包含空间位阻大的氨基酸的肽化合物的制备方法与流程

1.本发明涉及包含空间位阻大的氨基酸的肽化合物的制备方法。


背景技术：

2.作为在常规药物中不用作药物开发靶、所谓困难靶(tough-target)的实例，举出以细胞内分子等为靶的药物开发、或通过蛋白-蛋白相互作用的抑制的药物开发等。这些不用作药物开发的靶是由于药物分子无法到达疾病的靶分子，或列举靶分子的作用部位的形状为常规药物中难以作用的形状(非专利文献1)。
3.最近，作为接近常规技术中难以接近的困难靶的方法，环状肽受到关注(非专利文献2)。在环状肽对药物的应用中，不仅考虑提高与靶结合的能力，也考虑药物样(类似药物：优选显示膜通透性和代谢稳定性两者)环状肽和有效率的环状肽的筛选方法(非专利文献3、4)。此外，含有药物样非天然氨基酸的非天然型环状肽所需的条件变得明确，其在药物开发中的重要性和其认可度增加(专利文献1)。非天然氨基酸是该非天然型肽的重要要素，普遍认为，含有非天然氨基酸例如n-甲基(或n-烷基)氨基酸的肽、根据情形含有n-甲基(或n-烷基)氨基酸连续的单元的肽的合成由于其庞大而比天然型肽难度高(非专利文献5、6)。
4.将观点转移至氨基酸的侧链与天然氨基酸不同的非天然氨基酸时，据报告，氨基酸的α位被两个取代基取代的α，α-二取代氨基酸赋予脂溶性的增大、由于空间位阻含有α，α-二取代氨基酸的肽的构象自由度的限制、生物体内的稳定化(非专利文献7)，可以预期对药效和药物样两方面发挥大的正面影响。
5.在含有这些非天然氨基酸的肽的制备法中，由于这些非天然氨基酸的结构庞大，已知最常用于肽合成的fmoc法不适合(非专利文献8)。
6.根据这些容易推测，通过α，α-二取代氨基酸的羧基与氨基酸的氨基的缩合反应的肽合成、特别是通过n-烷基化α，α-二取代氨基酸的羧基与n-烷基化氨基酸的氨基的缩合反应的肽的合成由于一方或双方的氨基酸的空间庞大而困难。
7.作为连续引入n-烷基氨基酸的方法之一，已知使比n-烷基氨基酸空间位阻小的n-h氨基酸缩合而合成肽，在得到的肽中具有多个的nh基中，将作为目的的nh基选择性n-烷基化的方法(非专利文献9、10)。但是，这些方法是使α-单取代氨基酸和n-烷基氨基酸结合的方法，具有n-烷基-α，α-二取代氨基酸和n-烷基氨基酸结合的序列的肽的实用合成法是未知的。
8.现有技术文献
9.专利文献
10.专利文献1：国际公开第2018/225864号
11.非专利文献
12.非专利文献1：annu.rev.pharmacol.toxicol.，2016，56，23-40.
13.非专利文献2：future med.chem.2009，1，1289-1310.
14.非专利文献3：acs chem.biol.，2013，8，488-499.
15.非专利文献4：drug discovery today，2014，19，388-399.
16.非专利文献5：j.peptide res.，2005，65，153-166.
17.非专利文献6：biopolymers，109；e23110(doi：10.1002/bip.23110)
18.非专利文献7：有机合成化学协会杂志2002，vol.60，no.2，125-136.
19.非专利文献8：chem.soc.rev.，2016，45，631-654.
20.非专利文献9：org.lett.，2013，15，5012-5015.
21.非专利文献10：j.am.chem.soc.，1997，119，2301-2302.
22.发明概述
23.发明要解决的课题
24.在非专利文献5中，作为包含庞大的氨基酸的肽的制备法，示例包含n-烷基氨基酸的肽的制备方法。但是，该文献仅记载了氨基酸的缩合反应中的副反应的机理的研究和缩合试剂，没有记载更庞大的α，α-二取代氨基酸的缩合反应。
25.在非专利文献6中，示例n-烷基氨基酸的制备方法、和包含n-烷基氨基酸的肽的制备方法。该文献中示例关注于氨基酸的缩合剂的制备法，没有记载更庞大的α，α-二取代氨基酸的缩合反应。
26.在非专利文献7中，记载了α，α-二取代氨基酸的制备法、和包含α，α-二取代氨基酸的肽的有用性、α，α-二取代氨基酸的示例、和它们的制备方法，没有记载包含空间庞大的氨基酸的肽的制备。
27.在非专利文献8中，示例了合成困难的肽的制备法。在该文献中，记载了溶解度低、或容易凝集的肽的制备，没有记载应用缩合反应解决课题的方法。
28.在非专利文献9中，示例了应用可在温和条件除去的三氟乙酰基通过n-烷基氨基酸的肽键的形成法、和包含n-烷基氨基酸的肽的制备法。但是，没有提到与更庞大的α，α-二取代氨基酸的缩合反应。此外，已知并非仅可对结合了三氟乙酰基的氮原子选择性导入烷基，产生也对三氟乙酰基的氧原子导入烷基的异构体副产物。
29.在非专利文献10中，记载了向用对硝基苯磺酰基(nosyl)保护的氨基酸的氮原子导入烷基、制备含有n-烷基氨基酸的肽的方法。但是，已知由于对硝基苯磺酰基的脱保护步骤中产生副反应，在目的物的制备中存在问题(非专利文献9)。
30.如上，n-烷基-α，α-二取代氨基酸等n-取代-α，α-二取代氨基酸与n-烷基氨基酸等n-取代氨基酸的键形成反应困难，其有效的解决手段未知。本发明鉴于这样的情况完成，以提供包含n-取代-α，α-二取代氨基酸残基、和/或n-取代氨基酸残基的肽化合物的制备方法为课题。更具体地，以提供向n-取代氨基酸导入n-取代-α，α-二取代氨基酸的方法为课题。进一步，以提供将n-未取代-α，α-二取代氨基酸残基的氨基高选择性地n-官能化的方法为课题。
31.用于解决课题的手段
32.本发明人发现了连接n-取代氨基酸和n-取代-α，α-二取代氨基酸的方法。具体地，发现通过应用与n-取代氨基酸比较空间体积小、并且通过用吸电子性的保护基保护氨基提高羧基的反应性的n-未取代-α，α-二取代氨基酸，可以高效导入目的氨基酸。此外发现，在其随后的氨基的官能化中，对由于吸电子性的保护基酸度升高的nh基选择性进行n-烷基化反应等n-官能化反应。进一步，关注于由于吸电子性的保护基nh基的酸度升高，发现n-官能
化反应中使用的特定的碱，从而完成本发明。
33.即，本发明在非限定的具体的一个方式中包含以下发明。
34.〔1〕制备在n末端具有n-取代-α，α二取代氨基酸残基、包含该n-取代-α，α二取代氨基酸残基与n-取代氨基酸残基连接的二肽残基的肽化合物、其盐、或它们的溶剂化物的方法，其包括以下步骤：
35.步骤a：在缩合试剂的存在下或不存在下，使n-取代氨基酸、其盐、或它们的溶剂化物、或在n末端具有n-取代氨基酸残基的肽化合物、其盐、或它们的溶剂化物，与用吸电子性的保护基保护氨基的n-未取代-α，α二取代氨基酸、其盐、其脱水物、或它们的溶剂化物反应，得到在n末端具有用吸电子性的保护基保护氨基的n-未取代-α，α二取代氨基酸残基、包含该n-未取代-α，α二取代氨基酸残基与n-取代氨基酸残基连接的二肽残基的肽化合物、其盐、或它们的溶剂化物的步骤，和
36.步骤b：在碱和取代基导入剂的存在下，向n末端用吸电子性的保护基保护氨基的n-未取代-α，α二取代氨基酸残基的氨基导入取代基，得到在n末端具有用吸电子性的保护基保护氨基的n-取代-α，α二取代氨基酸残基、包含该n-取代-α，α二取代氨基酸残基与n-取代氨基酸残基连接的二肽残基的肽化合物、其盐、或它们的溶剂化物的步骤。
37.〔2〕〔1〕中记载的方法，其中，吸电子性的保护基是该保护基结合的nh基的pka(水中)为6～11的保护基。
38.〔3〕〔1〕或〔2〕中记载的方法，其中，碱的共轭酸的pka(乙腈中)是18～31。
39.〔4〕〔1〕～〔3〕的任一项中记载的方法，其中，n-取代氨基酸、或在n末端具有n-取代氨基酸残基的肽化合物加载于固相合成用树脂。
40.〔5〕〔1〕～〔4〕的任一项中记载的方法，其中，n-取代氨基酸、或在n末端具有n-取代氨基酸残基的肽化合物由式(2)表示：
[0041][0042]
[式中，
[0043]
p2是c
1-c6烷基、c
2-c6烯基、或c
7-c
14
芳烷基，
[0044]
r2是c
1-c6烷基、c
1-c6卤烷基、c
1-c6羟基烷基、c
1-c6烷基磺酰基c
1-c6烷基、c
2-c6炔基、任选被一个或多个卤素取代的c
1-c6烷氧基c
1-c6烷基、c
3-c8环烷基、c
3-c8环烷基c
1-c6烷基、c
3-c8环烷氧基c
1-c6烷基、或c
7-c
14
芳烷基，
[0045]
r3是羟基、o-pg2、任意的氨基酸残基、或任意的肽残基，
[0046]
pg2是羧基的保护基]。
[0047]
〔6〕〔1〕～〔5〕的任一项中记载的方法，其中，用吸电子性的保护基保护氨基的n-未取代-α，α二取代氨基酸由式(3)表示：
[0048][0049]
[式中，
[0050]
pg1是吸电子性的保护基，
[0051]
r1和q1独立地选自c
1-c6烷基、c
2-c6烯基、c
1-c6烷氧基c
1-c6烷基、c
3-c8环烷基c
1-c6烷基、或任选被取代的c
7-c
14
芳烷基，或
[0052]
r1和q1与它们结合的碳原子一起形成3～8元脂环或4～7元饱和杂环]。
[0053]
〔7〕〔1〕～〔6〕的任一项中记载的方法，其中，步骤a中得到的肽化合物由式(4)表示：
[0054][0055]
[式中，
[0056]
pg1、r1、和q1与式(3)的pg1、r1、和q1分别同义，
[0057]
p2、r2、和r3与式(2)的p2、r2、和r3分别同义]。
[0058]
〔8〕〔1〕～〔7〕的任一项中记载的方法，其中，步骤b中的取代基导入剂是p1x(式中，p1与式(1)的p1同义，x是离去基)，步骤b中得到的肽化合物由式(1)表示：
[0059][0060]
[式中，
[0061]
p1是c
1-c6烷基、c
2-c6烯基、或c
7-c
14
芳烷基，
[0062]
pg1、r1、和q1与式(3)的pg1、r1、和q1分别同义，
[0063]
p2、r2、和r3与式(2)的p2、r2、和r3分别同义]。
[0064]
〔9〕制备包含由式(1)表示的2个氨基酸残基连接的结构的肽化合物、其盐、或它们的溶剂化物的方法：
[0065][0066]
[式中，
[0067]
pg1是氨基的保护基，
[0068]
p1是c
1-c6烷基、c
2-c6烯基、或c
7-c
14
芳烷基，
[0069]
r1和q1独立地选自c
1-c6烷基、c
2-c6烯基、c
1-c6烷氧基c
1-c6烷基、c
3-c8环烷基c
1-c6烷基、或任选被取代的c
7-c
14
芳烷基，或
[0070]
r1和q1与它们结合的碳原子一起形成3～8元脂环或4～7元饱和杂环，p2是c
1-c6烷基、c
2-c6烯基、或c
7-c
14
芳烷基，
[0071]
r2是c
1-c6烷基、c
1-c6卤烷基、c
1-c6羟基烷基、c
1-c6烷基磺酰基c
1-c6烷基、c
2-c6炔基、任选被一个或多个卤素取代的c
1-c6烷氧基c
1-c6烷基、c
3-c8环烷基、c
3-c8环烷基c
1-c6烷基、c
3-c8环烷氧基c
1-c6烷基、或c
7-c
14
芳烷基，
[0072]
r3是羟基、o-pg2、任意的氨基酸残基、或任意的肽残基，
[0073]
pg2是羧基的保护基]，
[0074]
该方法包括以下步骤：
[0075]
步骤a：使由式(2)表示的化合物、其盐、或它们的溶剂化物：
[0076][0077]
[式中，p2、r2、和r3与式(1)的p2、r2、和r3分别同义]
[0078]
和由式(3)表示的化合物、其盐、其脱水物、或它们的溶剂化物：
[0079][0080]
[式中，pg1、q1、和r1与式(1)的pg1、q1、和r1分别同义]
[0081]
与缩合试剂反应，或使由该式(2)表示的化合物、其盐、或它们的溶剂化物、与由该式(3)表示的化合物的脱水物、其盐、或它们的溶剂化物反应，得到由式(4)表示的化合物、其盐、或它们的溶剂化物的步骤：
[0082][0083]
[式中，pg1、p2、q1、和r1～r3与式(1)的pg1、p2、q1、和r1～r3分别同义]，
[0084]
和
[0085]
步骤b：使由式(4)表示的化合物、其盐、或它们的溶剂化物与p1导入试剂反应，得到由式(1)表示的肽化合物、其盐、或它们的溶剂化物的步骤。
[0086]
〔10〕〔6〕～〔9〕的任一项中记载的方法，其中，r1和q1与它们结合的碳原子一起形成环丙烷环、环丁烷环、环戊烷环、环己烷环、或四氢吡喃环，或
[0087]
r1和q1独立地选自甲基、乙基、2-甲基丙基、烯丙基、甲氧基甲基、环己基甲基、任选
被取代的苄基、或任选被取代的苯乙基。
[0088]
〔11〕〔6〕～〔10〕的任一项中记载的方法，其中，在式(3)和/或式(4)中，pg1结合的nh基的pka(水中)是6～11。
[0089]
〔12〕〔6〕～〔11〕的任一项中记载的方法，其中，pg1是c
2-c6卤酰基。
[0090]
〔13〕〔12〕中记载的方法，其中，c
2-c6卤酰基是三氟乙酰基、三氯乙酰基、五氟丙酰基、2，3，3，3-四氟-2-(三氟甲基)丙酰基、或3，3，3-三氟-2-(三氟甲基)丙酰基。
[0091]
〔14〕〔1〕～〔13〕的任一项中记载的方法，其中，脱水物由下述式表示：
[0092][0093]
[式中，q1和r1与式(1)的q1和r1分别同义，r4是c
1-c5卤烷基]。
[0094]
〔15〕〔14〕中记载的方法，其中，r1和q1与它们结合的碳原子一起形成3～8元脂环。
[0095]
〔16〕〔14〕或〔15〕中记载的方法，其中，r4是三氟甲基、三氯甲基、五氟乙基、1，2，2，2-四氟-1-(三氟甲基)乙基、或2，2，2-三氟-1-(三氟甲基)乙基。
[0096]
〔17〕〔8〕～〔16〕的任一项中记载的方法，其中，p1是甲基、乙基、正丙基、异丙基、烯丙基、苄基、或苯乙基。
[0097]
〔18〕〔5〕～〔17〕的任一项中记载的方法，其中，p2是甲基、乙基、正丙基、异丙基、烯丙基、苄基、或苯乙基。
[0098]
〔19〕〔5〕～〔18〕的任一项中记载的方法，其中，r3是加载于固相合成用树脂的任意的氨基酸残基或任意的肽残基。
[0099]
〔20〕〔4〕～〔8〕和〔19〕的任一项中记载的方法，其中，固相合成用树脂是ctc树脂、wang树脂、或sasrin树脂。
[0100]
〔21〕〔1〕～〔20〕的任一项中记载的方法，其中，缩合试剂是dic或edci
·
hcl的任一种、或dic和oxyma的组合。
[0101]
〔22〕〔9〕～〔21〕的任一项中记载的方法，其中，p1导入试剂是p1x(式中，p1与式(1)的p1同义，x是离去基)与碱的组合。
[0102]
〔23〕〔22〕中记载的方法，其中，碱的共轭酸的pka(乙腈中)是18～31。
[0103]
〔24〕〔3〕～〔8〕和〔22〕～〔23〕的任一项中记载的方法，其中，碱选自：
[0104][0105]
[式中，
[0106]
rb1和rb4分别独立地是c
1-c4烷基，或rb1和rb4与rb1结合的氮原子和rb4结合的碳原子一起形成5～8元环，
[0107]
rb2和rb3分别独立地是c
1-c4烷基，或rb2和rb3与rb2结合的氮原子和rb3结合的氮原子以及该氮原子结合的碳原子一起形成5～8元环]、
[0108][0109]
[式中，
[0110]
rb6是c
1-c4烷基，
[0111]
rb5和rb7分别独立地是c
1-c4烷基，或与它们结合的各氮原子和该各氮原子结合的碳原子一起形成5～8元环，
[0112]
rb8是c
1-c4烷基，并且rb9是c
1-c4烷基或苯基，或rb8和rb9与它们结合的各氮原子和该各氮原子结合的碳原子一起形成5～8元环，
[0113]
此处rb9是苯基时，对于2个b2，该苯基的2个苯环任选地缩合形成萘]、
[0114][0115]
[式中，
[0116]
rb
10
是c
1-c4烷基，或rb
10
和rb
11
与它们结合的氮原子一起形成5～8元环、
[0117]
rb
11
在rb
10
和rb
11
形成5～8元环之外的情况下是c
1-c4烷基，或rb
11
和rb
12
与它们结合的各氮原子和该各氮原子结合的磷原子一起形成5～8元环，
[0118]
rb
12
在rb
11
和rb
12
形成5～8元环之外的情况下是c
1-c4烷基，或rb
12
和rb
13
与它们结合的氮原子一起形成5～8元环，
[0119]
rb
13
在rb
12
和rb
13
形成5～8元环之外的情况下是c
1-c4烷基，或rb
13
和rb
14
与它们结合的各氮原子和该各氮原子结合的磷原子一起形成5～8元环，
[0120]
rb
14
在rb
13
和rb
14
形成5～8元环之外的情况下是c
1-c4烷基，或rb
14
和rb
15
与它们结合的氮原子一起形成5～8元环，
[0121]
rb
15
在rb
14
和rb
15
形成5～8元环之外的情况下是c
1-c4烷基，
[0122]
rb
16
是氢、c
1-c8烷基、或c
6-c
10
芳基]、和
[0123][0124]
[式中，
[0125]
rb
17
独立地是c
1-c4烷基，或rb
17
和rb
18
与它们结合的氮原子一起形成5～8元环，
[0126]
rb
18
在rb
17
和rb
18
形成5～8元环之外的情况下是c
1-c4烷基，或rb
18
和rb
19
与它们结合的各氮原子和该各氮原子结合的磷原子一起形成5～8元环，
[0127]
rb
19
在rb
18
和rb
19
形成5～8元环之外的情况下是c
1-c4烷基，或rb
19
和rb
20
与它们结合的氮原子一起形成5～8元环，
[0128]
rb
20
在rb
19
和rb
20
形成5～8元环之外的情况下是c
1-c4烷基，
[0129]
rb
21
是c
1-c4烷基，或rb
21
和rb
22
与它们结合的氮原子一起形成5～8元环，
[0130]
rb
22
在rb
21
和rb
22
形成5～8元环之外的情况下是c
1-c4烷基，或rb
22
和rb
23
与它们结合的各氮原子和该各氮原子结合的磷原子一起形成5～8元环，
[0131]
rb
23
在rb
22
和rb
23
形成5～8元环之外的情况下是c
1-c4烷基，或rb
23
和rb
24
与它们结合的氮原子一起形成5～8元环，
[0132]
rb
24
在rb
23
和rb
24
形成5～8元环之外的情况下是c
1-c4烷基，或rb
24
和rb
25
与它们结合的各氮原子和该各氮原子结合的磷原子一起形成5～8元环，
[0133]
rb
25
在rb
24
和rb
25
形成5～8元环之外的情况下是c
1-c4烷基，或rb
25
和rb
26
与它们结合的氮原子一起形成5～8元环，
[0134]
rb
26
在rb
25
和rb
26
形成5～8元环之外的情况下是c
1-c4烷基，
[0135]
rb
27
是c
1-c4烷基、或c
6-c
10
芳基]。
[0136]
〔25〕〔3〕～〔8〕和〔22〕～〔24〕的任一项中记载的方法，其中，碱选自1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯(dbu)、1，5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(dbn)、1，8-双(四甲基胍基)萘(tmgn)、7-甲基-1，5，7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯(mtbd)、2-叔丁基-1，1，3，3-四甲基胍(btmg)、1，5，7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯(tbd)、叔丁基亚氨基-三(二甲基氨基)正膦(p1-tbu)、叔丁基亚氨基-三(吡咯烷基)正膦(p1-t-bu-三(四亚甲基)，btpp)、2-叔丁基亚氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氢-1，3，2-二氮杂膦杂苯(bemp)、叔辛基亚氨基-三(二甲基氨基)正膦(p1-t-oct)、亚氨基-三(二甲基氨基)正膦(hp1(dma))、1-叔丁基-2，2，4，4，4-五(二甲基氨基)-2λ5，4λ
5-连二(磷腈)(p2-t-bu)、和1-乙基-2，2，4，4，4-五(二甲基氨基)-2λ5，4λ
5-连二(磷腈)(p2-et)。
[0137]
〔26〕〔1〕～〔25〕的任一项中记载的方法，其中，步骤b在选自dmf、nmp、dmi、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、和乙腈的溶剂中进行。
[0138]
〔27〕制备包含n-取代-α，α二取代氨基酸残基与n-取代氨基酸残基连接的二肽残基的肽化合物、其盐、或它们的溶剂化物的方法，其包括〔1〕～〔26〕的任一项中记载的方法。
[0139]
〔28〕环状肽化合物、其盐、或它们的溶剂化物的制备方法，其包括：从通过〔1〕～〔27〕的任一项中记载的方法制备的肽化合物、其盐、或它们的溶剂化物脱保护n末端的保护基的步骤，
[0140]
任选地延伸肽链的步骤，和
[0141]
环化c末端侧的基团和n末端侧的基团形成环状部分的步骤，
[0142]
其中，该环状肽化合物包含8～15个氨基酸残基、包含至少3个n取代氨基酸残基、并且包含至少一个未被n取代的氨基酸残基，环状部分包含至少8个氨基酸残基。
[0143]
发明效果
[0144]
根据本发明，可以有效率地制备肽药品、肽药品的研究、和/或药品的原料药供给中有用的包含n-取代-α，α二取代氨基酸残基与n-取代氨基酸残基连接的二肽残基的肽化合物。此外，由于也可制备结合了各种非天然氨基酸残基的肽化合物，可以提供结构多样的肽化合物。
[0145]
附图简述
[0146]
[图1]图1是显示应用光电二极管阵列检测器、在最大吸收波长检测的、实施例2-4的反应混合物的lcms分析(分析条件：sqdfa05)的结果的图。
[0147]
[图2]图2是显示应用光电二极管阵列检测器、在最大吸收波长检测的、比较例1的反应混合物lcms分析(分析条件：sqdfa05)的结果的图。
[0148]
[图3]图3是显示应用光电二极管阵列检测器、在最大吸收波长检测的、比较例2-4的反应混合物的lcms分析(分析条件：sqdfa05)的结果的图。
[0149]
[图4]图4是显示应用光电二极管阵列检测器、在最大吸收波长检测的、比较例2-5的反应混合物的lcms分析(分析条件：sqdfa05)结果的图。
[0150]
用于实施发明的方式
[0151]
本发明中使用的简称在下文描述。
[0152]
aa：乙酸铵
[0153]
csa：(+)-10-樟脑磺酸
[0154]
dbu：1，8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一碳烯
[0155]
dcc：n，n
’‑
二环己基碳二亚胺
[0156]
dcm：二氯甲烷
[0157]
dce：1，2-二氯乙烷
[0158]
dead：偶氮二甲酸二乙酯
[0159]
dma：二甲基乙酰胺
[0160]
dmf：n，n-二甲基甲酰胺
[0161]
diad：偶氮二甲酸二异丙酯
[0162]
dic：n，n
’‑
二异丙基碳二亚胺
[0163]
dipea：n，n-二异丙基乙胺
[0164]
dmap：n，n-二甲基-4-氨基吡啶
[0165]
dtbbpy：4，4
’‑
二-叔丁基-2，2
’‑
联吡啶
[0166]
edta：乙二胺四乙酸
[0167]
fa：甲酸
[0168]
fmoc：9-芴基甲氧基羰基
[0169]
nmp：n-甲基-2-吡咯烷酮
[0170]
tbme：叔丁基甲基醚
[0171]
tes：三乙基硅烷
[0172]
tfa：三氟乙酸
[0173]
tfe：2，2，2-三氟乙醇
[0174]
thf：四氢呋喃
[0175]
thp：四氢吡喃基
[0176]
tmscl：三甲基氯硅烷
[0177]
hfip：1，1，1，3，3，3-六氟异丙醇
[0178]
hoat：1-羟基-7-氮杂苯并三唑
[0179]
hobt：1-羟基苯并三唑
[0180]
hoobt：3，4-二氢-3-羟基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪
[0181]
ipac：乙酸异丙酯
[0182]
oxyma：氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯
[0183]
ppts：对甲苯磺酸吡啶鎓
[0184]
edci
·
hcl：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐
[0185]
tips：三异丙基硅烷
[0186]
tfoh：三氟甲磺酸
[0187]
hatu：o-(7-氮杂-1h-苯并三唑-1-基)-n，n，n’，n
’‑
四甲基脲六氟磷酸盐
[0188]
dmso：二甲基亚砜
[0189]
fmoc-cl：(9h-芴-9-基)甲基羰酰氯
[0190]
fmoc-osu：9-芴基甲基n-琥珀酰亚胺碳酸酯
[0191]
ns：邻硝基苯磺酰基
[0192]
trt：三苯基甲基或三苯甲基
[0193]
tfa：三氟乙酰基
[0194]
mtbd：7-甲基-1，5，7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯
[0195]
tmgn：1，8-双(四甲基胍基)萘
[0196]
p1-tbu：叔丁基亚氨基-三(二甲基氨基)正膦
[0197]
(官能团等的定义)
[0198]
作为本说明书中的“卤素原子”，示例f、cl、br或i。
[0199]
本说明书中的“烷基”是从脂肪族烃除去任意一个氢原子衍生的1价基团，具有骨架中不含杂原子(指碳和氢原子以外的原子。)或不饱和碳-碳键、含有氢和碳原子的烃基或烃基团结构的子集。烷基不仅包含直链状的那种，也包含支链状的那种。作为烷基，具体地，列举碳原子数1～20(c
1-c
20
，下文“c
p-c
q”意味着碳原子数p～q个)的烷基，优选c
1-c
10
烷基，更优选c
1-c6烷基。作为烷基，具体地，列举甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、异丁基(2-甲基丙基)、正戊基、仲戊基(1-甲基丁基)、叔戊基(1，1-二甲基丙基)、新戊基(2，2-二甲基丙基)、异戊基(3-甲基丁基)、3-戊基(1-乙基丙基)、1，2-二甲基丙基、2-甲基丁基、正己基、1，1，2-三甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、1，1，2，2-四甲基丙基、1，1-二甲基丁
基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基等。
[0200]
本说明书中的“烯基”是具有至少1个双键(2个相邻sp2碳原子)的1价基团。根据双键和取代基(存在时)的构型，双键的几何学形式可以是entgegen(e)或zusammen(z)、顺式或反式构型。烯基不仅包含直链状的那种，也包含支链状的那种。作为烯基，优选列举c
2-c
10
烯基、更优选列举c
2-c6烯基，具体地，例如，列举乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基(包括顺式、反式)、3-丁烯基、戊烯基、3-甲基-2-丁烯基、己烯基等。
[0201]
本说明书中的“炔基”是具有至少1个三键(2个相邻sp碳原子)的1价基团。炔基不仅包含直链状的那种，也包含支链状的那种。作为炔基，优选列举c
2-c
10
炔基、更优选列举c
2-c6炔基，具体地，例如，列举乙炔基、1-丙炔基、炔丙基、3-丁炔基、戊炔基、己炔基、3-苯基-2-丙炔基、3-(2
′‑
氟苯基)-2-丙炔基、2-羟基-2-丙炔基、3-(3-氟苯基)-2-丙炔基、3-甲基-(5-苯基)-4-戊炔基等。
[0202]
本说明书中的“环烷基”意味着饱和或部分饱和的环状1价脂肪族烃基，包含单环、双环、螺环。作为环烷基，优选列举c
3-c8环烷基，具体地，例如，列举环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、双环[2.2.1]庚基、螺[3.3]庚基等。
[0203]
本说明书中的“芳基”意味着1价芳香族烃环，优选列举c
6-c
10
芳基。作为芳基，具体地，例如，列举苯基、萘基(例如，1-萘基、2-萘基)等。
[0204]
本说明书中的“杂环基”意味着除碳原子外还包含1～5个杂原子的非芳香族环状1价基团。杂环基可以在环中具有双键和或三键，环中的碳原子可以被氧化形成羰基，可以是单环或稠环。构成环的原子数目是优选4～10(4～10元杂环基)、更优选4～7(4～7元杂环基)。作为杂环基，具体地，例如，列举氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、二氢呋喃基、四氢呋喃基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、吗啉基、硫代吗啉基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、噁唑烷基、异噁唑烷基、噻唑烷基、异噻唑烷基、1，2-噻嗪烷、噻二唑烷基、氮杂环丁烷基、噁唑烷酮、苯并二噁烷基、苯并噁唑基、二氧戊环基、二噁烷基、四氢吡咯并[1，2-c]咪唑、硫杂环丁烷基、3，6-二氮杂双环[3.1.1]庚烷基、2，5-二氮杂双环[2.2.1]庚烷基、3-氧杂-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷基、磺内酰胺、2-氧杂螺[3.3]庚基等。
[0205]
本说明书中的“杂芳基”意味着除碳原子外还包含1～5个杂原子的芳香族性的环状1价基团。环可以是单环，也可以是与其它环的稠环，可以部分饱和。构成环的原子数目是优选5～10(5～10元杂芳基)，更优选5～7(5～7元杂芳基)。作为杂芳基，具体地，例如，列举呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、三嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噻二唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并噁二唑基、苯并咪唑基、吲哚基、异吲哚基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、苯并间二氧杂环戊烯基、中氮茚基、咪唑并吡啶基等。
[0206]
本说明书中的“烷氧基”意味着前述定义的“烷基”结合的氧基，优选列举c
1-c6烷氧基。作为烷氧基，具体地，例如，列举甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、3-甲基丁氧基等。
[0207]
本说明书中的“酰基(烷酰基)”意味着羰基与氢或前述“烷基”结合的基团，优选列
举c
1-c6酰基、更优选列举c
2-c4酰基。作为酰基，具体地，示例甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基等。
[0208]
本说明书中的“环烷氧基”意味着前述定义的“环烷基”结合的氧基，优选列举c
3-c8环烷氧基。作为环烷氧基，具体地，例如，列举环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基等。
[0209]
本说明书中的“烷基磺酰基”意味着前述定义的“烷基”结合的磺酰基，优选列举c
1-c6烷基磺酰基。作为烷基磺酰基，具体地，例如，列举甲基磺酰基等。
[0210]
本说明书中的“羟基烷基”意味着前述定义的“烷基”的一个或多个氢被羟基取代的基团，优选c
1-c6羟基烷基。作为羟基烷基，具体地，例如，列举羟基甲基、1-羟基乙基、2-羟基乙基、2-羟基-2-甲基丙基、5-羟基戊基等。
[0211]
本说明书中的“卤烷基”意味着前述定义的“烷基”的一个或多个氢被卤素取代的基团，优选c
1-c6卤烷基，更优选c
1-c6氟烷基。作为卤烷基，具体地，例如，列举二氟甲基、三氟甲基、2，2-二氟乙基、2，2，2-三氟乙基、3，3-二氟丙基、4，4-二氟丁基、5，5-二氟戊基等。
[0212]
本说明书中的“卤烷氧基”意味着前述定义的“烷氧基”的一个或多个氢被卤素取代的基团，优选c
1-c6卤烷氧基。作为卤烷氧基，具体地，例如，列举二氟甲氧基、三氟甲氧基、2，2-二氟乙氧基、2，2，2-三氟乙氧基等。
[0213]
本说明书中的“卤酰基(卤烷酰基)”意味着羰基与前述“卤烷基”结合的基团，优选列举c
2-c6卤酰基、更优选列举c
2-c4卤酰基。作为卤酰基，具体地，示例三氟乙酰基、三氯乙酰基、五氟丙酰基、2，3，3，3-四氟-2-(三氟甲基)丙酰基、3，3，3-三氟-2-(三氟甲基)丙酰基等。
[0214]
本说明书中的“烷氧基烷基”意味着前述定义的“烷基”的一个或多个氢被前述定义的“烷氧基”取代的基团，优选c
1-c6烷氧基c
1-c6烷基，更优选c
1-c6烷氧基c
1-c2烷基。作为烷氧基烷基，具体地，例如，列举甲氧基甲基、乙氧基甲基、1-丙氧基甲基、2-丙氧基甲基、正丁氧基甲基、异丁氧基甲基、仲丁氧基甲基、叔丁氧基甲基、戊氧基甲基、3-甲基丁氧基甲基、1-甲氧基乙基、2-甲氧基乙基、2-乙氧基乙基等。
[0215]
本说明书中的“环烷基烷基”意味着前述定义的“烷基”的一个或多个氢被前述定义的“环烷基”取代的基团，优选c
3-c8环烷基c
1-c6烷基，更优选c
3-c6环烷基c
1-c2烷基。作为环烷基烷基，具体地，例如，列举环丙基甲基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基等。
[0216]
本说明书中的“环烷氧基烷基”意味着前述定义的“烷基”的一个或多个氢被前述定义的“环烷氧基”取代的基团，优选c
3-c8环烷氧基c
1-c6烷基，更优选c
3-c6环烷氧基c
1-c2烷基。作为环烷氧基烷基，具体地，例如，列举环丙氧基甲基、环丁氧基甲基等。
[0217]
本说明书中的“烷基磺酰基烷基”意味着前述定义的“烷基”的一个或多个氢被前述定义的“烷基磺酰基”取代的基团，优选c
1-c6烷基磺酰基c
1-c6烷基，更优选c
1-c6烷基磺酰基c
1-c2烷基。作为烷基磺酰基烷基，具体地，例如，列举甲基磺酰基甲基、2-(甲基磺酰基)乙基等。
[0218]
本说明书中的“芳烷基(芳基烷基)”意味着前述定义的“烷基”的至少一个氢原子被前述定义的“芳基”取代的基团，优选c
7-c
14
芳烷基，更优选c
7-c
10
芳烷基。作为芳烷基，具体地，例如，列举苄基、苯乙基、3-苯基丙基等。
[0219]
本说明书中的“杂芳烷基(杂芳基烷基)”意味着前述定义的“烷基”的至少一个氢原子被前述定义的“杂芳基”取代的基团，优选5～10元杂芳基c
1-c6烷基，更优选5～10元杂
芳基c
1-c2烷基。作为杂芳基烷基，具体地，例如，列举3-噻吩基甲基、4-噻唑基甲基、2-吡啶基甲基、3-吡啶基甲基、4-吡啶基甲基、2-(2-吡啶基)乙基、2-(3-吡啶基)乙基、2-(4-吡啶基)乙基、2-(6-喹啉基)乙基、2-(7-喹啉基)乙基、2-(6-吲哚基)乙基、2-(5-吲哚基)乙基、2-(5-苯并呋喃基)乙基等。
[0220]
在本说明书中的“羧基的保护基”中，列举烷基酯型的保护基、苄基酯型的保护基、取代的烷基酯型的保护基等。作为羧基的保护基，具体地，示例甲基、乙基、t-bu基、苄基、三苯甲基、枯基、甲氧基三苯甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙基、2，2，2-三氯乙基、烯丙基等。
[0221]
在本说明书中的“氨基的保护基”中，列举氨基甲酸酯型的保护基、酰胺型的保护基、酰亚胺型的保护基、磺酰胺型的保护基等。作为氨基的保护基，具体地，示例fmoc、boc、cbz、alloc、三氟乙酰基、五氟丙酰基、邻苯二甲酰基、甲苯磺酰基、2-硝基苯磺酰基、4-硝基苯磺酰基、2，4-二硝基苯磺酰基等。
[0222]
本说明书中的“脂环”意味着非芳香族烃环。脂环可以在环中具有不饱和键，也可以是具有2个以上环的多环。此外，构成环的碳原子可以被氧化形成羰基。作为脂环，优选列举3～8元脂环，具体地，例如，列举环丙烷环、环丁烷环、环戊烷环、环己烷环、环庚烷环、环辛烷环、双环[2.2.1]庚烷环等。
[0223]
本说明书中的“杂环”意味着除碳原子外还包含1～5个杂原子的非芳香族杂环。杂环可以在环中具有双键和或三键，环中的碳原子可以被氧化形成羰基，可以是单环、稠环、螺环。构成环的原子数目没有限定，优选3～12(3～12元杂环)、更优选4～7(4～7元杂环)。作为杂环，具体地，例如，列举哌嗪、吡咯烷、哌啶、吗啉、高吗啉、六氢吡嗪、3-氧代哌嗪、2-氧代吡咯烷、氮杂环丁烷、2-氧代咪唑烷、氧杂环丁烷、二氢呋喃、四氢呋喃、二氢吡喃、四氢吡喃、四氢吡啶、硫代吗啉、吡唑烷、咪唑啉、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、咪唑烷、异噻唑烷、噻二唑烷、噁唑烷酮、苯并二噁烷、二氧戊环、二噁烷、四氢噻喃等。
[0224]
本说明书中的“饱和杂环”意味着除碳原子外还包含1～5个杂原子、环中不含双键和/或三键的非芳香族的杂环。饱和杂环可以是单环，也可以与其它的环、例如苯环等芳香环形成稠环。饱和杂环形成稠环时，作为饱和杂环优选列举4～7元饱和杂环，具体地，例如，列举氮杂环丁烷环、氧杂环丁烷环、四氢呋喃环、四氢吡喃环、吗啉环、硫代吗啉环、吡咯烷环、4-氧代吡咯烷环、哌啶环、4-氧代哌啶环、哌嗪环、吡唑烷环、咪唑烷环、噁唑烷环、异噁唑烷环、噻唑烷环、异噻唑烷环、噻二唑烷环、噁唑烷酮环、二氧戊环、二噁烷环、硫杂环丁烷环、八氢吲哚环、二氢吲哚环等。
[0225]
在本说明书中，“肽链”指一个或其以上的天然氨基酸和/或非天然氨基酸通过酰胺键和/或酯键连接的肽链。作为肽链，优选包含1～15个氨基酸残基的肽链，更优选由5～12个氨基酸残基组成的肽链。
[0226]
本发明中的“肽化合物”只要是天然氨基酸和/或非天然氨基酸通过酰胺键和/或酯键连接的肽化合物则没有特别限定，作为氨基酸残基数优选5～30个残基、更优选8～15个残基、进一步优选9～13个残基的肽化合物。加载于固相合成用树脂的那种也包含在肽化合物中。本发明中合成的肽化合物优选一个肽中包含至少3个n-取代氨基酸，更优选包含至少5个以上n取代氨基酸。这些n取代氨基酸可以在肽化合物中连续存在，也可以不连续存在。在本说明书中，构成肽化合物的“氨基酸”有时称为“氨基酸残基”，构成肽化合物的全部或一部分的“肽”有时称为“肽残基”。本发明中的肽化合物可以是直链状也可以是环状，优
选环状肽化合物。
[0227]
本发明中的“环状肽化合物”是可以通过将直链肽化合物的n末端侧的基团与c末端侧的基团环化得到的环状的肽化合物。环化可以是通过如酰胺键的碳-氮键的环化、通过如酯键和醚键的碳-氧键的环化、通过如硫醚键的碳-硫键的环化、通过碳-碳键的环化、或通过杂环构建的环化等任何形式。它们之中，优选经由酰胺键或碳-碳键等共价键的环化，更优选经由通过侧链的羧酸基与n末端的主链的氨基的酰胺键的环化。环化中应用的羧酸基和氨基等的位置可以是主链上，也可以是侧链上，只要是可环化的位置，则没有特别限制。
[0228]
本说明书中的“一个或多个”意味着一个或2个以上的数目。“一个或多个”在与某基团的取代基有关的上下文中应用时，该用语意味着从一个至该基团容许的取代基的最大数目。作为“一个或多个”，具体地，例如，列举1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、和/或比其大的数目。
[0229]
本说明书中的“固相合成用树脂”只要可以在通过固相法的肽化合物的合成中应用，则没有特别限定。作为这样的固相合成用树脂，具体地，例如，列举ctc树脂、wang树脂、sasrin树脂、三苯甲基氯树脂(trt树脂)、4-甲基三苯甲基氯树脂(mtt树脂)、4-甲氧基三苯甲基氯树脂(mmt)等可在酸性条件除去的那种。树脂可以根据应用的氨基酸侧的官能团适当选择。例如，作为氨基酸侧的官能团应用羧酸(主链羧酸、或由asp或glu代表的侧链羧酸)、或芳香环上的羟基(由tyr代表的酚基)时，作为树脂，优选应用三苯甲基氯树脂(trt树脂)或2-氯三苯甲基氯树脂(ctc树脂)。作为氨基酸侧的官能团应用脂肪族羟基(由ser或thr代表的脂肪族醇基)时，作为树脂，优选应用三苯甲基氯树脂(trt树脂)、2-氯三苯甲基氯树脂(ctc树脂)或4-甲基三苯甲基氯树脂(mtt树脂)。另外，在本说明书中，有时将树脂记载为树脂。固相合成用树脂可以与不限于肽中的c末端氨基酸的任意位置的氨基酸连接。优选c末端氨基酸的羧基与固相合成用树脂连接，该羧基可以是主链的羧基也可以是侧链的羧基。
[0230]
关于构成树脂的聚合物的种类没有特别限定。在由聚苯乙烯构成的树脂的情形中，可以应用100-200目或200-400目的任一种。此外，关于交联率也没有特别限定，优选1％dvb(二乙烯基苯)交联的那种。此外，作为构成树脂的聚合物的种类，列举tentagel、或chemmatrix。
[0231]
在本说明书中记载的化合物的制备中，在定义的基团在实施方法的条件下接受不期望的化学转化时，例如，通过应用官能团的保护、脱保护等手段，可以制备该化合物。此处，保护基的选择和引入去除操作可以列举例如“greene’s，“protective groups in organic synthesis”(第5版，john wiley&sons 2014)”中记载的方法，可以相应于反应条件适当应用它们。此外，也可以按需要改变取代基导入等的反应步骤的顺序。
[0232]
在本说明书中，在赋予“任选被取代的”的修饰语时，作为该取代基，例如，示例烷基、烷氧基、氟烷基、氟烷氧基、氧代、氨基羰基、烷基磺酰基、烷基磺酰基氨基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、芳基烷基、杂芳基烷基、卤素、硝基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、氰基、羧基、烷氧基羰基、甲酰基等。
[0233]
进一步，可以对它们分别赋予取代基，这些取代基也没有限制，例如，可以从包含卤素原子、氧原子、硫原子、氮原子、硼原子、硅原子、或磷原子的任意取代基中独立地自由选择一个或2个以上。即，示例任选被取代的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、环烷基
等。
[0234]
本发明中记载的化合物可以是其盐或它们的溶剂化物。在本发明中记载的化合物的盐中，例如，包含：盐酸盐；氢溴酸盐；氢碘酸盐；磷酸盐；膦酸盐；硫酸盐；甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐等磺酸盐；乙酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、水杨酸盐等羧酸盐；或钠盐、钾盐等碱金属盐；镁盐、钙盐等碱土金属盐；铵盐、烷基铵盐、二烷基铵盐、三烷基铵盐、四烷基铵盐等铵盐等。这些盐通过例如使该化合物与酸或碱接触而制备。本发明中记载的化合物的溶剂化物指溶液中溶质分子强烈吸引溶剂分子、形成一个分子集团的现象，若溶剂是水则称为水合物。本发明中记载的化合物可以是与选自醇(例如，甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇等)、二甲基甲酰胺、或二甘醇二甲醚等有机溶剂、或水等的单独溶剂的溶剂化物，也可以是与多种溶剂的溶剂化物。
[0235]
本说明书中的“氨基酸”中包含天然氨基酸和非天然氨基酸(有时称为氨基酸衍生物)。本说明书中的“天然氨基酸”指gly、ala、ser、thr、val、leu、ile、phe、tyr、trp、his、glu、asp、gln、asn、cys、met、lys、arg、pro。非天然氨基酸(氨基酸衍生物)没有特别限定，示例β-氨基酸、d型氨基酸、n取代氨基酸、α，α-二取代氨基酸、侧链与天然氨基酸不同的氨基酸、羟基羧酸等。作为本说明书中的氨基酸，任意的空间构型是容许的，但优选l型氨基酸。氨基酸的侧链的选择不设特别限制，除氢原子外也自由选自例如烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、环烷基、螺结合的环烷基。可以分别赋予取代基，这些取代基也没有限制，例如，可以从包含卤素原子、o原子、s原子、n原子、b原子、si原子、或p原子的任意的取代基中独立地自由选择一个或2个以上。即，示例任选被取代的烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、环烷基等、或氧代、氨基羰基、卤素原子等。在非限定的一个方式中，本说明书中的氨基酸可以是同一分子内具有羧基与氨基的化合物(即使该情形中，如脯氨酸、羟脯氨酸的亚氨基酸也包含在氨基酸中)。
[0236]
作为本说明书中包含卤素原子的取代基，示例取代基中有卤素的烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基等，更具体地，示例氟烷基、二氟烷基、三氟烷基等。
[0237]
作为包含o原子的取代基，列举羟基(-oh)、氧基(-or)、羰基(-c＝o-r)、羧基(-co2h)、氧基羰基(-c＝o-or)、羰基氧基(-o-c＝o-r)、硫羰基(-c＝o-sr)、羰基硫基(-s-c＝o-r)、氨基羰基(-c＝o-nhr)、羰基氨基(-nh-c＝o-r)、氧基羰基氨基(-nh-c＝o-or)、磺酰基氨基(-nh-so
2-r)、氨基磺酰基(-so
2-nhr)、氨磺酰氨基(-nh-so
2-nhr)、硫代羧基(-c＝o-sh)、羧基羰基(-c＝o-co2h)等基团。
[0238]
作为氧基(-or)的实例，列举烷氧基、环烷氧基、烯基氧基、炔基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、芳烷基氧基等。作为烷氧基，优选c
1-c4烷氧基、c
1-c2烷氧基，特别优选甲氧基、或乙氧基。
[0239]
作为羰基(-c＝o-r)的实例，列举甲酰基(-c＝o-h)、烷基羰基、环烷基羰基、烯基羰基、炔基羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、芳烷基羰基等。
[0240]
作为氧基羰基(-c＝o-or)的实例，列举烷基氧基羰基、环烷基氧基羰基、烯基氧基羰基、炔基氧基羰基、芳基氧基羰基、杂芳基氧基羰基、芳烷基氧基羰基等。
[0241]
作为羰基氧基(-o-c＝o-r)的实例，列举烷基羰基氧基、环烷基羰基氧基、烯基羰基氧基、炔基羰基氧基、芳基羰基氧基、杂芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基等。
[0242]
作为硫羰基(-c＝o-sr)的实例，列举烷基硫羰基、环烷基硫羰基、烯基硫羰基、炔
基硫羰基、芳基硫羰基、杂芳基硫羰基、芳烷基硫羰基等。
[0243]
作为羰基硫基(-s-c＝o-r)的实例，列举烷基羰基硫基、环烷基羰基硫基、烯基羰基硫基、炔基羰基硫基、芳基羰基硫基、杂芳基羰基硫基、芳烷基羰基硫基等。
[0244]
作为氨基羰基(-c＝o-nhr)的实例，列举烷基氨基羰基(例如，c
1-c6或c
1-c4烷基氨基羰基，特别示例乙基氨基羰基、甲基氨基羰基等。)、环烷基氨基羰基、烯基氨基羰基、炔基氨基羰基、芳基氨基羰基、杂芳基氨基羰基、芳烷基氨基羰基等。除这些外，还列举与-c＝o-nhr中的n原子结合的h原子被烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基进一步取代的基团。
[0245]
作为羰基氨基(-nh-c＝o-r)的实例，列举烷基羰基氨基、环烷基羰基氨基、烯基羰基氨基、炔基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基、芳烷基羰基氨基等。除这些外，还列举与-nh-c＝o-r中的n原子结合的h原子被烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基进一步取代的基团。
[0246]
作为氧基羰基氨基(-nh-c＝o-or)的实例，列举烷氧基羰基氨基、环烷氧基羰基氨基、烯基氧基羰基氨基、炔基氧基羰基氨基、芳基氧基羰基氨基、杂芳基氧基羰基氨基、芳烷基氧基羰基氨基等。除这些外，还列举与-nh-c＝o-or中的n原子结合的h原子被烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基进一步取代的基团。
[0247]
作为磺酰基氨基(-nh-so
2-r)的实例，列举烷基磺酰基氨基、环烷基磺酰基氨基、烯基磺酰基氨基、炔基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、杂芳基磺酰基氨基、芳烷基磺酰基氨基等。除这些外，还列举与-nh-so
2-r中的n原子结合的h原子被烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基进一步取代的基团。
[0248]
作为氨基磺酰基(-so
2-nhr)的实例，列举烷基氨基磺酰基、环烷基氨基磺酰基、烯基氨基磺酰基、炔基氨基磺酰基、芳基氨基磺酰基、杂芳基氨基磺酰基、芳烷基氨基磺酰基等。除这些外，还列举与-so
2-nhr中的n原子结合的h原子被烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基进一步取代的基团。
[0249]
作为氨磺酰氨基(-nh-so
2-nhr)的实例，列举烷基氨磺酰氨基、环烷基氨磺酰氨基、烯基氨磺酰氨基、炔基氨磺酰氨基、芳基氨磺酰氨基、杂芳基氨磺酰氨基、芳烷基氨磺酰氨基等。进一步，与-nh-so
2-nhr中的n原子结合的2个h原子可以被独立地选自烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、和芳烷基的取代基取代，此外，这2个取代基可以形成环。
[0250]
作为包含s原子的取代基，列举硫醇(-sh)、硫基(-s-r)、亚磺酰基(-s＝o-r)、磺酰基(-so
2-r)、磺基(-so3h)、五氟硫烷基(-sf5)。
[0251]
作为硫基(-s-r)的实例，选自烷基硫基、环烷基硫基、烯基硫基、炔基硫基、芳基硫基、杂芳基硫基、芳烷基硫基等。
[0252]
作为亚磺酰基(-s＝o-r)的实例，列举烷基亚磺酰基、环烷基亚磺酰基、烯基亚磺酰基、炔基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、杂芳基亚磺酰基、芳烷基亚磺酰基等。
[0253]
作为磺酰基(-so
2-r)的实例，列举烷基磺酰基、环烷基磺酰基、烯基磺酰基、炔基磺酰基、芳基磺酰基、杂芳基磺酰基、芳烷基磺酰基等。
[0254]
作为包含n原子的取代基，列举叠氮(-n3，也称为“叠氮基”)、氰基(-cn)、伯氨基(-nh2)、仲氨基(-nh-r；也称为单取代氨基)、叔氨基(-nr(r
′
)；也称为二取代氨基)、脒基(-c(＝nh)-nh2)、取代脒基(-c(＝nr)-nr
′r″
)、胍基(-nh-c(＝nh)-nh2)、取代胍基(-nr-c(＝
nr
″′
)-nr
′r″
)、氨基羰基氨基(-nr-co-nr
′r″
)、吡啶基、哌啶子基、吗啉代、氮杂环丁烷基等基团。
[0255]
作为仲氨基(-nh-r)的实例，列举烷基氨基、环烷基氨基、烯基氨基、炔基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、芳烷基氨基等。
[0256]
作为叔氨基(-nr(r
′
)；二取代氨基)的实例，例如，列举烷基(芳烷基)氨基等具有分别独立地选自烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基等的任意2个取代基的氨基，这些任意2个取代基可以形成环。具体地，示例二烷基氨基，特别是c
1-c6二烷基氨基、c
1-c4二烷基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基等。本说明书中的“c
p-cq二烷基氨基”指氨基中取代有2个c
p-cq烷基的基团，两个c
p-cq烷基可以相同也可以不同。
[0257]
作为取代脒基(-c(＝nr)-nr
′r″
)的实例，列举n原子上的3个取代基r、r
′
、和r
″
分别独立地选自烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基的基团，例如烷基(芳烷基)(芳基)脒基等。
[0258]
作为取代胍基(-nr-c(＝nr
″′
)-nr
′r″
)的实例，列举r、r
′
、r
″
、和r
″′
分别独立地选自烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基的基团，或它们形成环的基团等。
[0259]
作为氨基羰基氨基(-nr-co-nr
′r″
)的实例，列举r、r
′
、和r
″
分别独立地选自氢原子、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基的基团，或它们形成环的基团等。
[0260]
作为包含b原子的取代基，列举硼基(-br(r
′
))和二氧基硼基(-b(or)(or
′
))等。这2个取代基r和r
′
分别独立地选自烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基等，或它们可以形成环。具体地，列举环状硼基，更具体地，列举频哪醇硼基(pinacholatoboryl group)、新戊二醇硼基(neopentanediolatoboryl group)、儿茶酚硼基(catecholatoboryl group)等。
[0261]
作为本说明书中的n取代氨基酸的氮原子上的取代基，具体地，示例烷基、c
1-c6烷基、c
1-c4烷基、甲基、c
7-c
14
芳烷基、苄基、苯乙基等。
[0262]
氨基酸的主链氨基可以未取代(-nh2)，也可以被取代(即，-nhr。此处，r表示任选地具有取代基的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、环烷基，此外，如脯氨酸，与n原子结合的碳链和α位的碳原子可以形成环。)。这样的主链氨基的氢原子被取代的氨基酸在本说明书中有时称为“n-取代氨基酸”。作为本说明书中的“n-取代氨基酸”，优选示例n-烷基氨基酸、n-c
1-c6烷基氨基酸、n-c
1-c4烷基氨基酸、n-甲基氨基酸、n-c
2-c6烯基氨基酸、n-烯丙基氨基酸、n-c
7-c
14
芳烷基氨基酸、n-苄基氨基酸、n-苯乙基氨基酸，但不限于这些。
[0263]
本说明书中的“氨基酸”中包含分别对应的全部同位素。“氨基酸”的同位素是至少一个原子被原子编号(质子数)相同、质量数(质子和中子数的和)不同的原子取代的那种。作为本说明书的“氨基酸”中包含的同位素的实例，有氢原子、碳原子、氮原子、氧原子、磷原子、硫原子、氟原子、氯原子等，分别地，包含2h、3h、
13
c、
14
c、
15
n、
17
o、
18
o、
32
p、
35
s、
18
f、
36
cl等。
[0264]
(制备方法)
[0265]
在某方式中，本发明涉及制备在n末端具有n-取代-α，α二取代氨基酸残基、包含该n-取代-α，α二取代氨基酸残基与n-取代氨基酸残基连接的二肽残基的肽化合物、其盐、或它们的溶剂化物的方法，该方法包括后述的步骤a和步骤b。
[0266]
(步骤a)
[0267]
步骤a是在缩合试剂的存在下或不存在下使n-取代氨基酸、其盐、或它们的溶剂化
物、或在n末端具有n-取代氨基酸残基的肽化合物、其盐、或它们的溶剂化物，与用吸电子性的保护基保护氨基的n-未取代-α，α二取代氨基酸、其盐、其脱水物、或它们的溶剂化物反应，得到在n末端具有n-未取代-α，α二取代氨基酸残基、包含该n-未取代-α，α二取代氨基酸残基与n-取代氨基酸残基连接的二肽残基的肽化合物、其盐、或它们的溶剂化物的步骤。在本说明书中，肽化合物包含二肽意味着构成该肽化合物的氨基酸序列中包含该二肽。
[0268]
在某方式中，步骤a中应用的“n-取代氨基酸”是主链的氨基为-nhr的任意的天然或非天然氨基酸，此处，r是氢以外的任意基团。作为r，具体地，例如，列举任选被取代的烷基、任选被取代的烯基、任选被取代的炔基、任选被取代的芳基、任选被取代的杂芳基、任选被取代的芳烷基、任选被取代的环烷基等，此外，r如脯氨酸，与n原子结合的碳链与α位的碳原子可以形成环，该环可以进一步被任意的取代基取代。此外，n-取代氨基酸可以是盐的形式或溶剂化物的形式。
[0269]
在某方式中，步骤a中应用的“在n末端具有n-取代氨基酸残基的肽化合物”只要在n末端具有前述n-取代氨基酸残基，该肽化合物中包含的其它的氨基酸的种类和数目没有限定。此外，该肽化合物可以是盐的形式或溶剂化物的形式。
[0270]
步骤a中应用的n-取代氨基酸、或在n末端具有n-取代氨基酸残基的肽化合物可以购自供应商，或将购自供应商的那种改变配制。
[0271]
作为这样的n-取代氨基酸、或在n末端具有n-取代氨基酸残基的肽化合物，具体地，列举由下述式(2)表示化合物、或其盐、或它们的溶剂化物：
[0272][0273]
[式中，
[0274]
p2是c
1-c6烷基、c
2-c6烯基、或c
7-c
14
芳烷基，
[0275]
r2是c
1-c6烷基、c
1-c6卤烷基、c
1-c6羟基烷基、c
1-c6烷基磺酰基c
1-c6烷基、c
2-c6炔基、任选被一个或多个卤素取代的c
1-c6烷氧基c
1-c6烷基、c
3-c8环烷基、c
3-c8环烷基c
1-c6烷基、c
3-c8环烷氧基c
1-c6烷基、或c
7-c
14
芳烷基，
[0276]
r3是羟基、o-pg2、任意的氨基酸残基、或任意的肽残基，
[0277]
pg2是羧基的保护基]。
[0278]
在某方式中，步骤a中应用的“用吸电子性的保护基保护氨基的n-未取代-α，α二取代氨基酸”意味着氨基酸的α碳具有氢以外的二个任意的取代基、氨基酸的主链的氨基未取代、并且该氨基用吸电子性的保护基保护(即，“保护基-nh
‑”
)的氨基酸。该氨基酸可以是盐的形式或溶剂化物的形式。与α碳结合的二个取代基可以相同也可以不同。作为该取代基，具体地，例如，列举任选被取代的烷基、任选被取代的烷氧基烷基、任选被取代的烯基、任选被取代的炔基、任选被取代的芳基、任选被取代的杂芳基、任选被取代的芳烷基、任选被取代的杂芳烷基、任选被取代的环烷基、任选被取代的环烷基烷基等。此外，与α碳结合的二个取代基可以与它们结合的碳原子一起形成任选被取代的脂环、或任选被取代的杂环。
[0279]
步骤a中应用的用吸电子性的保护基保护氨基的n-未取代-α，α二取代氨基酸购自
供应商，或可以将购自供应商的那种改变配制。
[0280]
在某方式中，步骤a可以在缩合试剂存在下进行反应。另一方面，步骤a若在例如应用n-未取代-α，α二取代氨基酸的脱水物时等进行缩合反应，可以在缩合试剂不存在下进行反应。
[0281]
作为这样的用吸电子性的保护基保护氨基的n-未取代-α，α二取代氨基酸，具体地，列举由下述式(3)表示的化合物、或其盐、或它们的溶剂化物：
[0282][0283]
[式中，
[0284]
pg1是吸电子性的保护基，
[0285]
r1和q1独立地选自c
1-c6烷基、c
2-c6烯基、c
1-c6烷氧基c
1-c6烷基、c
3-c8环烷基c
1-c6烷基、或任选被取代的c
7-c
14
芳烷基，或
[0286]
r1和q1与它们结合的碳原子一起形成3～8元脂环或4～7元饱和杂环]。
[0287]
在某方式中，与n-未取代-α，α二取代氨基酸结合的吸电子性的保护基是该保护基结合的nh基的pka(水中)为6～11的保护基，优选nh基的pka(水中)为8～11的保护基。作为这样的保护基，具体地，列举c
2-c6卤酰基，更具体地，列举三氟乙酰基、三氯乙酰基、五氟丙酰基、2，3，3，3-四氟-2-(三氟甲基)丙酰基、或3，3，3-三氟-2-(三氟甲基)丙酰基等。
[0288]
在某方式中，作为通过步骤a得到的、在n末端具有n-未取代-α，α二取代氨基酸残基、包含该n-未取代-α，α二取代氨基酸残基与n-取代氨基酸残基连接的二肽残基的肽化合物，具体地，列举由下述式(4)表示的化合物、或其盐、或它们的溶剂化物：
[0289][0290]
[式中，
[0291]
pg1、r1、和q1与式(3)的pg1、r1、和q1分别同义、
[0292]
p2、r2、和r3与式(2)的p2、r2、和r3分别同义]。
[0293]
(步骤b)
[0294]
步骤b是在碱和取代基导入剂存在下、向通过步骤a得到的肽化合物的n末端具有的用吸电子性的保护基保护氨基的n-未取代-α，α二取代氨基酸残基的氨基导入取代基，得到在n末端具有用吸电子性的保护基保护氨基的n-取代-α，α二取代氨基酸残基、并且包含该n-取代-α，α二取代氨基酸残基与n-取代氨基酸残基连接的二肽残基的肽化合物、其盐、或它们的溶剂化物的步骤。
[0295]
作为本步骤中导入的取代基，具体地，列举任选被取代的烷基、任选被取代的烯基、任选被取代的炔基、任选被取代的芳烷基、任选被取代的环烷基等。
[0296]
在某方式中，步骤b中应用的碱优选其共轭酸的pka(乙腈中)是23～30的那种。作为这样的碱，具体地，列举后述具有脒骨架的碱、具有胍骨架的碱、或具有磷腈骨架的碱等。
[0297]
在某方式中，步骤b中应用的取代基导入剂用于向n末端的用吸电子性的保护基保护氨基的n-未取代-α，α二取代氨基酸残基的氨基(即“保护基-nh
‑”
)导入取代基。作为取代基导入剂，可以应用亲电子试剂。具体地，可以应用结合了导入的取代基和离去基(例如，卤素、三氟甲磺酰基、甲磺酰基、或甲苯磺酰基等磺酸基、或磷酸基)的化合物。
[0298]
在某方式中，作为通过步骤b得到的在n末端具有用吸电子性的保护基保护氨基的n-取代-α，α二取代氨基酸残基、包含该n-取代-α，α二取代氨基酸残基与n-取代氨基酸残基连接的二肽残基的肽化合物，具体地，列举由下述式(1)表示的化合物、或其盐、或它们的溶剂化物：
[0299][0300]
[式中，
[0301]
p1是c
1-c6烷基、c
2-c6烯基、或c
7-c
14
芳烷基，
[0302]
pg1、r1、和q1与式(3)的pg1、r1、和q1分别同义，
[0303]
p2、r2、和r3与式(2)的p2、r2、和r3分别同义]。
[0304]
通过本发明的方法制备的“在n末端具有n-取代-α，α二取代氨基酸残基、包含该n-取代-α，α二取代氨基酸残基与n-取代氨基酸残基连接的二肽残基的肽化合物”可以是其n末端的氨基用保护基保护，也可以是除去保护基的游离氨基(nhr-)。n末端的氨基用保护基保护时，该保护基可以是起因于步骤a中应用的“用吸电子性的保护基保护氨基的n-未取代-α，α二取代氨基酸”的吸电子性的保护基，也可以是该吸电子性的保护基被脱保护后导入的其它保护基(例如，fmoc基)。本发明除前述步骤a和前述步骤b还可以包括除去吸电子性的保护基的步骤和导入与该保护基不同的任意的保护基的步骤。在保护基的引入去除中，例如，可以应用“greene’s，“protective groups in organic synthesis”(第5版，john wiley&sons 2014)”中记载的方法。
[0305]
在某方式中，本发明涉及制备包含式(1)表示的2个氨基酸残基连接的结构的肽化合物、其盐、或它们的溶剂化物的方法，该方法包括如以下的方案所示的步骤a和步骤b。
[0306][0307]
在上述的各式中，pg1是氨基的保护基，在式(4)中，优选应用pg1结合的nh基的pka成为11以下的保护基。pg1结合的nh基的pka是11以下、优选6～11、更优选8～11时，可向pg1结合的式(4)的nh基选择性导入p1基。pka可以应用利用advanced chemistry development(acd/labs)software v11.02((c)1994-2019 acd/labs)的计算值。例如，三氟乙酰基与氮原子结合的(2，2，2-三氟乙酰基)丙氨酸叔丁酯的nh基的pka是9.71、2-甲基-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酸叔丁酯的nh基的pka是9.21。此外，五氟丙酰基与氮原子结合的2-甲基-2-(2，2，3，3，3-五氟丙酰胺)丙酸甲酯的nh基的pka是9.27，三氯乙酰基与氮原子结合的2-甲基-2-(2，2，2-三氯乙酰胺)丙酸甲酯的nh基的pka是9.72。其另一方面，吸电子力比这些卤酰基弱的乙酰基与氮原子结合的2-乙酰胺-2-甲基丙酸甲酯的nh基的pka是14.36，nh基的酸度比卤酰基弱。在本发明中，pg1优选nh基的质子的酸度变高的吸电子性的保护基，作为这样的保护基，列举c
2-c6卤酰基。作为c
2-c6卤酰基，优选三氟乙酰基、三氯乙酰基、五氟丙酰基、2，3，3，3-四氟-2-(三氟甲基)丙酰基、或3，3，3-三氟-2-(三氟甲基)丙酰基等。
[0308]
式(1)中、p1是c
1-c6烷基、c
2-c6烯基、或c
7-c
14
芳烷基。p1是c
1-c6烷基时，作为c
1-c6烷基，优选甲基、乙基、正丙基、或异丙基，p1是c
1-c6烯基时，作为c
1-c6烯基，优选烯丙基，p1是c
7-c
14
芳烷基时，作为c
7-c
14
芳烷基，优选苄基或苯乙基。
[0309]
在上述的各式中，r1和q1独立地选自c
1-c6烷基、c
2-c6烯基、c
1-c6烷氧基c
1-c6烷基、c
3-c8环烷基c
1-c6烷基、或任选被取代的c
7-c
14
芳烷基，或
[0310]
r1和q1与它们结合的碳原子一起形成3～8元脂环或4～7元饱和杂环。
[0311]
r1和/或q1是c
1-c6烷基时，作为c
1-c6烷基，优选甲基、乙基、异丙基、2-甲基丙基。r1和/或是c
2-c6烯基时，作为c
2-c6烯基，优选烯丙基。r1和/或q1是c
1-c6烷氧基c
1-c6烷基时，作为c
1-c6烷氧基c
1-c6烷基，优选甲氧基甲基、乙氧基甲基、1-丙氧基甲基、2-丙氧基甲基、正丁氧基甲基、异丁氧基甲基、仲丁氧基甲基、叔丁氧基甲基、戊氧基甲基、3-甲基丁氧基甲基、1-甲氧基乙基、2-甲氧基乙基、或2-乙氧基乙基。r1和/或q1是c
3-c8环烷基c
1-c6烷基时，作为c
3-c8环烷基c
1-c6烷基，优选环丙基甲基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基、环庚基甲基、2-环丙基乙基、2-环丁基乙基、2-环戊基乙基、2-环己基乙基。r1和/或是任选被取代的c
7-c
14
芳烷基时，作为c
7-c
14
芳烷基，优选苄基或苯乙基，作为c
7-c
14
芳烷基的芳基的取代基，优选选自卤素、c
1-c6烷基、c
1-c6卤烷基、c
1-c6烷氧基、c
1-c6卤烷氧基、和氰基的一个或
多个基团。
[0312]
r1和q1与它们结合的碳原子一起形成3～8元脂环或4～7元饱和杂环时，作为3～8元脂环，优选环丙烷环、环丁烷环、环戊烷环、环己烷环，作为4～7元饱和杂环，优选四氢吡喃环。
[0313]
在上述的各式中，p2是c
1-c6烷基、c
2-c6烯基、或c
7-c
14
芳烷基。p2是c
1-c6烷基时，作为c
1-c6烷基，优选甲基、乙基、正丙基、或异丙基，p2是c
1-c6烯基时，作为c
1-c6烯基，优选烯丙基，p2是c
7-c
14
芳烷基时，作为c
7-c
14
芳烷基，优选苄基或苯乙基。
[0314]
在上述的各式中，r2是c
1-c6烷基、c
1-c6卤烷基、c
1-c6羟基烷基、c
1-c6烷基磺酰基c
1-c6烷基、c
2-c6炔基、任选被一个或多个卤素取代的c
1-c6烷氧基c
1-c6烷基、c
3-c8环烷基、c
3-c8环烷基c
1-c6烷基、c
3-c8环烷氧基c
1-c6烷基、或c
7-c
14
芳烷基。
[0315]
作为r2，优选c
1-c6烷基、c
1-c6氟烷基、c
1-c4羟基烷基、甲基磺酰基c
1-c2烷基、c
2-c3炔基、任选被一个或多个氟取代的c
1-c4烷氧基c
1-c2烷基、c
3-c6环烷基、c
3-c6环烷基c1-c2烷基、c
3-c6环烷氧基c
1-c2烷基、苄基、苯乙基。
[0316]
作为r2，具体地，例如，列举甲基、乙基、正丙基、异丙基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、正丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正戊基、炔丙基、3，3-二氟丁基、5，5-二氟戊基、甲氧基甲基、1-甲氧基乙基、2-甲氧基乙基、正丙氧基甲基、1-羟基乙基、环丙氧基甲基、环丁氧基甲基、(2，2，2-三氟乙氧基)甲基、2-甲基磺酰基乙基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环丙基甲基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基、苄基、苯乙基等。
[0317]
上述的各式中，r3是羟基、o-pg2、任意的氨基酸残基、或任意的肽残基，此处，pg2是羧基的保护基。r3是o-pg2时，作为pg2，具体地，例如，列举叔丁基等烷基和三苯甲基、枯基、烯丙基、苄基等。r3是任意的氨基酸残基、或任意的肽残基时，可以向固相合成用树脂加载氨基酸残基或肽残基。向固相合成用树脂加载肽残基时，该树脂可以在肽残基的c末端的氨基酸残基加载，也可以在其以外的任意的位置的氨基酸残基加载。作为固相合成用树脂，优选列举ctc树脂、wang树脂、或sasrin树脂，进一步优选ctc树脂。此外，r3是任意的肽残基时，该肽残基由任意的种类和数目的氨基酸残基构成。作为构成肽残基的氨基酸残基的数目，优选2～13，更优选2～9。
[0318]
式(1)中，作为由以下的式：
[0319][0320]
表示的氨基酸残基，具体地，例如，列举meaib、mecleu、me(me)phe、me(me)abu、me(me)leu、me(me)ser(me)、me(me)phe、me(me)cha、me(me)val、etaib、npraib、allylaib、bnaib。
[0321]
式(1)中，作为由以下的式：
[0322][0323]
表示的氨基酸残基，具体地，例如，列举meala、meleu、mecha、meval、meala(cpent)、meala(cbu)、meala(cpr)、mechg、megly(cpent)、megly(cbu)、megly(cpr)、meabu、menva、menle、menva(5-f2)、mehle、meile、meser(npr)、meser(cpr)、mehnl、mehnl(7-f2)、mepra、meser(me)、methr、meser(cbu)、meser(tfe)、methr(me)、mehse(me)、memet(o2)、etval、nprval。
[0324]
式(1)中，r3是任意的氨基酸残基时，作为该氨基酸残基，具体地，例如，列举meser(tbuoh)、bala、bmeala、megly、mephe、mephe(3-f)、mephe(4-f)、d-mephe、2-achxc、2-acpnc、3-cf3-bala、asp-mor、asp-mor(26-bicyc)、asp-mor(so2)、asp-nme2、asp-oxz、asp-pip、asp-pip(345-f6)、asp-pip(4-me)、asp-pip-tbu、asp-piz(oxe)、asp-pyrro、asp-pyrro(34-f4)、asp-pyrro(3-me2)、d-(propargyl)gly-(c#ch2)、d-3-abu、d-3-meabu、d-gly(allyl)-(c#ch2)、d-hph-(c#ch2)、d-leu-(c#ch2)、d-measp-pyrro、d-meleu-(c#ch2)、d-pic(2)-(c#ch2)、d-pro-(c#ch2)、d-ser(ipen)-(c#ch2)、d-ser(ntbu-aca)-(c#ch2)、etasp-pip、measp-aze、measp-mor、measp-mor(26-bicyc)、measp-mor(so2)、measp-nme2、measp-oxz、measp-pip、measp-pip(345-f6)、measp-pip(3-f2)、measp-pip(4-f2)、measp-pip(4-me)、measp-piz(oxe)、measp-pyrro、measp-pyrro(34-f4)、measp-pyrro(3-me2)、nprasp-pip。
[0325]
步骤a是将由式(2)表示的化合物、其盐、或它们的溶剂化物、由式(3)表示的化合物、其盐、其脱水物、或它们的溶剂化物与缩合试剂反应、得到由式(4)表示的化合物、其盐、或它们的溶剂化物的步骤，或使由式(2)表示的化合物、其盐、或它们的溶剂化物、和由式(3)表示的化合物的脱水物(即，由式(3’)表示的化合物)、其盐、或它们的溶剂化物在缩合试剂不存在下反应、得到由式(4)表示的化合物、其盐、或它们的溶剂化物的步骤。
[0326]
由以下的式(2)表示的化合物可以购自供应商，或按需要将购自供应商的那种改变应用。具体地，例如，由式(2)表示的化合物可以通过向购自供应商的那种导入p2制备。
[0327][0328]
式(2)的p2、r2、和r3与式(1)的p2、r2、和r3分别同义。
[0329]
由以下的式(3)表示的化合物可以购自供应商，或按需要将购自供应商的那种改变应用。具体地，例如，由式(3)表示的化合物可以通过在溶剂中向购自供应商的那种应用碱和pg1导入试剂导入pg1制备。作为pg1导入试剂，具体地，例如，列举三氟乙酸乙酯、五氟丙酸乙酯、或三氯乙酸乙酯、三氟乙酸酐、五氟丙酸酐、三氯乙酸酐等，作为碱，具体地，例如，列举n，n-二异丙基乙胺、三乙胺、甲醇钠、乙醇钠等。作为pg1导入时应用的溶剂，具体地，将
三氟乙酸乙酯、五氟丙酸乙酯、或三氯乙酸乙酯用作导入试剂时，例如，列举甲醇、乙醇等。此外，将三氟乙酸酐、五氟丙酸酐、三氯乙酸酐用作导入试剂时，例如，列举二氯甲烷、四氢呋喃、吡啶等。
[0330][0331]
式中，pg1、q1、和r1与式(1)的pg1、q1、和r1分别同义。
[0332]
步骤a可以应用文献已知的反应条件进行。例如，示例merck公司2002年5月1日出版的固相合成手册等中记载的方法，可以相应于反应条件适当应用它们。作为步骤a中应用的缩合试剂，可以应用由dcc(n，n
’‑
二环己基碳二亚胺)、dic(n，n
’‑
二异丙基碳二亚胺)、edci
·
hcl(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)代表的碳二亚胺系缩合剂、由碳二亚胺系缩合剂和hoat、hobt、oxyma代表的添加剂的组合、由hatu(o-(7-氮杂-1h-苯并三唑-1-基)-n，n，n’，n
’‑
四甲基脲六氟磷酸盐)、hbtu(o-(1h-苯并三唑-1-基)-n，n，n’，n
’‑
四甲基脲六氟磷酸盐)、hctu(o-(6-氯-1h-苯并三唑-1-基)-n，n，n’，n
’‑
四甲基脲六氟磷酸盐)、comu((1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基吗啉代碳鎓六氟磷酸盐)代表的脲盐系缩合剂、由pyaop((7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基磷鎓六氟磷酸盐)、pybop(1h-苯并三唑-1-基氧基-三(吡咯烷基)磷鎓六氟磷酸盐)、pyoxim([乙基氰基(羟基亚氨基)乙酸-o2]三-1-吡咯烷基磷鎓六氟磷酸盐)代表的磷鎓盐系缩合剂、由1-氯-n，n-2-三甲基-1-丙烯胺(ghosez试剂)、tcfh(氯-n，n，n’，n
’‑
四甲基甲脒鎓六氟磷酸盐)、pyciu(n，n，n’，n
’‑
双(四亚甲基)氯甲脒鎓六氟磷酸盐)、btffh(氟-n，n，n’，n
’‑
双(四亚甲基)甲脒鎓六氟磷酸盐)、tffh(氟-n，n，n’，n
’‑
四甲基脒鎓六氟磷酸盐)代表的甲脒鎓盐系缩合剂等。优选dic或edci
·
hcl的任一种、或dic和oxyma的组合。
[0333]
此外，pg1是c
2-c6卤酰基时，也可在步骤a中应用从由式(3)表示的化合物配制的、作为该化合物的脱水物的由式(3’)表示的噁唑酮。构成噁唑酮环的氧原子和氧原子与氮原子之间的碳原子来自pg1的c
2-c6卤酰基的羰基，r4是来自pg1的c
2-c6卤酰基的卤烷基的c
1-c5卤烷基。作为用于配制噁唑酮的反应剂，具体地，例如，列举n，n
’‑
二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、亚硫酰氯等。
[0334][0335]
在由式(3’)表示的化合物中，r1和q1与式(3)的r1和q1同义。r1和q1可以与它们结合的碳原子一起形成3～8元脂环，作为这样的该3～8元脂环，具体地，列举环丙烷环、环丁烷环、环戊烷环、环己烷环等。
[0336]
在由式(3’)表示的化合物中，r4是c
1-c5卤烷基，作为c
1-c5卤烷基，具体地，列举三
氟甲基、三氯甲基、五氟乙基、1，2，2，2-四氟-1-(三氟甲基)乙基、或2，2，2-三氟-1-(三氟甲基)乙基等。它们之中优选三氟甲基。
[0337]
步骤b是使由式(4)表示的化合物、其盐、或它们的溶剂化物与p1导入试剂反应，得到由式(1)表示的肽化合物、其盐、或它们的溶剂化物的步骤。
[0338]
在本发明中，作为p1导入试剂，可以应用p1x(式中，p1与式(1)的p1同义，x是离去基)和碱的组合。在步骤b中，通过在适当pka的碱的存在下使由式(4)表示的化合物与p1x作用，可以向pg1结合的氮原子选择性导入p1。
[0339]
作为p1x，具体地，列举烷基碘、烷基溴、三氟甲磺酸烷基酯、对甲苯磺酸烷基酯、烯基碘、烯基溴、三氟甲磺酸烯基酯、对甲苯磺酸烯基酯、芳烷基碘、芳烷基溴、三氟甲磺酸芳烷基酯、对甲苯磺酸芳烷基酯等。p1导入试剂是甲基化试剂时，作为甲基化试剂，具体地，例如，列举甲基碘、硫酸二甲酯、三氟甲磺酸甲酯、对甲苯磺酸甲酯、甲磺酸甲酯等，p1导入试剂是乙基化试剂时，作为乙基化试剂，具体地，例如，列举乙基碘、乙基溴、硫酸二乙酯、三氟甲磺酸乙酯、对甲苯磺酸乙酯、甲磺酸乙酯等。p1导入试剂是烯丙基化试剂时，作为烯丙基化试剂，具体地，例如，列举烯丙基氯、烯丙基溴等。p1导入试剂是苄基化试剂时，作为苄基化试剂，具体地，例如，列举苄基氯、苄基溴等。p1导入试剂是苯乙基化试剂时，作为苯乙基化试剂，具体地，例如，列举(2-碘乙基)苯、(2-溴乙基)苯等。
[0340]
作为p1导入试剂应用p1x和碱的组合时，碱可以应用具有适于向作为目的的氮原子导入p1的碱度的那种。碱的碱度由碱的共轭酸的pka表示。有时将碱的共轭酸的pka称为碱的pka。
[0341]
具体地，可以应用具有足以将p1结合的nh基的氢脱氢化的pka的碱。
[0342]
碱的共轭酸的pka可以适当参考应用advanced chemistry development(acd/labs)software v11.02((c)1994-2019 acd/labs)的计算值、chem.eur.j.2002，8，1682-1693、j.org.chem.2005，70，3，1019-1028、eur.j.org.chem.，2019，40，6735-6748、或sigma-aldrich公司的目录记载的值等。
[0343]
pka根据溶剂而不同。dbu、dbn、tmgn、mtbd、btmg的共轭酸在水中的pka分别是13.28、13.42、12.26、14.37、13.81。(应用(advanced chemistry development(acd/labs)software v11.02((c)1994-2019acd/labs)的计算值))。
[0344]
另一方面，dbu、tmgn、mtbd、p1-tbu、btpp、bemp的共轭酸在乙腈中的pka是24.32、25.1、25.43、26.9、28.4，27.6(chem.eur.j.2002，8，1682-1693、sigma-aldrich公司的目录记载值)。dbn的共轭酸在乙腈中的pka是23.89(eur.j.org.chem.，2019，40，6735-6748)。
[0345]
[表1]
[0346][0347]
对于碱的共轭酸在水中的pka值(通过advanced chemistry development(acd/labs)software v11.02((c)1994-2019 acd/labs的计算值)和在乙腈中的pka值，在乙腈中的pka值为大致10～14高。
[0348]
在本发明中，优选应用pg1结合的nh基的pka(水中)为11以下的保护基。pg1结合的nh基的pka(水中)优选6～11，更优选8～11。
[0349]
将nh基的质子脱质子化所需的碱的共轭酸的pka需要与nh基的pka比较相差至少2以上、优选2～3、进一步优选2～6。
[0350]
因此，pg1结合的nh基的pka是6～11时，对于应用的碱的共轭酸的pka，(1)比nh基的pka大、(2)进一步，pka相差至少2以上、优选6以上、(3)进一步，优选相比在水中的pka在乙腈中的pka的换算值分(10～14)为大值的pka的碱。作为具体的碱的共轭酸的pka值(乙腈中)，只要是18～31、22～29、22～30、22～31、23～29、23～30、23～31，则可以用作本反应的碱。作为应用的碱的共轭酸的pka(乙腈中)的范围，优选22～31。
[0351]
此外，pg1结合的nh基的pka(乙腈中)是8～11时，应用的碱的共轭酸的pka(乙腈中)只要是20～31、20～30、20～29、21～31、21～30、21～29、22～31、22～30、22～29、23～31、23～30、23～29，则可以用作本反应的碱。作为应用的碱的共轭酸的pka(乙腈中)的范围，优选23～30。
[0352]
在某方式中，前述碱由具有脒骨架的下述式b1表示。
[0353][0354]
[式中，
[0355]
rb1和rb4分别独立地是c
1-c4烷基，或rb1和rb4与rb1结合的氮原子和rb4结合的碳原子一起形成5～8元环，
[0356]
rb2和rb3分别独立地是c
1-c4烷基，或rb2和rb3与rb2结合的氮原子和rb3结合的氮原子以及该氮原子结合的碳原子一起形成5～8元环]。
[0357]
rb1～rb4是c
1-c4烷基时，作为该c
1-c4烷基，优选列举甲基、乙基。
[0358]
rb1和rb4形成5～8元环时，作为该5～8元环，优选列举吡咯烷环、哌啶环、氮杂环庚烷(azepane)环等。
[0359]
rb2和rb3形成5～8元环时，作为该5～8元环，优选列举1，4，5，6-四氢嘧啶环等。
[0360]
作为由式b1表示的碱，具体地，例如，列举1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯(dbu)、1，5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(dbn)等。
[0361][0362]
在某方式中，前述碱由具有胍骨架的下述式b2表示。
[0363][0364]
[式中，
[0365]
rb6是氢或c
1-c4烷基，
[0366]
rb5和rb7分别独立地是c
1-c4烷基，或与它们结合的各氮原子和该各氮原子结合的碳原子一起形成5～8元环，
[0367]
rb8是c
1-c4烷基，并且rb9是c
1-c4烷基或苯基，或rb8和rb9与它们结合的各氮原子和该各氮原子结合的碳原子一起形成5～8元环，
[0368]
此处，rb9是苯基时，对于2个b2，该苯基的2个苯环可以缩合形成萘]。
[0369]
rb5～rb8是c
1-c4烷基时，作为该c
1-c4烷基，优选甲基，rb9是c
1-c4烷基时，作为该c
1-c4烷基，优选叔丁基。
[0370]
rb5和rb7形成5～8元环时，作为该5～8元环，优选列举咪唑烷环、六氢嘧啶环、1，3-二氮杂环庚烷环等。
[0371]
rb8和rb9形成5～8元环时，作为该5～8元环，优选列举1，4，5，6-四氢嘧啶环等。
[0372]
作为由式b2表示的碱，具体地，例如，列举1，8-双(四甲基胍基)萘(tmgn)、7-甲基-1，5，7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯(mtbd)、2-叔丁基-1，1，3，3-四甲基胍(btmg)、1，5，7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯(tbd)等。
[0373][0374]
在某方式中，前述碱由具有磷腈骨架的下述式b3表示。
[0375][0376]
[式中，
[0377]
rb
10
是c
1-c4烷基，或rb
10
和rb
11
与它们结合的氮原子一起形成5～8元环，
[0378]
rb
11
在rb
10
和rb
11
形成5～8元环之外的情况下是c
1-c4烷基，或rb
11
和rb
12
与它们结
合的各氮原子和该各氮原子结合的磷原子一起形成5～8元环，
[0379]
rb
12
在rb
11
和rb
12
形成5～8元环之外的情况下是c
1-c4烷基，或rb
12
和rb
13
与它们结合的氮原子一起形成5～8元环，
[0380]
rb
13
在rb
12
和rb
13
形成5～8元环之外的情况下是c
1-c4烷基，或rb
13
和rb
14
与它们结合的各氮原子和该各氮原子结合的磷原子一起形成5～8元环，
[0381]
rb
14
在rb
13
和rb
14
形成5～8元环之外的情况下是c
1-c4烷基，或rb
14
和rb
15
与它们结合的氮原子一起形成5～8元环，
[0382]
rb
15
在rb
14
和rb
15
形成5～8元环之外的情况下是c
1-c4烷基，
[0383]
rb
16
是氢、c
1-c8烷基、或c
6-c
10
芳基]。
[0384]
rb
10
～rb
15
是c
1-c4烷基时，作为该c
1-c4烷基，优选甲基、乙基，rb
16
是c
1-c8烷基时，作为该c
1-c8烷基，优选叔丁基、叔辛基。
[0385]
rb
10
和rb
11
、rb
12
和rb
13
、和/或rb
14
和rb
15
形成5～8元环时，作为该5～8元环，优选列举吡咯烷环、哌啶环、氮杂环庚烷环等。
[0386]
rb
11
和rb
12
、和/或rb
13
和rb
14
形成5～8元环时，该5～8元环优选不含rb
11
、rb
12
、rb
13
、和rb
14
结合的各氮原子和该各氮原子结合的磷原子以外的杂原子的5～8元饱和环。
[0387]
作为由式b3表示的碱，具体地，例如，列举叔丁基亚氨基-三(二甲基氨基)正膦(p1-tbu)、叔辛基亚氨基-三(二甲基氨基)正膦(p1-t-oct)、叔丁基亚氨基-三(吡咯烷基)正膦(p1-t-bu-三(四亚甲基)，btpp)、2-叔丁基亚氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氢-1，3，2-二氮杂膦杂苯(bemp)、亚氨基-三(二甲基氨基)正膦(hp1(dma))等。
[0388][0389]
在某方式中，前述碱由具有包含经由氮原子的2个磷原子的磷腈骨架的下述b4表示。
[0390][0391]
[式中，
[0392]
rb
17
独立地是c
1-c4烷基，或rb
17
和rb
18
与它们结合的氮原子一起形成5～8元环，
[0393]
rb
18
在rb
17
和rb
18
形成5～8元环之外的情况下是c
1-c4烷基，或rb
18
和rb
19
与它们结合的各氮原子和该各氮原子结合的磷原子一起形成5～8元环，
[0394]
rb
19
在rb
18
和rb
19
形成5～8元环之外的情况下是c
1-c4烷基，或rb
19
和rb
20
与它们结合的氮原子一起形成5～8元环，
[0395]
rb
20
在rb
19
和rb
20
形成5～8元环之外的情况下是c
1-c4烷基，
[0396]
rb
21
是c
1-c4烷基，或rb
21
和rb
22
与它们结合的氮原子一起形成5～8元环，
[0397]
rb
22
在rb
21
和rb
22
形成5～8元环之外的情况下是c
1-c4烷基，或rb
22
和rb
23
与它们结合的各氮原子和该各氮原子结合的磷原子一起形成5～8元环，
[0398]
rb
23
在rb
22
和rb
23
形成5～8元环之外的情况下是c
1-c4烷基，或rb
23
和rb
24
与它们结合的氮原子一起形成5～8元环，
[0399]
rb
24
在rb
23
和rb
24
形成5～8元环之外的情况下是c
1-c4烷基，或rb
24
和rb
25
与它们结合的各氮原子和该各氮原子结合的磷原子一起形成5～8元环，
[0400]
rb
25
在rb
24
和rb
25
形成5～8元环之外的情况下是c
1-c4烷基，或rb
25
和rb
26
与它们结合的氮原子一起形成5～8元环，
[0401]
rb
26
在rb
25
和rb
26
形成5～8元环之外的情况下是c
1-c4烷基，
[0402]
rb
27
是c
1-c4烷基、或c
6-c
10
芳基]。
[0403]
rb
17
～rb
26
是c
1-c4烷基时，作为该c
1-c4烷基，优选甲基、乙基，rb
27
是c
1-c4烷基时，作为该c
1-c4烷基，优选叔丁基。
[0404]
rb
17
和rb
18
、rb
19
和rb
20
、rb
21
和rb
22
、rb
23
和rb
24
、rb
25
和rb
26
形成5～8元环时，作为该5～8元环，优选列举吡咯烷环、哌啶环、氮杂环庚烷环等。
[0405]
rb
17
和rb
18
都是c
1-c4烷基时，优选rb
19
和rb
20
也都是c
1-c4烷基，优选rb
17
和rb
18
形成5～8元环，rb
19
和rb
20
也形成5～8元环。
[0406]
rb
21
和rb
22
都是c
1-c4烷基时，优选rb
23
和rb
24
以及rb
25
和rb
26
也都是c
1-c4烷基，优选rb
21
和rb
22
形成5～8元环，rb
23
和rb
24
以及rb
25
和rb
26
也形成成5～8元环。
[0407]
rb
18
和rb
19
、和/或rb
22
和rb
23
形成5～8元环时，优选该5～8元环是不含rb
11
、rb
12
、rb
13
、和rb
14
结合的各氮原子和该各氮原子结合的磷原子以外的杂原子的5～8元饱和环。
[0408]
作为由式b4表示的碱，具体地，例如，列举1-叔丁基-2，2，4，4，4-五(二甲基氨基)-2λ5，4λ
5-连二(磷腈)(p2-t-bu)、1-乙基-2，2，4，4，4-五(二甲基氨基)-2λ5、4λ
5-连二(磷腈)(p2-et)等。
[0409][0410]
在本发明中，作为p1导入试剂应用p1x和碱的组合时，作为反应中应用的溶剂，列举由dmf和nmp代表的酰胺系溶剂、由dmi代表的脲系溶剂、由四氢呋喃和2-甲基四氢呋喃代表的醚系溶剂、和乙腈，它们之中优选酰胺系溶剂。
[0411]
作为p1导入试剂应用p1x和碱时，优选用pg1保护的氨基的pka(水中)是6～11、碱的
共轭酸的pka(乙腈中)为23～30的pg1和碱的组合。此外，更优选用pg1保护的氨基的pka(水中)是8～11、碱的共轭酸的pka(乙腈中)为23～27的pg1和碱的组合。作为pg1、p1x、和碱的组合，优选pg1是三氟乙酰基，p1x是甲基碘、硫酸二甲酯、乙基碘、烯丙基溴、正丙基碘、苄基溴，碱是p1-tbu、tmgn、或mtbd。作为具体的pg1和碱的组合，列举三氟乙酰基和tmgn、三氟乙酰基和p1-tbu、三氟乙酰基和mtbd等。
[0412]
在某方式中，本发明涉及制备包含n-取代-α，α二取代氨基酸残基和n-取代氨基酸残基连接的二肽残基的肽化合物、其盐、或它们的溶剂化物的方法，包括制备在n末端具有n-取代-α，α二取代氨基酸残基、包含该n-取代-α，α二取代氨基酸残基与n-取代氨基酸残基连接的二肽残基的肽化合物、其盐、或它们的溶剂化物的前述方法。该方法可以包括在通过本说明书记载的方法制备的在n末端具有n-取代-α，α二取代氨基酸残基、包含该n-取代-α，α二取代氨基酸残基与n-取代氨基酸残基连接的二肽残基的肽化合物的n末端和/或c末端、使一个或多个氨基酸残基和/或肽残基进一步缩合的步骤。通过该方法制备的肽化合物是包含n-取代-α，α二取代氨基酸残基和n-取代氨基酸残基连接的二肽残基的任意的肽化合物，其中包含在该二肽残基的n末端侧和c末端侧连接任意的数目和种类的氨基酸的肽化合物。
[0413]
在某方式中，本发明还涉及环状肽化合物的制备方法，其进一步包括：从通过本发明的方法制备的由式(1)表示的肽化合物、其盐、或它们的溶剂化物将n末端的保护基(例如，pg1)脱保护的步骤、任选地延伸肽链的步骤、和环化c末端侧的基团和n末端侧的基团形成环状部分的步骤。
[0414]
环状肽化合物包含8～15个氨基酸残基、优选10～13个氨基酸残基，包含至少3个、优选至少3个～(构成环状肽化合物的氨基酸残基数-1)个n取代氨基酸残基，并且包含至少1个、优选至少3个未被n取代的氨基酸残基，环状部分包含至少8个氨基酸残基、优选至少10个氨基酸残基。
[0415]
在从由式(1)表示的肽化合物将pg1脱保护的步骤中，例如，可以应用“greene’s，“protective groups in organic synthesis”(第5版，john wiley&sons 2014)”中记载的方法。
[0416]
在延伸肽链的步骤、和形成环状部分的步骤中，可以应用例如wo2013/100132或wo2018/225864中记载的方法等公知方法。在通过固相合成延伸肽链时，在延伸步骤和形成环状部分的步骤之前，可以包括从树脂切割的步骤。
[0417]
另外，本说明书中引用的全部现有技术文献作为参考引入本说明书。
实施例
[0418]
用以下的实施例、比较例和参考例进一步说明本发明的内容，但本发明不限于该内容。全部原料和试剂得自供应商，或应用公知的方法合成。lcms的分析条件在表2记载。
[0419]
[表2]
[0420][0421]
实施例1：本实施例中使用的氨基酸和向树脂加载的肽等的配制
[0422]
实施例1-1：通过肽合成仪的肽合成中应用的fmoc-氨基酸
[0423]
在本说明书中记载的肽合成中，在通过肽合成仪的合成中应用表3～表5中记载的fmoc-氨基酸。
[0424]
表3和表5记载的fmoc-氨基酸购自供应商。
[0425]
表4记载的fmoc-氨基酸按以下所示方案合成。
[0426]
[表3]
[0427]
[0428][0429]
[表4]
[0430][0431]
[表5]
[0432][0433]
实施例1-1-1：化合物aa2-001、(2s)-4-[3-氯-4-(三氟甲基)苯基]-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)丁酸、(fmoc-hph(4-cf3-3-cl)-oh)的合成
[0434][0435]
在(4s)-4-[(2-甲基丙烷-2-基)氧基羰基氨基]-5-氧代-5-苯基甲氧基戊酸(boc-glu-obn、cas编号30924-93-7)(200g，592.82mmol)、n-羟基邻苯二甲酰亚胺(106g，649.78mmol，1.10当量)、dmap(3.6g，29.47mmol，0.05当量)的thf(2l)溶液中，在氮气氛下，在0℃滴加dic(138ml，1.54当量)。在25℃搅拌反应液16小时，通过过滤除去固形物，将滤液在减压下除去溶剂。用甲苯稀释残渣，通过过滤除去产生的固体，将滤液在减压下除去溶剂。通过重结晶(丙酮/庚烷)纯化残渣，得到化合物aa2-001-a(1-o-苄基5-o-(1，3-二氧代异吲哚-2-基)(2s)-2-[(2-甲基丙烷-2-基)氧基羰基氨基]戊二酸酯)。(230g，80％)
[0436]
lcms(esi)m/z＝505.2(m+na)+
[0437]
保留时间：0.992分钟(分析条件smdmethod_16)
[0438]
在dma(500ml)中加入溴化镍三水合物(nibr2·
3h2o)(4g，0.07当量)和4，4
’‑
二-叔丁基-2，2
’‑
联吡啶(dtbbpy)(3.9g，14.55mmol，0.07当量)，在氮气氛下，在50℃搅拌2小时配制ni溶液。
[0439]
在化合物aa2-001-a(100g，207.3mmol)、锌粉末(70g，5当量)和4-溴-2-氯-1-(三氟甲基)苯(160g，617mmol，3当量)的dma(500ml)混合液中添加之前配制的ni溶液，在25℃搅拌16小时。在反应液中加入edta
·
2na水溶液(10％)，用乙酸乙酯萃取。用饱和氯化钠水溶液洗涤合并的有机层后，用无水硫酸钠干燥，减压下除去溶剂。用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/石油醚)纯化得到的残渣，得到化合物aa2-001-b。(75g，77％)
[0440]
lcms(esi)m/z＝494(m+na)+
[0441]
保留时间：2.863分钟(分析条件smdmethod_17)
[0442]
在0℃冷却化合物aa2-001-b(75g，158.93mmol)的甲苯溶液(900ml)，滴加三氟甲磺酸(tfoh)(42ml，3.00当量)。在室温搅拌1小时后，加入水(75ml)。用水萃取该混合液，用乙酸乙酯萃取合并的水层。用水洗涤合并的有机层，用无水硫酸钠干燥后，减压下除去溶剂。在残渣中加入乙腈/水(900/900ml)，用氢氧化钠水溶液(48％)调整为ph。在该溶液中加入fmoc-osu(51.2g，151.93mmol，0.95当量)，边维持ph7.8至8.0边在室温搅拌16小时。过滤反应液，用6mol/l盐酸水将滤液的ph调整为2。收集析出的固体，在50℃干燥，得到化合物aa2-001((2s)-4-[3-氯-4-(三氟甲基)苯基]-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)丁酸、fmoc-hph(4-cf3-3-cl)-oh)。(70g，87％)
[0443]
lcms(esi)m/z＝525.8(m+na)+
[0444]
保留时间：2.180分钟(分析条件smdmethod_21)
[0445]
1h-nmr(300mhz，dmso-d6)δ12.70(s，1h)，7.91(d，j＝7.5hz，2h)，7.79-7.59(m，5h)，7.45-7.28(m，5h)，4.40-4.19(m，3h)，3.96-3.88(m，1h)，2.82-2.60(m，2h)，2.11-1.77(m，2h)
[0446]
实施例1-1-2：化合物aa2-002、(2s)-3-环丁基-2-[9h-芴-9-基甲氧基羰基(甲基)氨基]丙酸(fmoc-meala(cbu)-oh)的合成
[0447][0448]
在化合物aa2-002-a((2s)-3-环丁基-2-[9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基]丙酸、fmoc-ala(cbu)-oh)(3.36g，9.19mmol)的dcm(46ml)溶液中，在氮气氛下加入低聚甲醛(0.828g，27.6mmol)、无水硫酸镁(2.77g，22.99mmol)、三氟化硼乙醚络合物(bf3·
oet2)(1.398ml，11.03mmol)，在室温搅拌2小时。在反应液中加入将饱和氯化钠水溶液用水稀释至一半浓度的水溶液，进一步加入dcm稀释。将分离的有机层用饱和氯化钠水溶液洗涤，过滤。将得到的有机层在减压下除去溶剂，作为粗产物得到化合物aa2-002-b(3.63g)。
[0449]
lcms(esi)m/z＝378(m+h)+
[0450]
保留时间：1.01分钟(分析条件sqdfa05)
[0451]
在得到的化合物aa2-002-b(3.47g)的dcm(30.6ml)溶液中，在氮气氛下，加入三乙基硅烷(4.39ml，27.6mmol)、水(0.166g，9.19mmol)、三氟化硼乙醚络合物(bf3·
oet2)(3.50ml，27.6mmol)，搅拌2小时。在反应液中加入将饱和氯化钠水溶液用水稀释至一半浓度的水溶液，在室温搅拌15分钟。将从得到的混合物分离的有机层在减压下除去溶剂。通过用反相柱色谱(0.1％甲酸-水/0.1％甲酸-乙腈)纯化得到的残渣，得到化合物aa2-002((2s)-3-环丁基-2-[9h-芴-9-基甲氧基羰基(甲基)氨基]丙酸、fmoc-meala(cbu)-oh)。(3.18g，2步骤91％)
[0452]
lcms(esi)m/z＝380(m+h)+
[0453]
保留时间：0.94分钟(分析条件sqdfa05)
[0454]
实施例1-1-3：化合物aa2-003、(2s)-2-环戊基-2-[9h-芴-9-基甲氧基羰基(甲基)氨基]乙酸(fmoc-megly(cpent)-oh)的合成
[0455][0456]
在化合物aa2-003-a((2s)-2-环戊基-2-[9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基]乙酸、fmoc-gly(cpent)-oh)(30.0g，82mmol)、低聚甲醛(7.39g，246mmol)和csa(0.954g，4.10mmol)的甲苯(160ml)混合液中加入三氟乙酸(tfa)(9.0ml)后，在60℃搅拌4小时。将反应液冷却至室温后，通过过滤除去固体。用乙酸乙酯(220ml)稀释滤液后，用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液按顺序洗涤。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤后减压浓缩，作为粗产物得到化合物aa2-003-b。不实施以上的纯化进行随后的反应。
[0457]
lcms(esi)m/z＝378(m+h)+
[0458]
保留时间：1.01分钟(分析条件sqdfa05)
[0459]
在得到的化合物aa2-003-b(31g，82mmol)和三乙基硅烷(tes)(65.5ml，410mmol)与二氯乙烷(dce)(90ml)的混合液中加入三氟乙酸(tfa)(76ml，984mmol)，在60℃搅拌16小时。通过将反应液冷却至室温后减压浓缩，用正己烷/乙酸乙酯(95/5)洗涤得到的固体，减压干燥，得到化合物aa2-003((2s)-2-环戊基-2-[9h-芴-9-基甲氧基羰基(甲基)氨基]乙酸、fmoc-megly(cpent)-oh)(29.1g，93％)。
[0460]
lcms(esi)m/z＝380(m+h)+
[0461]
保留时间：0.92分钟(分析条件sqdfa05)
[0462]
实施例1-1-4：化合物aa2-004、(2s)-2-环丁基-2-[9h-芴-9-基甲氧基羰基(甲基)氨基]乙酸(fmoc-megly(cbu)-oh)的合成
[0463][0464]
以化合物aa2-004-a(2s)-2-环丁基-2-[9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基]乙酸、fmoc-gly(cbu)-oh)(2.5g，7.11mmol)为起始原料，通过与化合物aa2-002-b的合成同样的手法，作为粗产物得到化合物aa2-004-b。
[0465]
lcms(esi)m/z＝364(m+h)+
[0466]
保留时间：0.97分钟(分析条件sqdfa05)
[0467]
应用通过上述得到的化合物aa2-004-b的总量，通过与化合物aa2-002的合成同样的手法反应后，通过用反相柱色谱(0.1％甲酸水溶液/0.1％甲酸乙腈溶液)纯化，得到化合物aa2-004((2s)-2-环丁基-2-[9h-芴-9-基甲氧基羰基(甲基)氨基]乙酸、fmoc-megly(cbu)-oh)。(2.32g，2步骤89％)
[0468]
lcms(esi)m/z＝366(m+h)+
[0469]
保留时间：0.88分钟(分析条件sqdfa05)
[0470]
实施例1-1-5：化合物aa2-005、(2s)-3-环戊基-2-[9h-芴-9-基甲氧基羰基(甲基)氨基]丙酸(fmoc-meala(cpent)-oh)的合成
[0471][0472]
以化合物aa2-005-a((2s)-3-环戊基-2-[9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基]丙酸、fmoc-ala(cpent)-oh)(10g，26.4mmol)为起始原料，通过与化合物aa2-002-b的合成同样的手法，作为粗产物得到化合物aa2-005-b(10.5g)。
[0473]
lcms(esi)m/z＝392(m+h)+
[0474]
保留时间：1.05分钟(分析条件sqdfa05)
[0475]
应用得到的化合物aa2-005-b(10.5g)，通过与化合物aa2-002的合成同样的手法反应后，通过用反相柱色谱(0.1％甲酸水溶液/0.1％甲酸乙腈溶液)纯化，得到化合物aa2-005((2s)-3-环戊基-2-[9h-芴-9-基甲氧基羰基(甲基)氨基]丙酸、fmoc-meala(cpent)-oh)。(10.11g，2步骤96％)
[0476]
lcms(esi)m/z＝394(m+h)+
[0477]
保留时间：0.98分钟(分析条件sqdfa05)
[0478]
实施例1-2：本实施例中使用的向树脂加载的氨基酸和肽等的配制
[0479]
实施例1-2-1：化合物1-2-1、(3s)-3-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-4-氧代-4-吡咯烷-1-基丁酸-2-氯三苯甲基树脂(fmoc-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)的合成
[0480][0481]
在本说明书中，化合物与聚合物或树脂结合时，有时将聚合物或树脂部位用
○
表
示。此外，以明确树脂部位的反应点为目的，有时表示与
○
连接的反应部位的化学结构。例如，在上述的结构(fmoc-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-1))中，树脂的2-氯三苯甲基与asp的侧链羧酸经由酯键结合。另外，pyrro意味着吡咯烷，在上述的结构中，c末端的羧酸基与吡咯烷形成酰胺键。
[0482][0483]
在氮气氛下，在0℃在dmf(600ml)中按顺序加入edci
·
hcl(67.1g，350mmol)、hobt(43.4g，321mmol)、fmoc-asp(otbu)-oh(120g，292mmol)，在0℃搅拌1小时。在该反应液中缓慢加入吡咯烷(26.3ml，321mmol)，在0℃搅拌1个半小时。在0℃在反应液中加入乙酸乙酯(10v)和0.5mol/l盐酸水(2v)，分离有机层。将得到的有机层用0.5mol/l盐酸水、水、饱和碳酸氢钠水溶液/水(1/1(v/v))、饱和氯化钠水溶液/水(1/1(v/v))按顺序洗涤，用无水硫酸钠干燥后，减压下除去溶剂，作为粗产物得到化合物1-2-1-a。(137.1g，quant.)
[0484]
lcms(esi)m/z＝465(m+h)+
[0485]
保留时间：1.05分钟(分析条件sqd化合物aa05)
[0486]
在冰冷下，在化合物1-2-1-a(137g，395mmol)的dcm(137ml)溶液中缓慢加入tfa(271ml)使内部温度不超过10℃。在室温搅拌1小时后，分4次加入二异丙基醚(3.4l)，将析出的固体过滤收集，干燥，得到化合物1-2-1-b((3s)-3-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-4-氧代-4-吡咯烷-1-基丁酸，fmoc-asp-pyrro)。(108.4g，90％)
[0487]
lcms(esi)m/z＝409(m+h)+
[0488]
保留时间：0.83分钟(分析条件sqd化合物aa05)
[0489]
fmoc氨基酸向树脂的加载反应按照wo2013/100132或wo2018/225864中记载的方法进行。在带有过滤器的反应容器中加入2-氯三苯甲基氯树脂(1.60mmol/g、100-200目、1％dvb、48.7g)和脱水二氯甲烷(500ml)，在室温振荡20分钟。施加氮压除去二氯甲烷后，在反应容器中添加在化合物1-2-1-b(15.91g)和脱水二氯甲烷(350ml)中加入脱水甲醇(12.63ml)和二异丙基乙胺(dipea)(32.6ml)的混合液，振荡60分钟。施加氮压除去反应液后，在反应容器中添加在脱水二氯甲烷(350ml)中加入脱水甲醇(97.3ml)和二异丙基乙胺(dipea)(32.6ml)的混合液，振荡1小时30分钟。施加氮压除去反应液后，加入二氯甲烷(350ml)振荡5分钟后，施加氮压除去反应液。将用该二氯甲烷的树脂的洗涤重复5次，将得到的树脂在减压下干燥过夜，得到(3s)-3-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-4-氧代-4-吡咯
烷-1-基丁酸-2-氯三苯甲基树脂(fmoc-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro、化合物1-2-1、59.79g)。
[0490]
为了确认加载率，在反应容器中加入得到的化合物1-2-1(12.6mg)，加入dmf(2ml)，在室温振荡1小时。其后，加入dbu(40μl)在30℃振荡30分钟。其后，在反应混合液中加入dmf(8ml)，用dmf(11.5ml)稀释该溶液1ml。测定得到的稀释溶液的吸光度(294nm)(应用shimadzu、uv-1600pc(池长1.0cm)测定)。通过测定来自向树脂加载的fmoc氨基酸的fmoc的二苯并富烯，算出化合物1-2-1的加载量是0.464mmol/g。
[0491]
另外，关于同样合成的加载量不同的其它批号，也在肽合成和研究等中使用。
[0492]
实施例1-2-2：fmoc-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-2)的配制
[0493][0494]
应用肽合成仪(multipep rs；intavis公司制)，通过fmoc法进行本实施例中使用的fmoc-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-2)的配制。操作的详细顺序按照合成仪所附的手册。
[0495]
在合成仪中放置实施例1-2-1中配制的fmoc-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-1、0.464mmol/g)(每1柱100mg)、fmoc-meval-oh(0.6mol/l)和1-羟基-7-氮杂苯并三唑(hoat，0.375mol/l)的nmp溶液、和二异丙基碳二亚胺(dic)的n，n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液(10％v/v)。
[0496]
开始合成时，对放置的fmoc-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-1、0.464mmol/g)(每1柱100mg)，每1柱加入1ml二氯甲烷(dcm)在30分钟左右静置，使树脂膨胀。然后，用dmf洗涤树脂。
[0497]
脱fmoc步骤
[0498]
每1柱加入0.7ml的1，8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一碳烯(dbu)的dmf溶液(2％v/v)静置5～10分钟，进行脱fmoc。然后，用dmf(每1柱0.7ml、重复4次)洗涤树脂。
[0499]
延伸步骤
[0500]
对经脱fmoc步骤的树脂，加入放置的fmoc-氨基酸溶液(每1柱0.30ml)和dic/dmf溶液(每1柱0.36ml)的混合溶液，在40度静置。反应结束后，用dmf(每1柱0.7ml、重复4次)洗涤树脂。
[0501]
通过上述步骤延伸fmoc-meval。延伸后不进行脱fmoc步骤，进一步用dcm洗涤，干燥后，用于以后的研究。
[0502]
另外，以确认得到化合物1-2-2为目的，对得到的树脂的一部分，进行用tfe/dcm溶液(1/1(v/v))的肽切割。用lcms分析切割的溶液时，确认目的肽fmoc-meval-asp-pyrro(化
合物1-2-2＊)的生成。另外，在本实施例中，对化合物编号赋予＊时，表示为了确认反应从树脂切割肽并确认的化合物。化合物1-2-2＊表示切割了化合物1-2-2中包含的肽的羧酸和树脂的2-氯三苯甲基的键的肽化合物。
[0503][0504]
lcms(esi)m/z＝522.32(m+h)+
[0505]
保留时间：0.76分钟(分析条件sqdfa05)
[0506]
实施例1-2-3：fmoc-mephe-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-3)的配制
[0507][0508]
与实施例1-2-2同样，通过对fmoc-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-1、0.464mmol/g)延伸fmoc-mephe-oh配制。
[0509]
另外，以确认得到化合物1-2-3为目的，对得到的树脂的一部分，进行用tfe/dcm溶液(1/1(v/v)的肽切割。用lcms分析切割的溶液时，确认目的肽fmoc-mephe-asp-pyrro(化合物1-2-3＊)的生成。
[0510][0511]
lcms(esi)m/z＝570.31(m+h)+
[0512]
保留时间：0.80分钟(分析条件sqdfa05)
[0513]
实施例1-2-4：(3r)-3-[9h-芴-9-基甲氧基羰基(甲基)氨基]丁酸-2-氯三苯甲基树脂(fmoc-d-3-meabu-o-trt(2-cl)树脂、化合物1-2-4)的合成
[0514][0515]
应用购自供应商的(3r)-3-[9h-芴-9-基甲氧基羰基(甲基)氨基]丁酸(fmoc-d-3-meabu-oh)(11.5g，33.9mmol)和2-氯三苯甲基氯树脂(1.69mmol/g、100-200目、1％dvb、50g、84.5mmol)，以与化合物1-2-1的合成同样的手法，得到(3r)-3-[9h-芴-9-基甲氧基羰基(甲基)氨基]丁酸-2-氯三苯甲基树脂(fmoc-d-3-meabu-o-trt(2-cl)树脂、化合物1-2-4)。(58.95g，加载量0.343mmol/g)
[0516]
另外，同样合成的加载量不同的其它批号也在本实施例中的肽合成中使用。
[0517]
实施例1-3：肽合成中应用的用fmoc以外的保护基保护的氨基酸、和其脱水物
[0518]
本说明书中记载的肽合成中应用的、用fmoc以外的保护基保护的氨基酸和其脱水物按以下合成。
[0519]
实施例1-3-1：2-甲基-2-[(2，2，2-三氟乙酰基)氨基]丙酸(tfa-aib-oh)(化合物1-3-1)的配制
[0520][0521]
对2-氨基-2-甲基丙酸(25.0g)加入甲醇(242ml)、dipea(63.5ml，1.5当量)、三氟乙酸乙酯((cas编号383-63-1)、37.6ml，1.3当量)，在50度搅拌混合物18小时。其后，减压除去溶剂，对得到的残渣加入1n盐酸水溶液和乙酸乙酯，分离有机层和水层。将得到的有机层用饱和氯化钠水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，得到18.2g的粗产物。
[0522]
在tbme(80ml)中溶解粗产物(16.0g)后，边搅拌边滴加庚烷(320ml)1小时以上。将混合物在冰冷下进一步搅拌1小时后，进行过滤。用tbme/庚烷溶液(1/4，32ml)洗涤得到的粉末后，减压干燥，得到13.5g的2-甲基-2-[(2，2，2-三氟乙酰基)氨基]丙酸(tfa-aib-oh)(化合物1-3-1)。
[0523]
lcms(esi)m/z＝197.93(m-h)-[0524]
保留时间：0.40分钟(分析条件sqdfa05)
[0525]
实施例1-3-2.tfa-(me)abu-oh((s)-2-甲基-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丁酸、化合物1-3-2-b)的合成
[0526][0527]
在化合物1-3-2-a((s)-2-氨基-2-甲基丁酸、异缬氨酸、h-(me)abu-oh)(15.0g，128mmol)的甲醇(150ml)溶液中加入二异丙基乙胺(82.7g，640mmol)、三氟乙酸乙酯(54.6g，384mmol)后，在50℃搅拌16小时。将反应液冷却至室温后，减压浓缩，将得到的残渣在tbme中溶解后，用1n盐酸水溶液洗涤2次。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤后减压浓缩，得到粗产物。通过将得到的粗产物从tbme/己烷(1∶7)重结晶，得到化合物1-3-2-b((s)-2-甲基-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丁酸)(12g，44％)。
[0528]
lcms(esi)m/z＝214.0(m+h)+
[0529]
保留时间：0.32分钟(分析条件sqdfa05)
[0530]
实施例1-3-3.tfa-(me)leu-oh((s)-2，4-二甲基-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)戊酸、化合物1-3-3-b)的合成
[0531][0532]
在化合物1-3-3-a(2-甲基亮氨酸、(s)-2-氨基-2，4-二甲基戊酸、h-(me)leu-oh)(15.0g，103mmol)的甲醇(50ml)溶液中加入二异丙基乙胺(40.1g，310mmol)、三氟乙酸乙酯(44.0g，310mmol)后，在50℃搅拌16小时。将反应液冷却至室温后，减压浓缩，将得到的残渣在tbme中溶解后，用1n盐酸水溶液洗涤2次。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤后减压浓缩，得到粗产物。通过将得到的粗产物从tbme/己烷(1∶7)重结晶，得到化合物1-3-3-b((s)-2，4-二甲基-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)戊酸)(10g，40％)。
[0533]
lcms(esi)m/z＝242.1(m+h)+
[0534]
保留时间：0.66分钟(分析条件sqdfa05)
[0535]
实施例1-3-4.tfa-(me)ser(me)-oh((s)-3-甲氧基-2-甲基-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酸、化合物1-3-4-b)的合成
[0536][0537]
在化合物1-3-4-a(3-甲氧基-2-甲基-l-丙氨酸、(s)-2-氨基-3-甲氧基-2-甲基丙酸、h-(me)ser(me)-oh)(1.5g，11mmol)的甲醇(19ml)溶液中加入二异丙基乙胺(5.9ml，
34mmol)、三氟乙酸乙酯(4.0ml)后，在50℃搅拌21小时。将反应液冷却至室温后，减压浓缩，将得到的残渣在tbme(45ml)中溶解后，用1n盐酸水溶液(45ml)洗涤2次，用饱和氯化钠水溶液(45ml)洗涤1次。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤后减压浓缩，得到粗产物。通过将得到的粗产物用反相柱色谱(0.1％甲酸-水/0.1％甲酸-乙腈)纯化，得到化合物1-3-4-b((s)-3-甲氧基-2-甲基-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酸)(2.07g，72％)。
[0538]
lcms(esi)m/z＝228.2(m-h)-[0539]
保留时间：0.41分钟(分析条件sqdfa05)
[0540]
实施例1-3-5.tfa-(me)phe-oh((s)-2-甲基-3-苯基-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酸、化合物1-3-5-b)的合成
[0541][0542]
在化合物1-3-5-a((2s)-2-氨基-2-甲基-3-苯基丙酸、h-(me)phe-oh)(10.0g，55.8mmol)的甲醇(500ml)溶液中加入二异丙基乙胺(21.63g，167.4mmol)、三氟乙酸乙酯(23.78g，167.4mmol)后，在50℃搅拌16小时。将反应液冷却至室温后，减压浓缩，将得到的残渣tbme中溶解后，用1n盐酸水溶液洗涤2次，用饱和氯化钠水溶液洗涤1次。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤后减压浓缩，得到粗产物。通过将得到的粗产物从tbme/己烷(1∶15)重结晶，得到化合物1-3-5-b((s)-2-甲基-3-苯基-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酸)(8g，52％)。
[0543]
lcms(esi)m/z＝274.0(m-h)-[0544]
保留时间：0.68分钟(分析条件sqdfa05)
[0545]
实施例1-3-6.tfa-(me)cha-oh((s)-3-环己基-2-甲基-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酸、化合物1-3-6-c)的合成
[0546][0547]
在化合物1-3-6a(2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-环己基-2-甲基丙酸、fmoc-(me)cha-oh)的二氯甲烷(18.4ml)溶液中加入4-(3-苯基丙基)哌啶(4.7ml，22mmol)，在氮气氛下在室温搅拌16小时。在反应液中加入水(8ml)萃取产物，将水层用反相柱色谱(0.1％甲酸-水/0.1％甲酸-乙腈)纯化。此外，在有机相中加入水(5ml)和2n盐酸(5ml)，在水层中萃取残留粗产物后，用反相柱色谱(0.1％甲酸-水/0.1％甲酸-乙腈)纯化水层。通过合并柱纯化物得到化合物1-3-6-b((s)-2-氨基-3-环己基-2-甲基丙酸、h-(me)cha-oh)(1.1g，81％)，用于随后的反应。
[0548]
lcms(esi)m/z＝186.1(m+h)+
[0549]
保留时间：0.32分钟(分析条件sqdfa05)
[0550]
在化合物1-3-6-b((s)-2-氨基-3-环己基-2-甲基丙酸、h-(me)cha-oh)(1.1g，6.0mmol)的甲醇(20ml)溶液中加入二异丙基乙胺(3.1ml，18mmol)、三氟乙酸乙酯(2.1ml)后，在50℃搅拌2小时。将反应液冷却至室温后，加入二异丙基乙胺(3.1ml，18mmol)、三氟乙酸乙酯(2.1ml)后，在50度搅拌20小时。将反应液减压浓缩，将得到的残渣tbme(30ml)中溶解后，用1n盐酸水溶液(30ml)洗涤2次，用饱和氯化钠水溶液(40ml)洗涤1次。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤后减压浓缩，得到粗产物。通过将得到的粗产物用反相柱色谱(0.1％甲酸-水/0.1％甲酸-乙腈)纯化，得到化合物1-3-6-c((s)-3-环己基-2-甲基-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酸)(1.22g，72％)。
[0551]
lcms(esi)m/z＝280.2(m-h)-[0552]
保留时间：0.75分钟(分析条件sqdfa05)
[0553]
实施例1-3-7.tfa-(me)val-oh((s)-2，3-二甲基-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丁酸、化合物1-3-7-b)的合成
[0554][0555]
在化合物1-3-7-a((s)-2-氨基-2，3-二甲基丁酸、h-(me)val-oh)(2.0g，15mmol)的甲醇(25ml)溶液中加入二异丙基乙胺(8.0ml，46mmol)、三氟乙酸乙酯(5.5ml)后，在50度搅拌3小时。将反应液冷却至室温后，加入二异丙基乙胺(4.0ml，23mmol)三氟乙酸乙酯(2.7ml)后，在50度搅拌16小时。将反应液减压浓缩，将得到的残渣在tbme(40ml)中溶解后，用1n盐酸水溶液(40ml)和饱和氯化钠水溶液(40ml)按顺序洗涤。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤后减压浓缩，得到粗产物。通过将得到的粗产物用反相柱色谱(0.1％甲酸-水/0.1％甲酸-乙腈)纯化，得到化合物1-3-7-b((s)-2，3-二甲基-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丁酸)(1.17g，34％)。
[0556]
lcms(esi)m/z＝226.1(m-h)-[0557]
保留时间：0.54分钟(分析条件sqdfa05)
[0558]
实施例1-3-8.tfa-cleu-oh(1-(2，2，2-三氟乙酰胺)环戊烷-1-甲酸、化合物1-3-8-b)的合成
[0559][0560]
在化合物1-3-8-a(1-氨基环戊烷甲酸、h-cleu-oh)(25g，194mmol)的甲醇(100ml)溶液中加入二异丙基乙胺(37.5g，290mmol)、三氟乙酸乙酯(41.3g，290mmol)后，在50度搅
拌2天。将反应液冷却至室温后，加入二异丙基乙胺(4.0ml，23mmol)、三氟乙酸乙酯(2.7ml)后，在50度搅拌16小时。将反应液减压浓缩，将得到的残渣在tbme中溶解后，用1n盐酸水溶液和饱和氯化钠水溶液按顺序洗涤。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤后减压浓缩，得到粗产物。通过将得到的粗产物从tbme/己烷(3∶20)重结晶，得到化合物1-3-8-b(1-(2，2，2-三氟乙酰胺)环戊烷-1-甲酸)(20g，46％)。
[0561]
lcms(esi)m/z＝224.0(m-h)-[0562]
保留时间：0.49分钟(分析条件sqdfa05)
[0563]
实施例1-3-9. 2-(三氟甲基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-1-烯-4-酮(化合物1-3-9)的合成
[0564][0565]
在化合物1-3-8-b(tfa-cleu-oh、1-(2，2，2-三氟乙酰胺)环戊烷-1-甲酸)(25g，111mmol)的二氯甲烷(225ml)溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(27.7g，144mmol)，在室温搅拌2天。反应后，将反应液减压浓缩，得到粗产物。通过将得到的粗产物用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到化合物1-3-9(2-(三氟甲基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-1-烯-4-酮)(11.9g，52％)。
[0566]
lcms(esi)m/z＝208.1(m+h)+
[0567]
保留时间：0.86分钟(分析条件sqdaa05)
[0568]
实施例2：通过对固相合成中的肽中n末端被n-取代的氨基酸残基延伸n末端被tfa保护的n-未取代-α，α-二取代氨基酸、固相上的n-官能化，尝试导入n-取代-α，α-二取代氨基酸残基的实验
[0569][0570]
实施例2-1：fmoc-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-2)的脱fmoc后、tfa-aib-oh的延伸
[0571]
实施例2-1-1：fmoc-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-2)的脱fmoc后、应用dic的tfa-aib-oh延伸
[0572]
在带有过滤器的反应容器中，放置实施例1-2-2中配制的fmoc-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-2)(0.473mmol/g，100mg)，加入二氯甲烷(1ml)在室温振荡1小时，进行树脂的膨胀。用过滤器除去二氯甲烷后，将树脂用dmf(0.7ml)洗涤3次。然后，向树脂加入2％dbu/dmf溶液(脱fmoc溶液：0.7ml)在室温振荡5分钟，进行脱fmoc。除去脱
fmoc溶液后，将树脂用dmf(0.7ml)洗涤4次。
[0573]
对得到的树脂，实施tfa-aib-oh的延伸反应。
[0574]
延伸反应通过向树脂加入0.6m tfa-aib-oh/nmp溶液(0.3ml)和10％dic/dmf溶液(0.36ml)的混合溶液、在40度振荡20小时实施。
[0575]
用过滤器除去延伸反应的液相后，将树脂用dmf(0.7ml)洗涤4次，用二氯甲烷(0.7ml)洗涤4次，得到化合物2-1(tfa-aib-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)的批号1(以下记载为化合物2-1-1)。
[0576]
为了确认反应的进行，将得到的树脂(化合物2-1-1)用tfe/dcm溶液(1/1(v/v))进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，确认目的肽tfa-aib-meval-asp-pyrro(化合物2-1＊)的生成。其它的肽成分未被检测。该树脂(化合物2-1-1)在实施例2-3中使用。
[0577][0578]
lcms(esi)m/z＝481.21(m+h)+
[0579]
保留时间：0.53分钟(分析条件sqdfa05)
[0580]
实施例2-1-2：fmoc-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-2)的脱fmoc后、应用dic、加入oxyma作为添加剂的tfa-aib-oh的延伸
[0581]
在带有过滤器的反应容器中，放置实施例1-2-2中配制的fmoc-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-2)(0.473mmol/g，100mg)，除延伸试剂以外用与实施例2-1-1同样的方法进行tfa-aib的延伸。延伸试剂使用0.6m tfa-aib-oh/0.375m oxyma/nmp溶液(0.3ml)与10％dic/dmf溶液(0.36ml)的混合溶液。与实施例2-1-1同样从树脂切割肽，通过lcms分析的结果是，除目的肽tfa-aib-meval-asp-pyrro(化合物2-1＊)87.50％(uvarea)外，也确认未反应的h-meval-asp-pyrro是2.2％(uvarea)、和2个未鉴定的峰(分别8.85，1.43％(uvarea))。该树脂(化合物2-1的批号2、以下记载为化合物2-1-2)在比较例1中使用。
[0582]
实施例2-1-3：fmoc-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-2)的脱fmoc后、应用edci
·
hcl的tfa-aib-oh的延伸
[0583]
在带有过滤器的反应容器中，放置实施例1-2-2中配制的fmoc-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-2)(0.473mmol/g，100mg)，除延伸试剂以外用与实施例2-1-1同样的方法进行tfa-aib的延伸。延伸试剂使用0.6m tfa-aib-oh/nmp溶液(0.3ml)与edci
·
hcl(48mg、0.250mmol)/dmf溶液(0.36ml)的混合溶液。与实施例2-1-1同样从树脂切割肽，通过lcms分析的结果是，除目的肽tfa-aib-meval-asp-pyrro(化合物2-1＊)93.1％(uvarea)外，也确认未反应的h-meval-asp-pyrro是3.0％(uvarea)、未鉴定的3.9％(uvarea)的峰。该树脂(化合物2-1的批号3、以下记载为化合物2-1-3)在实施例2-2和实施
例2-3中使用。
[0584]
实施例2-2：通过对tfa-aib-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-1)的tfa酰胺部位的亲核取代反应(甲基碘作为甲基化剂、dbu作为碱)的n-甲基化
[0585]
在带有过滤器的反应容器中，在实施例2-1中配制的tfa-aib-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-1-3)(25mg)中加入二氯甲烷(1ml)在室温振荡15分钟，进行树脂的膨胀。用过滤器除去二氯甲烷后，将树脂用nmp(0.7ml)洗涤4次。
[0586]
向得到的树脂加入dbu(23μl)/nmp(0.35ml)溶液，然后加入甲基碘(63μl)/nmp(0.35ml)溶液，在40度振荡30分钟。用过滤器除去液相后，用nmp(0.7ml)洗涤4次，用二氯甲烷洗涤4次。将得到的树脂少量采样，用tfe/dcm溶液(1/1(v/v))进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液。
[0587]
对进行第1次甲基化的树脂，以提高反应转化率为目的，再次实施相同的操作。第2次甲基化在40度振荡20小时实施。通过洗涤树脂，得到化合物2-2。将得到的树脂少量采样，用tfe/dcm溶液(1/1(v/v))进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，确认目的物(化合物2-2＊)和未反应物(化合物2-1＊)。结果如表6所示。
[0588]
[表6]
[0589][0590][0591]
lcms(esi)m/z＝495.23(m+h)+
[0592]
保留时间：0.57分钟(分析条件sqdfa05)
[0593]
根据该结果得知，在应用甲基碘作为甲基化剂、dbu作为碱(共轭酸的乙腈中的pka＝24.34(j.org.chem.2005，70，1019-1028))的亲核取代反应中，tfa保护的n末端选择性地进行n-甲基化。通过替换试剂重复反应，显示提高反应的转化率。
[0594]
实施例2-3：通过对tfa-aib-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-1)的tfa酰胺部位的亲核取代反应(甲基碘作为甲基化剂、各种碱)的n-甲基化
[0595]
在带有过滤器的反应容器中，在实施例2-1中配制的tfa-aib-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-1-1或2-1-3)(25mg)中加入二氯甲烷(1ml)在室温振荡15分钟，进行树脂的膨胀。用过滤器除去二氯甲烷后，将树脂用dmf(0.7ml)洗涤4次。
[0596]
向得到的树脂加入碱(添加量在表7中记载)/dmf(0.35ml)溶液，然后加入甲基碘
(63μl)/dmf(0.35ml)溶液，在40度振荡15小时。用过滤器除去液相后，用dmf(0.7ml)洗涤4次，用二氯甲烷洗涤4次，得到化合物2-2。将得到的树脂少量采样，用tfe/dcm溶液(1/1(v/v))进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液。
[0597]
进行切割反应确认的结果如表7所示。使用p1-tbu作为碱时，也少量见到过度甲基化的产物(化合物2-3＊)的生成。
[0598]
[表7]
[0599][0600][0601]
lcms(esi)m/z＝509.25(m+h)+
[0602]
保留时间：0.59分钟(分析条件sqdfa05)
[0603]
根据该结果，在应用具有比dbu强的碱性的mtbd(共轭酸的乙腈中的pka＝25.43(chem.eur.j.2002，8，1682-1693))、tmgn(共轭酸的乙腈中的pka＝25.1(chem.eur.j.2002，8，1682-1693))、p1-tbu(共轭酸的乙腈中的pka＝26.9(aldrich公司有关磷腈碱的网址https://www.sigmaaldrich.com/chemistry/chemical-synthesis/technology-spotlights/phosphazenes.html(见于2019年10月10日)))作为碱的亲核取代反应中，显示进行目的n-甲基化。另外，在应用p1-tbu时，与该处的tfa酰胺部位不同的仲酰胺部位(由asp的氨基和meval的羧基构成的酰胺部位)中过度甲基化的产物被少量(3.8％)确认。根据该结果，为了在tfa酰胺部位选择性n-甲基化，考虑更优选应用共轭酸的pka的值是27以下的碱。
[0604]
实施例2-4：n-烷基化后的tfa-meaib-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-2)的tfa保护的脱保护
[0605]
在氮气氛下，在硼氢化钠(0.5g)中加入三甘醇二甲醚(三甘醇二甲基醚)(6.6ml)，在室温搅拌10分钟，得到2.0m硼氢化钠/三甘醇二甲醚溶液。
[0606]
在带有过滤器的反应容器中，加入实施例2-3、表7的第3次中配制的、以tmgn为碱的n-甲基化的树脂(化合物2-2)，加入二氯甲烷(1ml)在室温振荡30分钟，进行树脂的膨胀。用过滤器除去二氯甲烷后，将树脂用thf(0.7ml)洗涤4次。
[0607]
对得到的树脂加入thf(125μl)、甲醇(63μl)、之前配制的2.0m硼氢化钠/三甘醇二甲醚溶液(63μl)，在室温振荡30分钟。用过滤器除去液相后，用甲醇(0.7ml)洗涤4次(各洗涤时间是1分钟)、然后用二氯甲烷(0.7ml)洗涤4次，得到化合物2-4。将得到的树脂少量采
样，用tfe/dcm溶液(1/1(v/v))进行肽的切割、通过lcms分析切割的溶液。
[0608]
tfa保护的原料肽tfa-meaib-meval-asp-pyrro(化合物2-2＊)被完全消耗，观察到目的肽h-meaib-meval-asp-pyrro(化合物2-4＊)。lc图如图1，确认可高纯度合成。
[0609][0610]
目的肽h-meaib-meval-asp-pyrro(化合物2-4＊)
[0611]
lcms(esi)m/z＝399.23(m+h)+
[0612]
保留时间：0.35分钟(分析条件sqdfa05)
[0613]
如上，通过本发明，显示可以在庞大的n-烷基氨基酸后高纯度导入n-甲基-α，α-二烷基氨基酸。此外，可确认此后的脱tfa步骤也良好地进行，随后可实施从n末端的常规的肽延伸等。
[0614]
实施例2-5.在固相上在庞大的n-甲基氨基酸(meval)后导入各种n-甲基-α，α-二烷基氨基酸的实验
[0615]
按照以下的通式，应用各种tfa-氨基酸合成化合物2-5-1-1～化合物2-5-7-1和化合物2-5-1-2～化合物2-5-7-2。
[0616][0617]
[表8]
[0618]
meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-2)(0.552mmol/g，100mg)，加入二氯甲烷(1ml)在室温振荡45分钟，进行树脂的膨胀。用过滤器除去二氯甲烷后，将树脂用dmf(0.7ml)洗涤3次。然后，向树脂加入2％dbu/dmf溶液(脱fmoc溶液：0.7ml)在室温振荡5分钟，进行脱fmoc。除去脱fmoc溶液后，将树脂用dmf(0.7ml)洗涤4次。
[0623]
对得到的树脂，实施tfa-(me)abu-oh(化合物1-3-2-b)的延伸反应。
[0624]
延伸反应通过向树脂加入0.6m tfa-(me)abu-oh(化合物1-3-2-b)/nmp溶液(0.3ml)和10％dic/dmf溶液(0.36ml)的混合溶液、在60度振荡48小时实施。
[0625]
用过滤器除去延伸反应的液相后，将树脂用dmf(0.7ml)洗涤4次，用二氯甲烷(0.7ml)洗涤4次，得到化合物2-5-1-1(tfa-(me)abu-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。
[0626]
为了确认反应的进行，将得到的树脂(化合物2-5-1-1)取出一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，确认目的肽tfa-(me)abu-meval-asp-pyrro(化合物2-5-1-1＊)的生成。其它的肽成分未被检测。延伸后用dcm洗涤、干燥后，用于以后的研究。
[0627][0628]
lcms(esi)m/z＝495.4(m+h)+
[0629]
保留时间：0.56分钟(分析条件sqdfa05)
[0630]
实施例2-5-1-2.通过对tfa-(me)abu-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-5-1-1)的tfa酰胺部位的亲核取代反应的n-甲基化
[0631]
在带有过滤器的反应容器中，放置实施例2-5-1-1中配制的tfa-(me)abu-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-5-1-1)(45mg)，加入二氯甲烷(1ml)在室温振荡45分钟，进行树脂的膨胀。用过滤器除去二氯甲烷后，将树脂用dmf(0.7ml)洗涤4次。
[0632]
对得到的树脂，加入tmgn(27mg)/dmf(0.175ml)溶液，然后加入甲基碘(31μl)/dmf(0.175ml)溶液，在40度振荡1小时。用过滤器除去液相后，用dmf(0.7ml)洗涤2次。将得到的树脂少量采样，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液。
[0633]
对进行第1次甲基化的树脂，以提高反应转化率为目的，将同样的操作进一步实施3次。第2次甲基化在40度振荡1.5小时实施。第3次和第4次甲基化在40度振荡1小时实施。4次甲基化后，通过将树脂用dmf洗涤4次、进一步用dcm洗涤4次，得到化合物2-5-1-2。将得到的树脂取出一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，除目的肽tfa-me(me)abu-meval-asp-pyrro(化合物2-5-1-2＊)94.0％(uvarea)外
也确认tfa酰胺部位的o-甲基化物(化合物2-5-1-2a＊)6.0％(uvarea)。
[0634][0635]
lcms(esi)m/z＝509.5(m+h)+
[0636]
保留时间：0.60分钟(分析条件sqdfa05)
[0637][0638]
lcms(esi)m/z＝509.5(m+h)+
[0639]
保留时间：0.69分钟(分析条件sqdfa05)
[0640]
实施例2-5-2.tfa-me(me)leu-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-5-2-2)的合成
[0641]
实施例2-5-2-1.fmoc-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-2)的脱fmoc后、tfa-(me)leu-oh的延伸
[0642]
通过实施例2-5-1-1所示手法，应用化合物1-2-2(0.552mmol/g，100mg)、0.6m tfa-(me)leu-oh(化合物1-3-3-b)/dmf溶液(0.3ml)同样地合成化合物2-5-2-1(tfa-(me)leu-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。将得到的树脂取出一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，除目的肽tfa-(me)leu-meval-asp-pyrro(化合物2-5-2-1＊)(84.5％uvarea)外也确认meval-asp-pyrro的过度延伸物(化合物2-5-2-1a＊)6.8％(uvarea)为主要的杂质(脱fmoc后的转化效率是＞99％)。
[0643][0644]
lcms(esi)m/z＝523.5(m+h)+
[0645]
保留时间：0.67分钟(分析条件sqdfa05)
[0646][0647]
lcms(esi)m/z＝804.7(m+h)+
[0648]
保留时间：0.73分钟(分析条件sqdfa05)
[0649]
实施例2-5-2-2.通过对tfa-(me)leu-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-5-2-1)的tfa酰胺部位的亲核取代反应的n-甲基化
[0650]
通过实施例2-5-1-2所示手法，应用化合物2-5-2-1(45mg)同样地合成化合物2-5-2-2(tfa-me(me)leu-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。将得到的树脂取出一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，除目的肽tfa-me(me)leu-meval-asp-pyrro(化合物2-5-2-2＊)(68.5％uvarea)外也确认tfa酰胺部位的o-甲基化物(化合物2-5-2-2a＊)17.0％(uvarea)、作为起始原料的化合物2-5-2-1＊(14.5％uvarea)。
[0651]
[0652]
lcms(esi)m/z＝537.5(m+h)+
[0653]
保留时间：0.70分钟(分析条件sqdfa05)
[0654][0655]
lcms(esi)m/z＝537.5(m+h)+
[0656]
保留时间：0.81分钟(分析条件sqdfa05)
[0657]
实施例2-5-3.tfa-me(me)ser(me3-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-5-3-2)的合成
[0658]
实施例2-5-3-1.fmoc-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-2)的脱fmoc后、tfa-(me)ser(me)-oh的延伸
[0659]
通过实施例2-5-1-1所示手法，应用化合物1-2-2(0.552mmol/g，100mg)，0.6m tfa-(me)ser(me)-oh(化合物1-3-4-b)/dmf溶液(0.3ml)同样地合成化合物2-5-3-1(tfa-(me)ser(me)-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。将得到的树脂取出一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，确认目的肽tfa-(me)ser(me)-meval-asp-pyrro(化合物2-5-3-1＊)的生成。其它的肽成分未被检测。
[0660][0661]
lcms(esi)m/z＝511.4(m+h)+
[0662]
保留时间：0.55分钟(分析条件sqdfa05)
[0663]
实施例2-5-3-2.通过对tfa-(me)ser(me)-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-5-3-1)的tfa酰胺部位的亲核取代反应的n-甲基化
[0664]
通过实施例2-5-1-2所示手法，应用化合物2-5-3-1(45mg)同样地合成化合物2-5-3-2(tfa-me(me)ser(me)-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。将得到的树脂取出一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，确认目的肽tfa-me(me)ser(me)-meval-asp-pyrro(化合物2-5-3-2＊)的生成(94.0％uvarea)。
[0665][0666]
lcms(esi)m/z＝525.5(m+h)+
[0667]
保留时间：0.61分钟(分析条件sqdfa05)
[0668]
实施例2-5-4.tfa-me(me)phe-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-5-4-2)的合成
[0669]
实施例2-5-4-1.fmoc-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-2）的脱fmoc后、tfa-(me)phe-oh的延伸
[0670]
通过与实施例2-5-1-1同样的手法，通过使反应时间为72小时，应用化合物1-2-2(0.552mmol/g，100mg)、0.6m tfa-(me)phe-oh(化合物1-3-5-b)/dmf溶液(0.3ml)同样地合成化合物2-5-4-1(tfa-(me)phe-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。将得到的树脂取出一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，确认目的肽tfa-(me)phe-meval-asp-pyrro(化合物2-5-4-1＊)的生成(81.4％uvarea)。脱fmoc后的转化效率是＞99％，除作为主要杂质的meval-asp-pyrro的过度延伸物(化合物2-5-4-1a＊)4.1％(uvarea)外，也检测到结构不明的峰。
[0671][0672]
lcms(esi)m/z＝557.5(m+h)+
[0673]
保留时间：0.68分钟(分析条件sqdfa05)
[0674][0675]
lcms(esi)m/z＝838.7(m+h)+
[0676]
保留时间：0.73分钟(分析条件sqdfa05)
[0677]
实施例2-5-4-2.通过对tfa-(me)phe-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-5-4-1)的tfa酰胺部位的亲核取代反应的n-甲基化
[0678]
通过实施例2-5-1-2所示手法，应用化合物2-5-4-1(45mg)同样地合成化合物2-5-4-2(tfa-me(me)phe-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。此时第2次n-甲基化也实施1小时。将得到的树脂取出一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，除确认目的肽tfa-me(me)phe-meval-asp-pyrro(化合物2-5-4-2＊)(79.7％uvarea)的生成外，也检测meval-asp-pyrro的过度延伸物(化合物2-5-4-2a＊)和tfa酰胺部位的o-甲基化物(化合物2-5-4-2b＊)(共11.8％uvarea)作为杂质(起始原料的转化效率是100％)。
[0679][0680]
lcms(esi)m/z＝571.5(m+h)+
[0681]
保留时间：0.74分钟(分析条件sqdfa05)
[0682][0683]
lcms(esi)m/z＝852.7(m+h)+
[0684]
保留时间：0.79分钟(分析条件sqdfa05)
[0685][0686]
lcms(esi)m/z＝571.5(m+h)+
[0687]
保留时间：0.79分钟(分析条件sqdfa05)
[0688]
实施例2-5-5.tfa-me(me)cha-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-5-5-2)的合成
[0689]
实施例2-5-5-1.fmoc-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-2)的脱fmoc后、tfa-(me)cha-oh的延伸
[0690]
通过与实施例2-5-1-1同样的手法，通过使反应时间为72小时，应用化合物1-2-2(0.552mmol/g，100mg)、0.6m tfa-(me)cha-oh(化合物1-3-6-c)/dmf溶液(0.3ml)同样地合成化合物2-5-5-1(tfa-(me)cha-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。将得到的树脂取出一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，确认目的肽tfa-(me)cha-meval-asp-pyrro(化合物2-5-5-1＊)的生成(81.1％uvarea)。作为主要的杂质检测到包含meval-asp-pyrro的过度延伸物(化合物2-5-5-1a＊)的多个结构不明的峰(脱fmoc后的转化效率是100％)。
[0691][0692]
lcms(esi)m/z＝563.6(m+h)+
[0693]
保留时间：0.76分钟(分析条件sqdfa05)
[0694][0695]
lcms(esi)m/z＝844.8(m+h)+
[0696]
保留时间：0.80分钟(分析条件sqdfa05)
[0697]
实施例2-5-5-2.通过对tfa-(me)phe-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-5-5-1)的tfa酰胺部位的亲核取代反应的n-甲基化
[0698]
通过实施例2-5-1-2所示手法，应用化合物2-5-5-1(45mg)同样地合成化合物2-5-5-2(tfa-me(me)cha-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。此时第2次n-甲基化也实施1小时。将得到的树脂取出一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，除目的肽tfa-me(me)cha-meval-asp-pyrro(化合物2-5-5-2＊)(74.4％uvarea)外，也确认tfa酰胺部位的o-甲基化物(化合物2-5-5-2a＊)12.1％(uvarea)、作为起始原料的化合物2-5-5-1＊(13.5％uvarea)。
[0699][0700]
lcms(esi)m/z＝577.5(m+h)+
[0701]
保留时间：0.80分钟(分析条件sqdfa05)
[0702][0703]
lcms(esi)m/z＝577.5(m+h)+
[0704]
保留时间：0.92分钟(分析条件sqdfa05)
[0705]
实施例2-5-6.tfa-me(me)val-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-5-6-2)的合成
[0706]
实施例2-5-6-1.fmoc-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-2)的脱fmoc后、tfa-(me)val-oh的延伸
[0707]
通过与实施例2-5-1-1同样的手法，通过使反应时间为72小时，应用化合物1-2-2(0.552mmol/g，100mg)、0.6m tfa-(me)val-oh(化合物1-3-7-b)/dmf溶液(0.3ml)，同样地合成化合物2-5-6-1(tfa-(me)val-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。将得到的树脂取出一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，确认目的肽tfa-(me)val-meval-asp-pyrro(化合物2-5-6-1＊)的生成(66.6％uvarea)。作为杂质检测到包含meval-asp-pyrro的过度延伸物(化合物2-5-6-1a＊)的多个结构不明的峰(脱fmoc后的转化效率是98％)。
[0708][0709]
lcms(esi)m/z＝509.5(m+h)+
[0710]
保留时间：0.59分钟(分析条件sqdfa05)
[0711][0712]
lcms(esi)m/z＝790.7(m+h)+
[0713]
保留时间：0.67分钟(分析条件sqdfa05)
[0714]
实施例2-5-6-2.通过对tfa-(me)val-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-5-6-1)的tfa酰胺部位的亲核取代反应的n-甲基化
[0715]
基于实施例2-5-1-2所示手法，使反应温度为60度，应用化合物2-5-6-1(40mg)同样地合成化合物2-5-6-2(tfa-me(me)val-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。此时第2次n-甲基化也实施1小时。将得到的树脂取出一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，除目的肽tfa-me(me)val-meval-asp-pyrro(化合物2-5-6-2＊)(21.2％uvarea)外，也确认tfa酰胺部位的o-甲基化物(化合物2-5-6-2a＊)17.1％(uvarea)、作为起始原料的化合物2-5-6-1＊(39.6％uvarea)。此外，检测到多个结构不明峰。
[0716][0717]
lcms(esi)m/z＝523.5(m+h)+
[0718]
保留时间：0.65分钟(分析条件sqdfa05)
[0719][0720]
lcms(esi)m/z＝523.5(m+h)+
[0721]
保留时间：0.77分钟(分析条件sqdfa05)
[0722]
实施例2-5-7.tfa-mecleu-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-5-7-2)的合成
[0723]
实施例2-5-7-1.fmoc-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-2)的脱fmoc后、tfa-cleu-oh的延伸
[0724]
通过实施例2-5-1-1所示手法，应用化合物1-2-2(0.552mmol/g，100mg)、0.6m tfa-cleu-oh(化合物1-3-8-b)/dmf溶液(0.3ml)同样地合成化合物2-5-7-1(tfa-cleu-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。将得到的树脂取出一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，确认目的肽tfa-cleu-meval-asp-pyrro(化合物2-5-7-1＊)的生成。其它的肽成分未被检测。
[0725][0726]
lcms(esi)m/z＝507.4(m+h)+
[0727]
保留时间：0.56分钟(分析条件sqdfa05)
[0728]
实施例2-5-7-2.通过对tfa-cleu-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-5-7-1)的tfa酰胺部位的亲核取代反应的n-甲基化
[0729]
通过实施例2-5-1-2所示手法，应用化合物2-5-7-1(45mg)同样地合成化合物2-5-7-2(tfa-mecleu-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。将得到的树脂取出一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，除确认目的肽tfa-mecleu-meval-asp-pyrro(化合物2-5-7-2＊)(92.1％uvarea)的生成外，作为杂质检测到tfa酰胺部位的o-甲基化物(化合物2-5-7-2a＊)7.9％(uvarea)(起始原料的转化效率是100％)。
[0730][0731]
lcms(esi)m/z＝521.4(m+h)+
[0732]
保留时间：0.61分钟(分析条件sqdfa05)
[0733][0734]
lcms(esi)m/z＝521.4(m+h)+
[0735]
保留时间：0.70分钟(分析条件sqdfa05)
[0736]
以上，根据实施例2-5的结果显示，通过本发明的手法，在固相合成中庞大的n-甲基氨基酸后，meaib以外的各种n-甲基-α，α-二烷基氨基酸的导入可为实用的水平。
[0737]
实施例2-6.在固相上、在庞大的n-甲基氨基酸(meval)后、导入各种n-取代-α，α-二烷基氨基酸的实验
[0738]
按照以下的通式，应用各种tfa-氨基酸，合成化合物2-6-1～化合物2-6-4。
[0739][0740]
[表9]
[0741][0742]
实施例2-6-1.tfa-aib-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-1)的tfa酰胺部位的n-乙基化
[0743]
在带有过滤器的反应容器中，放置通过与实施例2-1-1同样的手法配制的tfa-aib-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-1)(0.552mmol/g，50mg)，加入二氯甲烷(1ml)在室温振荡45分钟，进行树脂的膨胀。用过滤器除去二氯甲烷后，将树脂用dmf(0.7ml)洗涤4次。
[0744]
对得到的树脂加入tmgn(29mg)/dmf(0.175ml)溶液，然后加入乙基碘(44μl)/dmf(0.175ml)溶液，在60度振荡1小时。用过滤器除去液相后，用dmf(0.7ml)洗涤2次。将得到的树脂少量采样，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液。
[0745]
对进行第1次乙基化的树脂，以提高反应转化率为目的，将同样的操作进一步实施4次。第5次乙基化后，通过将树脂用dmf洗涤4次、进一步用dcm洗涤4次，得到化合物2-6-1(tfa-etaib-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。将得到的树脂取出一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，除目的肽tfa-etaib-meval-asp-pyrro(化合物2-6-1＊)(26.1％uvarea)外，也确认tfa酰胺部位的o-乙基化物(化合物2-6-1a＊)15.4％(uvarea)、起始原料化合物2-1＊(54.8％uvarea)等。
[0746][0747]
lcms(esi)m/z＝509.4(m+h)+
[0748]
保留时间：0.60分钟(分析条件sqdfa05)
[0749][0750]
lcms(esi)m/z＝509.4(m+h)+
[0751]
保留时间：0.67分钟(分析条件sqdfa05)
[0752]
实施例2-6-2.tfa-aib-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-1)的tfa酰胺部位的n-正丙基化
[0753]
通过实施例2-6-1所示手法，应用化合物2-1(0.552mmol/g，50mg)、正丙基碘(54μl
×
5)，同样地合成化合物2-6-2(tfa-npraib-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。将得到的树脂取出一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，除目的肽tfa-npraib-meval-asp-pyrro(化合物2-6-2＊)(10.0％uvarea)外，也确认tfa酰胺部位的o-正丙基化物(化合物2-6-2a＊)6.3％(uvarea)、起始原料化合物2-1＊(82.7％uvarea)等。
[0754][0755]
lcms(esi)m/z＝523.5(m+h)+
[0756]
保留时间：0.66分钟(分析条件sqdfa05)
[0757][0758]
lcms(esi)m/z＝523.5(m+h)+
[0759]
保留时间：0.73分钟(分析条件sqdfa05)
[0760]
实施例2-6-3.tfa-aib-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-1)的tfa酰胺部位的n-烯丙基化
[0761]
通过实施例2-6-1所示手法，应用化合物2-1(0.552mmol/g，50mg)，烯丙基溴(48μl
×
5)，同样地合成化合物2-6-3(tfa-allylaib-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。将得到的树脂取出一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，除目的肽tfa-allylaib-meval-asp-pyrro(化合物2-6-3＊)(20.3％uvarea)外，也确认tfa酰胺部位的o-烯丙基化物(化合物2-6-3a＊)6.9％(uvarea)、起始原料化合物2-1＊(72.8％uvarea)。
[0762][0763]
lcms(esi)m/z＝521.4(m+h)+
[0764]
保留时间：0.64分钟(分析条件sqdfa05)
[0765][0766]
lcms(esi)m/z＝521.5(m+h)+
[0767]
保留时间：0.71分钟(分析条件sqdfa05)
[0768]
实施例2-6-4.tfa-aib-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-1)的tfa
酰胺部位的n-苄基化
[0769]
通过实施例2-6-1所示手法，应用化合物2-1(0.552mmol/g，50mg)，苄基溴(66μl
×
5)，同样地合成化合物2-6-4(tfa-bnaib-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。将得到的树脂取出一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，除目的肽tfa-bnaib-meval-asp-pyrro(化合物2-6-4＊)(6.2％uvarea)外，也确认tfa酰胺部位的o-苄基化物(化合物2-6-4a＊)7.7％(uvarea)、起始原料化合物2-1＊(79.5％uvarea)。
[0770][0771]
lcms(esi)m/z＝571.5(m+h)+
[0772]
保留时间：0.72分钟(分析条件sqdfa05)
[0773][0774]
lcms(esi)m/z＝571.5(m+h)+
[0775]
保留时间：0.79分钟(分析条件sqdfa05)
[0776]
以上，根据实施例2-6的结果显示，通过本发明的手法，在固相合成中庞大的n-甲基氨基酸后，不限于n-甲基-α，α-二烷基氨基酸，n-取代-α，α-二烷基氨基酸的导入也可为实用的水平。
[0777]
实施例2-7.在固相上、在庞大的n-烷基氨基酸(etval/nprval)后、导入n-甲基-α，α-二烷基氨基酸(mecleu)的实验
[0778]
按照以下的通式，合成化合物2-7-1～化合物2-7-2、化合物2-7-3-1～化合物2-7-3-4和化合物2-7-4-1～化合物2-7-4-4。
[0779][0780]
[表10]
[0781]
[0782][0783]
实施例2-7-1.fmoc-val-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-7-1)的配制
[0784]
在带有过滤器的反应容器中，放置通过与实施例1-2-1同样的手法配制的fmoc-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-1)(0.552mmol/g，100mg)，加入二氯甲烷(1ml)在室温振荡45分钟，进行树脂的膨胀。用过滤器除去二氯甲烷后，将树脂用dmf(0.7ml)洗涤3次。然后，向树脂加入2％dbu/dmf溶液(脱fmoc溶液：0.7ml)在室温振荡5分钟，进行脱fmoc。除去脱fmoc溶液后，将树脂用dmf(0.7ml)洗涤4次。
[0785]
对得到的树脂实施fmoc-val-oh的延伸反应。
[0786]
延伸反应通过向树脂加入fmoc-val-oh(0.6mol/l)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(hoat，0.375mol/l)的nmp溶液(0.3ml)和10％dic/dmf溶液(0.36ml)的混合溶液、在40度振荡3小时实施。
[0787]
用过滤器除去延伸反应的液相后，将树脂用dmf(0.7ml)洗涤4次，用二氯甲烷(0.7ml)洗涤4次，得到化合物2-7-1(fmoc-val-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。
[0788]
为了确认反应的进行，取出得到的树脂(化合物2-7-1)的一部分(～5mg)，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，确认目的肽fmoc-val-asp-pyrro(化合物2-7-1＊)的生成(97.3％uvarea)。此外，也同时检测到val的过度延伸物(化合物2-7-1a＊)2.7％(uvarea)。延伸后用dcm洗涤、干燥后，用于以后的研究。
[0789][0790]
lcms(esi)m/z＝508.4(m+h)+
[0791]
保留时间：0.72分钟(分析条件sqdfa05)
[0792][0793]
lcms(esi)m/z＝607.5(m+h)+
[0794]
保留时间：0.74分钟(分析条件sqdfa05)
[0795]
实施例2-7-2.fmoc-val-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-7-1)的脱fmoc和n末端的ns化
[0796]
在带有过滤器的反应容器中，放置实施例2-7-1中配制的fmoc-val-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-7-1)(0.552mmol/g，每1柱100mg)，加入二氯甲烷(1ml)在室温振荡45分钟，进行树脂的膨胀。用过滤器除去二氯甲烷后，将树脂用dmf(0.7ml)洗涤2次。然后，向树脂加入2％dbu/dmf溶液(脱fmoc溶液：0.7ml)在室温振荡10分钟，进行脱fmoc。除去脱fmoc溶液后，将树脂用dmf(0.7ml)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(hoat，0.157mol/l)和dipea(0.157mol/l)的dmf溶液(0.7ml)、dmf(0.7ml)按顺序洗涤，然后用thf(0.7ml)洗涤3次。
[0797]
对得到的树脂加入2，4，6-三甲基吡啶(0.074ml，0.552mmol)的thf溶液(0.35ml)和2-硝基苯磺酰氯(0.049g，0.221mmol)的thf溶液(0.35ml)，在40度振荡3小时。
[0798]
用过滤器除去液相后，将树脂用thf(1ml)洗涤5次，用二氯甲烷(1ml)洗涤5次，得到化合物2-7-2(ns-val-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。
[0799]
为了确认延伸的进行，取出得到的树脂的一部分(～5mg)，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液时，确认目的肽ns-val-asp-pyrro(化合物2-7-2＊)以94.3％(uvarea)生成。ns化后用dcm洗涤、干燥后，用于以后的研究。
[0800][0801]
lcms(esi)m/z＝471.3(m+h)+
[0802]
保留时间：0.55分钟(分析条件sqdfa05)
[0803]
实施例2-7-3-1.通过对ns-val-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-7-2)的ns酰胺部位的光延反应的n-乙基化
[0804]
在带有过滤器的反应容器中，放置实施例2-7-2中配制的ns-val-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-7-2)(0.552mmol/g，100mg)，加入二氯甲烷(1ml)在室温振荡45分钟，进行树脂的膨胀。用过滤器除去二氯甲烷后，将树脂用thf(1ml)洗涤2次。
[0805]
单独地，在1.5ml小瓶中加入三苯基膦(72.0mg，0.276mmol)的thf(0.35ml)溶液和diad(54μl、0.276mmol)的thf(0.35ml)溶，轻微振荡混合，在室温静置15分钟后，加入乙醇(32μl、0.552mmol)混和后静置5分钟。将得到的溶液加入膨胀的树脂，在35度振荡1小时。用过滤器除去液相后，将树脂用thf(0.7ml)洗涤4次，用二氯甲烷(0.7ml)洗涤4次，得到化合物2-7-3-1(ns-etval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。
[0806]
将得到的树脂的一部分(～5mg)用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)从肽切割，通过lcms分析切割的溶液时，确认目的肽ns-etval-asp-pyrro(化合物2-7-3-1＊)的生成(从化合物2-7-2的转化率是100％)。得到的树脂在干燥后，用于以后的研究。
[0807][0808]
lcms(esi)m/z＝499.4(m+h)+
[0809]
保留时间：0.64分钟(分析条件sqdfa05)
[0810]
实施例2-7-3-2.ns-etval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-7-3-1)的脱ns化
[0811]
在带有过滤器的反应容器中，放置实施例2-7-3-1中配制的ns-val-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-7-3-1)(0.552mmol/g，100mg)，加入二氯甲烷(1ml)在室温振荡45分钟，进行树脂的膨胀。用过滤器除去二氯甲烷后，将树脂用nmp(0.7ml)洗涤2次。
[0812]
对得到的树脂加入dbu(42μl、0.276mmol)/nmp溶液(0.35ml)和1-十二烷硫醇(126
μl、0.552mmol)/nmp溶液(0.35ml)，在60度振荡4小时。用过滤器除去液相后，用nmp(0.7ml)洗涤2次。取出得到的树脂的一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液。
[0813]
对进行第1次脱ns化的树脂，以提高反应转化率为目的，再次实施同样的操作。第2次脱ns化在60度振荡12小时。第2次脱ns化后，通过将树脂用nmp洗涤4次、进一步用dcm洗涤4次，得到化合物2-7-3-2(h-etval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。取出得到的树脂的一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，除目的肽h-etval-asp-pyrro(化合物2-7-3-2＊)84.6％(uvarea)外，也检测到推测对ns保护的硝基1-十二烷硫醇被本位取代的杂质(化合物2-7-3-2a＊)(12.6％uvarea)。
[0814][0815]
lcms(esi)m/z＝314.3(m+h)+
[0816]
保留时间：0.26分钟(分析条件sqdfa05)
[0817][0818]
lcms(esi)m/z＝654.5(m+h)+
[0819]
保留时间：1.25分钟(分析条件sqdfa05)
[0820]
实施例2-7-3-3.对h-etval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-7-3-2)的tfa-cleu-oh的延伸反应是树脂应用2-(三氟甲基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-1-烯-4-酮(化合物1-3-9)的tfa-cleu的延伸
[0821]
在带有过滤器的反应容器中，放置实施例2-7-3-2中配制的h-etval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-7-3-2)(0.552mmol/g，100mg)，加入二氯甲烷(1ml)在室温振荡45分钟，进行树脂的膨胀。用过滤器除去二氯甲烷后，将树脂用dmf(0.7ml)洗涤3次。tfa-cleu-oh的延伸反应通过向树脂加入纯2-(三氟甲基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-1-烯-4-酮(化合物1-3-9)(0.582g，2.81mmol)、在60度振荡48小时实施。为了确认反应的进
行，24小时后将少量得到的树脂采样，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，确认目的肽的生成。用过滤器除去延伸反应后的液相后，将树脂用dmf(1ml)洗涤4次，用二氯甲烷(1ml)洗涤4次，得到化合物2-7-3-3(tfa-cleu-etval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。
[0822]
为了确认反应的进行，取出得到的树脂(化合物2-7-3-3)的一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，除确认目的肽tfa-cleu-etval-asp-pyrro(化合物2-7-3-3＊)(55.5％uvarea)的生成外，也检测到etval-asp-pyrro的过度延伸物(化合物2-7-3-3a＊)(18.0％uvarea)、推测对ns保护的硝基1-十二烷硫醇被本位取代的杂质(化合物2-7-3-2a＊)(11.8％uvarea)等。此外，也检测到如向树脂加载tfa-cleu-oh的峰。延伸后用dcm洗涤、干燥后，用于以后的研究。
[0823][0824]
lcms(esi)m/z＝521.5(m+h)+
[0825]
保留时间：0.60分钟(分析条件sqdfa05)
[0826][0827]
lcms(esi)m/z＝816.7(m+h)+
[0828]
保留时间：0.69分钟(分析条件sqdfa05)
[0829]
实施例2-7-3-4.通过对tfa-cleu-etval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-7-3-3)的tfa酰胺部位的亲核取代反应的n-甲基化
[0830]
在带有过滤器的反应容器中，放置实施例2-7-3-3中配制的tfa-cleu-etval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-7-3-3)(66mg)，加入二氯甲烷(1ml)在室温振荡1小时，进行树脂的膨胀。用过滤器除去二氯甲烷后，将树脂用dmf(0.7ml)洗涤4次。
[0831]
对得到的树脂加入tmgn(59mg)/dmf(0.35ml)溶液，然后加入甲基碘(69μl)/dmf(0.35ml)溶液，在40度振荡1小时。用过滤器除去液相后，用dmf(0.7ml)洗涤2次。取出得到的树脂的一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的
溶液。
[0832]
对进行第1次甲基化的树脂，以提高反应转化率为目的，将同样的操作进一步实施2次。3次甲基化后，通过将树脂用dmf洗涤4次、进一步用dcm洗涤4次，得到化合物2-7-3-4(tfa-mecleu-etval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。取出得到的树脂的一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，除目的肽tfa-mecleu-etval-asp-pyrro(化合物2-7-3-4＊)(53.2％uvarea)外，也确认etval-asp-pyrro过度延伸后被me化的化合物(化合物2-7-3-4a＊)(29.8％uvarea)、推测对ns保护的硝基1-十二烷硫醇被本位取代的杂质(化合物2-7-3-2a＊)(11.9％uvarea)等。此外，也检测到如向树脂加载tfa-cleu-oh的me化的峰。
[0833][0834]
lcms(esi)m/z＝535.4(m+h)+
[0835]
保留时间：0.66分钟(分析条件sqdfa05)
[0836][0837]
lcms(esi)m/z＝830.7(m+h)+
[0838]
保留时间：0.75分钟(分析条件sqdfa05)
[0839]
实施例2-7-4-1.通过对ns-val-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-7-2)的ns酰胺部位的光延反应的n-正丙基化
[0840]
通过实施例2-7-3-1所示手法，应用化合物2-7-2(0.552mmol/g，100mg)和1-丙醇(41μl、0.552mmol)，同样地合成化合物2-7-4-1(ns-nprval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。将得到的树脂取出一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，确认目的肽ns-nprval-asp-pyrro(化合物2-7-4-1＊)94.7％(uvarea)的生成(从化合物2-7-2的转化率是100％)。
[0841][0842]
lcms(esi)m/z＝513.4(m+h)+
[0843]
保留时间：0.69分钟(分析条件sqdfa05)
[0844]
实施例2-7-4-2.ns-nprval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-7-4-1)的脱ns化
[0845]
通过实施例2-7-3-2所示手法，应用化合物2-7-4-1(0.552mmol/g，100mg)，同样地合成化合物2-7-4-2(h-nprval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。将得到的树脂取出一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，除目的肽h-nprval-asp-pyrro(化合物2-7-4-2＊)81.1％(uvarea)外，也检测到推测对ns保护的硝基1-十二烷硫醇被本位取代的杂质(化合物2-7-4-2a＊)(15.1％uvarea)。
[0846][0847]
lcms(esi)m/z＝328.3(m+h)+
[0848]
保留时间：0.28分钟(分析条件sqdfa05)
[0849][0850]
lcms(esi)m/z＝668.6(m+h)+
[0851]
保留时间：1.28分钟(分析条件sqdfa05)
[0852]
实施例2-7-4-3.对h-nprval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-7-4-2)应用2-(三氟甲基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-1-烯-4-酮(化合物1-3-9)的tfa-cleu的延伸
[0853]
通过实施例2-7-3-3所示手法，应用化合物2-7-4-2(0.552mmol/g，100mg)，同样地合成化合物2-7-4-3(tfa-cleu-nprval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。将得到的树脂取出一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，除确认目的肽tfa-cleu-nprval-asp-pyrro(化合物2-7-4-3＊)(53.1％uvarea)的生成外，也检测到nprval-asp-pyrro的过度延伸物(化合物2-7-4-3a＊)(31.0％uvarea)、推测对ns保护的硝基1-十二烷硫醇被本位取代的杂质(化合物2-7-4-2a＊)(13.3％uvarea)等。此外，也检测到如向树脂加载tfa-cleu-oh的峰。
[0854][0855]
lcms(esi)m/z＝535.5(m+h)+
[0856]
保留时间：0.65分钟(分析条件sqdfa05)
[0857][0858]
lcms(esi)m/z＝844.8(m+h)+
[0859]
保留时间：0.77分钟(分析条件sqdfa05)
[0860]
实施例2-7-4-4.通过对tfa-cleu-nprval-asp(otrt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-7-4-3)的tfa酰胺部位的亲核取代反应的n-甲基化
[0861]
通过实施例2-7-3-4所示手法，应用化合物2-7-4-3(0.552mmol/g，60mg)，同样地合成化合物2-7-4-4(tfa-mecleu-nprval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro)。将得到的树脂取出一部分，用tfe/dcm/dipea溶液(1∶1∶0.015)进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液，除目的肽tfa-mecleu-nprval-asp-pyrro(化合物2-7-4-4＊)(46.1％uvarea)外，也确认nprval-asp-pyrro过度延伸后被me化的化合物(化合物2-7-4-4a＊)(38.3％uvarea)、推测对ns保护的硝基1-十二烷硫醇被本位取代的杂质(化合物2-7-4-2a＊)(12.6％uvarea)等。此外，也检测到如向树脂加载tfa-cleu-oh的me化的峰。
[0862][0863]
lcms(esi)m/z＝549.5(m+h)+
[0864]
保留时间：0.71分钟(分析条件sqdfa05)
[0865][0866]
lcms(esi)m/z＝858.7(m+h)+
[0867]
保留时间：0.83分钟(分析条件sqdfa05)
[0868]
以上，根据实施例2-7的结果显示，通过本发明的手法，在固相合成中庞大的n-烷基氨基酸后，n-甲基-α，α-二烷基氨基酸的导入可为实用的水平。
[0869]
实施例3：用本发明的手法导入meaib、进行肽合成的实例
[0870]
按照通过wo2013/100132或wo2018/225864中记载的fmoc法的肽合成法，通过下述的基本途径进行肽的延伸。即，
[0871]
1)向2-氯三苯甲基树脂加载asp侧链的羧酸或肽主链羧酸、从氨基酸的n末端通过fmoc法的肽延伸反应，
[0872]
2)从2-氯三苯甲基树脂的肽的切割过程，
[0873]
3)通过经切割过程从2-氯三苯甲基树脂释放产生的asp侧链的羧酸或肽主链羧酸、与肽链n末端(三角单元)的氨基的缩合的酰胺环化，
[0874]
4)按需要肽链中包含的侧链官能团的保护基的脱保护，
[0875]
5)通过制备型hplc的化合物的纯化的5阶段的步骤。在本实施例中，除非另有表述，以该基本途径为基础进行肽化合物的合成。
[0876][0877]
实施例3-1：(5s，8s，11s，15r，18s，23as，29s，35s，37as)-8，11-二((s)-仲丁基)-29-(3-氯-4-(三氟甲基)苯乙基)-35-(环己基甲基)-18-异丙基-5，6，12，15，16，19，21，21，22，33，36-十一甲基二十四氢-2h-氮杂环丁烷并[2，1-u]吡咯并[2，1-i][1，4，7，10，13，16，19，22，25，28，31]十一碳氮杂环三十四烷-4，7，10，13，17，20，23，28，31，34，37(14h)-十一酮(化合物3-1)的合成
[0878][0879]
化合物3-1的合成从化合物1-2-4按以下方案进行。
[0880][0881]
应用(3r)-3-[9h-芴-9-基甲氧基羰基(甲基)氨基]丁酸-2-氯三苯甲基树脂(fmoc-d-3-meabu-o-trt(2-cl)树脂)(化合物1-2-4、100mg，0.343mmol/g，0.0343mmol)作为原料，在带有过滤器的反应容器中用实施例1-2-2中记载的肽延伸法进行fmoc-meval-oh的延伸后，用与实施例2-1-1同样的操作进行tfa-aib-oh(2-甲基-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酸)(化合物1-3-1)的延伸，得到化合物3-1-a。
[0882]
将得到的化合物3-1-a用dcm(1ml)膨胀后用dmf(1ml)洗涤4次。加入磷腈碱p1-tbu(38μl，0.150mmol)的dmf溶液(180μl)和甲基碘(62μl，1mmol)的dmf溶液(180μl)，密闭下在40℃振荡30分钟。除去反应液后，将树脂用dmf(1ml)洗涤4次，进一步用dcm(1ml)洗涤4次，
得到化合物3-1-b。将得到的树脂的一部分用tfe/dcm(1/1(v/v))切割，用lcms进行分析，确认化合物3-1-b＊的生成。
[0883][0884]
lcms(esi)m/z＝424(m-h)-[0885]
保留时间：0.57分钟(分析条件sqdfa05)
[0886]
在烧瓶中放入硼氢化钠(nabh4)(758mg，20mmol)，抽真空后置于氮气氛下，在三甘醇二甲醚(10ml)中溶解，作为溶液a。将上述中得到的化合物3-1-b用dcm(1ml)膨胀后，用thf(0.7ml)洗涤4次。向树脂加入thf(0.5ml)、甲醇(0.25ml)、溶液a(0.25ml)，在开放系统中在室温振荡40分钟。除去反应液后，加入甲醇(0.7ml)，1分钟后弃去液体，重复4次洗涤操作，进一步用dcm(0.7ml)同样地洗涤4次，得到化合物3-1-c。将得到的树脂的一部分用tfe/dcm(1/1(v/v))切割，用lcms进行分析，确认化合物3-1-c＊的生成。
[0887][0888]
lcms(esi)m/z＝330(m+h)+
[0889]
保留时间：0.33分钟(分析条件sqdfa05)
[0890]
配制化合物3-1-c后的肽延伸和环化、纯化的步骤按照以下的合成法进行。
[0891]
与实施例1-2-2同样，在肽合成仪中放置化合物3-1-c(每1柱100mg)、各种fmoc-氨基酸(fmoc-pro-oh、fmoc-hph(4-cf3-3-cl)-oh(化合物aa2-001)、fmoc-megly-oh、fmoc-mecha-oh、fmoc-aze(2)-oh、fmoc-meala-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-meleu-oh)(0.3-0.6mol/l)和hoat或oxyma或hoobt(0.375mol/l)的nmp溶液(溶液1)、和二异丙基碳二亚胺(dic)的n，n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液(10％v/v，溶液2)。
[0892]
溶液1和溶液2用合成仪的混合瓶混合后向树脂添加，进行树脂上的氨基和fmoc氨基酸的缩合反应。
[0893]
应用二氮杂双环十一碳烯(dbu)的dmf溶液(2％v/v)作为fmoc脱保护溶液进行合成。树脂用dmf洗涤后，将fmoc脱保护、随后fmoc氨基酸的缩合反应作为1个循环，通过重复该循环使肽在树脂表面上延伸。肽延伸结束后，在肽合成仪上进行树脂的n末端的fmoc基的除去后，用dmf洗涤树脂。
[0894]
对得到的固相上加载的链状肽，加入dcm使树脂再膨胀后，向树脂加入2，2，2-三氟乙醇(tfe)/dcm(1/1(v/v)，2ml)，在室温振荡2小时。然后，通过用合成用柱过滤管内的溶液
除去树脂，将残留的树脂进一步用2，2，2-三氟乙醇(tfe)/dcm(1/1(v/v)，1ml)洗涤2次。混合得到的全部切割溶液，在减压下浓缩。
[0895]
在dmf/dcm(1/1(v/v)，8ml)中溶解切割后在减压下浓缩的残渣。加入0.5m的o-(7-氮杂-1h-苯并三唑-1-基)-n，n，n，n-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)/dmf溶液(对应用的树脂上的摩尔数(加载量(mmol/g)乘以使用的树脂量(通常是0.10g))成为1.5当量的容量)、和dipea(对应用的树脂上的摩尔数1.8当量)，在室温振荡2小时。其后，在减压下除去溶剂。通过lcms测定确认目的环状肽的生成。
[0896]
其后，在减压下，除去溶剂后，加入dmf或dmso，用过滤器过滤除去不溶物后，用制备型hplc纯化，得到化合物3-1((5s，8s，11s，15r，18s，23as，29s，35s，37as)-8，11-二((s)-仲丁基)-29-(3-氯-4-(三氟甲基)苯乙基)-35-(环己基甲基)-18-异丙基-5，6，12，15，16，19，21，21，22，33，36-十一甲基二十四氢-2h-氮杂环丁烷并[2，1-u]吡咯并[2，1-i][1，4，7，10，13，16，19，22，25，28，31]十一碳氮杂环三十四烷-4，7，10，13，17，20，23，28，31，34，37(14h)-十一酮)(4.1mg，9％)。
[0897]
lcms的分析结果在表12中记载。
[0898]
实施例3-2：与实施例3-1同样地进行肽合成的实例
[0899]
通过实施例3-1中所示手法，也同样地合成化合物3-2～化合物3-9。另外，构成化合物3-1～化合物3-9(结构式在表13中记载)中记载的环状肽的各氨基酸残基的正式名称、结构、和简称的关系根据上述的表3～5和以下的表11理解。
[0900]
lcms的分析结果在表12中记载。
[0901]
[表11]
[0902]
[0903]
[0904]
[0905]
[0906]
[0907]
[0908]
[0909]
[0910]
[0911]
[0912]
[0913]
[0914]
[0915]
[0916][0917]
[表12]
[0918]
化合物编号lcms条件保留时间(分钟)lcms(esi)m/zms极性化合物3-1ssc-a-af-017.5131318.6(m+h)+化合物3-2ssc-a-fa-015.3371302.6(m+h)+化合物3-3ssc-a-af-017.4081288.7(m-h)-化合物3-4ssc-a-fa-014.5951262.5(m+h)+化合物3-5ssc-a-af-017.6031314.9(m-h)-化合物3-6ssc-a-fa-015.3831300.7(m-h)-化合物3-7ssc-a-af-017.2431286.9(m-h)-化合物3-8ssc-a-fa-015.5641316.6(m+h)+化合物3-9ssc-a-fa-015.2041290.6(m+h)+
[0919]
[表13]
[0920]
[0921]
[0922]
[0923]
[0924][0925]
比较例1：通过对tfa-aib-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-1)的tfa酰胺部位的光延反应的n-甲基化
[0926]
作为与本发明的比较例，作为三氟乙酰胺部位的选择性n-甲基化法，尝试进行光延反应的已知手法(org.lett.2013，15，5012-5015)。
[0927]
在带有过滤器的反应容器中，在实施例2-1-2中配制的tfa-aib-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物2-1-2)(0.473mmol/g，100mg)中加入二氯甲烷(1ml)，在室温振荡15分钟，进行树脂的膨胀。用过滤器除去二氯甲烷后，将树脂用thf(0.7ml)洗涤4次。
[0928]
对得到的树脂，加入三苯基膦(66.0mg)/thf(0.7ml)溶液、甲醇(20μl)、diad(49μl)，在40度振荡30分钟。用过滤器除去液相后，再次加入三苯基膦(66.0mg)/thf(0.7ml)溶液、甲醇(20μl)、diad(49μl)，在40度振荡1小时。用过滤器除去液相后，将树脂用thf(0.7ml)洗涤4次，用二氯甲烷(0.7ml)洗涤4次。
[0929]
将得到的树脂用tfe/dcm溶液(1/1(v/v))进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液时，除目的肽tfa-meaib-meval-asp-pyrro(化合物2-2＊)的生成外，也检测到tfa酰胺部位的o-甲基化的产物(化合物c1-1)、从其进行水解的h-aib-meval-asp-pyrro(化合物c1-2)。lc图如图2。
[0930]
目的肽tfa-meaib-meval-asp-pyrro(化合物2-2＊)
[0931][0932]
lcms(esi)m/z＝495.26(m+h)+
[0933]
保留时间：0.58分钟(分析条件sqdfa05)
[0934]
在tfa酰胺部位o-甲基化的产物(化合物c1-1)
[0935][0936]
lcms(esi)m/z＝495.26(m+h)+
[0937]
保留时间：0.64分钟(分析条件sqdfa05)
[0938]
从化合物c1-1进行水解的h-aib-meval-asp-pyrro(化合物c1-2)
[0939][0940]
lcms(esi)m/z＝385.26(m+h)+
[0941]
保留时间：0.35分钟(分析条件sqdfa05)
[0942]
根据该结果，与文献(org.lett.2013，15，5012-5015)不同，n末端是α，α-二烷基氨基酸时，除n-甲基化外也同时大幅进行o-甲基化，确认引起收率和纯度的降低。该结果与实施例2-2和实施例2-3所示n-选择性甲基化的结果形成对比。
[0943]
比较例2：常规固相合成法中的n-甲基氨基酸后fmoc-aib-oh延伸后，通过进行从fmoc保护改变为ns保护、n末端树脂上的n-甲基化和脱ns，尝试meaib的导入的实验
[0944]
作为与本发明的比较例，通过与文献记载同样的方法(nature protocols 2012，7，3，432-444)，固相合成法中的n-甲基氨基酸后fmoc-aib-oh延伸后，通过进行从fmoc保护改变为ns保护、n末端树脂上的n-甲基化和脱ns，尝试meaib的导入。
[0945][0946]
比较例2-1：对fmoc-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-2)、fmoc-aib-oh的固相中的延伸反应
[0947]
在带有过滤器的反应容器中，在实施例1-2-2中配制的fmoc-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-2)(0.464mmol/g，100mg)中加入二氯甲烷(1ml)，在室温振荡30分钟，进行树脂的膨胀。用过滤器除去二氯甲烷后，将树脂用dmf(1ml)洗涤2次。然后，向树脂加入2％dbu/dmf溶液(脱fmoc溶液：0.7ml)，在室温振荡10分钟，进行脱fmoc。除去脱fmoc溶液后，将树脂用dmf(0.7ml)洗涤4次。
[0948]
对得到的树脂，实施fmoc-aib-oh的延伸反应。
[0949]
延伸反应通过向树脂加入0.6m fmoc-aib-oh/0.375m oxyma/nmp溶液(0.3ml)和10％dic/dmf溶液(0.36ml)的混合溶液、在50度振荡15小时实施。
[0950]
将本延伸反应进一步重复2次。(第2次延伸条件：50度24小时，第3次延伸条件：50度20小时)
[0951]
用过滤器除去延伸反应的液相后，将树脂用dmf(0.7ml)洗涤4次，用二氯甲烷(0.7ml)洗涤4次。
[0952]
为了确认延伸的进行，取出得到的树脂的一部分(～5mg)，对未反应点，用fmoc-gly-oh进行覆盖(capping)。
[0953]
覆盖通过向树脂加入0.6m fmoc-gly-oh/0.375m hoat/nmp溶液(0.3ml)和10％dic/dmf溶液(0.36ml)的混合溶液、在40度振荡45分钟实施。
[0954]
用过滤器除去延伸反应的液相后，将树脂用dmf(0.7ml)洗涤4次，用二氯甲烷(0.7ml)洗涤4次。
[0955]
用tfe/dcm溶液(1/1(v/v))进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液时，可以确认目的肽fmoc-aib-meval-asp-pyrro(化合物c2-1＊)60.4％生成。
[0956][0957]
lcms(esi)m/z＝605.52(m-h)-[0958]
保留时间：2.16分钟(分析条件sqdfa05long)
[0959]
另外，得到的树脂的未反应点用购自供应商的z-gly-oh(n-α-苄氧羰基甘氨酸、cas：1138-80-3)进行覆盖。
[0960]
覆盖通过向树脂加入0.6m z-gly-oh/0.375m hoat/nmp溶液(0.3ml)和10％dic/dmf溶液(0.36ml)的混合溶液、在40度振荡2小时实施。
[0961]
用过滤器除去覆盖反应的液相后，将树脂用dmf(0.7ml)洗涤4次，用二氯甲烷(0.7ml)洗涤4次，得到化合物c2-1。
[0962]
比较例2-2：fmoc-aib-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物c2-1)的脱fmoc和n末端的ns化
[0963]
在带有过滤器的反应容器中，放入比较例2-1中配制的fmoc-aib-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物c2-1)(0.464mmol/g，100mg)，加入二氯甲烷(1ml)在室温振荡30分钟，进行树脂的膨胀。用过滤器除去二氯甲烷后，将树脂用dmf(1ml)洗涤2次。然后，向树脂加入2％dbu/dmf溶液(脱fmoc溶液：0.7ml)在室温振荡10分钟，进行脱fmoc。除去脱fmoc溶液后，将树脂用dmf(1ml)洗涤3次，然后用thf(1ml)洗涤4次。
[0964]
对得到的树脂加入2，4，6-三甲基吡啶(0.062ml，0.464mmol)的thf溶液(0.35ml)和2-硝基苯磺酰氯(0.041g，0.186mmol)的thf溶液(0.35ml)，在40度振荡2小时。
[0965]
用过滤器除去液相后，将树脂用thf(1ml)洗涤次，用二氯甲烷(1ml)洗涤4次。
[0966]
将通过上述的2-硝基苯磺酰氯的ns化进一步重复2次(第2次：40度、振荡16小时，第3次：40度振荡21小时)。
[0967]
为了确认延伸的进行，将得到的树脂的一部分(～5mg)取出，用tfe/dcm溶液(1/1(v/v))进行肽的切割，通过lcms分析切割的溶液时，确认目的肽ns-aib-meval-asp-pyrro(化合物c2-2＊)64.9％生成。
[0968]
将得到的树脂的未反应点用z-gly-oh进行覆盖。
[0969]
覆盖通过向树脂加入0.6m z-gly-oh/nmp溶液(0.3ml)和10％dic/dmf溶液(0.36ml)的混合溶液、在40度振荡2小时实施。
[0970]
用过滤器除去延伸反应的液相后，将树脂用dmf(0.7ml)洗涤4次，用二氯甲烷(0.7ml)洗涤4次，得到ns-aib-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物c2-2)。
[0971][0972]
lcms(esi)m/z＝568.45(m-h)-[0973]
保留时间：0.59分钟(分析条件sqdfa05)
[0974]
比较例2-3：通过对ns-aib-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物c2-2)的ns酰胺部位的光延反应的n-甲基化
[0975]
在带有过滤器的反应容器中，在比较例2-2中配制的ns-aib-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物c2-2)(0.464mmol/g，100mg)中加入二氯甲烷(1ml)，在室温振荡20分钟，进行树脂的膨胀。用过滤器除去二氯甲烷后，将树脂用thf(1ml)洗涤4次。
[0976]
对得到的树脂加入三苯基膦(61.0mg，0.232mmol)和甲醇(19μl、0.464mmol)的thf(0.7ml)溶液，然后加入diad(45μl、0.232mmol)，在40度振荡30分钟。用过滤器除去液相后，将树脂用thf(1ml)洗涤4次，用二氯甲烷(1ml)洗涤4次。
[0977]
将得到的树脂的一部分(～5mg)用tfe/dcm溶液(1/1(v/v))进行从肽的切割，通过lcms分析切割的溶液时，确认目的肽ns-meaib-meval-asp-pyrro(化合物c2-3＊)的生成(从化合物c2-2的转化率是96％)。残余ns-meaib-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物c2-3)在下一次步骤中使用。
[0978][0979]
lcms(esi)m/z＝582.47(m-h)-[0980]
保留时间：0.63分钟(分析条件sqdfa05)
[0981]
比较例2-4：ns-meaib-meval-asp-pyrro树脂(化合物c2-3)的脱ns化
[0982]
在带有过滤器的反应容器中，在比较例2-3中配制的ns-meaib-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物c2-3)(0.464mmol/g，50mg)中加入二氯甲烷(0.5ml)，在室温振荡20分钟，进行树脂的膨胀。用过滤器除去二氯甲烷后，将树脂用nmp(0.5ml)洗涤4次。
[0983]
对得到的树脂加入dbu(17μl、0.115mmol)/nmp溶液(0.35ml)和2-巯基乙醇(16μl、0.230mmol)/nmp溶液(0.30ml)，在室温振荡1小时。用过滤器除去液相后，将树脂用nmp(0.5ml)洗涤4次，用二氯甲烷(0.5ml)洗涤4次。
[0984]
将得到的树脂的一部分(～5mg)用tfe/dcm溶液(1/1(v/v))进行从树脂的切割，通过lcms分析切割的溶液时，如图3，确认进行了脱ns化的目的肽h-meaib-meval-asp-pyrro(化合物c2-4＊)的生成。
[0985][0986]
lcms(esi)m/z＝399.29(m+h)+
[0987]
保留时间：0.34分钟(分析条件sqdfa05)
[0988]
比较例2-5：ns-meaib-mephe-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro的脱ns化
[0989][0990]
在带有过滤器的反应容器中，相对于实施例1-2-3中配制的化合物1-2-3(100mg)，在与比较例2-1～比较例2-3同样的操作中配制的ns-meaib-mephe-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物c2-5-1)(0.464mmol/g，50mg)中加入二氯甲烷(0.5ml)，在室温振荡20分钟，进行树脂的膨胀。用过滤器除去二氯甲烷后，将树脂用nmp(0.5ml)洗涤4次。
[0991]
对得到的树脂加入dbu(17μl、0.115mmol)/nmp溶液(0.35ml)和2-巯基乙醇(16μl、0.230mmol)/nmp溶液(0.30ml)，在室温振荡1小时。用过滤器除去液相后，将树脂用nmp(0.5ml)洗涤4次，用二氯甲烷(0.5ml)洗涤4次。
[0992]
将得到的树脂的一部分(～5mg)用tfe/dcm溶液(1/1(v/v))进行从树脂的切割，通
过lcms分析切割的溶液时，如图4，除进行了脱ns化的目的肽h-meaib-mephe-asp-pyrro(化合物c2-5-2＊)的生成，也检测到推测对ns保护的硝基2-巯基乙醇被本位取代的杂质(化合物c2-5-3＊)。
[0993][0994]
lcms(esi)m/z＝447.31(m+h)+
[0995]
保留时间：0.39分钟(分析条件sqdfa05)
[0996][0997]
lcms(esi)m/z＝661.74(m-h)-[0998]
保留时间：0.65分钟(分析条件sqdfa05)
[0999]
根据这些比较例2的结果，对庞大的n-甲基氨基酸的n末端，可以导入庞大的n-甲基-α，α-二烷基氨基酸(该实例中，meaib)，另一方面，通过包括fmoc-aib的延伸、向ns基的保护基改变的一系列步骤，确认成为低纯度、低收率。此外明确，通过脱ns阶段ns保护基上的副反应，引起纯度降低。确认在文献记载的已知条件，对庞大的n-甲基氨基酸的n末端，以高纯度、高收率导入庞大的n-甲基-α，α-二烷基氨基酸是困难的。
[1000]
参考例：常规固相合成法中的n-甲基氨基酸后fmoc-meaib-oh延伸的尝试
[1001]
参考例1：对fmoc-meval-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-2)、fmoc-meaib-oh的固相中的延伸反应
meaib-meval-asp-pyrro(化合物r1＊)。
[1006][1007]
参考例2：对fmoc-mephe-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-3)、fmoc-meaib-oh的固相中的延伸反应
[1008][1009]
在带有过滤器的反应容器中，加入实施例1-2-3中配制的fmoc-mephe-asp(o-trt(2-cl)-树脂)-pyrro(化合物1-2-3)(0.464mmol/g，100mg)，通过与参考例1同样的操作，尝试fmoc-meaib的延伸。延伸反应在40度实施15小时。
[1010]
其后，通过与参考例1同样的操作，适当进行树脂的洗涤、未反应点的用fmoc-gly-oh的覆盖、从树脂的肽的切割，通过lcms分析切割的溶液时，目的肽fmoc-meaib-mephe-asp-pyrro(化合物r2＊)的生成维持在3.1％。
[1011][1012]
lcms(esi)m/z＝669.43(m+h)+
[1013]
保留时间：0.88分钟(分析条件sqdfa05)
[1014]
以上，根据参考例的结果确认，常规固相合成法(fmoc法)中的n-甲基氨基酸(即，n-取代氨基酸)后fmoc-meaib-oh(即，n-取代-α，α二取代氨基酸)的延伸难度非常高，有得不到作为目的的肽的情况。
[1015]
产业上的可利用性
[1016]
根据本发明发现，在应用固相法的肽化合物的制备中，可以有效率地制备包含n-取代-α，α二取代氨基酸残基与n-取代氨基酸残基连接的二肽残基的肽化合物。本发明在肽合成的领域中有用。