低，引起的临床病多样，给养禽业造成巨大的经济损失。禽传染性支气管炎病毒诊断方法有很多，主要有免疫琼脂扩散(AGP)试验、酶联免疫吸附(ELISA)试验、免疫印迹(IBT)、聚合酶链式反应(PCR)以及实时荧光定量 (real-time PCR)等。但上述方法存在试验周期较长、操作繁琐、受检测材料限制、对实验仪器及检测人员的技术要求高等不同缺点，因此不适合在基层实验室应用。江苏省家禽科学研究所于2010年I月8日申请了名称为“基于环介导等温扩增技术的鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂盒及其使用方法”，申请号为“201010017295. 5” 的中国发明专利申请，公开了使用三对特异性引物即内引物、外引物和环引物对鸡传染性支气管炎病毒进行检测的技术，但此申请并未提及检测灵敏度及特异性的问题，因此，我们无从知晓其公开的试剂盒及方法的灵敏度及特异性，因此此专利申请的技术方案其实并没有实践意义。
发明内容
为了解决以上现有技术中尚无有实际检测意义的环介导等温检测禽传染性支气管炎病毒的方法的技术，本发明提供了特异性和灵敏度好的环介导等温扩增禽传染性支气管炎病毒的引物。本发明的另一个目的是提供一种快速、准确检测禽传染性支气管炎病毒的检测试剂盒。本发明还提供了一种禽传染性支气管炎病毒的检测方法。本发明是通过以下措施实现的
一种环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)禽传染性支气管炎病毒的引物，共包括外侧引物对、内侧引物对和环形引物对三对特异性引物，三对引物对能与禽传染性支气管炎病毒(GeneBank Accession Number AF470626)中5a_5b (见序列表中序列I)基因结合，序列如下
外侧引物对
上游引物 F3 :5’ -TTAGATTTAGTTTATAGGTTGG-3’，见序列表中序列 2，下游引物B3 5’ -CCTTACCGCTTGCCATGA-3’，见序列表中序列3，
内侧引物对
上游引物FIP
5’ -AACACAATCTAATCCTTCTCTCAITTTGTATGAATAATAGTAAAGATAATCC-3’，见序列表中序
列4，
下游引物BIP
5’ -TACTTTCTTAACAAAGCAGGACAITTTCACAAGITTTCCCTTGGAATA-3’，见序列表中序列 5， 环形引物对
上游引物LF :5’ -CTTTTCTTGCTATTGCTCC-3’，见序列表中序列6，
下游引物LB 5’ -CAGAGCCTTGTCCCGCGT-3’，见序列表中序列7，
夕卜侧引物对、内侧引物对、环形引物对的摩尔比为1:8:4。引物识别的八个区域位于近年所有禽传染性支气管炎病毒5a_5b基因的保守区， 所以引物能够识别所有的禽传染性支气管炎病毒5a_5b基因。本发明提供的禽传染性支气管炎病毒检测试剂盒在使用过程中，所述的外侧引物对、内侧引物对和环形引物对作为一个整体使用，使用时应尽量避免弓I物二聚体的形成。一种禽传染性支气管炎病毒的检测试剂盒，包括环介导等温扩增反应液，环介导等温扩增反应液中含有上述三对特异性引物。所述的检测试剂盒，每24 μ L环介导等温扩增反应液中含有外侧引物对上游引物和下游引物各5pmol，内侧引物对上游引物和下游引物各40pmol，环形引物对上游引物和下游引物各20pmol。所述的检测试剂盒，每24 μ L环介导等温扩增反应液中还含有TriS-HCl 20mM、 KCl IOmM, (NH4)2SO4 IOmM, MgSO4 4_16mM、Tween20 O. 1%、钙黄绿素 O. 05 mM、MnCl2 O. 6mM、 AMV反转录酶O. 2U、甜菜碱O. 8M、脱氧核苷酸dNTPs I. 4mM、Bst聚合酶8U。所述的检测试剂盒，每24 μ L环介导等温扩增反应液中还含有Tris-HCl 20mM、 KCl IOmM, (NH4)2SO4 IOmM, MgSO4 8mM、Tween20 O. 1%、钙黄绿素 O. 05 mM、MnCl2 O. 6mM、AMV 反转录酶O. 2U、甜菜碱O. 8M、脱氧核苷酸dNTPs I. 4mM、Bst聚合酶8U。所述的检测试剂盒，所述的检测试剂盒中还包括荧光显色剂。所述的检测试剂盒，荧光显色剂为钙黄绿素和MnCl2。一种禽传染性支气管炎病毒的检测方法，是用所述的禽传染性支气管炎病毒的检测试剂盒对来自发病禽类动物的样品总RNA进行环介导等温扩增反应，确定发病禽类动物中是否携带禽传染性支气管炎病毒。所述环介导等温扩增反应条件为59-65°C、30-75分钟。所述试剂盒还包括环介导等温扩增试剂、阳性对照、阴性对照；所述阳性对照为禽传染性支气管炎病毒RNA。所述的检测方法，还包括将进行完环介导等温扩增反应的样本在80°C条件下反应 2分钟。应用本发明提供的试剂盒检测禽传染性支气管炎病毒，可以通过直接检视判断样本是否含有禽传染性支气管炎病毒。直接检视方法为
装有阳性对照的反应管有亮绿色可见荧光，装有阴性对照的反应管仍为棕黄色无荧光液体。如果装有待检样品的反应管有亮绿色可见荧光，则说明待检样品中禽传染性支气管炎病毒检测结果为阳性。如果装有待检样品的反应管仍为棕黄色无荧光液体，则说明待检样品中禽传染性支气管炎病毒检测结果为阴性。本发明提供的禽传染性支气管炎病毒检测试剂盒检测原理如下
所述的引物组与所述的禽传染性支气管炎病毒AF470626序列5a_5b基因8个特定结合区域结合，见表I。表I引物组与所述的禽传染性支气管炎病毒AF470626序列5a_5b基因结合区域
权利要求
1.一种环介导等温扩增禽传染性支气管炎病毒的引物，其特征在于共包括外侧引物对、内侧引物对和环形引物对三对特异性引物，序列如下外侧引物对上游引物 F3 :5’ -TTAGATTTAGTTTATAGGTTGG-3 ，下游引物 B3 : 5’ -CCTTACCGCTTGCCATGA-3’，内侧引物对上游引物FIP 5’ -AACACAATCTAATCCTTCTCTCATTTTGTATGAATAATAGTAAAGATAATCC-3’ ，下游引物BIP 5’ -T ACTTTCTTAACAAAGCAGGACATTTTCACAAGTTTTCCCTTGGAATA-3’ ，环形引物对上游引物 LF :5’ -CTTTTCTTGCTATTGCTCC-3’，下游引物 LB : 5 ’ -CAGAGCCTTGTCCCGCGT-3，，夕卜侧引物对、内侧引物对、环形引物对的摩尔比为1:8:4。
2.一种禽传染性支气管炎病毒的检测试剂盒，其特征在于包括环介导等温扩增反应液，环介导等温扩增反应液中含有权利要求I中的三对特异性引物。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于每24μL环介导等温扩增反应液中含有外侧引物对上游引物和下游引物各5pmol，内侧引物对上游引物和下游引物各 40pmoI,环形引物对上游引物和下游引物各20pmoI。
4.根据权利要求2或3所述的检测试剂盒，其特征在于每24μ L环介导等温扩增反应液中还含有 Tris-HCl 20mM、KCl IOmM, (NH4) 2SO4 IOmM、MgSO4 4_16mM、Tween20 O. 1%、钙黄绿素O. 05 mM、MnCl2 O. 6mM、AMV反转录酶O. 2U、甜菜碱O. 8M、脱氧核苷酸dNTPs I. 4mM、 Bst聚合酶8U。
5.根据权利要求2或3所述的检测试剂盒，特征在于每24μ L环介导等温扩增反应液中还含有 Tris-HCl 20mM、KCl IOmM, (NH4)2SO4 IOmM, MgSO4 8mM、Tween20 O. 1%、钙黄绿素O.05 mM, MnCl2 O. 6mM、AMV 反转录酶 O. 2U、甜菜碱 O. 8M、脱氧核苷酸 dNTPs 1.4mM、Bst 聚合酶8U。
6.根据权利要求2或3所述的检测试剂盒，特征在于所述的检测试剂盒中还包括荧光显色剂。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，特征在于荧光显色剂为钙黄绿素和MnCl2。
8.一种禽传染性支气管炎病毒的检测方法，其特征是使用权利要求2或3所述的检测试剂盒对样品RNA进行环介导等温扩增反应，同时设置阳性对照组和阴性对照组，所述环介导等温扩增反应条件为59-65°C、30-75分钟。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于将进行完环介导等温扩增反应的样本在80°C条件下反应2分钟。
全文摘要
本发明涉及禽传染性支气管炎病毒检测技术领域，环介导等温扩增禽传染性支气管炎病毒的引物，共包括外侧引物对、内侧引物对和环形引物对三对特异性引物，如序列表中所示，三对引物摩尔比为1:8:4。禽传染性支气管炎病毒的检测试剂盒，包括环介导等温扩增反应液，环介导等温扩增反应液中含有三对特异性引物。检测方法，用检测试剂盒对来自发病禽类动物的样品总RNA进行环介导等温扩增反应，反应条件为59-65℃、30-75分钟。本发明的检测试剂盒，特异性和敏感性高，快速，可检测出1个拷贝的RNA。
文档编号C12Q1/70GK102605100SQ20121004049
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月22日 优先权日2012年2月22日
发明者张琳, 张秀美, 杨少华, 胡北侠, 颜世敢 申请人:山东省农业科学院畜牧兽医研究所