专利名称：一种d-塔格糖3-差向异构酶固定化方法
技术领域：
本发明涉及一种D-塔格糖3-差向异构酶固定化方法，属生物工程技术领域。
背景技术：
国际稀有糖协会(ISRQ对稀有糖的定义为“在自然界存在但含量极少的一类单糖及其衍生物”。D-阿洛酮糖(D-Psicose)是一种在自然界中较为稀有的天然己酮糖，属于稀有糖的一种。D-阿洛酮糖是D-果糖在C3位置的差向异构体，其甜味类似于蔗糖，甜度相当于果糖的70%，而热量值却只有0. 007kcal/g,因此被称为零能量甜味剂，同时D-阿洛酮糖还具有改善肠道菌群、降低血糖、抗龋齿等功能特性。D-塔格糖3-差向异构酶(D-tagatose 3-epimerase,以下简称DTE)家族蛋白可催化D-果糖异构为D-阿洛酮糖，是D-阿洛酮糖生物转化生产的关键酶。由于固定化酶在稳定性、重复使用性、经济成本、特殊工艺需要等方面较游离酶制剂有着显著的优越性，为了更有效地利用各种游离酶制剂，酶的固定化研究也一直受到研究者的重视。而关于DTE 家族的固定化研究并不多，目前仅有日本香川大学(Kagawa University) Izumori团队和韩国世宗大学(Sejong University) Oh团队对DTE家族的固定化进行过报道。其中，Izumori 团队先后对菊芋假单胞菌iPsGudomorms cichorii)野生菌来源和重组表达的DTE固定化， 进行D-阿洛酮糖的生物转化法生产研究，优化后的工艺以Chitopearl beads为载体，通过离子交换结合方法固定重组DTE ;0h团队以离子交换树脂Duolite A568对根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) : ^ ^! 白勺 D_psicose 3-epimerase ii^TlSl^^b ￠: 硼酸盐存在下，D-阿洛酮糖的转化率达到65%。因此筛选新的树脂进行DTE家族的固定化成为食品从业者的新任务。
发明内容
本发明的目的在于提供一种D-塔格糖3-差向异构酶固定化方法。本发明实现目的的技术方案是
一种D-塔格糖3-差向异构酶固定化方法，包括下列步骤
(1)获取酶液称取R.sphaeroides SKOll发酵菌体，按质量体积比1 10的比例，加入缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，50mmol/L NaCl, pH7. 0-8. 0)重悬菌体，利用超声波细胞破碎仪处理菌体后，在转速为600(Tl0000r/min、温度为0 5°C的条件下离心l(T30min，收集上清液，此上清液即为D-塔格糖3-差向异构酶液；
(2)离子交换树脂处理采用313、或D301-III离子交换树脂，先用去离子水浸泡胀润、 去杂，接着用质量浓度4%NaOH溶液浸泡1 后去离子水清洗至中性，再用质量浓度4%HC1 溶液浸泡1 后去离子水清洗至中性，最后用质量浓度4%NaOH溶液浸泡1 后去离子水清洗至中性，用两倍树脂体积的去离子水浸泡，4°C下保存；
(3)固定化采用先吸附后交联的方法，向处理好的离子交换树脂中加入D-塔格糖3-差向异构酶液，每g树脂加入D-塔格糖3-差向异构酶粗酶液l_6mL，并加入上述Tris-HCl缓冲液补足6mL，于pH 7. 0 8. 0、2(T40°C吸附6 12h后取出；加入戊二醛溶液至终浓度为0. 019Γ0. 2%，于2、°C轻轻振荡交联广5h，用去离子水洗涤以除去游离酶和未交联的戊二醛，即得到固定化的D-塔格糖3-差向异构酶。固定化酶液的制备
球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides, R. sphaeroides),定名为 R. sphaeroides SKOlUP CCTCC N0.M207185，通过发酵制备菌体(发酵具体条件见ZL200710191380. 1)；离心发酵液(10000 g，10 min,4°C )收集菌体，用Tris-HCl缓冲液(50 mM, pH 8.0)洗涤细胞2次即得静息细胞；细胞按质量体积比1:10加入Tris-HCl缓冲液(50 mM,pH 8.0)重悬后超声破碎7 min(300 W，工作1 s，停3 s，冰浴)，离心(15000 g，20min，4°C )后对上清测定DTE活性，即为游离酶活。游离DTE酶活力测定
取 30 μ L 游离酶上清液，加 50 μ L 400 g/L D-果糖及 120 μ L Tris-HCl (50 mM,pH 8.0)缓冲液，50°C反应5 min，立即取出，加热煮沸10 min终止反应，冷却，12000 r/min离心15min后取上清，HPLC检测。固定化DTE酶活力测定
称取固定化酶0. lg，加ImL 100 g/L D-果糖(用50 mM,pH 8. 0的Tris-HCl缓冲液配制)，反应及测定方法同游离DTE酶活力测定。酶活力定义
在50°C、pH 8.0条件下，以D-果糖为底物反应，每分钟生成1 μπιο D-阿洛酮糖的酶量为一个酶活力单位。酶活回收率定义
固定化酶的酶活回收率是指固定化酶的总活力与用于固定化的游离酶的总酶活力之比的百分率。
权利要求
1. 一种D-塔格糖3-差向异构酶固定化方法，其特征在于包括下列步骤(1)获取酶液称取R.sphaeroides SKOll发酵菌体，按质量体积比1 10的比例，加入50mmol/L Tris-HCl、50mmol/L NaCl、pH7. 0-8. 0缓冲液重悬菌体，利用超声波细胞破碎仪处理菌体后，在转速为600(Tl0000r/min、温度为(T5°C的条件下离心l(T30min，收集上清液，此上清液即为D-塔格糖3-差向异构酶液；(2)离子交换树脂处理采用313、或D301-III离子交换树脂，先用去离子水浸泡胀润、 去杂，接着用质量浓度4%NaOH溶液浸泡1 后去离子水清洗至中性，再用质量浓度4%HC1 溶液浸泡1 后去离子水清洗至中性，最后用质量浓度4%NaOH溶液浸泡1 后去离子水清洗至中性，用两倍树脂体积的去离子水浸泡，4°C下保存；(3)固定化采用先吸附后交联的方法，向处理好的离子交换树脂中加入D-塔格糖3-差向异构酶液，每g树脂加入D-塔格糖3-差向异构酶粗酶液l_6mL，并加入上述 Tris-HCl缓冲液补足6mL，于pH 7. 0 8. 0、2(T40°C吸附6 12h后取出；加入戊二醛溶液至终浓度为0. 019Γ0. 2%，于2、°C轻轻振荡交联广5h，用去离子水洗涤以除去游离酶和未交联的戊二醛，即得到固定化的D-塔格糖3-差向异构酶。
全文摘要
一种D-塔格糖3-差向异构酶固定化方法，属生物工程技术领域。本发明步骤是(1)预处理菌体获得目的酶液；(2)预处理离子交换树脂；(3)向处理好的大孔离子交换树脂中加入D-塔格糖3-差向异构酶液进行吸附后，加入戊二醛溶液进行交联，用去离子水洗涤以除去游离酶和未交联的戊二醛，即得到固定化的D-塔格糖3-差向异构酶。本发明以离子交换树脂为载体，通过先吸附后交联的方法固定了D-塔格糖3-差向异构酶，该法操作简单，成本低廉，固定的D-塔格糖3-差向异构酶储存稳定性和操作稳定性高，有较宽的pH适应性，固定化酶活回收率可达50%以上。
文档编号C12N11/08GK102533711SQ201210040790
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月22日 优先权日2012年2月22日
发明者周林芳, 张涛, 江波, 沐万孟, 缪铭 申请人:江南大学