用于治疗骨髓增生性肿瘤的赖氨酸特异性组蛋白脱甲基化酶抑制剂的制作方法

用于治疗骨髓增生性肿瘤的赖氨酸特异性组蛋白脱甲基化酶抑制剂
1.本技术要求于2019年12月9日提交的美国临时申请号62/945,609以及于2020年12月4日提交的美国临时申请号63/121,461的权益，将这两者的全部内容通过引用特此并入，就像完整地写在本文中一样。
2.骨髓增生性肿瘤(mpn)(是包括真性红细胞增多症(pv)、原发性血小板增多症(et)和骨髓纤维化(mf)的疾病类别)属于不同的造血障碍家族，这些造血障碍由多能造血干/祖细胞的获得性体细胞突变引起，导致红细胞、白细胞和血小板生成方面的血液学失调以及脾肿大和全身症状的异常。mpn具有共同的突变，这些突变组成型地改变负责造血的正常生理信号。mpn可能临床上表现为良性克隆性骨髓增生，但起始的异常干/祖细胞易受新突变和表观遗传学改变的影响，这些新突变和表观遗传学改变使得快速演变为伴有骨髓纤维化的骨髓衰竭或转化为急性髓细胞性白血病(aml)。
3.许多mpn患者在诊断时无症状。et、pv和pmf可以彼此伪装，从而混淆最终诊断和预后。通常存在的临床表现包括疲劳、体重减轻、盗汗、发热、呼吸困难和因有时大量脾肿大引起的腹部不适。这三种mpn障碍在表型上重叠，并且甚至与其他髓系肿瘤相似。在90％的mpn患者中发现jak2(jak2
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)中的特异性点突变，以及钙网蛋白(calr)和血小板生成素受体(mpl)中的突变。尽管这些突变在pv、et和原发性mf pmf之间的分布不相等，但它们在诊断上并不能确定具体的mpn或预后，并且它们也不是相互排斥的。健康个体可能携带这些突变中的一种而不发展为mpn，事实上，这些突变中的一些可以作为种系突变携带，从而导致遗传形式的mpn。然而，基于不同的流行病学、天然病史和分子特征，et、pv和pmf各自被视为独立的临床实体。pv是最常见的mpn，并且似乎是jak2中的表型表现突变。pv是唯一以红细胞增多为特征的mpn，定义为血细胞比容≥60％，并且血红蛋白≥20gm/dl。et特征在于持续血小板计数为》450,000/μl，并且主要在女性中出现。mf(原发性或继发性骨髓纤维化，但有时称为伴有骨髓组织异生的骨髓纤维化，原因不明的骨髓组织异生或原发性骨髓硬化)是慢性炎症过程，其中过量胶原沉积在骨髓中，从而损害与骨髓纤维化和髓外造血相关的造血作用。
4.主要并发症由继发于骨髓衰竭的血细胞减少、髓外造血(主要发生在脾脏和肝脏)和演变为急性髓细胞性白血病引起。对患者而言，脾肿大是最令人担忧的原发性骨髓纤维化并发症，这导致机械性不适、营养不足、脾梗塞、门静脉和肺动脉高压以及血细胞扣留。et和pv均与血栓形成并发。et和pv可以发展为mf，以及发展为aml。
5.在mpn中发现的许多其他体细胞突变也存在于骨髓增生异常综合征(mds)和初发aml中；这些突变包括dnmt3a、idh1/2、tet2、asxli、ezh2、tp53、nf1、nras、kras、sf3b1、u2af1、srsf2和runx1中的突变。这种共享的突变谱导致了这些障碍的表型重叠，并且影响其天然病史，包括演变为骨髓衰竭或aml。
6.没有特异性针对原发性骨髓纤维化、原发性血小板增多症或真性红细胞增多症的治疗。当前的治疗不能显著地改变疾病的天然病史，因此当前的治疗主要是为了改善症状。与促红细胞生成素(epo)水平《100mu/ml相关的贫血可能对重组epo治疗有应答，但与肝脾
肿大的增加有关。泼尼松可能对具有活动性炎症或自身免疫性疾病证据的病人有效。高尿酸血症用别嘌醇来控制。非选择性jak1/2抑制剂鲁索替尼被批准用于中风险1和2，以及高风险mf患者和高风险pv患者。在大约50％的患者中，鲁索替尼可有效减缓全身症状，使脾脏大小或体积减小35％。鲁索替尼延长了患有原发性mf(pmf)的高风险患者的生存期，并且降低jak
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等位基因负荷。在一些患者中，鲁索替尼会加重贫血，但即使血小板减少很严重，也可以得到改善。鲁索替尼仅在施用时有效；症状会在停药时复发。骨髓纤维化不受影响，并且鲁索替尼对突变负荷无影响。在大约60％的原发性骨髓纤维化患者中，沙利度胺(以50至100mg/天的剂量)与泼尼松的组合能有效改善贫血和血小板减少，并且使脾脏大小减少大约20％。以减少脾肿大的低剂量干扰素-α可在疾病早期有效，但可引起血细胞减少。聚乙二醇干扰素可以在pv中产生分子缓解，并且在少数患者中逆转pmf的骨髓纤维化。羟基脲的急性毒性发生率较低，但会引起骨髓抑制，并且为具有致白血病性。低剂量烷基化剂可以减轻脏器肿大，逆转骨髓纤维化，并且改善血细胞计数，但只是偶尔有持久的效果；烷基化剂可以引起严重的骨髓抑制，并且具有致白血病性。唯一有潜力的治愈性治疗是同种异体骨髓移植，适用于年龄小于65岁、具有中等2级或高dipss评分、有匹配供体的患者。干细胞移植的五年存活率平均值为大约50％。
7.dna的表观遗传修饰，如胞嘧啶的甲基化或组蛋白的翻译后修饰，如甲基化和乙酰化，通过改变染色质结构而影响基因表达。基因表达模式的变化有可能改变给定细胞的表型。dnmt3a和tet2中的突变与dna中胞嘧啶的正常甲基化模式的变化相关，而jak2、ezh2和asxli中的突变改变了组蛋白的甲基化、乙酰化和磷酸化状态：这些种类变化都改变了正常基因表达程序的模式。编码影响细胞表观遗传状态的蛋白质的基因的突变表明，针对此类蛋白质的酶功能，可以选择性地消除恶性干细胞/原生细胞克隆和/或恢复其正常表型。
8.赖氨酸特异性脱甲基化酶1(lsd1，也称为kdm1a)是从组蛋白(h)h3去除关键赖氨酸(k)(k4和k9)处的单甲基基团和二甲基基团的酶(shi等人,2004)。组蛋白h3k4和h3k9的甲基化是与基因的速率变化相关的翻译后修饰。通过改变染色质的局部状态，lsd1是基因表达的表观遗传调节因子。组蛋白h3上的赖氨酸(k)位点和那些位点上的甲基化程度(1、2或3个甲基基团)与特定的功能有关，例如，增强子和超级增强子的特征在于h3k4me1标记，而h3k4me2则常发现于活跃转录基因的近端启动子和增强子中。
9.lsd1通过直接与dna结合的蛋白质机构(一般是tf)被定位在基因组的三个一般区域：增强子和超级增强子、近端启动子和转录单元的内部区域。许多tf，包括激活因子(如v-myb禽成髓细胞性白血病病毒癌基因同源物(myb)和类固醇激素受体)以及抑制因子(如生长因子独立1转录抑制因子(gfi1))，都会将lsd1募集至特定的基因组位置。lsd1是更大的蛋白质复合物的一部分，含有例如co-re 1沉默转录因子(corest)或核小体重塑和组蛋白脱乙酰酶(nurd)，它们决定了细胞特异性染色质重塑。这些复合物还可能包括dnmt1和组蛋白脱乙酰酶1、2和3(hdac1、2和3)活性，所有这些物质都有助于维持或修饰该基因组位点的表观遗传状态。因此，除自身酶活性外，lsd1的重要特性是其作为其他表观遗传酶支架的功能，这些表观遗传酶被共募集至基因组位点。在许多组蛋白脱甲基化酶中，lsd1独特地利用黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)以在产生h2o2和甲醛的过程中氧化去除一个或两个甲基基团。因此，fad是lsd1活性的重要辅助因子。其他33个组蛋白赖氨酸脱甲基化酶(jumonji类型)利用铁依赖性机制来去除组蛋白赖氨酸中的甲基基团。
10.lsd1是必需基因；lsd1活性的丧失会导致早期胚胎死亡。也需要该蛋白用于调节自我更新和增殖之间的平衡。使用多西环素诱导的短发夹lsd1(shlsd1)进行的条件性体内lsd1敲低(kd)确立了lsd1为造血干细胞(hsc)和骨髓祖细胞的中心调节因子。lsd1 kd导致严重的但可逆转的血小板减少、嗜中性白血球减少和贫血；单核细胞数量增加。27天的lsd1 kd导致循环多能祖细胞(mpp)和hsc的增加，伴随趋化因子(c-x-c基序)受体4(cxcr4)的下调，但不影响休眠hsc池的规模。使用诱导性cre系统在lsd1切除12周后的长期hsc中观察到自我更新受损(mx1cre小鼠x lsd1fl/fl小鼠)，与lsd1抑制驱动分化一致。
11.lsd1在调节从多能性至终末分化的进展中起着关键作用。通过“主”转录因子八聚体结合转录因子4(oct4)、sry(性别决定区y)盒2(sox2)、nanog以及共激活因子介质(mediator)将lsd1募集至对正常发育至关重要的基因的“高置信度”启动子和超级增强子。尽管对维持胚胎干细胞(esc)状态并非必不可少，但作为nurd复合物的一部分，lsd1“停止使用”指导多能性程序的基因的增强子，从而允许esc分化。随着细胞向分化更强的细胞状态转变，lsd1对于esc基因表达程序的完全关闭至关重要。lsd1在esc中发挥的作用在现象上与lsd1在骨髓造血过程中发挥的重要作用相似，在骨髓造血过程中，在产生干细胞基因表达特征的hsc中活跃的增强子也被“停止使用”，从而使祖细胞向特定的骨髓系定型。谱系特异性祖细胞终末分化所必需的增强子准备好被h3k4me1标记激活，而启动子特征在于h3k4进行性甲基化，形成h3k4me3。增强子h3k27乙酰化锁定转录激活和谱系定型。与分化期间需要稳定的h3k4甲基化一致，随着骨髓分化进入终末细胞状态，lsd1表达显著降低。lsd1酶位于髓系造血的顶点。lsd1可防止干细胞和髓系祖细胞发生髓系分化，但随着细胞向特定髓系谱系(红系、粒细胞和巨核细胞)定型，lsd1会下调。在急性髓细胞性白血病细胞中抑制lsd1会造成干细胞潜能丧失(克隆发生)，并伴随诱导分化为更成熟的单核细胞免疫表型。在骨髓增生性肿瘤的小鼠模型中，用lsd1抑制剂治疗可以减少突变体祖细胞群体，这与lsd1在维持自我更新表型中发挥的作用一致。
12.作为调节骨髓成熟的关键因子，lsd1适合作为多种骨髓增生性肿瘤的靶标。存在以下三种主要的可以用lsd1抑制剂治疗的骨髓增生性肿瘤：真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、原发性骨髓纤维化(或继发于pv和et的骨髓纤维化)；其他mpn在下文中披露，并且也可通过本文披露的方法治疗。其他mpn包括所有开始于造血干细胞/祖细胞发生体细胞突变而导致的克隆性障碍的mpn。这些相关疾病之间的临床重叠反映在它们共有的体细胞突变遗传谱中，包括jak2、dnmt3a、mpl、calr以及asxl1中的突变。在骨髓纤维化(jak2
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和mpl
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)的小鼠模型中，lsd1的抑制导致疾病的五个参数显著改善：血小板减少、脾肿大减少、红细胞计数减少、骨髓纤维化消退和突变体细胞负荷减少。
13.在bcr-abl阴性骨髓增生性肿瘤中，原发性骨髓纤维化和pv/et后骨髓纤维化(ppv-mf和pet-mf)与最高程度的发病率和死亡率相关，包括进行性骨髓(bm)纤维化和由此导致的bm衰竭。即使jak抑制剂鲁索替尼目前被批准用于治疗mf相关的脾肿大和全身症状，但jak抑制剂疗法并未减少mpn患者的jak2突变体细胞群体。jak抑制在mpn患者中诱导具有临床意义的分子应答的能力有限，这强调了需要开发更有效的用于这些jak激酶/stat依赖性恶性肿瘤的疗法。
14.最近的研究已表明，赖氨酸特异性组蛋白脱甲基化酶lsd1(kdm1a)通过影响状态特异性基因表达模式，参与造血干细胞/祖细胞在体内增殖和分化之间的平衡。在生理性造
血中，lsd1对影响红系、巨核细胞和粒细胞谱系的正常骨髓分化至关重要，但对单核细胞/树突谱系没有影响。lsd1的小分子抑制剂已在急性髓细胞性白血病(aml)和实体癌的临床前模型中呈现出有希望的结果，并且最近已进入aml的临床试验。然而，lsd1在mpn发病机理中的作用和需要，以及lsd1在mpn中的治疗靶向是当前研究的领域。
15.wo 2012/107498披露了某些lsd1抑制剂治疗费城染色体阴性骨髓增生性障碍原发性血小板增多症、骨髓纤维化、以及真性红细胞增多症的用途。us 2016/0257662和us 2016/0237043披露了抑制lsd1的化合物。us 2019/0070172披露了这些化合物和其他化合物在治疗骨髓增生性肿瘤(包括et、mf和pv)中的效用。
16.然而，仍需要有效的lsd1抑制剂，该抑制剂经证明能够治疗骨髓纤维化和其他骨髓增生性肿瘤及伴随症状，并且在治疗骨髓纤维化和其他骨髓增生性肿瘤时达到特定的临床相关终点，同时避免严重的副作用，如重度血小板减少症。
附图说明
17.图1示出了用lsd1抑制剂化合物1治疗的患者从治疗第0天至第84天的脾脏体积变化。
18.图2示出了用lsd1抑制剂化合物1治疗的患者从治疗第0天至第84天的mpn-10评分的变化。
19.图3比较了用lsd1抑制剂化合物1的治疗与最佳可用治疗(bat)从治疗第0天到第84天的脾脏体积应答(svr)和总症状评分(tss)方面的变化。
20.图4示出了在用lsd1抑制剂化合物1治疗的过程中第12周炎性细胞因子s100a9的变化。
21.图5示出了在用lsd1抑制剂化合物1治疗的过程中第12周炎性细胞因子rantes的变化。
22.图6示出了在用lsd1抑制剂化合物1治疗的过程中第12周炎性细胞因子il-8的变化。
23.图7示出了在用lsd1抑制剂化合物1治疗的过程中第12周循环生长因子vegf的变化。
24.图8示出了在用lsd1抑制剂化合物1治疗的过程中第12周循环生长因子pdgf-bb的变化。
25.图9是化合物1对lsd1抑制的治疗理论的示意图。
26.图10示出了六名经lsd1抑制剂化合物1治疗的患者中f细胞的百分比。
27.图11示出了(i)第0天至(ii)12周(a)mpn saf tss和(b)脾脏体积的绝对变化。
28.图12示出了代表性患者的治疗进展。(a)lsd1抑制剂的每日剂量，mg；(b)脾脏大小，cm；(c)症状评分；(d)血小板(左刻度，k/ul)和血红蛋白(右刻度)；(e)wbc和嗜中性粒细胞；以及(f)疲劳评分(10＝最严重)。
具体实施方式
29.本文提供了用于治疗有需要的受试者的骨髓增生性肿瘤的方法，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。
30.还提供了用于抑制有需要的受试者的恶性髓样细胞增殖的方法，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。
31.还提供了用于减少有需要的受试者的由骨髓细胞分泌的一种或多种蛋白质生长因子的浓度的方法，这些骨髓细胞激活一种或多种分泌网硬蛋白和胶原的细胞类型，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。
32.在某些实施例中，该一种或多种蛋白质生长因子选自血小板源生长因子、血管内皮生长因子、转化生长因子β1、以及血小板因子4(又名cxcl4)。
33.在某些实施例中，这些激活一种或多种分泌网硬蛋白和胶原的细胞类型的骨髓细胞是巨核细胞。
34.在某些实施例中，一种或多种分泌网硬蛋白和胶原的细胞类型选自基质细胞和/或骨髓驻留的成纤维细胞和/或肌成纤维细胞。
35.还提供了用于减少有需要的受试者的由骨髓细胞分泌的一种或多种蛋白质生长因子的浓度的方法，这些骨髓细胞损害骨髓破骨细胞减少骨髓骨硬化的量的功能，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。
36.在某些实施例中，该受试者中的损害骨髓破骨细胞减少骨髓骨硬化量的功能的骨髓细胞是巨核细胞。
37.还提供了用于减少有需要的受试者的网硬蛋白和胶原骨髓纤维化的方法，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。
38.还提供了用于减少有需要的受试者的一种或多种炎性细胞因子的血浆水平的方法，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。
39.还提供了用于减少有需要的受试者的由髓样细胞的突变等位基因频率测量的恶性细胞负荷的方法，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。
40.还提供了用于消除有需要的受试者的恶性髓样细胞的方法，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。
41.还提供了用于减少有需要的受试者的病理性升高的红细胞质量的方法，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。
42.还提供了用于减小有需要的受试者的异常脾脏大小或体积的方法，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。
43.还提供了用于减少有需要的受试者的髓外造血量的方法，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。
44.还提供了用于改善有需要的受试者的由经验证的患者报告的qol评估测量的生活质量(qol)的方法，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。
45.还提供了用于减少有需要的受试者的由经验证的患者报告的症状评估表测量的骨髓纤维化的全身症状的方法，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。
46.还提供了用于延长有需要的患有骨髓纤维化的受试者的寿命的方法，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。
47.还提供了用于延迟或预防有需要的受试者的骨髓纤维化向急性髓细胞性白血病进展的方法，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。
48.还提供了用于减少有需要的受试者的血小板计数的方法，该方法包括施用治疗有
效量的lsd1抑制剂。
49.还提供了用于使有需要的受试者的骨髓细胞构成减少至具有少于5％母细胞的年龄标化正常细胞构成的方法，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。
50.还提供了用于维持有需要的受试者的骨髓母细胞计数或使骨髓母细胞计数减少至《5％的方法，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。
51.还提供了用于使mf患者的血红蛋白增加至》100g/l的方法，该方法包括施用治疗有效量的lsd1抑制剂。
52.还提供了用于减少有需要的受试者的血栓形成和出血的频率的方法，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。
53.还提供了用于减少有需要的受试者的红细胞的输注频率的方法，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。
54.还提供了用于a)使患有pv的男性患者的血细胞比容降低至《45％，或使患有pv的女性患者的血细胞比容降低至≤42％，b)使pv患者的血红蛋白水平降低至《160g/l，和/或c)使pv患者的红细胞质量减少至≤5.2m/ml的方法，任一方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。
55.在上述每种方法的某些实施例中，lsd1抑制剂是n-[(2s)-5-{[(1r,2s)-2-(4-氟苯基)环丙基]氨基}-1-(4-甲基哌嗪-1-基)-1-氧代戊-2-基]-4-(1h-1,2,3-三唑-1-基)苯甲酰胺,双甲苯磺酸盐(“化合物1”)。
[0056]
本文还提供了治疗受试者的骨髓增生性肿瘤且达到血小板计数为约50x109至约100x109个血小板/l的方法，该方法包括：施用起始剂量为0.5mg/kg/d的化合物1；约一周后，评估该受试者的血小板计数；如果血小板计数≥90x109个血小板/l，并且较先前访视的血小板减少％《50％，则添加0.2mg/kg/d的化合物1至每日剂量；如果血小板计数≥90x109个血小板/l，并且较先前访视的血小板减少％≥50％，则添加0.1mg/kg/d的化合物1至每日剂量；如果血小板计数在40x109个血小板/l和89x109个血小板/l之间，则维持当前化合物1的每日剂量；如果血小板计数在25x109个血小板/l和39x109个血小板/l之间，则将当前化合物1的mg/kg每日剂量降低25％；如果血小板计数《25x109个血小板/l，则停止给药直至血小板恢复至》50x109个血
小板/l，然后以当血小板计数低于25x109个血小板/l施用的剂量的50％施用化合物1；以及任选地，大约每周重复血小板计数评估和剂量调整步骤，直至该受试者的血小板计数为约50x109至约100x109个血小板/l。
[0057]
在某些实施例中，有需要的受试者患有骨髓增生性肿瘤。
[0058]
在某些实施例中，骨髓增生性肿瘤是骨髓纤维化(mf)。
[0059]
在某些实施例中，骨髓纤维化选自原发性骨髓纤维化(pmf)、pv后骨髓纤维化(ppv-mf)、以及et后骨髓纤维化(pet-mf)。
[0060]
在某些实施例中，骨髓纤维化是原发性骨髓纤维化(pmf)。
[0061]
在某些实施例中，骨髓增生性肿瘤是真性红细胞增多症(pv)。
[0062]
在某些实施例中，骨髓增生性肿瘤是原发性血小板增多症(et)。
[0063]
在某些实施例中，所述受试者或该受试者的恶性髓样细胞在选自以下的一种或多种基因中具有突变：janus激酶2(jak2)、骨髓增生性白血病病毒癌基因(mpl)和钙网蛋白(calr)。
[0064]
在某些实施例中，该方法进一步包括以下步骤：确定所述受试者是否在选自以下的一种或多种基因中具有突变：janus激酶2(jak2)、骨髓增生性白血病病毒癌基因(mpl)和钙网蛋白(calr)。
[0065]
在某些实施例中，化合物1的治疗有效且无害量是足以使患有骨髓纤维化的受试者维持血小板计数为约50x109至约100x109个血小板/l的量，或下文另外说明的量。在某些实施例中，化合物1的治疗有效且无害量是足以使受试者的血小板计数维持在约50x109至约75x109个血小板/l的量。
[0066]
在某些实施例中，化合物1的治疗有效且无害量是足以使患有原发性血小板增多症的患者维持血小板计数低于400x109的量，或下文另外说明的量。
[0067]
在某些实施例中，化合物1的治疗有效且无害量是足以使患有pv的患者维持血小板计数为约150x109至约250x109个血小板/l的量，或下文另外说明的量。
[0068]
在某些实施例中，化合物1的治疗有效且无害量为约0.5mg/kg/d至约1.5mg/kg/d。
[0069]
在某些实施例中，化合物1的治疗有效且无害量为约0.7mg/kg/d至约1.2mg/kg/d。
[0070]
在某些实施例中，化合物1的治疗有效且无害量为每天约40mg至每天约100mg。
[0071]
在某些实施例中，化合物1的治疗有效且无害量为每天约50mg至每天约85mg。
[0072]
在某些实施例中，向该受试者施用起始剂量为0.5mg/kg/d的化合物1，然后一周后：如果血小板计数≥90x109个血小板/l，并且较先前访视的血小板减少％《50％，则调整该受试者的剂量以添加0.2mg/kg/d的化合物1至每日剂量；如果血小板计数≥90x109个血小板/l，并且较先前访视的血小板减少％≥50％，则调整该受试者的剂量以添加0.1mg/kg/d的化合物1至每日剂量；如果血小板计数在40x109个血小板/l和89x109个血小板/l之间，则维持化合物1的每日剂量；如果血小板计数在25x109个血小板/l和39x109个血小板/l之间，则调整受试者的剂量以将当前化合物1的mg/kg每日剂量降低25％；如果血小板计数为《25x109个血小板/l，则停止给药直至血小板恢复至》50x109个
血小板/l，然后调整受试者的剂量以在当血小板计数低于25x109个血小板/l施用的剂量的50％下施用化合物1；以及任选地，在整个治疗过程中大约每周重复血小板计数评估和剂量调整步骤，直至该受试者的血小板计数为约50x109至约100x109个血小板/l。
[0073]
还提供了治疗有需要的受试者的骨髓增生性肿瘤的方法，其中该受试者具有突变等位基因，所述方法包括：向该受试者施用一定量的n-[(2s)-5-{[(1r,2s)-2-(4-氟苯基)环丙基]氨基}-1-(4-甲基哌嗪-1-基)-1-氧代戊-2-基]-4-(1h-1,2,3-三唑-1-基)苯甲酰胺,双甲苯磺酸盐(“化合物1”)。
[0074]
在某些实施例中，突变等位基因是选自以下的一种或多种基因的等位基因：janus激酶2(jak2)(如jak
v617f
)，骨髓增生性白血病病毒癌基因(mpl)(如mpl
w515k
)，以及钙网蛋白(calr)(如calr
52b_del
、calr
k385ncx
、或calr
kkrk374x
)。
[0075]
在某些实施例中，突变等位基因是选自以下的一种或多种基因的等位基因：dnmt3a、idh1/2、tet2、asxli、ezh2、tp53、nf1、nras、kras、sf3b1、u2af1、srsf2、runx1、cbl、zbtb33、prpf8、cntn5、frem2、map1b、以及gpr183。
[0076]
在某些实施例中，突变等位基因是以下中的一种或多种：asxl1
hhchreaa630x
、asxl1-642x
、asxl1
q780*
、asxl1
r693
、asxl1-884x*
、asxl1-642x
、asxl1
qll695hx
、以及asxl1
q768*
。
[0077]
在某些实施例中，突变等位基因是细胞分裂1样1中染色体的生物定向(bod1l1)基因的等位基因。
[0078]
在某些实施例中，突变等位基因是以下中的一种或多种：bod1l1
s1623c
、bod1l1
e1612k
、bod1l1
k1136n
、bod1l1
r1074w
、bod1l1
y812c
、bod1l1
e289k
、以及bod1l1
r508s
。缩写与定义
[0079]
为了有助于对本披露的理解，如本文所用的大量术语和缩写在下文定义如下：
[0080]
当介绍本披露或其一个或多个优选实施例的要素时，冠词“一个/一种”、“该”和“所述”旨在意指这些要素中的一个或多个。术语“包括”、“包含”和“具有”旨在是包含性的，并且意指可能存在除所列元素之外的其他元素。
[0081]
如本文所用，当术语“和/或”在两个或更多个项目的清单中使用时，意指所列出项目中的任何一项可以单独采用，或与所列出项目中的任何一项或多项组合采用。例如，表述“a和/或b”旨在意指a和b中的任一者或两者，即，单独的a、单独的b，或者a与b组合。表述“a、b和/或c”旨在意指单独的a、单独的b、单独的c、a与b组合、a与c组合、b与c组合、或者a、b与c组合。
[0082]
如本文所用，术语“约”当指代可测量的值，如化合物的量、剂量、时间、温度等时，意在涵盖指定量的20％、10％、5％、1％、0.5％或甚至0.1％的变化。
[0083]
如本文所用，药物的“治疗有效量”是消除、减缓或为其所施用的疾病或疾病症状提供缓解的药物或其药学上可接受的盐的量。
[0084]
如本文所用，药物的“无害量”是指不产生剂量限制毒性或副作用的药物或其药学上可接受的盐的量。这种毒性/副作用的一个实例是贫血(血红蛋白《8克/dl)、重度血小板减少症(血小板计数《25k/ul)、或严重的粒细胞减少(绝对嗜中性粒细胞计数《0.5k/ul)。
[0085]
如本文所用，“有需要的受试者”是表现出疾病的一种或多种症状或指标的人或非人动物。
[0086]
当披露值范围以及使用符号“从n1…
至n
2”或“在n1…
与n2之间”(其中n1和n2是数字)时，则除非另外说明，否则此符号旨在包括这些数字本身以及它们之间的范围。此范围可以是整的或在这些端值之间连续的并且包括这些端值。通过举例，范围“从2至6个碳”旨在包括两个、三个、四个、五个以及六个碳，因为碳以整数单位出现。通过举例，将范围“从1至3μm(微摩尔)”(旨在包括1μm、3μm和介于两者之间的所有数)与有效数字的任何数字(例如，1.255μm、2.1μm、2.9999μm等)进行比较。当n在“0个碳原子”的上下文中被设定为0时，旨在表示化学键或无。
[0087]
不对称中心存在于本文披露的化合物中。这些中心由符号“r”或“s”指定，取决于手性碳原子周围的取代基的构型。应当理解，本发明涵盖所有立体化学异构体形式，包括非对映异构体、对映异构体和差向异构体形式，连同d-异构体和1-异构体，以及它们的混合物。化合物的单独立体异构体可以从可商购的含有手性中心的起始物质合成制备，或通过制备对映异构体的产物的混合物随后分离，如转化为非对映异构体的混合物随后分离或重结晶、色谱技术、在手性色谱柱上直接分离对映异构体，或本领域已知的任何其他适当的方法来制备。特定立体化学的起始化合物是可商购的，或可以通过本领域已知的技术进行制备并拆分。另外，本文披露的化合物可以作为几何异构体存在。本发明包括所有顺式、反式、同式、逆式、异侧(e)和同侧(z)异构体，以及它们的适当混合物。另外，化合物可以作为互变异构体存在；本发明提供了所有互变异构的异构体。另外，本文披露的化合物可以按非溶剂化形式以及与药学上可接受的溶剂如水、乙醇等的溶剂化形式存在。通常，认为溶剂化形式等效于非溶剂化形式。
[0088]
如本文所用，术语“疾病”旨在大体与术语“障碍”和“病症”(如在医学症状中)同义并且可与之互换使用，因为所有这些都反映了人体或动物体或其中一部分的、损伤正常功能并且使人类或动物的寿命期限缩短或生活质量下降的异常状况，典型地表现为区别体征和症状。
[0089]
术语“组合疗法”意指施用两种或更多种治疗剂来治疗本披露内容中所述的治疗的病症或障碍。这种施用涵盖以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂，如在具有固定比率活性成分的单个胶囊中或者在针对每种活性成分的多个分开的胶囊中。此外，这种施用还涵盖以依次的方式使用每种类型的治疗剂。在任一情况下，治疗方案将在治疗本文所述的病症或障碍中提供药物组合的有益作用。
[0090]
术语“治疗学上可接受的”是指适合与患者组织接触而不产生过度毒性、刺激和变应性应答，与合理的受益/风险比相称且可有效用于预期用途的那些化合物(或盐、前药、互变异构体、两性离子形式等)。
[0091]
如本文所用，提及“治疗”患者旨在包括预防。术语“患者”意指包括人类的所有哺
乳动物。患者的实例包括人类、牛、狗、猫、山羊、绵羊、猪、以及兔子。优选地，患者是人。
[0092]
术语“前药”是指在体内变得更具活性的化合物。本文披露的某些化合物也可以作为前药存在，如hydrolysis in drug and prodrug metabolism:chemistry,biochemistry,and enzymology[药物和前药代谢中的水解：化学、生物化学和酶学](testa,bernard和mayer,joachim m.wiley-vhca[威立-vhca出版社],瑞士苏黎世(zurich,switzerland)2003)中所述。本文所述化合物的前药是以下化合物的结构改良型：该化合物在生理条件下容易进行化学变化来提供该化合物。另外，在离体环境中，通过化学方法或生化方法可以将前药转变成该化合物。例如，当前药置于经皮贴片贮器内部时用合适的酶试剂或化学试剂可以将前药缓慢地转变成化合物。因为在一些情况下前药可以比化合物或母体药物更容易施用，所以它们经常是有用的。例如，它们可以是通过口服施用而生物可利用的，而母体药物却不行。前药还可以在药物组合物中具有改进的优于母体药物的溶解性。本领域已知多种前药衍生物，如依赖于前药的水解切割或氧化激活的那些。前药的实例是(但不限于)作为酯(该“前药”)施用的化合物，但是然后代谢水解为羧酸，即活性实体。另外的实例包括化合物的肽基衍生物。
[0093]
本文披露的化合物可以作为治疗学上可接受的盐存在。本发明包括以上以盐形式列出的化合物，该盐形式包括酸加成盐。合适的盐包括与有机酸或无机酸形成的那些。此类酸加成盐通常是药学上可接受的。然而，非药学上可接受的盐的盐可以在所讨论的化合物的制备和纯化中是有效用的。也可以形成碱加成盐，并且是药学上可接受的。对于盐的制备和选择的更完整的讨论，参考以下文献：pharmaceutical salts:properties,selection,and use[药用盐：特性、选择与使用](stahl,p.heinrich.wiley-vhca[威立-vhca出版社],瑞士苏黎世,2002)。
[0094]
如本文所用，术语“治疗上可接受的盐”表示本文披露的化合物的盐或两性离子形式，其是水溶性的或油溶性的或可分散的并且是如本文所定义的治疗上可接受的。这些盐可以在化合物的最后分离和纯化期间制备，或是通过游离碱形式的适当的化合物与合适的酸反应分开地制备。代表性酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、l-抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐(benzenesulfonate，besylate)、重硫酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、二葡萄糖酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、龙胆酸盐、戊二酸盐、甘油磷酸盐、乙醇酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、马尿酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟乙磺酸盐(羟乙基磺酸盐)、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、dl-扁桃酸盐、均三甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、焦谷氨酸盐、琥珀酸盐、磺酸盐、酒石酸盐、l-酒石酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。并且，可以将本文披露的化合物中的碱性基团用甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物；二甲基、二乙基、二丁基和二戊基的硫酸酯；癸基、月桂基、豆蔻基和甾醇基的氯化物、溴化物和碘化物；以及苄基和苯乙基的溴化物进行季铵化。可以采用以形成治疗上可接受的加成盐的酸的实例包括无机酸(如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸)以及有机酸(如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸)。盐还可以通过这些化合物与碱金属或碱土离子的配位形成。因此，本发明设想了本文所披露化合物的钠盐、钾盐、镁盐和钙盐等。
[0095]
碱加成盐可以在化合物最后的分离和纯化期间，通过让羧基基团与合适的碱(如
金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)反应，或者与氨或者有机伯、仲或叔胺反应而制备。治疗上可接受的盐的阳离子包括锂、钠、钾、钙、镁和铝，以及无毒季胺阳离子如铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺、乙胺、三丁胺、吡啶、n,n-二甲基苯胺、n-甲基哌啶、n-甲基吗啉、二环己胺、普鲁卡因、二苄胺、n,n-二苄基苯乙胺、1-二苯羟甲胺和n,n'-二苄基乙二胺。可用于形成碱加成盐的其他代表性有机胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶和哌嗪。
[0096]
化合物的盐可以通过使适当的游离碱形式的化合物与适当的酸反应来制备。
[0097]
本文所披露的化合物可以按多晶型物和其他不同的固体形式(如溶剂化物、水合物等)存在。化合物可以是盐或游离碱或酸的多晶型物、溶剂化物或水合物。
[0098]
术语“骨髓增生性肿瘤”(mpn)是指当由于激活控制白细胞或红细胞、或血小板的产生的激素信号传导途径的体细胞突变，身体制备太多这些类型的细胞时，发生的血癌。它们是“造血干细胞的克隆性疾病”，因为肿瘤细胞产生于源自骨髓细胞的单突变克隆(campregher等人,rev bras hematol hemoter.[巴西血液学和血液疗法杂志]2012；34(2):150-5)。mpn包括真性红细胞增多症(pv)、骨髓纤维化(包括原发性骨髓纤维化(pmf，在某些实施例中，包括纤维化前/早期和明显的纤维化阶段)和pv/et后骨髓纤维化(ppv-mf和pet-mf))，原发性血小板增多症(et)，慢性嗜中性粒细胞白血病(cnl)，慢性嗜酸细胞白血病(cel-nos)和慢性髓细胞性白血病(cml)，以及其他无法分类的mpn。mpn和相关髓系肿瘤与以及急性白血病，以及pv、et、pmf和其他mpn诊断标准的更详尽讨论，参见arber等人“the 2016revision to the world health organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia[世界卫生组织对髓系肿瘤和急性白血病分类的2016年修订版]”,blood[血液],2016,127(20):2391-2405。对于骨髓纤维化诊断和应答标准的详细讨论，参见tefferi a等人,“revised response criteria for myelofibrosis:international working group-myeloproliferative neoplasms research and treatment(iwg-mrt)and european leukemianet(eln)consensus report[修订的骨髓纤维化应答标准：国际工作组-骨髓增生性肿瘤研究与治疗(iwg-mrt)以及欧洲白血病网(eln)共识报告]”blood[血液],122(8):1395-98(2013)。
[0099]
以下缩写可在整个说明书中使用，并具有指定的含义。
配制品
[0100]
虽然本文披露的化合物可能作为原料化学品施用，但是还可能将它们呈现为药物配制品(等同地，“药物组合物”)。因此，本文提供了药物配制品，这些药物配制品包含本文披露的某些化合物中的一种或多种，或者其一种或多种药学上可接受的盐、酯、前药、酰胺或溶剂化物，以及一种或多种其药学上可接受的载体和任选地一种或多种其他治疗成分。这种或这些载体必须在与配制品的其他成分相容且对于其接受者无害的意义上是“可接受的”。适当的配制品取决于所选择的施用途径。任何熟知的技术、载体和赋形剂可以适合地使用并且如本领域已知的那样使用；例如，在remington’s pharmaceutical sciences[雷明顿药物科学]中。本文披露的药物组合物可以用本领域已知的任何方式制造，例如通过常规的混合、溶解、造粒、造糖衣丸、磨细、乳化、包囊、包埋或压片方法。
[0101]
配制品包括适用于以下各项的那些：口服、肠胃外(包括皮下、真皮内、肌内注射、静脉内、关节内、脂肪内(intraadiposal)、动脉内、颅内、病灶内、鼻内、眼内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、直肠内、鞘内、气管内、肿瘤内、脐静脉内、阴道内、囊内、玻璃体内、和髓内)、腹膜内、直肠、局部(topical)(包括但不限于：真皮、口腔、舌下、阴道、直肠、鼻、耳和眼)、局灶(local)、粘膜、舌下、皮下、透粘膜、透真皮、透口腔、透真皮、和阴道；脂质体、在乳膏中、在脂质组合物中、经由导管、经由灌洗、经由连续输注、经由输注、经由吸入、经由注射、经由局部递送、通过局部灌注、直接浸浴靶细胞、或其任何组合。尽管施用的最合适的途径可以取决于例如接收者的病症和障碍。配制品可以方便地以单位剂型呈现，并且可以通过配药学领域熟知的任何方法来制备。典型地，这些方法包括使本文披露的化合物或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、前药或溶剂化物(“活性成分”)与构成一种或多种辅助成分的载体混合的步骤。通常，配制品通过以下方式制备：均匀且密切地使活性成分与液体载体或细粉碎的固体载体或与这两者混合，并且然后如果需要的话，使产物成形为所希望的配制品。
[0102]
适用于口服施用的本文披露的化合物的配制品可以离散单元呈现，如各自含有预定量活性成分的硬或软胶囊、薄片、扁囊剂或片剂；以粉末或颗粒呈现；以在水性液体或非水性液体中的糖浆剂、酏剂、溶液或悬浮液呈现；或以水包油液体乳液、油包水液体乳液、或在脂质体中分散的化合物呈现。活性成分也可以大丸剂、药糖剂或糊剂呈现。
[0103]
可以口服使用的药物制剂类包括片剂、由明胶制成的推入配合式(push-fit)胶囊、以及由明胶和增塑剂(如甘油或山梨醇)制成的密封式软胶囊。可以通过任选地与一种
或多种辅助成分一起压制或模制来制造片剂。可以通过在合适的机器中压制处于自由流动形式(如粉末或颗粒)的活性成分来制备压制片，该活性成分任选地与粘合剂、惰性稀释剂或润滑剂、表面活性剂或分散剂混合。模制片可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物来制备。这些片剂可以任选地被包衣或刻痕，并且可以被配制以提供其中活性成分的延迟的、缓慢或受控释放或吸收。组合物可以进一步包含增强溶解性和分散性的治疗剂。所有用于口服施用的配制品应以适合于这种施用的剂量使用。推入配合式胶囊可以含有与填充剂(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)和/或润滑剂(如滑石或硬脂酸镁)以及任选地稳定剂配混的活性成分。在软胶囊中，可以将活性化合物溶解或悬浮在合适的液体如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。此外，可以添加稳定剂。糖衣丸的芯具有合适的包衣。为此目的，可以使用浓缩的糖溶液，这些溶液可以任选地含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料添加到片剂或糖衣丸包衣中，以用于鉴别或表征活性化合物剂量的不同组合。
[0104]
依据施用途径，可将化合物或其颗粒剂或颗粒包被于物质中以保护化合物免受可能导致这些化合物失活的酸和其他自然条件的作用。
[0105]
可以配制这些化合物用于通过注射进行肠胃外施用，例如，通过向身体或向疾病或伤口的位点弹丸式注射或连续输注。用于注射的配制品可以以单位剂型而存在，例如在添加有防腐剂的安瓿中或在多剂量容器中。这些组合物可以呈如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。配制品可存在于单位剂量或多剂量容器(例如，密封的安瓿和小瓶)中，并且可以以粉末形式储存或在冷冻干燥(冻干)条件下储存，只需要在使用前即时添加无菌液体载剂(例如，盐水或无菌的无热原水)。临时注射溶液和悬浮液可以由先前描述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
[0106]
用于肠胃外施用的配制品包括活性化合物的水性和非水性(油性)无菌注射溶液，这些活性化合物可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使配制品与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油(如芝麻油)或合成的脂肪酸酯(如油酸乙酯或甘油三酯)，或脂质体。水性注射悬浮液可以含有增加悬浮液的粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许对高度浓缩的溶液进行制备的试剂。为了通过除胃肠外施用以外的其他途径施用治疗化合物，可能必需用防止化合物失活的物质对其进行包衣或者将化合物与物质一起共施用(例如，通过脂质体配制品)。
[0107]
应当理解，除了上文特别提及的成分外，上述配制品还可以包括本领域中考虑到所讨论配制品的类型的其他常规试剂，例如适合于口服施用的那些配制品可以包括调味剂。
[0108]
优选的单位剂量配制品是含有有效剂量的(如下文所叙述的)或其适当分数的活性成分的那些。在某些实施例中，本文披露的配制品每天施用一次。然而，这些配制品还可以被配制用于以任何施用频率来施用，包括每周一次、每5天一次、每3天一次、每2天一次、每天一次、每天两次或更多次，等。此类给药频率还维持根据治疗方案而变化的持续时间。
特定的治疗方案的持续时间可从一次性给药至延续数月或数年的方案而变化。在下文进一步讨论剂量和给药方案。
[0109]
可以与载体物质组合产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的宿主和具体的施用方式而变化。类似地，向患者施用的化合物的精确量将是主治医师的责任。针对任何特定患者的具体剂量水平将取决于多种因素，包括所使用的具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康情况、性别、饮食、施用时间、施用途径、排泄速率、药物组合、所治疗的确切的障碍以及所治疗的适应症或病症的严重程度。此外，施用途径可以取决于病症及其严重程度而变化。
[0110]
在某些情况下，可能合适的是，将至少一种本文所述的化合物(或其药学上可接受的盐、酯或前药)与另一种治疗剂组合施用。仅通过举例，如果患者在接受本文中的一种化合物时经历的副作用之一是炎症，则将抗炎剂与初始治疗剂组合施用可能是合适的。可替代地，仅通过举例，本文所述化合物之一的治疗有效性可以通过施用佐剂来提高(即，佐剂自身可以仅具有最小的治疗益处，但与另一种治疗剂组合时，增强了对患者的整体治疗益处)。甚至有可能两种化合物(本文所述的化合物之一和第二种化合物)可以共同实现所希望的治疗效果，该治疗效果是任何一种都无法单独实现的。可替代地，仅通过举例，患者所经历的益处可以通过施用本文所述化合物之一与另一种也具有治疗益处的治疗剂(其也包括治疗方案)来增加。仅通过举例，在涉及施用本文所述的化合物之一针对急性髓细胞性白血病或镰状细胞贫血的治疗中，增加的治疗益处也可以通过向患者提供针对镰状细胞贫血或针对急性髓细胞性白血病的另一种治疗剂来得到。在任何情况下，无论所治疗的疾病、障碍或病症如何，患者所经历的总体益处可能只是两种治疗剂的加和，或者在患者中这两种治疗剂可以具有协同治疗效果。
[0111]
有效的组合疗法可以通过同时包括两种药剂的单一组合物或药理学配制品，或同时使用两种不同的组合物或配制品来实现，其中一种组合物包括本披露的化合物，并且另一种包括一种或多种第二药剂。可替代地，该疗法可以在其他药剂治疗之前或之后，间隔从几分钟到几个月不等。考虑到药物的毒性(如果有的话)，向患者施用本披露的化合物将遵从用于施用药物的一般方案。预期将根据需要重复治疗周期。
[0112]
可能的组合疗法的具体非限制性实例包括本文披露的化合物与以下药剂和药剂类别一起使用：抑制dna甲基转移酶的药剂，例如地西他滨或5'-氮杂-胞嘧啶；抑制组蛋白脱乙酰基酶、组蛋白脱苏素化酶、组蛋白去泛素酶或组蛋白磷酸酶活性的药剂，例如羟基脲；反义rna，它们可能会抑制结合在γ珠蛋白启动子中的dr位点处的蛋白复合体的其他组分的表达；抑制klf1的作用或klf1的表达的药剂；抑制bcl11a的作用或bcl11a的表达的药剂；以及抑制细胞周期进程的药剂，例如羟基脲，ara-c或柔红霉素；诱导白血病细胞的分化的药剂，例如全反式维甲酸(atra)；以及jak抑制剂，如鲁索替尼(jakafi/jakavi)、菲卓替尼(fedratinib)(inrebic)、舍拉替尼(cerdulatinib)(prt062070)、甘多替尼(gandotinib)(ly-2784544)、来他替尼(lestaurtinib)(cep-701)、莫洛替尼(momelotinib)(gs-0387，cyt-387)、以及帕瑞替尼(pacritinib)(sb1518)。
[0113]
因此，在另一方面，本发明提供了用于治疗需要这种治疗的人或动物受试者的疾病或障碍的方法，该方法包括向所述受试者施用一定量的可有效减轻或预防受试者的所述障碍的本文披露的化合物与本领域中已知的用于治疗所述障碍的至少一种另外的药剂的
组合。化合物
[0114]
可在本文披露的方法中使用的抑制lsd1的化合物的实例包括下文化合物。其他lsd1抑制剂是本领域已知的。用于制备化合物的一般合成方法
[0115]
在以下实例和整个披露内容中，可以使用以下缩写：ptfe＝聚四氟乙烯；rm＝反应混合物；rh＝相对湿度；rt＝室温；sm＝起始物质；mecn＝乙腈；clph＝氯苯酚；dce＝二氯乙烷；dcm＝二氯甲烷；dipe＝二异丙醚；dma＝二甲基乙酰胺；dmf＝二甲基甲酰胺；dmso＝二甲亚砜；et2o＝二乙醚；etoac＝乙酸乙酯；etoh＝乙醇；h2o＝水；i pa＝丙-2-醇；i-proac＝异乙酸丙酯；mek＝甲基乙基酮；meoh＝甲醇；mibk＝甲基异丁基酮；mtbe＝甲基叔丁基醚；n-buoac＝正丁基乙酸酯；n-buoh＝正丁醇；nmp＝正甲基吡咯烷酮；n-proh＝正丙醇；s-buoac＝仲丁基乙酸酯；t-buoh＝叔丁醇；tfa＝三氟乙酸；thf＝四氢呋喃；tmp＝2,2,4-三甲基戊烷；1h-nmr＝质子核磁共振；dsc＝差示扫描量热法；dvs＝动态蒸汽吸附；gvs＝重量蒸汽吸附；hplc＝高效液相色谱法；hs＝顶部空间；hsm＝热台显微术；ic＝离子色谱法；idr＝固有溶出速率；kf＝卡尔费希尔；mas＝魔角旋转；mdsc＝调制示差扫描量热法；plm＝偏振光显微术；pvm＝粒子图像和测量；scxrd＝单晶体x射线衍射；ss-nmr＝固态核磁共振；tga＝热重量分析；uv＝紫外光vh-xrpd＝可变湿度x射线粉末衍射；vt-xrpd＝可变温度x射线粉末衍射；以及xrpd＝x射线粉末衍射。可以使用其他缩写，并且这些缩写对于本领域技术人员来说将是熟悉的。
[0116]
本发明进一步通过以下非限制性实例进行说明。下文示例的这些方法也可以推导出本文披露的化合物。适合用于在制备本发明实例中使用的另外的方法可以在wo 2015/021128和wo 2016/130952中找到，将这两者的内容通过引用特此并入，就像完整地写在本文中一样。可以通过以上披露的方法制备另外的lsd1抑制剂。中间体a：(1r,2s)-2-(4-氟苯基)-1-甲基环丙胺
[0117]
在0℃下，伴随搅拌将乙基2-(二乙氧基膦酰基)丙酸酯(3.45g，14.48mmol，2.00当量)在乙二醇二甲醚(20ml)中的溶液用n-buli(2.5m)(5.8ml)逐滴处理。将所得溶液在室温下搅拌30min。向其中添加2-(4-氟苯基)环氧乙烷(1g，7.24mmol，1.00当量)。将所得溶液搅拌12h，同时在油浴中将温度维持在80℃。将反应混合物冷却至室温。然后通过加入20ml水淬灭反应。将所得溶液用乙酸乙酯萃取，并且将有机层干燥并浓缩。将残余物在硅胶上进行色谱分析，并且用乙酸乙酯/石油醚(1:100)洗脱。这得到呈黄色油状物的1g(62％)的乙基(1r)-2-(4-氟苯基)-1-甲基环丙烷-1-甲酸酯。在室温下，将乙基(1r)-2-(4-氟苯基)-1-甲基环丙烷-1-甲酸酯(1g，4.50mmol，1.00当量)在甲醇/h2o(10/2ml)以及氢氧化钾(1.26g，
22.46mmol，4.99当量)中的溶液搅拌10h。将所得溶液用h2o稀释。用盐酸(2mol/l)将溶液的ph值调整至2。将所得溶液用乙酸乙酯萃取，并且将有机层合并，并经无水硫酸钠干燥，并在真空下浓缩。这得到呈黄色油状物的800mg(92％)的(1r)-2-(4-氟苯基)-1-甲基环丙烷-1-甲酸。将(1r)-2-(4-氟苯基)-1-甲基环丙烷-1-甲酸(400mg，2.06mmol，1.00当量)在甲苯(10ml)中的溶液与叠氮化磷酸二苯氧基酯(680mg，2.47mmol，1.20当量)、以及三乙胺(312mg，3.08mmol，1.50当量)混合。将所得溶液在油浴中在90℃下搅拌30min。然后，添加叔丁醇(2ml)。使得所得溶液在搅拌下再反应12h，同时在油浴中将温度维持在90℃。将反应混合物冷却至室温，并且将所得溶液用乙酸乙酯稀释。将所得混合物用h2o洗涤。将混合物经无水硫酸钠干燥，并且在真空下浓缩。将残余物在硅胶柱上进行色谱分析，并且用乙酸乙酯/石油醚(1:100)洗脱。这呈黄色油状物的350mg(64％)的叔丁基n-[(1r)-2-(4-氟苯基)-1-甲基环丙基]氨基甲酸酯。将叔丁基n-[(1r,2s)-2-(4-氟苯基)-1-甲基环丙基]氨基甲酸酯(350mg，1.32mmol，1.00当量)在甲醇(hcl)(10ml)中的溶液在室温下搅拌2h。将所得溶液用10ml的h2o稀释。用饱和的碳酸氢钠溶液将该溶液的ph值调整至9。将所得溶液用3x10ml乙酸乙酯萃取，并且将有机层合并，并经无水硫酸钠干燥，并在真空下浓缩。这得到呈黄色油状物的200mg(92％)的(1r,2s)-2-(4-氟苯基)-1-甲基环丙-1-胺。实例a1：n-((s)-1-氧代-6-(((1r,2s)-2-苯基环丙基)氨基)-1-(吡咯烷-1-基)己-2-基)苯甲酰胺
[0118]
由(s)-2-氨基-6-羟基己酸制备(s)-2-苯甲酰胺基-6-羟基己酸。将四氢呋喃中的物质(1g，3.98mmol，1.00当量)与3-(二乙氧基磷酰基氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4(3h)-酮(depbt)(2.4g，8.03mmol，2.00当量)和咪唑(542mg，7.97mmol，2.00当量)反应。随后在0℃下在30min内添加吡咯烷(283mg，3.98mmol，1.00当量)在四氢呋喃中的溶液。将所得溶液在室温下搅拌16h。将溶液用kh2po4(水性)稀释。将水层用乙酸乙酯萃取，并且将有机层用盐水洗涤，并且经无水硫酸钠干燥。过滤后，将溶剂在减压下去除。将残余物通过制备型hplc纯化，并且用含有0.5％nh4hco3的mecn洗脱。这得到呈浅黄色油状物的640mg(53％)的(s)-n-(6-羟基-1-氧代-1-(吡咯烷-1-基)己-2-基)苯甲酰胺。将在二氯甲烷(100ml)中的(s)-n-(6-羟基-1-氧代-1-(吡咯烷-1-基)己-2-基)苯甲酰胺(640mg，2.10mmol，1.00当量)用戴斯-马丁高碘烷(dmp)(893mg，2.11mmol，1.00当量)进行氧化。将所得溶液在水/冰浴中在0
℃下搅拌30min，并且然后用na2so3(水性)和nahco3(水性)稀释。将水层用乙酸乙酯萃取，并且将有机层用盐水洗涤，并且经无水硫酸钠干燥。过滤后，将溶剂在减压下去除。将残余物在硅胶上进行色谱分析，并且用乙酸乙酯/石油醚(10:1)洗脱。这给出呈白色固体的150mg(24％)的(s)-n-(1,6-二氧代-1-(吡咯烷-1-基)己-2-基)苯甲酰胺。将(s)-n-(1,6-二氧代-1-(吡咯烷-1-基)己-2-基)苯甲酰胺(150mg，0.50mmol，1.00当量)溶解在二氯甲烷(25ml)中。添加(1r,2s)-2-苯基环丙胺(66mg，0.50mmol，1.00当量)。搅拌5分钟后，添加三乙酰氧基硼氢化钠(252mg，1.19mmol，2.40当量)。将所得溶液在0℃下搅拌30min。在反应完成后，将所得溶液用饱和nahco3稀释。然后，将其用二氯甲烷萃取。将有机层用盐水洗涤，并且经无水硫酸钠干燥。将溶剂在减压下去除，并且将残余物通过制备型hplc(具有0.5％nh4hco3的can/h2o)纯化。这得到呈无色油状物的29mg(14％)的n-((s)-1-氧代-6-(((1r,2s)-2-苯基环丙基)氨基)-1-(吡咯烷-1-基)己-2-基)苯甲酰胺。1h nmr(300mhz,cd3od-d4)δppm:7.85(d,j＝7.5hz,2h),7.60-7.00(m,8h),4.85-4.75(m,1h),3.92-3.80(m,1h),3.70-3.30(m,4h),2.74(t,j＝7.2hz,1h),2.36-2.28(m,1h),2.07-1.75(m,7h),1.74-1.37(m,4h),1.10-0.95(m,2h)；ms(es,m/z):420(m+h)。实例a2：n-((s)-1-氧代-6-(((1r,2s)-2-苯基环丙基)氨基)-1-(哌啶-1-基)己-2-基)苯甲酰胺
[0119]
用与被描述用于合成n-((s)-1-氧代-6-(((1r,2s)-2-苯基环丙基)氨基)-1-(吡咯烷-1-基)己-2-基)苯甲酰胺同样的方式制备n-((s)-1-氧代-6-(((1r,2s)-2-苯基环丙基)氨基)-1-(哌啶-1-基)己-2-基)苯甲酰胺。使用3-(二乙氧基磷酰基氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4(3h)-酮和咪唑，将(s)-2-苯甲酰胺基-6-羟基己酸与哌啶偶联。在戴斯-马丁条件下，将所得醇(s)-n-(6-羟基-1-氧代-1-(哌啶-1-基)己-2-基)苯甲酰胺氧化为醛(s)-n-(1,6-二氧代-1-(哌啶-1-基)己-2-基)苯甲酰胺。在还原氨化条件下(na(oac)3bh)，将其与(1r,2s)-2-苯基环丙胺偶联，以得到呈无色油状物的所希望的产物n-((s)-1-氧代-6-(((1r,2s)-2-苯基环丙基)氨基)-1-(哌啶-1-基)己-2-基)苯甲酰胺。es,m/z＝434(m+h)。1h nmr(300mhz,cd3od-d4)δppm:7.86(d,j＝7.2hz,2h),7.70-7.40(m,3h),7.30-7.15(m,2h),7.15-7.08(m,1h),7.06(d,j＝7.2hz,2h),5.15-5.00(m,1h),3.80-3.60(m,2h),3.60-3.40(m,2h),2.34(t,j＝7.2hz,2h),2.40-2.30(m,1h),2.10-1.40(m,4h),1.15-1.00(m,2h)。实例a3：4-氟-n-((s)-6-(((1r,2s)-2-(4-氟苯基)环丙基)氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)-1-氧代己-2-基)苯甲酰胺
[0120]
以类似于实例a2的方式制备4-氟-n-((s)-6-(((1r,2s)-2-(4-氟苯基)环丙基)氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)-1-氧代己-2-基)苯甲酰胺。通过用me2s-bh3还原(s)-2-(4-氟苯甲酰胺基)己二酸来制备醇4-氟-n-((s)-6-(((1r,2s)-2-(4-氟苯基)环丙基)氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)-1-氧代己-2-基)苯甲酰胺。使用此类型还原以制备类似的醇(例如，用于合成n-((s)-1-氧代-6-(((1r,2s)-2-苯基环丙基)氨基)-1-(吡咯烷-1-基)己-2-基)苯甲酰胺(实例a1)的醇起始物质(s)-2-苯甲酰胺基-6-羟基己酸)。向吹入并维持在氮惰性气氛下的1000-ml 3颈圆底烧瓶中放入(s)-2-(4-氟苯甲酰胺基)己二酸(10g，35.30mmol，1.00当量)在四氢呋喃(300ml)中的溶液。然后在0℃下添加me2s-bh3(11ml，3.00当量)在四氢呋喃(50ml)中的溶液。将所得溶液在冰/盐浴中在0℃下搅拌3h。然后将反应通过添加20ml的甲醇淬灭。将所得混合物在真空下浓缩。将所得溶液用300ml的饱和na2co3稀释。将所得溶液用3x100ml的乙酸乙酯萃取，并且将水层合并。用盐酸(2mol/l)将溶液的ph值调整至2。将所得溶液用3x200ml的乙酸乙酯萃取，并且将有机层合并。将所得混合物用1x500ml的盐水洗涤。将混合物经无水硫酸钠干燥。将固体过滤出。将所得混合物在真空下浓缩。这得到呈无色油状物的6g(63％)的(s)-2-(4-氟苯甲酰胺基)-6-羟基己酸。将此物质与n-甲基哌嗪反应，随后进行戴斯-马丁氧化反应，并且以被描述用于合成n-((s)-1-氧代-6-(((1r,2s)-2-苯基环丙基)氨基)-1-(吡咯烷-1-基)己-2-基)苯甲酰胺(实例a1)的方式，通过与(1r,2s)-2-(4-氟苯基)环丙胺的还原氨基化反应进行偶联，以产生呈无色油状物的所希望的产物4-氟-n-((s)-6-(((1r,2s)-2-(4-氟苯基)环丙基)氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)-1-氧代己-2-基)苯甲酰胺。es,m/s＝485*m+h)。1h nmr(300mhz,cd3od-d4)δppm:7.83(dd,j1＝5.4hz,j2＝1.4hz,2h),7.18-7.04(m,3h),7.00-6.87(m,4h),5.17-5.05(m,1h),3.78-3.50(m,4h),2.71(t,j＝6.9hz,2h),2.30(s,3h),2.28-2.21(m,1h),1.90-1.78(m,2h),1.72-1.31(m,9h),1.07-0.96(m,1h),0.94-0.86(m,1h)。实例158：n-[(2s)-1-(4-(甲基)哌嗪-1-基)-5-[[(1r,2s)-2-(4-氟苯基)-环丙基]氨基]-1-氧代戊-2-基]-4-(1h-1,2,3-三唑-1-基)苯甲酰胺(化合物2；化合物1的游离碱)
[0121]
根据方案ii的方法制备n-[(2s)-1-(4-(甲基)哌嗪-1-基)-5-[[(1r,2s)-2-(4-氟苯基)-环丙基]氨基]-1-氧代戊-2-基]-4-(1h-1,2,3-三唑-1-基)苯甲酰胺(化合物2)。
[0122]
4-(1h-1,2,3-三唑基-1-基)苯甲酰氯(1)在100-ml圆底烧瓶中，将4-(1h-1,2,3-三唑-1-基)苯甲酸(1g，5.29mmol，1.00当量)和亚硫酰氯(20ml)进行合并。将所得溶液在油浴中在80℃下搅拌16h。然后将所得混合物在减压下浓缩，提供1g(91％)的呈黄色固体的中间体(1)。
[0123]
(2s)-5-[[(1r,2s)-2-(4-氟苯基)环丙基](丙烯-3-基)氨基]-2-[[4-(1h-1,2,3-三唑-1-基)苯基]甲酰胺基]戊酸(2)在100-ml圆底烧瓶中，将(2s)-2-氨基-5-[(1r,2s)-2-(4-氟苯基)环丙基](丙-2-烯-1-基)氨基戊酸(500mg，1.63mmol，1.00当量)、et3n(494mg，4.88mmol，3.00当量)和thf(20ml)合并。随后在0℃下伴随搅拌于30min内，逐滴添加来自先前步骤的中间体(1)(1g，4.82mmol，2.95当量)在thf(20ml)中的溶液。将所得溶液在0℃下在冰/盐浴中搅拌1h，然后在减压下浓缩，并且施加至硅胶柱(其中ch2cl2/甲醇(10:1))上。将收集的这些级分合并，并且在减压下浓缩，提供400mg(51％)的呈灰白色固体的中间体(2)。
[0124]
n-[(2s)-1-(4-(甲基)哌嗪-1-基)-5-[[(1r,2s)-2-(4-氟苯基)-环丙基](丙-2-烯-1-基)氨基]-1-氧代戊-2-基]-4-(1h-1,2,3-三唑-1-基)-苯甲酰胺(3)在100-ml圆底烧瓶中，将来自先前步骤的中间体(2)(400mg，0.84mmol，1.00当量)、depbt(375mg，1.25mmol，1.50当量)、和thf(20ml)进行合并，随后添加咪唑(85mg，1.25mmol，1.50当量)。将混合物在0℃下搅拌30min，此时在0℃下伴随搅拌于3min内逐滴添加1-甲基哌嗪(127mg，1.27mmol，1.50当量)。将所得溶液在20℃下搅拌16h，然后在减压下浓缩。将残余物施加到硅胶柱(其中ch2cl2/甲醇(10:1))上。将收集的这些级分合并，并且在真空下浓缩，提供300mg(64％)的呈黄色固体的中间体(3)。
[0125]
n-[(2s)-1-(4-(甲基)哌嗪-1-基)-5-[[(1r,2s)-2-(4-氟苯基)-环丙基]氨基]-1-氧代戊-2-基]-4-(1h-1,2,3-三唑-1-基)苯甲酰胺(实例158；化合物2)向吹扫并维持在氮惰性气氛下的100-ml圆底烧瓶中放入n-[(2s)-5-[[(1r,2s)-2-(4-氟苯基)环丙基](丙-2-烯-1-基)氨基]-1-(4-甲基哌嗪-1-基)-1-氧代戊-2-基]-4-(1h-1,2,3-三唑-1-基)苯甲
酰胺(300mg，0.54mmol，1.00当量)、1,3-二甲基-1,3-二嗪农-2,4,6-三酮(210mg，1.34mmol，2.50当量)、pd(pph3)4(155mg，0.13mmol，0.25当量)。将所得溶液在油浴中在45℃下搅拌2h。将所得混合物在真空下浓缩。将粗产物(10ml)通过快速制备型hplc进行纯化。这得到65mg(23％)的呈黄色固体的实例158。
[0126]
可替代地，实例158及其双甲苯磺酸盐(化合物2双甲苯磺酸盐，“化合物1”)可以通过方案iii的方法来制备：
[0127]
本文披露的化合物，包括化合物1，也可以如us 20160237043、wo 2018035259和wo 2018035249中披露来合成。
[0128]
本文化合物可使用类似于本文描述的那些方法以及本领域已知的方法、使用适当的起始物质和试剂进行合成。在以下结构中，应当理解的是，单一异构体的混合物，如外消旋混合物以及可替代的对映异构体、兼性离子等可以例如通过使用适当的l-或d-异构体、或手性或非手性化合物作为起始物质或试剂，或通过采用分离步骤进行制备。
[0129]
因此，在某些实施例中，在以下化合物中，环丙胺的取代基的构型相对于苯基是反式的。在某些实施例中，反式构型是r、s；在其他实施例中，反式构型是s、r。
[0130]
在某些实施例中，化合物是：(“化合物2”)或其盐、多晶型物、或溶剂化物。
[0131]
在某些实施例中，化合物是具有下式的盐：或其多晶型物或溶剂化物，其中：x选自甲苯磺酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、草酸盐、苯磺酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、乙磺酸盐、以及苹果酸盐；并且q是选自1和2的整数。
[0132]
在某些实施例中，x是甲苯磺酸盐。
[0133]
在某些实施例中，q是2。
[0134]
在某些实施例中，化合物是(“化合物1”)。
[0135]
以上披露的化合物，或它们的任何子集或种类，可用于本文所述的治疗和影响临床/治疗相关终点的任何方法。
[0136]
在某些实施例中，提供了如本文披露的化合物，用作药物。
[0137]
在某些实施例中，提供了如本文披露的化合物用于在制造用于预防或治疗疾病或病症或实现临床相关终点的药物中使用，如本文所讨论。
[0138]
在某些实施例中，提供了药物组合物，该药物组合物包含如本文披露的化合物，以
及药学上可接受的载体。
[0139]
在某些实施例中，将药物组合物配制为用于口服施用。
[0140]
在某些实施例中，药物组合物另外包含另一种治疗剂。治疗疾病的方法和药物中的用途
[0141]
本文提供了用于治疗或预防骨髓增生性肿瘤的方法，该方法包括向有需要的受试者施用如本文披露的lsd1抑制剂化合物。
[0142]
在某些实施例中，方法影响或产生以下中的一种或多种：
·
抑制有需要的受试者的恶性髓样细胞的增殖；
·
减少有需要的受试者的由骨髓细胞(例如，巨核细胞)分泌的一种或多种蛋白质生长因子(例如，血小板源生长因子、血管内皮生长因子、转化生长因子β1或血小板因子4(又名cxcl4))的浓度，这些骨髓细胞激活一种或多种分泌网硬蛋白和胶原的细胞类型(例如，基质细胞、骨髓驻留的成纤维细胞、或肌成纤维细胞)；
·
减少有需要的受试者的由骨髓细胞(例如，巨核细胞)分泌的一种或多种蛋白质生长因子(例如，血小板源生长因子、血管内皮生长因子、转化生长因子β1或血小板因子4(又名cxcl4))的浓度，这些骨髓细胞损害骨髓破骨细胞减少骨髓骨硬化的量的功能；
·
减少有需要的受试者的网硬蛋白和/或胶原骨髓纤维化；
·
减少有需要的受试者的一种或多种炎性细胞因子的血浆水平；
·
减少有需要的受试者的由髓样细胞的突变等位基因频率测量的恶性细胞负荷；
·
消除有需要的受试者的恶性髓样细胞；
·
减少有需要的受试者的病理性升高的红细胞质量；
·
减少有需要的受试者的恶性髓样细胞的质量；
·
减小有需要的受试者的异常脾脏大小或体积；
·
减少有需要的受试者的髓外造血量；
·
改善有需要的受试者的由经验证的患者报告的qol评估测量的生活质量(qol)；
·
减少有需要的受试者的通过患者报告的调查测量的骨髓纤维化全身症状；
·
延长有需要的患有骨髓纤维化的受试者的寿命；
·
延迟或预防有需要的受试者的骨髓纤维化向急性髓细胞性白血病进展；
·
减少有需要的受试者的血小板计数；
·
减少有需要的受试者的病理性升高的红细胞质量；
·
降低有需要的受试者的升高的粒细胞谱系的骨髓细胞的升高水平；
·
减少有需要的受试者的骨髓细胞构成至具有少于5％母细胞的年龄标化正常细胞构成；
·
维持有需要的受试者的骨髓母细胞计数或减少骨髓母细胞计数至《5％；
·
减少有需要的受试者的血栓形成和出血的频率；
·
减少有需要的受试者的红细胞的输注频率；
·
增加mf患者的血红蛋白值至》100g/l，并且低于年龄和性别调整后正常的上限；
·
减少患有pv的男性患者的血细胞比容至《45％或减少患有pv的女性患者的血细胞比容至≤42％；
·
降低pv患者的血红蛋白水平至《160g/l；和/或
primary myelofibrosis in the jak2 v617f era[jak2v617f方面真性红细胞增多症、原发性血小板增多症以及原发性骨髓纤维化的诊断和管理]”clin adv hematol oncol[血液学和肿瘤学的临床进展],2009年5月；7(5):334-42中披露的那些方法。
[0148]
本文提供了用于减少有需要的受试者的一种或多种炎性细胞因子的血浆水平的方法，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。在某些实施例中，一种或多种炎性细胞因子选自：干扰素γ(ifnγ)、肿瘤坏死因子α(tnfα)、白介素1β(il-1β)、白介素6(il-6)、白介素8(il-8)、白介素10(il-10)、白介素12(il-12)、白介素15(il-15)、白介素17(il-17)、cxcl4(pf4)、以及cxcl10(ip10)。
[0149]
在某些实施例中，经测量的一种或多种细胞因子减少至约以下水平或以下：
·
il-6减少至约9pg/ml以下；
·
il-8减少至约18pg/ml以下；
·
il-10减少至约51pg/ml以下；
·
il-12减少至约182pg/ml以下；
·
il-15减少至约38pg/ml以下；
·
tnfα减少至约15pg/ml以下；和/或
·
infγ减少至约23pg/ml以下。在某些实施例中，两种、三种、四种、五种或更多种炎性细胞因子减少。
[0150]
本文提供了用于减少有需要的受试者的恶性髓样细胞的质量的方法，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。在某些实施例中，恶性髓样细胞的质量通过流式细胞术免疫表型测量。在某些实施例中，通过突变等位基因的频率、具有致病性mpn突变(mpl、calr或jak2)的细胞数量与含有野生型和突变等位基因的细胞总数的比率来测量恶性髓样细胞的质量。
[0151]
本文提供了用于减少有需要的受试者的突变等位基因负荷的方法，该方法包括施用治疗有效量的lsd1抑制剂。在某些实施例中，突变等位基因是选自以下的一种或多种基因的等位基因：janus激酶2(jak2)、骨髓增生性白血病病毒癌基因(mpl)和钙网蛋白(calr)。在某些实施例中，lsd1抑制剂是如本文披露的lsd1抑制剂化合物。在某些实施例中，突变等位基因负荷减少约50％的突变的janus激酶2(jak2)、骨髓增生性白血病病毒癌基因(mpl)或钙网蛋白(calr)的受试者(或受试者池的平均值)突变等位基因负荷。在某些实施例中，在一名或多名患者中测量治疗后突变等位基因负荷的减少，并且与治疗前的水平和治疗过程后的水平进行比较。在某些实施例中，突变等位基因负荷减少至检测不到janus激酶2(jak2)、骨髓增生性白血病病毒癌基因(mpl)和钙网蛋白(calr)的突变等位基因的水平。突变等位基因负荷可以通过本领域已知的方法，包括上文披露的方法来评估。
[0152]
本文提供了用于减少有需要的受试者的病理性升高的红细胞质量的方法，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。在某些实施例中，受试者患有真性红细胞增多症。在某些实施例中，受试者具有janus激酶2(jak2)的突变。在某些实施例中，通过测量血细胞比容或血液血红蛋白推断出升高的红细胞质量。在某些实施例中，测量的血细胞比容或血红蛋白应减少到与性别相符的正常范围。例如，在某些实施例中：
·
男性pv患者的血液血红蛋白将减少到小于16.5g/dl，或女性pv患者的血液血红蛋白将减少到小于16.0g/dl；
·
男性pv患者的血细胞比容将减少到小于49％，或女性pv患者的血细胞比容将减少到小于48％。在某些实施例中，通过同位素红细胞质量测定来测量升高的红细胞质量。在某些实施例中，升高的红细胞质量比平均正常预测值高25％。
[0153]
本文提供了用于减少有需要的受试者的升高的白细胞计数的方法，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。在某些实施例中，受试者患有慢性嗜中性粒细胞白血病。
[0154]
本文还提供了用于减少有需要的受试者的升高的粒细胞谱系骨髓细胞的水平的方法，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。在某些实施例中，将粒细胞谱系的骨髓细胞减少至正常范围内的值。本文还提供了用于使有需要的受试者的骨髓细胞构成减少至具有少于5％母细胞的年龄标化正常细胞构成的方法，该方法包括施用治疗有效量的lsd1抑制剂。在某些实施例中，受试者患有慢性嗜中性粒细胞白血病。
[0155]
本文提供了用于使有需要的受试者的血红蛋白增加至》100g/l直至低于年龄和性别调整后正常的上限的水平的方法，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。
[0156]
还提供了用于a)使pv患者的血红蛋白水平降低至《160g/l，或b)使pv患者的红细胞质量减少的方法，其中该减少由血红蛋白水平hb《160g/l来推断，任一方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。还提供了用于使mf患者的血红蛋白增加至》100g/l的方法，该方法包括施用治疗有效量的lsd1抑制剂。还提供了用于使mf患者的血红蛋白值增加至》100g/l，并且低于年龄和性别调整后正常的上限的方法，该方法包括施用治疗有效量的lsd1抑制剂。在某些实施例中，所述受试者在选自以下的一种或多种基因中具有突变：janus激酶2(jak2)、骨髓增生性白血病病毒癌基因(mpl)和钙网蛋白(calr)。在某些实施例中，所述受试者患有原发性血小板增多症。在某些实施例中，所述患者的输注负荷减少。
[0157]
本文提供了用于减小有需要的受试者的异常脾脏大小或体积的方法，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。在某些实施例中，所述受试者在选自以下的一种或多种基因中具有突变：janus激酶2(jak2)、骨髓增生性白血病病毒癌基因(mpl)和钙网蛋白(calr)。
[0158]
本文提供了用于减少有需要的受试者的髓外造血量的方法，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。在某些实施例中，所述受试者在选自以下的一种或多种基因中具有突变：janus激酶2(jak2)、骨髓增生性白血病病毒癌基因(mpl)和钙网蛋白(calr)。在某些实施例中，髓外造血量通过脾肿大进行测量。在某些实施例中，所述受试者的脾肿大减少至少约30％、至少约35％、至少约40％、或至少约45％。在某些实施例中，所述受试者的脾肿大减少至少35％。在某些实施例中，约50％的患者的脾肿大减少至少35％。
[0159]
本文提供了用于减少有需要的受试者的如通过患者报告的调查测量的骨髓纤维化的全身症状的方法，该方法包括施用治疗有效且无害量的lsd1抑制剂。在某些实施例中，所述全身症状包含选自以下的一种或多种症状：疲劳、早饱、腹部不适、不活动、注意力不集中、手脚麻木和/或刺痛、盗汗、瘙痒、骨痛、大于100
°
f的发热、以及无意的体重减轻。
[0160]
在某些实施例中，所述患者报告的调查是骨髓增生性肿瘤症状评估表(mpn-saf)。mpn-saf是经验证的骨髓增生性肿瘤最常见症状的临床评估表，其中患者以1-10分制自我报告其对各种常见症状的评分，其中1分为最有利或无症状，10分为最不利或可想象的最严
重的症状。参见例如，scherber r等人,“the myeloproliferative neoplasm symptom assessment form(mpn-saf):international prospective validation and reliability trial in 402patients[骨髓增生性肿瘤症状评估表(mpn-saf)：402名患者的国际前瞻性验证和可靠性试验],”blood[血液]118(2):401-08(2014)。完整或缩写形式均可向患者施用。在缩写版本中，可从17项mpn-saf的十个最相关临床症状中计算出“总症状评分”(tss)：最严重的疲劳、注意力、早饱、不活动、盗汗、瘙痒(itching)、骨痛、腹部不适、体重减轻以及发热。因此，mpn-saf tss的可能范围为0至100。当生活质量评分至少评定为10分中的4分，则定义为“临床缺陷”；如果症状评定为≥10分中的4分或≤10分中的6分，则定义为“中度”；以及，如果症状评定为≥10分中的7分，则定义为“重度”。对于在bfi和mpn-saf上完成这10个项目中至少六个项目的患者，mpn tss按观察项目的平均值乘以10计算，以获得0至100的量表。参见例如，emanuel rm等人,“myeloproliferative neoplasm(mpn)symptom assessment form total symptom score:prospective international assessment of an abbreviated symptom burden scoring system among patients with mpns,[骨髓增生性肿瘤(mpn)总症状评分评估表：患有mpn的患者的简化症状负荷评分系统的前瞻性国际评估]”j clin oncol[临床肿瘤学杂志]30(33):4098-103(2012)。
[0161]
在某些实施例中，总症状评分(mpn-saf:tss)减少至少50％。
[0162]
在某些实施例中，所述患者报告的调查是骨髓纤维化症状评估表(mf-saf)。参见例如，mesa ra等人,“the myelofibrosis symptom assessment form(mfsaf):an evidence-based brief inventory to measure quality of life and symptomatic response to treatment in myelofibrosis,[骨髓纤维化症状评估表(mfsaf)：基于证据的测量生活质量和对骨髓纤维化治疗的症状应答的简明量表]”leuk res.[白血病研究]33(9):1199-203(2009)。在某些实施例中，mf-saf总症状评分降低至少50％。
[0163]
在某些实施例中：
·
受试者在选自以下的一种或多种基因中具有突变：janus激酶2(jak2)、骨髓增生性白血病病毒癌基因(mpl)和钙网蛋白(calr)；
·
受试者患有骨髓增生性肿瘤；
·
受试者患有选自真性红细胞增多症(pv)、原发性血小板增多症(et)、以及骨髓纤维化的骨髓增生性肿瘤；
·
受试者患有骨髓纤维化；
·
受试者患有选自原发性骨髓纤维化(pmf)和pv/et后骨髓纤维化的骨髓纤维化；
·
受试者患有pv/et后骨髓纤维化(mf)；
·
受试者患有原发性骨髓纤维化(pmf)；
·
受试者患有真性红细胞增多症；
·
受试者患有原发性血小板增多症；
·
受试者患有慢性髓细胞性白血病；
·
受试者患有慢性嗜中性粒细胞白血病；或者
·
受试者患有慢性嗜酸细胞白血病；
·
受试者是人；和/或
·
lsd1抑制剂是如本文披露的lsd1抑制剂化合物。
[0164]
还提供了其中可以将以上任何方法实施例与这些实施例中的任一个或多个组合的实施例，条件是该组合不互相排斥。如本文所用，当一个被定义为不能与另一个重叠时，两个实施例“是互相排斥的”。例如，其中待治疗的障碍是原发性骨髓纤维化(pmf)的实施例与其中待治疗的障碍是pv/et后骨髓纤维化(mf)的实施例是互斥的，因为这些分类是不同诊断的结果。然而，其中待治疗的障碍是pmf的实施例与其中网硬蛋白和/或胶原骨髓纤维化减少的实施例不相互排斥，因为网硬蛋白和/或胶原骨髓纤维化发生于pmf。
[0165]
上文披露的方法或它们的任何子集或种类可以使用上文披露的任何化合物作为lsd1抑制剂，或者是离散的化学种类或者如式或实施例之一所述，或者是包含它们的药物组合物。实例
[0166]
下文呈现了证明本文披露的组合物和方法的效用的生物测定和临床试验。生物活性
[0167]
本文披露的化合物已被证明为lsd1的抑制剂，如，例如在wo 2015/021128和wo 2016/130952，或上文引用的任何参考文献中披露，将这些文献的内容通过引用特此并入。实例1：骨髓纤维化的1/2a期和2b期临床试验
[0168]
一项评估每日一次口服施用的化合物1在患有高风险mf患者中的安全性、耐受性、稳态药代动力学和药效动力学的多中心、开放标签研究作为1/2a期研究开始，并且扩展为2b期研究，所述高风险mf包括原发性骨髓纤维化(pmf)、真性红细胞增多症后骨髓纤维化(ppv-mf)、以及原发性血小板增多症后骨髓纤维化(pet-mf)(统称为“mf”)。
[0169]
研究的1/2a期部分评估了：最初的起始剂量0.25mg/kg/d的安全性；85天的治疗持续时间，随后的清除期长达28天；以及，药代动力学和药物浓度测量。证明临床益处的患者可以恢复另外12周周期的治疗。过渡至2b期研究，实施了通过早期药代动力学和药效动力学研究以及安全性评估支持的变化，这些变化包括：增加的起始剂量为0.5mg/kg/d，其中滴定增量更大；168天(24周)的治疗持续时间，通过去除清除期而连续的给药；消除pk和药物浓度取样；以及，访视时间表缩短。
[0170]
这项研究在多个地点进行。治疗了多达50名年龄为十八岁或以上、患有高风险骨髓纤维化的患者。主要目的包括安全性和耐受性、药代动力学(pk；仅1/2a期)以及脾脏体积减小(svr)。探索性终点包括通过在1/2a期减少源自mpn-saf的总症状评分(tss)和在2b期使用mpn-saf tss工具所证明的全身症状、细胞因子和骨髓(bm)纤维化方面的改善。关键入选标准包括：高风险或中等2级风险的骨髓纤维化；根据研究人员的判断，用经批准的可用疗法(包括鲁索替尼)治疗失败(对该疗法是难治的或对其具有耐药性、通过该疗法未得到充分控制或对其不耐受)，或不能成为该经批准的可用疗法的候选者；血小板计数≥100k/μl；以及，循环母细胞≤10％。
[0171]
使用血小板计数作为bomedemstat活性对巨核细胞功能和活性影响的生物标志物进行定制给药。巨核细胞(骨髓和产生血小板的其他部位中的细胞)是骨髓纤维化和原发性血小板增多症的发病机理的核心。在这两种情况下，骨髓造血干细胞的体细胞突变导致成熟的巨核细胞产生过量的血小板和生物活性蛋白，这些过量的血小板和生物活性蛋白改变了骨髓生态位，并且溢出到循环中的，从而产生了这些病症的症状特征，如瘙痒和疲劳。
[0172]
减少过量的巨核细胞产物的一个策略是靶向巨核细胞的成熟和功能。靶向巨核细
胞的治疗的有效性可以通过测量巨核细胞的产物(例如循环中的血小板或血浆或血清中的炎性细胞因子和生长因子)来定量。
[0173]
通过滴定剂量将血小板计数降至特定范围，可使这种治疗的给药更加精确。
[0174]
本研究的1/2a期部分，患者以推定的0.25mg/kg/d次治疗剂量开始。根据评估时的血小板值，使用剂量滴定每周(人血小板的寿命)进行剂量调整(向上或向下)。以0.125或0.0625mg/kg/d的增量进行向上滴定，如下文所示。以当前剂量的50％的减量进行向下滴定。预期计算出的有效剂量约1mg/kg qd，尽管这并不代表上限；预期达到最佳治疗效果所需的剂量在患者之间会有变化，并且可能随时间而变化。预计与最有效治疗效果相关的滴定靶标血小板计数为≥50,000至《100,000/μl(50-100x109/l)。基于每周血小板计数评估的1/2a期滴定和再激发规则记录在下文的表1。表1本研究1/2a期部分的滴定和再激发规则表1本研究1/2a期部分的滴定和再激发规则重要事项：对于在美国招募的患者，对于向上滴定需要anc≥0.5x109/l(500/μl)和hb》8g/dl(80g/l)。对于低于这些阈值的anc或hb值，维持或调整当前剂量取决于如下文所述的血小板计数。*dsmc可能会在审查单个患者和患者应答后，推荐与上述不一致的向上或向下滴定。
**再激发时，上述所有规则均重新适用。
[0175]
然而，招募至本研究1/2a期部分的所有患者均需要从0.25mg/kg/d的最初的起始剂量起多次向上滴定化合物1，以使血小板处于靶标血小板计数范围内，这表明起始剂量应更高。随后生成剂量-应答曲线，该曲线提供了滴定算法来调整剂量，以达到每微升50,000-75,000个血小板(k/ul)的靶标血小板计数，如此设计目的是将重度血小板减少症的概率降至最低。排除最高和最低剂量(总日剂量4mg和100mg)，达到靶标范围内血小板计数所需的化合物1的平均总日剂量为78.3mg(s.d.13.8，范围53-90mg)，或相当于大约0.7至1.2mg/kg/d。因此，为了使患者能够更快地达到最佳剂量，同时仍维持足够的安全边界，为进入本研究2b期部分的所有患者选择了新的0.5mg/kg qd的化合物1起始剂量。与此新靶标相关的滴定和再激发规则也进行了调整(表2)。表2本研究2b期部分的滴定和再激发规则重要事项：对于向上滴定，需要anc≥0.5x109/l(500/μl)和hb》8g/dl(80g/l)。对于低于这些阈值的anc或hb值，维持或调整当前剂量取决于如下表所述的血小板计数。*dsmc可能推荐与上述不一致的向上或向下滴定。**以先前mg/kg剂量的50％再激发。
￥
再激发时，上述所有规则均重新适用。
§
注意如果自先前访视后血小板计数增加，则应遵循“《”规则。
φ
施用先前mg/kg剂量的75％，反映了25％的剂量减少。
[0176]
在修改给药算法后，基于前十六名患者的经验，对给药、应答和安全性进行了重新分析。使患者达到并且安全维持在靶标血小板计数范围内所需的平均剂量(“治疗剂量”)为63.8mg/d或0.85mg/kg/d(假设平均体重为75kg)。(三名患者未达到靶标范围；两名患者在
第6周之前退出，并且一名患者由于疲劳而不同意增加剂量。)除第321天至第510天总日剂量保持在4mg的一名患者和第35天中止研究的第二名患者外，总日治疗剂量范围为50mg至85mg。在3期研究中，预计起始剂量为40mg，在随后的4-6周内再进行一次或两次剂量调整。
[0177]
十八名患者招募至本研究的1b/2a期部分。其中，四名患者提前退出本研究：1名患者进展为加速期疾病(第39天)；2名患者由于不良事件、疲劳(第33天)、蜂窝织炎(认定为不相关)(第77天)；以及1名患者由于贫血(第77天)而寻求替代疗法。到目前为止，第12周其余14名患者的应答可评估，并且第24周有9名患者的应答可评估。另有13名患者招募至2b期部分，如下所述。迄今为止的总共31项专利的患者特征在下表3中给出。表3.
[0178]
除一名患者外，所有患者均接受了一种或多种先前治疗，包括鲁索替尼。48％接受过pmf，33％接受过pet-mf，19％接受过ppv-mf。患者年龄中值为65岁(48-89)，其中58％为男性。48％被归类为高风险(ipss)，其余为中等风险2。在进行了深度遗传分析(对264个aml和mpn基因进行外显子组测序)的那些患者中，71％的患者具有一种以上的突变，其中63％为高分子风险(asxl1、u2af1、srsf2)突变；31％的患者具有异常核型。大部分患者具有≥3个突变。按照上述起始剂量和滴定规则，患者接受了12周的每日治疗，随后是长达28天的清除期。起始血小板计数范围为约141至约1309k/μl。在治疗前和给药12周后的清除期进行了骨髓活检和腹部影像学研究。使用2016年修订的世界卫生组织骨髓肿瘤分类(arber等人,2016)集中进行骨髓纤维化分级；图像读取也集中进行。骨髓增生性肿瘤症状评估表(mpn-saf)在基线时自行填写，并且从第0天到研究结束(eos)访视期间每周填写。总症状评分源
自这一工具。临床益处明显的患者可继续治疗另外12周的周期。
[0179]
结果.18名患者中的78％(n＝14)完成了12周(84天)治疗，44％(n＝9)完成了24周治疗。在被认为其初步分析是可评估的患者(n＝14，那些完成85天周期并在清除的前2周内获得可用的影像学研究的患者)中，化合物1对骨髓纤维化症状有深远影响。如图1所示，到目前为止，在所评估的患者中，脾脏体积普遍减小。在第12周，7名患者(50％)出现脾脏体积减小；在第24周，6名患者(75％)出现脾脏体积减小，其中1名患者(12.5％)减小35％。如图2所示，mpn-10评分也普遍降低。第12周时，11名患者(79％)出现症状评分降低，其中3名患者(21％)降低≥50％；第24周时，8名患者(89％)出现症状评分降低，其中4名患者(44％)降低≥50％。
[0180]
当与最佳可用治疗(bat)进行比较时，例如，如在persist-2临床试验(参见，例如，临床试验编号nct02055781)中，化合物1胜过bat，如图3所示：脾脏体积应答(svr)和总症状评分(tss)均较好。
[0181]
此外，观察到炎性细胞因子下调和循环生长因子减少。如图4至图6所示，在用化合物1的治疗过程中，在第12周s100a9(图4)、rantes(图5)和il-8(图6)普遍降低；同时，所有患者的ccl3、il-6、il-10、il-33、il-28a、ifnβ、ifnα、ifnγ水平均未升高。如图7和图8所示，生长因子vegf和pdgf-bb的水平在第12周时普遍降低。图9示出了这些结果在lsd1抑制的治疗理论中的相关性。
[0182]
还观察到血红蛋白(hb)水平和含胎儿血红蛋白的红细胞(f细胞)百分比的改善。在招募至1b/2a期的18名患者中，3名患者在第0天出现hb》10g/dl，15名患者出现2级或3级贫血，其中hb《10g/dl。在用化合物1治疗过程的第84天，hb》10g/dl的3名患者中，1名患者得到改善(定义为hb》1g/dl的增加)，2名患者出现恶化(hb》1g/dl的减少)。在15名hb《10g/dl的患者中，9名患者为输血依赖型，以及6名患者为非输血依赖型。在第84天时，9名输血依赖型患者中，1名患者变为非输血依赖型，并且具有改善的hb》1g/dl，8名患者维持稳定的输血频率，并且一名患者增加了输血频率。在6名非输血依赖型患者中，1名患者得到改善，3名患者保持稳定，2名患者出现恶化(1名患者变为输血依赖型；1名患者出现hb下降》1g/dl)。同时，化合物1降低了f细胞的百分比，如图10所示(其中患者是任意编号的，并且不一定对应于先前图中的患者编号)。胎儿血红蛋白(hbf)是癌症的既定血清学指标，并且在骨髓增生性肿瘤的脾脏中观察到了不会在健康成人脾脏中出现的胎儿造血。
[0183]
还观察到骨髓纤维化等级的变化。在迄今为止报告骨髓活检的13名患者(第0天至第84天或eot)中，2名患者(15％)得到改善≥1级，8名患者(62％)具有稳定的纤维化评分，以及3名患者(23％)进展了1级。
[0184]
对于症状评分，改善通常呈剂量依赖性且迅速，例如，前16名患者中有8名在14天内疲劳评分得到改善。在这16名患者中，除一名患者外，所有患者均在最低的两个剂量下观察到这些变化。与jak抑制剂在患有mf的患者中的研究所报告的相似，症状学改善与脾脏体积变化之间没有相关性。脾脏体积的减少以几种方式受到损害。用预期为次优的初始剂量特意对患者进行治疗，并且大多数患者直到85天周期的中途才达到靶标范围内的血小板计数。此外，所有患者在清除期都进行了随访影像学研究
‑‑
身体检查很容易发现脾脏体积增大。在本研究的2b期部分，已消除了清除期，并且改进了给药方案，以更迅速地达到靶标血小板计数，并将患者安全地维持在该范围内更长时间。
[0185]
用化合物1治疗降低了所有患者的血小板计数。血小板产生的变化与化合物1的暴露密切相关
‑‑
血小板计数可以以合理的精确度进行滴定。这些变化的动力学与人血小板的已知寿命(7天)一致。随着治疗的中止，血小板计数强劲反弹，这表明一旦药物清除，化合物1的抗血小板形成作用是可逆的。与用大鼠和狗进行的研究一样，粒细胞的产生似乎对lsd1抑制不敏感；外周粒细胞计数在治疗时较低，淋巴细胞计数不变，并且单核细胞计数普遍适度升高。这些观察与非临床研究和其他临床研究中所观察到的一致。
[0186]
安全性.在整个研究过程中，没有发生死亡或剂量限制性毒性。四种sae(均为3级)归因于化合物1，包括疼痛性脾肿大、头痛、恶心和呕吐、以及心力衰竭。有139种所有级别的ae归因于化合物1。上述两项研究的31名受试者中最常见的ae为血小板减少(11名受试者，35％)、贫血(3名受试者，10％)和恶心(1名，3％)。归因于化合物1的最常见3/4级ae为贫血(6名受试者，19％)和嗜中性白血球减少(3名受试者，10％)。
[0187]
上述表明，在治疗选择有限的患有mf的患者异质群体中，化合物1耐受良好，似乎安全，并且在减小脾脏体积和大体上改善大多数患者的症状评分方面有效。实例2：骨髓纤维化的2b期临床试验
[0188]
在1/2a期研究中对骨髓纤维化患者进行了一项多中心、开放标签、剂量范围发现研究，以评估每日口服化合物1的安全性、最佳有效给药规则、稳态药代动力学和药效动力学。
·
主要目的是在mf患者中评估化合物1对以下方面的影响：安全性和耐受性
·
药代动力学(仅1/2a期)
·
脾脏体积减小
[0189]
探索性目标(可对部分或全部进行分析)包括在用化合物1治疗的mf患者中评估：
·
治疗方案在产生药效动力学作用方面的充分性
·
血液学应答(所有血液学参数可在治疗期间或中止药物持续指定时间间隔后进行评估，可能包含：全血细胞计数(cbc)，包括血小板、红细胞和白细胞(rbc和wbc)，以及循环母细胞计数；骨髓的细胞组成(母细胞％)；以及，胎儿血红蛋白的诱导)
·
采用骨髓增生性肿瘤症状评估表(mpn-saf)所评估的全身症状的改善
·
骨髓纤维化评分的降低
·
剂量和血浆谷浓度随时间变化的关系(仅1/2a期)
·
如通过恶性细胞特异性核酸标志物(dna或rna；核酸标志物包括通过测序或其它核酸测定方法检测的rna和/或dna突变)测量的疗法对疾病负荷的影响
·
治疗对细胞因子特征(细胞因子定量)的影响
·
恶性细胞的基因畸变与药效动力学应答之间的关系
·
并将传统的临床应答与探索性的应答评估相关联
[0190]
化合物1以多种强度的胶囊形式提供。基于化合物1游离碱，即活性物质，这些强度可包括：1mg、5mg、10mg、25mg和50mg。所提供的胶囊强度可能在整个研究期间发生变化。
[0191]
mf治疗的治疗目标是仅在24小时给药周期的一部分内抑制造血细胞中lsd1的活性，这足以减少驱动骨髓纤维化的细胞因子和生长因子的产生。安全和治疗性起始剂量的考虑因素包括慢性毒理学研究，与迄今为止先前研究中接受过化合物1治疗的患者的临床经验相结合。与该治疗目标和pk建模联合，选择0.25mg/kg/d的起始剂量(ds)用于本研究的
1/2a期部分。然而，所有患者均需要从该起始剂量开始多次向上滴定化合物1，以使血小板处于靶标血小板计数范围内，这表明ds应更高。随后生成剂量-应答曲线，该曲线提供了滴定算法来调整剂量，以达到每微升50,000-75,000个血小板(k/ul)的靶标血小板计数，如此设计目的是将重度血小板减少症的概率降至最低。排除最高和最低剂量，达到靶标范围内血小板计数所需的化合物1平均总日剂量为78.3mg(s.d.13.8，范围53-90mg)，或相当于大约0.7至1.2mg/kg/d。因此，为了使患者能够更快地达到最佳剂量，同时仍维持足够的安全边界，为进入本研究2b期部分的所有患者选择了新的0.5mg/kg qd的化合物1起始剂量。
[0192]
本研究设计使用了适用于靶向性非细胞毒性药物(如化合物1)的基于替代性模型的方法，其中未观察到暴露与毒性之间的单调关系(le tourneau等人,2009)。特别地，本研究采用在大鼠和狗中开发的剂量-毒性模型，该模型将在抑制血小板生成所需的稳态下末次给药(c
min
)后24小时的药物血浆浓度相关联。
[0193]
由于不存在因化合物1而急性中毒的非临床研究的证据，即使在极高剂量(人体等效剂量(hed)约20-40mg/kg)下，据信两名前哨患者足以建立起始剂量的急性安全性。因此，两名前哨患者以0.25mg/kg/d的最初的ds继续给药7天，并且在治疗任何其他患者之前每周监测两次。由于本研究并未调查细胞毒性剂的作用，因此通过给前哨患者给药建立安全性后，认为在循环基础上招募患者是合适的。招募患者，并且在循环基础上进行治疗。
[0194]
为确保患者安全，数据安全监查委员会(dsmc)每月对安全性参数和药效动力学标志物进行审查，以围绕化合物1的安全性和药效动力学作用得出结论。dsmc还审查了患者剂量滴定和建议的剂量调整，并且评估了第3天访视的必要性。在完成对每名前哨患者的7天治疗后的4天内，dsmc召开会议，并且确定其对以下是安全的：1.每名前哨患者继续给药(注意：在本次审查之前，给药没有中断)，以及2.开始用化合物1治疗另外的患者。研究实施
[0195]
本研究以1/2a期研究开始，评估起始剂量的安全性、85天的治疗持续时间以及化合物1的药代动力学和药效动力学作用，随后过渡至2b期研究，其中并入了早期药代动力学和药效动力学研究及安全性评估支持的变化。本研究由两个治疗期组成：初始治疗期(itp)，随后是另外的治疗期(atp)。患者开始招募至本研究的2b期部分，其中将itp延长使得患者每日接受治疗持续169天。也将atp延长，为符合条件的患者提供另外的169天的治疗。
[0196]
初始治疗期.在itp期间，患者最初会在第一周(itp第0、3和7天)每周返回两次进行研究评估；3名患者以新ds给药后，dsmc召开会议以评估第3天访视的必要性。在接下来的7周内(itp第14、21、28、35、42、49和56天)患者每周返回一次，至少每两周返回一次持续8周(itp第70、84、98和112天)，然后每月返回一次持续8周(itp第140和168天)。预期到第8周(第56天)，患者将达到稳定剂量，不再需要每周滴定。对于剂量未稳定的特殊患者，由pi的判断继续每周访视(注意：第112天后也可继续每两周访视)。在第84天和第168天，患者经历了腹部磁共振成像(mri)，或者如果该患者不是mri候选者，则接受计算机断层成像(ct)。在第168天，还需要进行骨髓取样。在第168天访视前或访视时，但理想情况下出于后勤目的，在第140天访视时进行“资格”评估，以确定患者是否获得临床益处(将
临床益处定义为不符合进行性疾病标准且安全地耐受化合物1；该定义适用于整个文献，并且将不会在每次提及临床益处时重复)。此类患者有资格进入atp，预期转变将在给药无中断的情况下发生。未获得临床益处的患者，或实现完全应答(cr)、部分应答(pr)或临床改善(ci)且随后复发(相当于治疗失败)的患者，停用化合物1并经历治疗结束(eot)、研究结束前(pre-eos)和研究结束(eos)访视。
[0197]
另外的治疗期.在atp中，如由主要研究人员所决定的，预期对那些获得临床益处的患者再继续治疗169天。每月(atp第0、28、56、84、112、140和168天)符合条件的患者返回进行研究评估。预期继续进行atp的患者将已经达到稳定剂量，不再需要频繁滴定。对于剂量未稳定的特殊患者，根据pi的判断继续每两周一次访视。在第168天，患者经历了与itp中相同的程序和评估，包括mri或ct(如果患者不是mri候选者)，以及骨髓取样。在第168天访视前或访视时，但理想情况下出于后勤目的，在第140天访视时，进行“资格”评估，以确定患者是否继续获得临床益处。因此，此类患者有资格重新进入atp，这是反复的；只要患者继续符合条件，他们就继续接受化合物1。
[0198]
根据该方案，招募至化合物1的先前临床试验的某些患者将在开始本文披露的延长的atp之前完成其当前治疗期。此类患者在治疗期间未经历任何清除期，但清除期内所规定的评估仍通过第84天访视时需要的mri(或ct)以及骨髓抽吸和活检进行。对于这些患者，“资格”评估发生在紧接第84天访视前的研究访视中。
[0199]
尽管消除了清除期，但仍进行了清除期间所规定的评估。所有患者均经历了随访期访视，包括末次给药后大约2天内的eot访视、末次给药后大约14天的eos前访视以及末次给药后大约28天的eos访视。未进入atp或提前停药的患者进入随访期，随访期从决定结束治疗后大约2天内的eot访视开始。
[0200]
在整个研究过程中，通过频繁监测临床体征和症状以及通过外周血和尿分析，密切跟踪患者的不良事件(ae)和毒性体征。通过频繁外周血的血液学评估以及必要的骨髓抽吸和活检，密切监测药效动力学作用。在整个给药过程中，如果需要，则根据标准机构指南进行输注。给药
[0201]
通过使用剂量滴定，所有患者均给药至所估计的人所需化合物1的剂量，该剂量在24小时给药周期的部分时间内提供足够的暴露以安全地抑制正常造血(指定为dpi)。
[0202]
初始治疗期(itp).对于进入研究2b期部分的所有患者，从第0天以ds为0.5mg/kg qd开始治疗。可以在每次临床访视时(第3天除外)进行剂量调整，根据来自先前访视的血液学值的比较，采用向上或向下剂量滴定，如根据以下规则所指示的。预期dpi为≤1.2mg/kg qd；然而，这不是滴定目标的上限，因为达到治疗作用所需的剂量在患者之间会有变化，并且可能随时间而改变。预期与临床显著治疗作用相关的血小板滴定靶标为血小板计数≥50,000至≤75,000/μl(50-75x109/l)。基于血小板评估、绝对嗜中性粒细胞(anc)和血红蛋白(hgb)计数的滴定和再激发规则如下所示。
[0203]
滴定规则.重要的：对于向上滴定，需要anc≥0.5x109/l(500/μl)和hgb》8g/dl(80g/l)。对于低于这些阈值的anc或hgb值，维持或调整当前剂量取决于如下表4所述的血小板计数。表4.
*dsmc可能推荐与上述不一致的向上或向下滴定。**以先前mg/kg剂量的50％再激发。￥再激发时，上述所有规则均重新适用。
§
注意如果自先前访视后血小板计数增加，则应遵循“《”规则。φ施用先前mg/kg剂量的75％，反映了25％的剂量减少。
[0204]
如果发生需要减少剂量的ae，可随时与医学监督员协商减少剂量。
[0205]
另外的治疗期(atp)：符合条件的患者将在atp第0天“重新开始”化合物1，按照上表的滴定规则继续进行剂量滴定；给药没有停止(即第168天＝新atp的第0天)。另外的剂量滴定可在与医学监督员协商后进行。
[0206]
研究持续时间.筛选程序可在治疗开始前长达28天开始。在研究期间，患者最初可接受长达169天的给药。末次给药后对患者进行了28天的随访。因此，预期参与本研究的期望持续时间为从第一名患者的首次访视(fpfv)到最后一名患者末次访视(lplv)至少32周。根据患者益处评估，可以给予另外的治疗。
[0207]
研究评估.下文概述的评估通过研究访视详细呈现。
[0208]
骨髓增生性肿瘤总症状评分评估表(mpn-saf tss)将在基线和从第0天到研究结束(eos)访视的每个访视日(第3天除外)完成。
[0209]
在整个eos访视期间，将在首次化合物1给药后的每次访视时评估不良事件(ae)。
[0210]
身体检查(pe)，包括生命体征：将在筛选时进行全面身体检查。在整个研究期间，将在所有其他临床访视时(第3天除外)时进行有限身体检查(lpe)。lpe包括体重、评估较先
前pe变化的身体系统检查和脾脏测量。应通过触诊从肋骨边缘到最大的脾突出点用软尺/胶带以厘米测量来确定脾边缘。所有访视时应以相同方式测量脾脏。
[0211]
将在筛选，基线(如果与筛选访视分开)，给药前第0天，整个研究期间的每月(即，第28、56、84、112、140和168天)，怀疑复发时，eot、eos前和eos/et访视时，以及如果在患者继续接受研究期间怀疑怀孕时，对具有生育潜力的女性(wocbp)进行尿液或血清妊娠测试。
[0212]
骨髓抽吸和活检将在以下时间点进行：
·
基线时(不超过首次化合物1给药前21天)。
·
在第168天(
±
7天)。
·
此后大约每6个月，在atp的第168天(
±
7天)，只要患者继续符合条件。
·
在eot和et时(除非在先前5周内已进行)，以及怀疑复发时(除非在过去21天内已进行或计划在接下来的7天内进行)。需要尽可能从第一次拉动开始抽吸，但不得晚于第二次拉动。itp期间需要进行的骨髓评估总数为约32周2次。仅当患者符合atp、证明应答后出现疑似复发或有进展性疾病的证据时，才需要进行另外的骨髓评估。
[0213]
将在以下时间点进行腹部的mri或ct(如果患者不是mri候选者)：
·
在给药前第0天(
±
2天)
·
在第84天和第168天访视(
±
7天)时
·
此后大约每6个月，在atp的第168天(
±
7天)，只要患者继续符合条件
·
在eot、et以及怀疑复发时(除非在先前5周内已进行)
[0214]
临床实验室测量：在筛选，基线(如果与筛选访视分开)，给药前第0天，怀疑复发时，以及在eot、eos前和eos/et访视时，并且根据以下进行以下实验室测量：
·
生物化学
–
整个研究期间每月一次(即，第28、56、84、112、140和168天)
·
手动分类的血液学
‑‑
整个研究期间的每次临床访视
·
凝血
–
整个研究期间每月一次(即，第28、56、84、112、140和168天)
·
尿分析
–
整个研究期间第84天和第168天
[0215]
细胞因子：样品收集时间点如下。
·
给药前第0天，第14、28、84和168天，以及每次atp第168天访视，只要患者继续符合条件
·
在eot时，和在et时(仅当患者在itp期间停药时才需要et)
[0216]
红细胞血红蛋白f(hbf)和f细胞％(仅选定部位/仅itp)：
·
给药前第0天、第84天和第168天
·
在eot时和et时(只有当患者在itp期间停药时，才需要两者)
[0217]
基因组分析：应在基线时收集种系样品；然而，可收集直至并包括给药前第1天。根据样品产量，重复取样可能是必要的。
[0218]
将在以下时间点收集血液样品用于基因组分析：
·
基线时(不超过首次化合物1给药前21天)
·
在第84天和第168天访视时
·
此后大约每6个月，每次atp第168天访视，只要患者继续符合条件
·
在eot、eos/et以及怀疑复发时
将按照骨髓取样计划对任何骨髓抽吸物样品进行基因组分析。
[0219]
药效动力学(pd)评估：将使用治疗期间和中止治疗指定时间间隔后收集的血液和骨髓样品来评估pd参数。可以进行以下各项：具有白细胞差异的全血细胞计数(cbc)；循环细胞因子的测量；和通过测序鉴定的rna和/或dna突变及其频率的测量；以及胎儿血红蛋白的诱导。将结合每个骨髓取样时间点进行骨髓评估，包括形态学和纤维化评分。
[0220]
合格标准.患者必须符合所有适用的纳入标准，且不符合任何排除标准。
[0221]
纳入标准：1.知情同意。2.年龄：在筛选时18+岁。3.按照世界卫生组织(who)骨髓增生性肿瘤诊断标准的pmf、按照iwg-mrt的ppv-mf、或按照iwg-mrt的pet-mf的诊断，并且符合以下另外的亚型特定标准：a.归类为高风险(3个预后因素)或中等风险2(2个预后因素)。预后因素，由国际工作组定义(cervantes等人,2009)：i.年龄》65岁；ii.存在全身症状(体重减轻、发热、盗汗)；iii.明显的贫血(hgb《10g/dl)(在筛选期间，必须证明非输血依赖性患者的血红蛋白值《10g/dl。出于评估风险因素的目的，接受定期输注浓集红细胞的患者将被视为血红蛋白《10g/dl。)；iv.白细胞增多病史[wbc》25x109/l(25,000/μl)]；v.循环母细胞》1％。4.对可用的经批准的疗法具有难治性或耐药性、未得到充分控制或对其不耐受，或根据研究人员的判断，这些患者不是可用的经批准的疗法的候选者(注意：经批准的疗法包括鲁索替尼)。5.东部肿瘤协作组(ecog)的行为状态评分≤2。6.第0天给药前外周母细胞计数≤10％。7.第0天给药前绝对嗜中性粒细胞计数≥0.5x109/l(500/μl)。8.第0天给药前血小板计数≥100x109/l(100,000/μl)。9.预期寿命》36周。10.已中止所有先前针对mpn的疗法，包括鲁索替尼、任何化疗剂、免疫抑制疗法(例如，皮质类固醇》10mg/天，除了以下指出的例外情况：允许使用皮质类固醇用于治疗痛风；允许维持性补充皮质类固醇疗法，如泼尼松≤10mg/天或皮质类固醇等效物)、免疫调节剂(例如，沙利度胺)、研究第0天前至少2周的放射疗法、以及研究第0天前4周的干扰素。允许使用低剂量的乙酰水杨酸。经医学监督员批准，可以考虑在治疗前《2周对非指数或骨病变进行姑息性放射治疗。11.在研究期间接受骨髓评估、外周血和尿液取样。12.能够吞咽胶囊。13.从筛选到最后一次化合物1给药后28天，具有生育潜力的女性(wocbp)和能育的男性必须同意使用经批准的避孕方法。避孕方法包括：抑制排卵的雌激素和孕激素组合的激素避孕；与抑制排卵相关的仅孕激素激素避孕；宫内节育器(iud)；双侧输卵管阻塞；一
夫一妻制性关系中输精管切除的伴侣(至少在给药前六个月进行输精管结扎或输卵管结扎)；以及完全性禁欲(定义为避免异性性交)。如果禁欲的患者在研究期间性活跃，他们必须同意使用经批准的避孕方法。胚胎胎儿毒性风险在28天内得到完全缓解，28天大于药物在本研究中所使用剂量下的10个半衰期。
[0222]
排除标准：1.在开始服用研究药物前≤4周经历过重大手术，或尚未从这种手术的副作用中恢复。2.在开始服用研究药物前2周内经历过任何外科手术，不包括小手术(如皮肤活检或中央静脉内导管放置/移除)。3.脾切除术病史。4.有造血干细胞移植病史或筛选后24周内计划进行造血干细胞移植。5.未消退的来自先前疗法的治疗相关毒性(除非消退至≤1级)。6.目前使用禁用药物(如罗米司亭(romiplostim))，或在使用研究药物治疗期间预计将需要使用这些药物中任一种。7.已知对与化合物1或lsd1抑制剂(即单胺氧化酶抑制剂；maoi)化学相关的药物具有即刻或延迟超敏反应或特异反应，该反应禁忌其参与。8.目前使用单胺氧化酶a和b抑制剂(maoi)。9.不受控制的活动性感染。10.并发第二活动性且不稳定的恶性肿瘤(并发第二活动性但稳定的恶性肿瘤(如非黑色素瘤皮肤癌)的患者符合条件)。11.具有筛选出血风险时的证据，包括以下任何一项：a.激活的部分促凝血酶原激酶时间(aptt)≥1.3x局部正常上限b.国际标准化比率(inr)≥1.3x局部正常上限c.与骨髓增生性障碍或其治疗无关的重度血小板减少症或血小板功能障碍病史d.已知出血障碍(例如，异常纤维蛋白原血症、因子ix缺乏、血友病、维勒布兰德氏病(von willebrand's disease)、弥散性血管内凝血[dic]、纤维蛋白原缺乏或其他凝血因子缺乏)12.具有筛选重大肾功能不全或肝功能不全(除非是由于溶血或白血病浸润)时的证据，如通过以下任何局部实验室参数所定义的：a.计算的肾小球滤过率(gfr；使用科克罗夫特-高尔特方程)《40ml/min或血清肌酐》1.5x局部正常上限b.天冬氨酸转氨酶(ast)或丙氨酸转氨酶(alt)≥2x局部正常上限13.已知的人类免疫缺陷病毒(hiv)感染或已知的活动性乙型或丙型肝炎病毒感染(测试将不作为筛选程序的一部分进行)。14.任何可能干扰药物吸收(例如慢性腹泻)、混淆研究结果或因参与研究而对患者构成另外风险的疾病/胃肠(gi)功能损害的病史；经历胃旁路手术的患者。15.在研究第0天之前的不到14天内使用研究药剂，或该药剂的至少有7个半衰期的等效物(以较长者为准)。16.妊娠或哺乳期女性；打算在研究期间的任何时间怀孕的女性。
[0223]
安全指南.通常，支持性护理(输血、施用抗真菌剂等)应根据机构政策进行维持。另外，建议对血小板计数≤10x109/l(10,000/μl)的患者进行输血。在研究期间，在出现增殖的情况下，可使用羟基脲：a)在主要研究人员判断下，对于白细胞计数≥30x109/l(30,000/μl)，并且大部分细胞似乎为未成熟细胞(骨髓细胞/早幼粒细胞)的情况，开始羟基脲治疗；以及b)当白细胞计数《10x109/l(10,000/μl)，中止羟基脲治疗。应密切监测服用可能诱导或抑制cyp3a4或cyp2d6的药物的患者，了解共施用的潜在影响；应特别注意唑类的抗感染药物。
[0224]
禁用药物/治疗.1.除羟基脲外的所有细胞毒性剂2.血小板形成剂：罗米司亭、艾曲波帕3.泼尼松或泼尼松龙》10mg/天(注意例外情况为：允许使用皮质类固醇用于治疗痛风)和地塞米松》4mg/天。允许维持性补充皮质类固醇疗法，如泼尼松≤10mg/天，或皮质类固醇等效物。4.单胺氧化酶a和b抑制剂5.当患者血小板计数《50x109/l(50,000/μl)时，禁用抗凝血剂和非类固醇抗炎药(nsaid；包括阿司匹林)。lsd1抑制可能诱导血细胞减少，进而可能导致粒细胞和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(g-csf和gm-csf)及促红细胞生成素(epo)升高。尽管未明确禁止，但在粒细胞减少或贫血(分别继发于lsd1的抑制)的情况下外源给予g-csf、gm-csf和epo不太可能具有临床益处。
[0225]
研究毒性的管理.将使用美国国家癌症研究所(nci)于2010年6月14日发布的不良事件通用术语标准(ctcae)4.03版评估不良事件强度。
[0226]
血液学毒性：血液学值超出正常参考范围是mpn的固有特征，并且也是治疗这些疾病的许多治疗性尝试的预期效果。预期在人体内会出现在非临床和临床研究中观察到的化合物1对正常骨髓造血的影响；这些影响是化合物1对lsd1抑制的药效动力学作用，因此未被视为不利的。除以下情况外，这些事件将不被视为dlt。
[0227]
剂量限制性毒性(dlt)：初始治疗期第7天内发生的，研究人员认为可能、也许或明确与化合物1相关的以下任一ae：
·
导致具有临床意义的并发症(即，临床上显著的出血事件*或需要预防性输血)的血小板减少；
·
血小板计数》50,000x109/l(50,000/μl)的患者发生临床上显著的出血事件，其中临床上显著的出血事件被定义为危及生命、无法控制和/或导致血液动力学不稳定的事件；ο任何4级或5级非血液学不良事件；ο任何在停药7天内未能恢复至2级的3级非血液学不良事件，以下情况除外：
·
应答于标准医疗护理的≥3级恶心、呕吐或腹泻
·
≥3级无力，持续14天以下
·
任何与潜在的恶性肿瘤无关且持续超过24小时的3级电解质异常。如果认为继续服用化合物1对患者安全，则经历dlt的患者可将其剂量向下调整。
[0228]
停止规则.如果出现以下情况，将中止治疗：dlt后，认为患者继续服用化合物1不
安全；由于dlt导致的剂量减少后，患者在21天内未能证明有显著改善；或由于血小板计数低于25x109/l(25,000/μl)而暂时中断化合物1后，患者的血小板计数在21天内未恢复至》50x109/l(50,000/μl)。
[0229]
结果.本研究招募了13名患者；到目前为止，85％的患者仍处于研究中。
[0230]
在第12周时所有患者的特征如下：
·
总症状(n＝32)ο78％(25)症状评分降低ο25％(8)降低了≥50％
[0231]
在第12周时2b期患者的特征如下：
·
脾脏体积(n＝14)ο86％(12)脾脏体积减小ο14％(2)减小了≥35％ο29％(4)减小了≥20％ο到第12周变化的中值＝-15％
[0232]
图11(a)和图11(b)分别示出了12周期间mpn saf tss和脾脏体积的绝对变化。
[0233]
图12示出了在196天的过程中患者008-103的治疗进展。小图(a)示出了lsd1抑制剂的剂量滴定，单位为mg。以下小图示出了该给药方案的作用：(b)脾脏大小，cm；(c)症状评分；(d)血小板(左刻度，k/ul)和血红蛋白(右刻度)；(e)wbc和嗜中性粒细胞；以及(f)疲劳评分(10＝最严重)。实例3：测序方案
[0234]
测序方案的特征如下：
·
样品：种系(颊或头发)和“肿瘤”(骨髓、外周血、粒细胞)
·
靶富集：idt aml组中11,736个杂交探针靶向髓系肿瘤中复发突变的261个基因(约6300个外显子)
·
依诺米那公司(illumina)测序：2x150 bp的配对末端测序；每个样品测序约1000万对
·
目标测序深度》500；实际值：》90％的样品为》1000
·
分析：burrows-wheeler比对(bwa)＝》varscan2基因型＝》calr的igv等。
·
体细胞调用(somatic calls)的截止值：测序深度：》20突变体(或变体)等位基因频率(vaf)：》15％
·
注释：所有调用均已提交至华盛顿大学的cadd(组合注释依赖性耗减)οcadd评分截止值》20，鉴定了最有害的突变的前1％
[0235]
观察到以下情况：
·
7/22(32％)示出了部分或所有体细胞突变降低
·
12/22(55％)具有稳定的vaf
·
3/22(14％)的患者具有增加的vaf
·
随访550+天的患者中未发现新的突变
·
没有进展至aml
[0236]
下表呈现了mpn体细胞突变和其他体细胞突变，以及随访时的vaf
[0237]
下表呈现了研究中改变患者vaf的实例。
[0238]
通过以上的说明，本领域的技术人员可以很容易地确定本发明的实质特征并且在不偏离本发明的精神和范围的情况下可以对本发明作出不同变化和修改，以使它适应不同用途和条件。
[0239]
提供以上列出的详细描述是为了帮助本领域的技术人员实践本披露。然而，本文描述和要求权利的本披露的范围并不受本文所披露的具体实施例的限制，因为这些实施例旨在阐明本披露的若干方面。任何等效的实施例都旨在处于本披露的范围之内。事实上，除了本文所示和所述的那些，本披露的各种修改根据前面描述对于本领域技术人员来说也将变得清楚，这些修改并不偏离本发明发现的精神或范围。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围之内。
[0240]
在本说明书中引用的所有参考文献都通过引用而特此并入。对本文的参考文献的讨论只是为了总结其作者做出的主张，并非承认任何参考文献构成与专利性有关的现有技术。申请人保留质疑提及的参考文献的准确性和相关性的权利。