一种小脑浦肯野细胞的体外培养方法
【专利摘要】本发明属于细胞生物学【技术领域】，提供了一种浦肯野细胞的体外培养方法。本发明发法浦肯野细胞所培养的新鲜培养基是由DMEM/F-12培养基添加B27神经细胞生长添加剂组成。在体外培养第14天的浦肯野细胞能够清楚的看到浦肯野细胞的明显结构，当第28天的时候可以看到更多的树突结构，细胞发育的非常好。本发明方法培养基能在国内很容易购买。且木瓜蛋白酶的激活方法能更好的为培养浦肯野细胞服务。
【专利说明】一种小脑浦肯野细胞的体外培养方法
[0001]
【技术领域】
[0002] 本发明属于细胞生物学【技术领域】，特别是提供了一种浦肯野细胞的体外培养方 法，适用于基础医学方面的研究。
【背景技术】
[0003] 目前针对小脑浦肯野细胞的体外培养方法有很多，主要有如下不足：1.木瓜蛋白 酶针对小脑组织的消化能力不强，不能充分消化组织块；2.在国际上培养浦肯野细胞的培 养基主要是来源于日本"S μ mitomo"神经细胞培养基。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种浦肯野细胞的体外培养方法。该方法使 用能够很容易购买的浦肯野细胞的体外培养的培养基。
[0005] 本发明针对国内的情况，进行了如下的改良：1.针对木瓜蛋白酶消化组织块效果 差的情况，我们采用激活木瓜蛋白酶，采用如下方法：2ml PBS溶液（或者不含Ca2+、Mg2+的 D-Hanks)、32. 2μ1半胱氨酸、16.4μ1木瓜蛋白酶37°C热激30min。在消化组织块的时 候在加入2μ1 DNase I。②.本实验方法培养浦肯野细胞的培养基为DMEM/F-12培养基、 B27神经细胞生长添加剂，采用的是一种无血清的培养基。
[0006] -种浦肯野细胞的体外培养方法，包括如下步骤： (1) 多聚赖氨酸处理的盖玻片准备 用IOOyg/μ 1多聚赖氨酸包被盖玻片，盖玻片置于35mm的培养皿中37°C 5% 0)2培 养过夜，用高压灭菌过的PBS进行清洗，在包被的盖玻片附近加入PBS，晃动培养皿，洗掉废 弃的PBS，重复一次，然后置于通风厨内晾干；木瓜蛋白酶消化小脑组织后将细胞接种在盖 玻片上； (2) 激活木瓜蛋白酶 将2ml PBS溶液或者不含Ca2+、Mg2+的D-Hanks溶液、32. 2μ1半胱氨酸、16. 4μ1木 瓜蛋白酶37°C热激30min ; (3) 接种细胞 ①.取3只PO时期的C57BL/6鼠婴，取小脑置于D-Hanks液中，去掉血管、脑膜，取其 小脑置于D-Hanks液中； .切 碎，IOOOrpm离心2min后去掉上清；:1 ·加入热激后的木瓜蛋白酶、2μ1 DNase I，37°C消 化15min ;④.用Iml枪头吹打10下继续37°C消化15min ;⑤.将消化好的组织经过40 μ m 的过滤网后，加入含有FBS培养基终止消化，IOOOrpm离心5min后，弃上清；⑥.加入含有 血清的培养基600 μ 1，该培养基由90vol%DMEM/F-12和10vol%FBS组成，计数，细胞数在 5*105,37°C培养1小时；⑦.加入成新鲜培养基lml，新鲜培养基由DMEM/F-12培养基中添 加2vol%的B27神经细胞生长添加剂组成，此后每隔3天置换一半的新鲜培养基。
[0007] (4)细胞发育情况的检测 分别取出已经培养14、28天的浦肯野细胞进行发育情况的检测，检测的指标选取的是 浦肯野细胞特异性的标记Calbindin抗体，通过免疫组化的方法来标记浦肯野细胞，在显 微镜下清晰的看到浦肯野细胞的树突结构。
[0008] 将培养好的浦肯野细胞取出，洗掉培养基，置换IxPBS清洗3次，每次5min ;加入 IxPBT对细胞进行破膜处理25min ;0. 3%H202漂洗15min ;用IxPBS清洗三次，每次5min，吸 干PBS溶液；用5%正常山羊血清进行封闭，室温封闭1小时；加入一抗（Calbindin，1 :500， 用5%正常山羊血清进行稀释)，室温2小时；用IxPBS溶液清洗3次，每次IOmin ;加入生物 素标记的二抗（1 :200)，室温1小时；用IxPBS溶液清洗3次，每次IOmin ;用DAB显色，待显 色充分用IxPBS溶液终止显色反应。
[0009] 本发明所述的Calbindin抗体为浦肯野细胞特异性的标记分子，通过免疫荧光或 者免疫组化的方法能够很好的显示出浦肯野细胞的完整的形态结构。
[0010] 本发明的优点在于，所述的浦肯野细胞所培养的新鲜培养基是由DMEM/F-12培养 基添加 B27神经细胞生长添加剂组成，这种培养基能在国内很容易购买并且用来配制进行 实验。且木瓜蛋白酶的激活方法能更好的为培养浦肯野细胞服务。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1为2000年Toshihide Tabata的浦肯野细胞的培养方法所培养出的细胞。
[0012] 图2为本实验经过改良后所得到的结果。
[0013] 在体外培养第14天的浦肯野细胞能够清楚的看到浦肯野细胞的明显结构（上 图），当第28天的时候可以看到更多的树突结构，细胞发育的非常好(下图)。
【具体实施方式】
[0014] 1.多聚赖氨酸处理的玻片准备： 用100yg/yl多聚赖氨酸（P7405-5MG，sigma)进行包被盖玻片（10211811(：，世泰）， 盖玻片置于35mm的培养皿中37°C 5% 0)2培养过夜。在使用前用高压灭菌过的PBS进行 清洗，注意不能对包被的盖玻片进行猛烈冲洗。在包被的盖玻片附近加入PBS，轻轻晃动培 养皿，洗掉废弃的PBS，重复一次，置于通风厨内瞭干。
[0015] 2.激活木瓜蛋白酶： 2ml PBS溶液（或者不含Ca2+、Mg2+的D-Hanks溶液）、32·2μ1半胱氨酸、16·4μ1木 瓜蛋白酶（P_3250，sigma) 37°C热激 30min。
[0016] 3.接种细胞： ①.取3只PO时期的C57BL/6鼠婴(购买于武汉大学A III动物中心)，取小脑置于 D-Hanks液（GNB14175,吉诺生物医药技术有限公司）中，去掉血管、脑膜，取其小脑至于 D-Hanks液中；f ·切碎，1000rpm，2min去掉上清；.言·加入热激后的木瓜蛋白酶、2μ1 DNase I (9003-98-9, sigma)，37°C消化 15min ;④·用 Iml 枪头轻轻吹打 10 下继续 37°C消 化15min;⑤.40 μ m的过滤网后，加入含有FBS培养基终止消化，IOOOrpm 5min，弃上清； ⑥·加入含有血清的培养基600 μ 1，计数，细胞数在5*105。37°C培养1小时；⑦·置换成 新鲜培养基 Iml (DMEM/F-12 (SH30023, Olb，Thermo)、B27 (17504, GIBCO))。
[0017] 4.细胞发育情况的检测： 分别取出已经培养14、28天的浦肯野细胞进行发育情况的检测。检测的指标选取的是 浦肯野细胞特异性的标记 Calbindin 抗体（Monoclonal anti Calbindin D_28k，Swant)。 通过免疫组化的方法来标记浦肯野细胞，在高倍显微镜下能很清晰的看到浦肯野细胞的树 突结构，比较发育的情况。
[0018] 将培养好的浦肯野细胞取出，洗掉培养基，置换IxPBS清洗3次，每次5min ;加入 IxPBT对细胞进行破膜处理25min ;0. 3%H202漂洗15min ;用IxPBS清洗三次，每次5min，吸 干PBS溶液；用5%正常山羊血清进行封闭，室温封闭1小时；加入一抗（Calbindin，1 :500， 用5%正常山羊血清进行稀释)，室温2小时；用IxPBS溶液清洗3次，每次IOmin ;加入生物 素标记的二抗（1 :200)，室温1小时；用IxPBS溶液清洗3次，每次IOmin ;用DAB显色，待显 色充分用IxPBS溶液终止显色反应，在高倍光学显微镜下进行观察病拍照。
【权利要求】
1. 一种小脑浦肯野细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤如下： (1) 多聚赖氨酸处理的盖玻片准备 用100yg/ill多聚赖氨酸包被盖玻片，盖玻片置于35mm的培养皿中37°C5% 0)2培 养过夜，用高压灭菌过的PBS进行清洗，在包被的盖玻片附近加入PBS，晃动培养皿，洗掉废 弃的PBS，重复一次，然后置于通风厨内晾干；木瓜蛋白酶消化小脑组织后将细胞接种在盖 玻片上； (2) 激活木瓜蛋白酶 将21111?85溶液或者不含0&2+、1%2+的0-他111^溶液、32.2111半胱氨酸、16.4111木 瓜蛋白酶37°C热激30min; (3) 接种细胞 ①.取3只P0时期的C57BL/6鼠婴，取小脑置于D-Hanks液中，去掉血管、脑膜，取其 小脑置于D-Hanks液中；2 .切碎，lOOOrpm离心2min后去掉上清；?.加入热激后的木瓜 蛋白酶、2iilDNaseI，37°C消化15min;④.用lml枪头吹打10下继续37°C消化15min; ⑤.将消化好的组织经过40ym的过滤网后，加入含有FBS培养基终止消化，lOOOrpm离心 5min后，弃上清；⑥.加入含有血清的培养基600yl，该培养基由90vol%DMEM/F-12和 10vol%FBS组成，计数，细胞数在5*105，37°C培养1小时；⑦.加入成新鲜培养基lml，新 鲜培养基由DMEM/F-12培养基中添加2vol%的B27神经细胞生长添加剂组成，此后每隔3 天置换一半的新鲜培养基； (4) 细胞发育情况的检测 分别取出已经培养14、28天的浦肯野细胞进行发育情况的检测，检测的指标选取的是 浦肯野细胞特异性的标记Calbindin抗体，通过免疫组化的方法来标记浦肯野细胞，在显 微镜下清晰的看到浦肯野细胞的树突结构。
2. 根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液PBS由8 克/升的氯化钠、0.2克/升的氯化钾、2克/升的磷酸氢二钠、0.2克/升的磷酸二氢钾组 成。
【文档编号】C12N5/079GK104480071SQ201410845553
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月31日 优先权日:2014年12月31日
【发明者】卢祖能, 尹皓, 张泉 申请人:武汉大学