治疗关节软骨缺损的组合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种治疗关节软骨缺损的组合物，具体地，所述组合物包括：治疗有效量的脂肪间充质祖细胞、人血清白蛋白溶液，和透明质酸钠。所述的制剂采用了优化的制剂体积和组分浓度，具有意外的优异治疗效果。
【专利说明】
治疗关节软骨缺损的组合物
技术领域
[0001] 本发明涉及软骨治疗领域，具体地，本发明提供了一种治疗关节软骨缺损的组合 物。
【背景技术】
[0002] 膝关节透明软骨位于胫骨和股骨之间，和滑膜液一起对于膝关节的活动起缓冲和 润滑作用。膝关节透明软骨修复能力较差，当受到外力冲击等发生损伤时无法自发愈合或 再生。透明软骨不含血液，神经以及淋巴系统，因此无法激发机体的修复反应。
[0003] 早期的膝关节软骨损伤症状不够明显，一般需要通过关节镜手术才能发现，因此 容易进展为慢性的较为严重的关节软骨损伤，并引发疼痛，肿胀等症状。严重的关节软骨损 伤不经妥善治疗极易引发膝关节骨性关节炎，最终导致残疾。
[0004] 目前针对膝关节软骨损伤的主要治疗方法为手术治疗，以微骨折手术为代表，对 受损的膝关节区域钻孔，以刺激自身的骨髓间充质干细胞参与关节软骨的修复。然而微骨 折手术后生成的软骨组织为纤维软骨，而非透明软骨，因此微骨折手术虽在短期内有一定 的效果，但长期的随访证实接受微骨折手术的膝关节功能仍然会出现衰退现象。
[0005] 同时，采用自身软骨颗粒填充的修复技术可以替代患者关节软骨缺损部位，操作 相对简便，但软骨颗粒的来源受限，同时研究显示这种治疗方法对于>5cm 2的关节软骨损伤 治疗效果不佳。
[0006]自体软骨细胞移植手术是另一种较为常用修复膝关节软骨的治疗方式，该方法取 患者自身的软骨组织，提取软骨细胞进行体外培养，然后再重新移植入患者的膝关节软骨 损伤位点。该方法对于治疗膝关节软骨损伤成功率较高，然而需要较高的技术条件，同时采 集患者自身的软骨组织具有一定的风险，软骨细胞在体外培养容易衰老分化，失去修复关 节软骨损伤的能力。
[0007] 祖细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，脂肪来源的间充质祖细胞是成体 间充质祖细胞的一种，取材容易，对供者伤害较小，同时具有成软骨，成骨和成脂的分化能 力，在体外培养环境可以大量扩增且保持其分化能力。因此是治疗膝关节软骨损伤的理想 细胞类型。然而，现有的祖细胞组合物在临床用于经关节腔内注射治疗软骨缺损中，常出现 例如关节肿胀与酸痛之类的并发症。因此，本领域需要开发新型的软骨损伤修复制剂。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种施用方便、组分优化，且能够快速促进软骨损伤部位修 复的关节软骨缺损组合物。
[0009] 本发明的第一方面，提供了一种治疗关节软骨缺损的组合物，其特征在于，所述组 合物包括：治疗有效量的脂肪间充质祖细胞、人血清白蛋白溶液，和透明质酸钠。
[0010] 在另一优选例中，所述的人血清白蛋白溶液为0. 5-2(v/v) %人血清白蛋白；较佳 地为 0.8-1. 5 (v/v) %。
[0011] 在另一优选例中，所述的人血清白蛋白溶液是0. 5-2(v/v) %人血清白蛋白的复方 电解质注射液溶液。
[0012] 在另一优选例中，所述的透明质酸钠为溶液，较佳地为15_25wt %的透明质酸钠水 溶液。
[0013] 在另一优选例中，所述的治疗关节软骨缺损指修复软骨缺损，较佳地，所述的软骨 缺损的修复包括选自下组的一个或多个特征：软骨厚度增加、软骨基质再生、软骨II型胶 原增生、软骨降解酶MMP-13分泌被抑制。
[0014] 在另一优选例中，所述的治疗关节软骨缺损包括使治疗对象的选自下组的一个或 多个指标改善：疼痛评分NRS-11、关节活动功能障碍W0MAC评分、关节软骨体积、关节软骨 厚度、骨髓水肿。
[0015] 在另一优选例中，所述的间充质祖细胞具有选自下组的任一或多种特征：
[0016] (i) 95 %以上的细胞具有表面抗原⑶90 ;
[0017] (ii) 95 %以上的细胞具有表面抗原⑶73 ;
[0018] (iii) 95 %以上的细胞具有表面抗原⑶29 ;
[0019] (iv)95%以上的细胞具有表面抗原⑶49d。
[0020] 在另一优选例中，98%以上的细胞具有表面抗原⑶90,更佳地，99%以上的细胞具 有表面抗原⑶90。
[0021] 在另一优选例中，98%以上的细胞具有表面抗原⑶73,更佳地，99%以上的细胞具 有表面抗原⑶73。
[0022] 在另一优选例中，98%以上的细胞具有表面抗原⑶29,更佳地，99%以上的细胞具 有表面抗原⑶29。
[0023] 在另一优选例中，98 %以上的细胞具有表面抗原⑶49d，更佳地，99 %以上的细胞 具有表面抗原⑶49d。
[0024] 在另一优选例中，99. 6%以上的细胞具有表面抗原⑶90。
[0025] 在另一优选例中，99. 7%以上的细胞具有表面抗原⑶73。
[0026] 在另一优选例中，99. 5%以上的细胞具有表面抗原⑶29。
[0027] 在另一优选例中，99. 8%以上的细胞具有表面抗原⑶49d。
[0028] 在另一优选例中，所述的间充质祖细胞具有选自下组的任一或多种特征：
[0029] (v) 2%以下的细胞具有表面抗原⑶34 ;
[0030] (vi) 1 %以下的细胞具有表面抗原⑶45 ;
[0031] (vii)〇. 3%以下的细胞具有表面抗原Actin ;
[0032] (viii)O. 5%以下的细胞具有表面抗原⑶14 ;
[0033] (ix) 0. 1 %以下的细胞具有表面抗原HLA-DR。
[0034] 在另一优选例中，1 %以下的细胞具有表面抗原⑶34,更佳地，0. 5 %以下的细胞具 有表面抗原⑶34。
[0035] 在另一优选例中，0. 5 %以下的细胞具有表面抗原⑶45,更佳地，0. 1 %以下的细胞 具有表面抗原⑶45。
[0036] 在另一优选例中，所述的细胞不具有表面抗原⑶34。
[0037] 在另一优选例中，所述的细胞不具有表面抗原⑶45。
[0038] 在另一优选例中，所述的细胞不具有表面抗原⑶14。
[0039] 在另一优选例中，所述的细胞不具有表面抗原HLA-DR。
[0040] 在另一优选例中，所述脂肪间充质祖细胞在所述组合物中的浓度为105_10 9/mL。
[0041 ] 在另一优选例中，所述脂肪间充质祖细胞在所述组合物中的浓度为106_10 s/mL。
[0042] 在另一优选例中，所述脂肪间充质祖细胞在所述组合物中的浓度为 5X 105-5X 106/mL〇
[0043] 在另一优选例中，所述脂肪间充质祖细胞在所述组合物中的浓度为 5X 106-5X 107/mL〇
[0044] 在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞还表达细胞因子，且所述的细胞因子 选自下组：TGF-β 1，HGF，VEGF，或其组合。
[0045] 在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞表达细胞因子TGF-βΙ的量为 1000-1300pg/ml/10 6 细胞。
[0046] 在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞表达细胞因子HGF的量为 9000-10000pg/ml/10 6 细胞。
[0047] 在另一优选例中，所述的脂肪间充质祖细胞表达细胞因子VEGF的量为 300-800pg/ml/10 6 细胞。
[0048] 在另一优选例中，所述的间充质祖细胞具有成软骨、成骨及成脂分化能力。
[0049] 在另一优选例中，所述的组合物中，透明质酸钠与人血清白蛋白的体积比为 1-5:0. 8-1. 2,较佳地为 2-4:1，更佳地为 2. 5-3. 5:1。
[0050] 在另一优选例中，所述组合物为单元剂型，且所述单元剂型的体积为< 4mL，较佳 地为彡3mL。
[0051] 在另一优选例中，所述单元剂型的体积为0. 15-3mL。
[0052] 在另一优选例中，对于每cm2关节软骨损伤面积施用1单元的组合物。
[0053] 在另一优选例中，所述的组合物还用于使软骨厚度增加。
[0054] 在另一优选例中，所述的组合物还用于使软骨基质再生。
[0055] 在另一优选例中，所述的组合物还用于使软骨II型胶原增生。
[0056] 在另一优选例中，所述的组合物还用于抑制软骨降解酶MMP-13分泌。
[0057] 在另一优选例中，所述组合物注射后，脂肪间充质祖细胞在体内存活时间为10 周。
[0058] 本发明的第二方面，提供了一种如本发明第一方面所述的组合物的制备方法，所 述方法包括步骤：将脂肪间充质祖细胞、人血清白蛋白溶液和透明质酸钠混合，制成组合 物。
[0059] 在另一优选例中，所述方法还包括对脂肪间充质祖细胞进行培养，且所述的培养 包括步骤：
[0060] a)提供30_50ml的脂肪组织；
[0061] b)用胶原酶I对所述的脂肪组织进行消化；
[0062] c)弃去消化后的脂肪，收集底层沉淀；
[0063] d)加入细胞培养基，混勾，去除未消化的组织块，进行细胞计数；
[0064] e)调整接种密度，将细胞接种至T75培养瓶；接种密度为5 X 105_2 X 106/T75培养 瓶（每个T75培养瓶中接种12ml抽脂脂肪量），置35-40°C、1-10% 0)2下培养至贴壁细胞 呈集落；
[0065] f)用Trypsin EDTA溶液消化1. 5-2. 5min，离心去除消化液后进行传代，得到所述 的脂肪间充质祖细胞。
[0066] 在另一优选例中，在所述方法中，用于对脂肪间充质祖细胞进行培养所用的培养 基为无血清培养基或含血清培养基。
[0067] 本发明的第三方面，提供了一种用于治疗骨关节软骨缺损的制剂，所述制剂包含 如本发明第一方面所述的组合物作为有效成分。
[0068] 在另一优选例中，所述的制剂是注射剂，较佳地为关节腔注射剂。
[0069] 在另一优选例中，所述的为单元剂型，且所述单元剂型的体积为< 4mL，较佳地为 3mL〇
[0070] 在另一优选例中，所述单元剂型的体积为0. 15_3mL。
[0071] 在另一优选例中，对于每cm2关节软骨损伤面积施用1单元的组合物。
[0072] 在另一优选例中，所述的制剂还用于使软骨厚度增加。
[0073] 在另一优选例中，所述的制剂还用于使软骨基质再生。
[0074] 在另一优选例中，所述的制剂还用于使软骨II型胶原增生。
[0075] 在另一优选例中，所述的制剂还用于抑制软骨降解酶MMP-13分泌。
[0076] 在另一优选例中，所述制剂注射后，脂肪间充质祖细胞在体内存活时间为10周。
[0077] 本发明的第四方面，提供了一种试剂组合或试剂盒，包括：
[0078] a.脂肪来源的间充质祖细胞；
[0079] b. 15-25 %透明质酸钠溶液；
[0080] c. 0. 5-2 %人血清白蛋白溶液；
[0081] 和d.说明书，所述的说明书中记载了使用方案；
[0082] 且所述的使用方法包括：将组分a、b、c混合，用于对骨关节软骨缺损患者进行治 疗。
[0083] 本发明的第五方面，提供了一种预防和/或治疗骨性关节炎的方法，所述方法包 括步骤：给需要的对象施用如本发明第一方面所述的组合物，或给需要的对象施用如本发 明第三方面所述的制剂。
[0084] 在另一优选例中，所述方法包括步骤：用如本发明第一方面所述的组合物或如本 发明第三方面所述的制剂，对所述对象的关节腔进行注射。
[0085] 在另一优选例中，所述组合物或制剂的施用量为：每cm2关节软骨损伤面积 0. 5-2X106个细胞。
[0086] 在另一优选例中，所述组合物或制剂的施用量为：每cm2关节软骨损伤面积注射 l-5mL组合物或制剂。
[0087] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0088] 图1为实施例2中的流式检测实验图谱；
[0089] 图2阿辛蓝染色检测脂肪间充质祖细胞成软骨、成骨和成脂肪能力；
[0090] 图3为实施例3中本发明组和对照组细胞存活情况；
[0091 ] 图4为组合物治疗效果图，图中，图4A番红固绿染色图、图4B为II型胶原实验图， 图4C为MMP-13免疫组化实验图；
[0092] 图5为脂肪间充质祖细胞在大鼠体内示踪的实验结果；其中，图5A为文献Hirie et al，Stem Cells，2009中的人滑膜来源间充质祖细胞大鼠膝关节注射实验结果，图5B为 本发明实施例7实验结果；
[0093] 图6为脂肪间充质祖细胞治疗效果实验结果，图6A为脂肪间充质祖细胞组合物治 疗后NRS-11评分图；图6B为关节活动功能障碍W0MAC评分图；图6C为关节软骨体积MRI 测定结果。
【具体实施方式】
[0094] 本发明人经过长期而深入的研究，意外地发现，用一类特定的脂肪间充质祖细胞 结合透明质酸制成注射针剂，在低注射量（约3ml左右）的情况下，即可治疗软骨损伤。基 于上述发现，发明人完成了本发明。
[0095] 术语
[0096] 如本文所用，术语"以上"和"以下"包括本数，例如"95%以上"指彡95%，"0. 2% 以下"指彡0.2%。
[0097] 脂肪
[0098] 自体脂肪是整形和抗衰老治疗的优良来源，脂肪组织材料可以来源于腰部、臀部、 腹部、大腿、上臂等部位。本领域技术人员可采用通用的技术方法获得自体脂肪组织，包括 (但不限于）抽吸、手术分离等方法。
[0099] 在本发明中，脂肪组织或脂肪原料没有特别限制，可以是来源于动物或人的任何 部位的脂肪组织，优选人的脂肪组织。较佳地，脂肪组织可以是腰部、臀部、腹部、大腿、上臂 等部位的组织。
[0100] 脂肪来源的间充质祖细胞
[0101] 如本文所用，术语"脂肪来源的间充质祖细胞"、"haMPCs"或"adipose tissue-derived mesenchymal progenitor cells"含义相同，可以互换使用。
[0102] 本发明使用的脂肪来源的间充质祖细胞优选人来源的脂肪来源的间充质祖细胞； 更优选人自体脂肪来源的间充质祖细胞。
[0103] 本领域的普通技术人员可以使用常规方法进行haMPCs的分离和培养，在一个优 选例的实施例中，包括步骤：
[0104] a)洗涤脂肪组织（除去血细胞）：向脂肪组织中加入生理盐水，以充分洗涤脂肪组 织，使不同相分离，吸去下层水相；重复以上操作直到下层液较为清澈。
[0105] b)胶原酶消化：加入胶原酶I对脂肪组织进行消化。
[0106] c)收集沉淀：弃去上层消化后的脂肪，收集底层沉淀至一个新离心管，加 DMEM以 离心洗涤。
[0107] d)过滤并计数：加 DMEM，混勾，过滤去除未消化的组织块，加 DMEM，吸取1ml计数 细胞量及活力。
[0108] e)接种培养：离心洗涤一次，根据计数细胞的量调整接种密度接种至T75培养瓶， 进行培养。
[0109] f)传代：接种后约1-2天贴壁，3天左右出现少量贴壁间充质干细胞，培养至贴 壁细胞呈集落时，用Trypsin EDTA溶液消化传代，每T75培养瓶加入2ml，消化时间为 1. 5-2. 5min，收集并计数细胞，根据原代贴壁情况按1:1-2的比例传代，传代后细胞生长变 快，一般三天即可再次传代，根据细胞生长情况，按照1 :2-3的比例传代，收集P3-P7代细胞 用于治疗或制备药物组合物。
[0110] 脂肪来源的间充质祖细胞的抗原检测
[0111] 本发明使用的脂肪来源的间充质祖细胞具有极高的纯度和活性。
[0112] 本领域的普通技术人员可以使用常规方法对间充质祖细胞表面抗原进行检测，如 过流式细胞仪法等。
[0113] 脂肪来源的间充质祖细胞具有多种特异性抗原和受体，主要有：⑶29、⑶73、⑶90、 CD49d 等。
[0114] 带有⑶90抗原的间充质祖细胞在总间充质祖细胞中的比例多92 %，更佳地 彡95%，更佳地多98%，最佳地，99%以上的细胞具有表面抗原⑶90。
[0115] 带有⑶73抗原的间充质祖细胞在总间充质祖细胞中的比例多92 %，更佳地 彡95%，更佳地多98%，最佳地，99%以上的细胞具有表面抗原⑶73。
[0116] 带有⑶29抗原的间充质祖细胞在总间充质祖细胞中的比例多92 %，更佳地 彡95%，更佳地多98%，最佳地，99%以上的细胞具有表面抗原⑶29。
[0117] 带有⑶49d抗原的间充质祖细胞在总间充质祖细胞中的比例多92 %，更佳地 彡95%，更佳地多98%，最佳地，99%以上的细胞具有表面抗原⑶73。
[0118] 在本发明的优选实施例中，所述的细胞具有选自下组的一个或多个特征：99. 6% 以上的细胞具有表面抗原CD90 ;99. 7%以上的细胞具有表面抗原CD73 ;99. 5%以上的细胞 具有表面抗原CD29 ;和/或99. 8%以上的细胞具有表面抗原CD49d。
[0119] 脂肪来源的间充质祖细胞的阴性指标包括：⑶34、⑶45等。本发明中，带有⑶34 的间充质祖细胞在总间充质祖细胞中的比例< 2%，更佳地< 1%，更佳地< 0. 5%，最佳地 没有⑶34。
[0120] 带有⑶45的间充质祖细胞在总间充质祖细胞中的比例< 1%，更佳地< 0. 5%，更 佳地< 0. 1 %，最佳地没有⑶45。
[0121] 本领域的普通技术人员可以使用常规方法对haMPCs进行使用、处理、施用等操 作。如：每批haMPCs发放或使用之前，必须通过无菌、内毒素和支原体检查，以及DNA同一 认定。每批发放的细胞都要符合细胞活力多95%、细胞纯度（阳性指标多95%，阴性指标 〈2% )。haMPCs急毒、过敏检测结果均呈阴性，均有一份相应的检测报告。
[0122] 软骨缺损及其修复
[0123] 关节软骨属于透明软骨，主要由软骨细胞、软骨基质及II型胶原组成，它具有良 好的弹性及摩擦系数小等力学特性，对于关节的功能活动极其重要。关节的创伤和炎症等 疾病常引起关节软骨损害，由于关节软骨再生能力有限，一旦损伤，难以自行修复，从而导 致关节功能障碍。长期以来，如何修复病损的关节软骨，一直是骨科研究的重要课题之一。
[0124] 本发明中，软骨缺损的修复包括选自下组的一个或多个指标被改善：软骨厚度增 加、软骨基质再生、软骨II型胶原增生、软骨降解酶MMP-13分泌被抑制、关节积液、骨刺增 生、骨髓水肿等症状的减少、软骨生成基因表达的升高（优选为选自下组的软骨生成基因： Colleger! II、TGF-beta、BMP-2,或其组合）、软骨溶解酶抑制基因表达的降低（优选的所述 的软骨溶解酶选自下组：??ΜΡ1、??ΜΡ2,或其组合）、生成软骨细胞信号传导通路基因表达 的升高（优选为选自下组的；生成软骨细胞信号传导通路基因：P_ERKl/2、Ihh，或其组合）。
[0125] 特别地，在临床治疗中，所述的修复还包括使治疗对象的选自下组的一个或多个 指标改善：疼痛评分NRS-11、关节活动功能障碍W0MAC评分、关节软骨体积、关节软骨厚度、 骨髓水肿。
[0126] 透明质酸钠
[0127] 透明质酸钠广泛存在于动物和人体的生理活性物质，在人皮肤、关节滑膜液、脐 带、房水及眼玻璃体中均有分布。分子量为500000~730000道尔顿，其溶液具有高黏弹性 及仿形性，常为眼科手术辅助用药，尚可用于腹部手术后，注入腹腔内，减少术后肠管粘链。 也可以注入关节腔内，减少关节面的摩擦，减轻关节疼痛。也可膀胱灌注，用于膀胱上皮氨 基葡萄糖保护层缺乏的临时替代。
[0128] 药物组合物及其应用
[0129] 本发明还提供了一种注射剂组合物，它含有有效量的间充质祖细胞，以及药学上 可接受的载体。
[0130] 通常，可将间质血管层细胞和间充质祖细胞配制于无毒的、惰性的和药学上可接 受的水性载体介质中，如生理盐水中，其中pH通常约为5-8,较佳地，pH约为7-8。
[0131] 如本文所用，术语"有效量"或"有效剂量"是指可对人和/或动物产生功能或活 性的且可被人和/或动物所接受的量。
[0132] 如本文所用，"药学上可接受的"的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良 副反应（如毒性、刺激和变态反应）的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语"药学上 可接受的载体"指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
[0133] 本发明的药物组合物含有的载体包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、 甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制 成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。 所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物 制剂还可制成缓释制剂。
[0134] 本发明所述间质血管层细胞和间充质祖细胞的有效量可随给药的模式和待治疗 的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种 因素来确定（例如通过临床试验）。所述的因素包括但不限于：所述药代动力学参数例如 生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状 况、给药的途径等。
[0135] 本发明的药物组合物优选为关节腔注射试剂。在另一优选例中，所述关节腔 注射制剂的间充质祖细胞浓度为10 5-109个/mL，较佳地为10 6-108个/mL，更佳地为 5X 106-5X 107/mL〇
[0136] 本发明还提供了一种使用本发明所述药物组合物的方法，在一个具体地实施例 中，包括步骤：
[0137] (1)给需要的对象施用间质血管层细胞，和
[0138] (2)给需要的对象施用间充质祖细胞，优选的使用时间为步骤⑴之后的1个月， 和/或3个月。
[0139] 在本发明中，给所需要的对象施用间充质祖细胞，优选的施用部位为所述对象的 关节腔，从而刺激祖细胞成软骨分化从而修复病变。
[0140] 本发明的主要优点如下：
[0141] 1.本发明使用脂肪间充质祖细胞、透明质酸钠和人血清白蛋白制成注射液，作为 脂肪间充质祖细胞溶剂，仅需关节腔内注射即可填充至关节软骨损伤部位，可以治疗大面 积软骨缺损。
[0142] 2.本发明采用了优化的制剂体积和组分浓度，具有意外的治疗效果，而且本制剂 中的脂肪间充质祖细胞能存活意外长的时间。
[0143] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0144] 实施例1细胞的分离，纯化和培养
[0145] a)洗涤脂肪组织（除去血细胞）：向含有脂肪的离心管中加入等量的生理盐水，拧 紧盖子，晃动3min以充分洗涤脂肪组织，接着静止3-5min，使不同相分离，吸去下层水相； 重复以上操作三次，直到下层液较为清澈。
[0146] b)胶原酶消化：吸弃生理盐水后，加预热的与脂肪等体积的含0. 1 %胶原酶I的 DMEM，置恒温振荡器中，37°C，200rpm，消化lh，每隔15min，晃动离心管5~10秒（使脂肪 与胶原酶I充分接触）。
[0147] c)收集沉淀：消化完毕，2000rpm离心10min，弃去上层消化后的脂肪，收集两管的 底层沉淀至一个新离心管，加 DMEM至50ml，lOOOrpm离心8min洗涤一次。
[0148] d)过滤并计数：加 DMEM至50ml，混匀，lOOum滤器过滤去除为消化的组织块，加 DMEM至50ml，吸取lml计数细胞量及活力。
[0149] e)接种培养：lOOOrpm离心8min洗涤一次，根据计数细胞的量调整接种密度接种 至T75培养瓶（接种密度：一般每个T75培养瓶中接种12ml抽脂脂肪量，即50ml抽脂脂肪 分离得到的细胞接种到4个T75培养瓶），置37°C、5% C02培养。
[0150] f)传代：接种后约1-2天贴壁，3天左右出现少量贴壁间充质干细胞，培养5-7天 贴壁细胞呈集落时，用Trypsin EDTA溶液消化传代，每T75培养瓶加入2ml，消化时间为 1. 5-2. 5min，收集并计数细胞，按5 X 103/cm2 (即根据原代贴壁情况1:1-2的比例）传代，传 代后细胞生长变快，一般三天即可再次传代，根据细胞生长情况，按照1 :2_3的比例传代， 收集P3-P7代细胞用于治疗或制备药物组合物。
[0151] 实施例2脂肪祖细胞的鉴别
[0152] 将用实施例1所培养的脂肪祖细胞离心后重悬；细胞计数后将细胞浓度调整为 1 X 10S/L，分别与人抗 CD34、CD45、CD29、CD73、CD90、CD105、Actin、CD14、HLA-DR 单克隆抗 体室温反应30min，用PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行检测（图1)。
[0154] 结论：通过流式细胞仪对脂肪祖细胞进行细胞表面抗原标记表达分析显示该细胞 纯度很高。
[0155] 实施例3脂肪间充质祖细胞成软骨、成骨、成脂分化能力测试
[0156] 以实施例1所培养的细胞作为本发明组，进行成软骨、成骨、成脂分化能力测试。 体外向软骨方向分化培养3-4周后阿辛蓝染色表明以实施例1所培养的细胞在体外具有向 软骨分化的能力（图2A);体外向骨方向分化培养3-4周后茜素红染色表明以实施例1所 培养的细胞在体外具有向骨分化的能力（图2B);体外向脂肪方向分化培养3-4周后油红0 染色表明以实施例1所培养的细胞在体外具有向脂肪分化的能力（图2C)。
[0157] 实施例4脂肪间充质祖细胞表达细胞因子的检测
[0158] 实施例1中所培养的脂肪间充质祖细胞离心后重悬，调整细胞密度接种，48h后收 集上清，检测细胞因子TGF-β 1，HGF和VEGF，检测结果见下表。
[0159]
[0160] 结论：该脂肪间充质祖细胞能够表达TGF- β 1，HGF和VEGF。
[0161] 实施例5膝关节软骨修复注射剂的制备
[0162] 用Trypsin EDTA消化细胞，制备细胞悬液，使用生理盐水洗涤三次，去除残留液 体。根据关节软骨损伤面积，准备合适的细胞量1 X 1〇6细胞/cm2关节软骨损伤面积，使用 透明质酸钠注射液重悬细胞，并与人血清白蛋白溶液混合后制备成终产品组合物。
[0163] 经研究发现，使用20%透明质酸钠注射液重悬细胞后以3 :1的比例与1%人血清 白蛋白混合，既可以保证脂肪间充质祖细胞的有效保存时间在8小时，同时能够形成有效 的生物支架结构，从而使终产品更容易填充至软骨缺损部位，而且保持一定的黏度，和软骨 缺损部位更好的结合。
[0164] 脂肪间充质祖细胞终产品剂型对于细胞活率的影响对比如图3所示。图中，左侧 为脂肪间充质祖细胞终产品以台酚蓝法测细胞活率，右侧为脂肪间充质祖细胞直接与透明 质酸钠注射液混合8小时后细胞活率。可见，本发明的剂型可以很好地保持脂肪间充质祖 细胞的存活率。
[0165] 实施例6人脂肪间充质祖细胞组合物治疗新西兰大白兔关节软骨损伤
[0166] 新西兰大白兔30只，分3组，每组10只，组一不做任何处理，组二与组三行右下肢 膝关节前交叉韧带切断和内侧半月板切除后六周形成软骨损伤模型。组二组三于术后第六 周、九周、十二周分别透明质酸钠、人脂肪间充质祖细胞组合物进行注射，术后第十六周处 死动物，进行番红固绿染色、Π 型胶原和MMP-13免疫组化实验。
[0167] 结论：本发明的人脂肪间充质祖细胞组合物能再生损伤的软骨，番红固绿染色显 示软骨基质再生明显（图4A);软骨II型胶原增生明显（图4B)和软骨降解酶MMP-13分 泌受抑制（图4C)。
[0168] 实施例7人脂肪间充质祖细胞组合物SD大鼠膝关节注射示踪实验
[0169] 在无血清培养基中将细胞浓度调整为1 X 106/mL ;按1 :100比例将DiD细胞标记 液混入细胞悬液中，即每1毫升细胞悬液中加入10 μ 1细胞标记液，轻轻吹打混合；37°C条 件下孵育50分钟。标记后的细胞悬液，在37°C，1500rpm条件下离心5分钟；移除上清液， 在37°C的无血清培养液中重新悬浮细胞；重复步骤4及步骤5,清洗细胞2次以上；完成清 洗后10分钟，进行荧光检测。
[0170] 2月龄SPF级SD大鼠行右后肢内侧半月板去除手术造模，所有的实验大鼠均于造 模术后立即进行1次右后肢膝关节腔内注射。将20只造模后的实验大鼠随机分为2组，组 一为对照组，注射l〇〇ul透明质酸钠溶液；组二为实验组，注射100ul (2. 5X 106)经膜染料 DiD染色的人脂肪间充质祖细胞组合物；组三为未手术造模组，注射100ul (2. 5 X 106)经膜 染料DiD染色的人脂肪间充质祖细胞组合物。小动物成像仪（PerkinElmer公司）每周检 测大鼠膝关节内残留细胞。
[0171] 结论：本发明的2. 5X 106人脂肪间充质祖细胞组合物在SD大鼠手术组体内能存 活10周左右，在非手术组体内能存活4周左右（图5B)，存活时间均优于日本小组5x101 滑膜来源间充质祖细胞大鼠膝关节注射实验（约4周，图5A)。
[0172] 实施例8临床膝关节软骨修复
[0173] 关节软骨损伤患者18名，在获得伦理委员会批件和签署知情同意书的条件下取 自体脂肪30-50ml，制备成脂肪间充质祖细胞组合物，取3ml组合物注射到有软骨损伤的关 节腔，取自身对照，观察注射后3个月、6个月、12个月的疗效。
[0174] 患者体位：仰卧位，全身肌肉放松
[0175] 关节：伸直位或微曲
[0176] 进针点：内、外侧髌骨缘膝眼注射
[0177] 患者仰卧位，膝关节伸直，髌骨上缘与髌骨内外侧缘的交点为两点，斜向髌股关节 中心，以45°角穿刺。膝关节微屈30°左右，从髌骨下方的髌韧带内侧或外侧关节间隙垂 直进针，慢速将组合物终产品注射入膝关节腔内，注射后保持30分钟，之后可以正常活动。
[0178] 治疗后在第12、24、48周随访。结果表明，脂肪间充质祖细胞组合物能够明显降低 患者的关节疼痛，疼痛评分NRS-11明显下降（图6A);提升关节的活动功能，关节活动功能 障碍W0MAC评分明显下降（图6B) ;MRI所测关节软骨体积明显增加（图6C)。
[0179] 结论：脂肪间充质祖细胞和透明质酸钠注射液组合物对于治疗关节透明软骨缺损 效果明显。
[0180] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种治疗关节软骨缺损的组合物，其特征在于，所述组合物包括：治疗有效量的脂 肪间充质祖细胞、人血清白蛋白溶液，和透明质酸钠。2. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的间充质祖细胞具有选自下组的任 一或多种特征： (i) 95%以上的细胞具有表面抗原CD90 ; (ii) 95%以上的细胞具有表面抗原CD73 ; (iii) 95%以上的细胞具有表面抗原CD29 ; (iv) 95%以上的细胞具有表面抗原CD49d。3. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的间充质祖细胞具有选自下组的任 一或多种特征： (v) 2 %以下的细胞具有表面抗原CD34 ; (vi) 1 %以下的细胞具有表面抗原CD45 ; (vii) O. 3%以下的细胞具有表面抗原Actin ; (viii) O. 5%以下的细胞具有表面抗原CD14 ; (ix) 0. 1 %以下的细胞具有表面抗原HLA-DR。4. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述脂肪间充质祖细胞在所述组合物中 的浓度为105_10 9/mL。5. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的脂肪间充质祖细胞还表达细胞因 子，且所述的细胞因子选自下组：TGF-β 1，HGF，VEGF，或其组合。6. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组合物中，透明质酸钠与人血清白 蛋白的体积比为1-5:0. 8-1. 2,较佳地为2-4:1，更佳地为2. 5-3. 5:1。7. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物为单元剂型，且所述单元剂型 的体积为彡4mL，较佳地为彡3mL。8. 如权利要求1-7任一所述的组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：将 脂肪间充质祖细胞、人血清白蛋白溶液和透明质酸钠混合，制成组合物。9. 一种用于治疗骨关节软骨缺损的制剂，其特征在于，所述制剂包含如权利要求1-7 任一所述的组合物作为有效成分。10. -种试剂组合或试剂盒，其特征在于，包括： a. 脂肪来源的间充质祖细胞； b. 15-25 %透明质酸钠溶液； c. 0.5-2 %人血清白蛋白溶液； 和d.说明书，所述的说明书中记载了使用方案； 且所述的使用方法包括：将组分a、b、c混合，用于对骨关节软骨缺损患者进行治疗。
【文档编号】A61P29/00GK106031792SQ201510104870
【公开日】2016年10月19日
【申请日】2015年3月10日
【发明人】曹卫, 汪文, 李蒙, 何娜, 戴成祥, 张丽, 张露亿, 王飞, 李苏克, 刘佳
【申请人】西比曼生物科技（上海）有限公司, 西比曼生物科技（无锡）有限公司