用于从细胞生产养殖肉类、组织和相关产品的系统的制作方法

1.本发明的实施例涉及细胞培养的改良系统和方法。本发明的实施例还涉及肉类生产和组织结构/工程的改良系统和方法。


背景技术：

2.动物肉蛋白质含量高，足够提供构建用于支持身体所需蛋白质的所有氨基酸。传统食用肉是从农场饲养的动物或鱼类中获取的。然而，农业和水产养殖业消耗大量的能源和资源，其碳足印亦高。农业或水产养殖生产的肉类亦会对公共健康造成威胁，因为肉类可能在生产过程中接触到致病原、污染物和毒素。人口增长、肉类需求增加、环境问题、土地和水资源有限、生物多样性丧失以及对动物屠宰的负面看法等一系列问题促使科学家开发出替代生产肉类的技术。
3.体外细胞培养肉生产是指利用细胞培养技术在实验室中培养动物肌肉组织或器官组织以制造肉类和肉制品的过程。如本文所述，体外细胞培养肉和肉制品包括动物蛋白制品以及可溶性和固体的非肉制品。虽然体外细胞培养肉和肉制品仍处于早期开发阶段，与传统肉制品相比，体外细胞培养肉和肉制品具有更多优势，例如健康和环境上的优势，以及对动物的好处。体外细胞培养肉和肉制品是下一代新兴技术，属于比细胞农业或从细胞培养制造农产品更广阔的领域。
4.从动物活检中获取的细胞(例如肌肉细胞、体细胞、干细胞等)可以作为用于生产体外细胞培养肉的细胞，这些细胞被放在生物反应器或其他无菌环境的培养基中独立于动物活体生长。细胞可以通过在生物反应器中的可食用三维支架上，模仿动物器官生长成半固体或固体。起始细胞可以是直接从动物组织中获得的原代细胞，也可以是连续细胞系。如果在正确的条件下及适当的培养基中生长，原代细胞将根据其细胞脱氧核糖核酸末端端粒的长度所限的次数生长和增殖。而连续细胞系则可以在体外长期培养。细胞生物学端粒研究已经能够将原代细胞转化为不朽的连续细胞系。通过利用病毒癌基因、化学处理或端粒酶逆转录酶的过度表达，我们可以将原代细胞转化为连续的细胞系，以防止端粒缩短。
5.培养基含有细胞增殖所需的成分，如氨基酸、盐、维生素、生长因子和缓冲系统，以控制ph值。目前的方法是向培养基中添加胎牛血清(fbs)，以提供重要的大分子、生长因子和免疫分子。然而，胎牛血清来自未出生的小牛不符合不含动物产品的指标。因此从事生产体外细胞培养肉研究的科学家认为在无动物成分的培养基中培养细胞是的一个重要的因素。而某些生长因子可能来自于人类。
6.目前的体外细胞培养肉生产涵盖大多数商品肉类种类，例如基于细胞的牛肉、猪肉和家禽肉类。然而，这些肉类具有复杂的组织结构和涉及多种细胞，当前的生物医学技术难以生产这些肉类，成本也很高。体外细胞培养肉生产还缺乏提高肉类蛋白质水平和生物产量的非转基因方法。此外，如上所述，当前的细胞培养技术仍然依赖动物成分(如胎牛血清)作为营养源，以及昂贵的非食品级生长因子。
7.在养殖肉的生产或再生医学/组织工程/组织构建的临床应用中，收获足够数量的
细胞是至关重要的。在养殖肉的生产应用中，一公斤的蛋白质大约含有8
×
10
12
个肌肉细胞。在再生医学的应用中，大多数应用的治疗每次需要大约10
10
到10
12
个细胞。例如，需要1x 109到2x 109心肌细胞来替换成人受损的心脏组织。治疗肝功能衰竭需要10
10
个肝细胞。
8.当前的细胞培养方法是在培养基的存在下将细胞接种在培养容器的二维培养表面上。一般来说，培养基中含有葡萄糖、维生素、无机盐、氨基酸等营养物质。随着细胞的生长，营养物质逐渐耗尽，代谢废物积累。因此，每二至三天更换一次培养基，以补充营养和去除废物。这种细胞培养方法存在几个问题。首先，细胞在培养基更换之间的次优条件下生长。特别是如果细胞高度增殖并具有高代谢率，细胞会在短时间内消耗葡萄糖等营养物质并积累乳酸和氨等废物。代谢废物或生长抑制剂水平升高会抑制细胞生长。这会阻碍细胞在下一轮培养基更换之前以最佳速率生长。其次，更换培养基会浪费营养物质和生长因子；并增加生产成本。用过的培养基中被更换时仍含有营养物质。特别是，用过的培养基中的生长因子(来自血清补充剂或由细胞分泌)在培养基更换期间被去除。这增加了血清补充剂的使用，血清补充剂占培养基成本和生产成本的很大一部分。第三，需要手动更换培养基，这增加了生产成本和在大规模生产中污染的机会。
发明概要
9.本发明提供可供人类食用的体外细胞培养肉类的生产方法，为上述挑战提供解决方案。
10.本发明的一个目的是提供一种用于扩大细胞生产的替代系统和方法，从而降低养殖肉类和组织工程/再生医学/组织构建应用的成本并扩大生产。本发明的另一个目的是提供一种用于细胞生产的系统，该系统维持最佳培养条件、稳定的营养水平和/或的最低水平的生长抑制剂。本发明的又一目的在于提供一种大规模细胞培养系统，该系统能够自动补充养分，去除细胞产生的生长抑制剂，同时保留未使用的生长因子以提高产量和降低成本。
11.本发明的另一个目的是提供一种使用细胞培养系统制作肉制品的方法。此外，本发明的一个目的是提供一种使用该培养系统进行组织工程/构建的方法。最后，本发明的一个目的是提供一种用于将细胞扩增至临床相关数量以用于再生医学应用的方法。
12.本发明具有以下优点：(1)将培养基中的营养物质如葡萄糖保持在最佳水平，将废物如氨和乳酸保持在低水平，以实现最佳的细胞活力和细胞生长；(2)于培养基中保留细胞分泌的生长因子和减少源自动物的血清的使用。生长因子是昂贵的，因此本发明通过将生长因子保留在培养基同时去除废物来帮助降低成本并优化培养基的使用。
13.如下文将更详细讨论的，与常规技术相比，本发明显着地(1)减少了从细胞培养系统中排放的废物，并且(2)增加了细胞的大量生产。
14.根据本发明的一个实施例，本发明提供一个细胞培养系统，该系统包括被配置为容纳至少一种类型的细胞的细胞培养单元；一个新鲜培养基单元，以向细胞培养单元供应和接收第一流体；一个废物去除单元，以供应和从新鲜培养基单元接收第二流体；第一个泵，该泵连接在细胞培养单元和新鲜培养基单元之间，用于循环第一流体；第二个泵，该泵连接在新鲜培养基单元和废物去除单元之间，用于循环第二流体，其中细胞培养单元、新鲜培养基单元和废物去除单元彼此分开以避免交叉污染。
15.根据本发明的另一个实施例，本发明提供一种使用本发明的细胞培养系统培养细
胞培养物的方法，该方法包括如下步骤:将至少一种类型的细胞放入细胞培养单元的；在细胞培养单元和新鲜培养基单元之间循环第一流体；在新鲜培养基单元和废物清除单元之间循环第二流体；在新鲜培养基单元处将废物从第一流体提取到第二流体；在新鲜培养基单元处从第二流体向第一流体补充营养。
16.本发明的实施例应用用于人类食用和/或组织工程/组织构造/再生医学应用的体外细胞培养肉类生产的系统和方法，其为上述挑战提供解决方案。
17.附图简要说明
18.为更好地理解本发明，可以参考详细说明并结合附图一并考虑。图中的组件不一定按比例缩放，而是强调解说本发明背后的原理。
19.图1是根据本发明一个实施例的通过体外细胞培养进行肉类生产的方法的流程图。
20.图2是根据本发明一个实施例用于增强转录后蛋白质表达的方法的示意图。
21.图3是根据本发明一个实施例用于增强转录后表达胶原1型α1(col1a1)的方法的示意图。
22.图4是根据本发明一个实施例用于增强转录后表达胶原1型α2(col1a2)的方法的示意图。
23.图5是根据本发明一个实施例，用于体外细胞培养肉类生产的具有固相生物反应器的示意图或概念横截面图。
24.图6是根据本发明的一个与图5类似的实施例，但具有第二固相的生物反应器的示意图或概念横截面图。
25.图7是根据本发明一个实施例的细胞培养系统的示意图。
26.图8是根据本发明一个实施例的新鲜培养基单元的示意图。
27.图9是根据本发明一个实施例的废物去除单元的示意图。
28.图10a显示在第0天在基于胶原的支架中培养的hek293细胞的明场图像和live/dead染色图像。图10b显示第4天在基于胶原的支架中培养的hek293细胞的明场图像和live/dead染色图像。图10c显示在第11天在基于胶原的支架中培养的hek293细胞的明场图像和live/dead染色图像。
29.图11显示了经图7的细胞培养系统中培养11天后产生及从此提取的细胞团的图像，细胞团通过胰蛋白酶消化和离心从基于胶原的支架提取。在细胞培养系统中生长的细胞生长形成比对照组中体积大得多的微组织。微组织团块在细胞培养系统中观察到，但在对照组中则没有。生物反应器，在细胞培养系统原型中培养的细胞。对照组，在6孔板中培养的细胞。
30.图12是在细胞培养系统和6孔板中细胞培养11天后培养基中葡萄糖浓度的变化图。
31.详细说明
32.图1显示用于生产体外细胞培养肉的方法10。如本文所述，“体外细胞培养肉生产”是指基于细胞的肉类生产过程或基于细胞的农业过程，其中来自动物和/或植物的组织在实验室中使用细胞培养技术增长以制造肉类和肉类产品。在区块12，组织从动物或植物中分离。在一个实施例中，该组织源自硬骨鱼纲的骨性鱼，包括咸水鱼，例如石斑鱼、鲈鱼或黄
鱼。在其他实施例中，其他类型的动物组织也可以被分离，例如牛组织。在一些实施例中，区块12可从鱼收集器官组织，例如鱼鳔，并制备细胞悬浮液。尽管以下描述主要源自鱼类的组织，但这些概念可应用于源自其他动物和/或植物的组织，以提供其他类型的体外细胞培养肉和/或动物蛋白产品，以及素食肉和/或蛋白产品。
33.许多分离的细胞是成体细胞，可以使用医学研究中已建立的各种方法使其持续增殖(区块14)。例如，特定基因，如山中(yamanaka)因子，可用于将成年细胞重新编程为干细胞，如诱导多能干细胞(ipsc)。作为替代选择，分离的成年细胞可以通过端粒酶逆转录酶的过度表达转化为连续的细胞系。在其他实施例中，可分离其他类型的细胞，例如成体干细胞和胚胎干细胞。在这方面，应当理解，本发明的方法包括细胞系的所有来源。
34.在下一个区块16中，通过在无菌室或容器(如生物反应器)中附着/粘附食品级生物兼容性支架，将细胞生长为模拟动物器官(如鱼器官)的固体或半固体结构。无菌室或容器可进行温度控制，并可具有入口和出口，用于引入和移除化学物、营养素和细胞等物质。食品级生物兼容性支架最终成为食用产品的一部分，由基于植物或基于真菌的材料制成，例如但不限于琼脂糖、海藻酸钠、壳聚糖、菌丝体和魔芋葡甘聚糖。海藻酸钠是一种从褐藻中自然提取的生物聚合物，具有生物兼容性。此外，从真菌中提取的植物性壳聚糖具有抗菌性能。在一些实施例中，区块16在没有抗生素或抗菌化合物的无菌容器中进行。区块18涉及向生物反应器提供培养基以支持细胞存活和生长。培养基可以是含有不同成分的缓冲溶液,所述成分包括但不限于无机盐(例如氯化钙(cacl2)、氯化钾(kcl)、氯化钠(nacl)、碳酸氢钠(nahco3)、磷酸二氢钠(nah2po4)、硫酸镁(mgso4)等)、氨基酸、维生素(例如硫胺素、核黄素、叶酸等)，和其他成分如葡萄糖，β-巯基乙醇、乙二胺四乙酸(edta)和丙酮酸钠。生长培养基的非限制性示例包括但不限于莱柏维兹的l-15(leibovitz’s l-15)培养基、eagle’s培养基(mem)、培养基199、杜尔贝科的改良eagle培养基(dmem)、ham’s f12营养混合液、ham’s f10营养混合液、maccoy’s 5a培养基、glasgow改良eagle培养基(gmem)、iscove’s改良dulbecco培养基和rpmi 1640。
35.根据区块20，将食品级生长因子和细胞因子引入生物反应器中的培养基中能够支持细胞生长和增殖。生长因子和细胞因子可包括但不限于胰岛素生长因子1(igf-1)、胰岛素、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素6受体(il-6r)、白细胞介素11(il-11)、成纤维细胞生长因子(fgf)、表皮生长因子(egf)和转铁蛋白。区块20可涉及在没有胎牛血清(fbs)的情况下共同培养生物工程细胞和分离细胞。生物工程细胞被改造以分泌上述生长因子和细胞因子，并根据生长和增殖的需要向分离细胞提供这些生物分子。
36.如本文所述，“生物工程”细胞并不等同于转基因细胞。生物工程细胞有一个特定的基因，该基因过度表达一种或多种特定的蛋白质。生物工程细胞可以是鱼细胞，也可以是其他类型的动物细胞，如牛细胞。生物工程细胞不存在于最终的肉制品中。作为非限制性示例，生物工程鱼细胞可与分离的鱼细胞共同培养，或生物工程牛细胞可与分离的牛细胞共同培养。本发明的共同培养方法消除了培养基中对动物源性胎牛血清(fbs)的需要。此外，该共同培养方法在原位向正在生长的分离细胞持续提供食品级特异性生长因子和细胞因子，并简化生产过程和降低生产成本。然而，在其他实施例中，fbs或其他血清可用于供应生长因子、细胞因子和其他营养物以支持块16期间的细胞生长。
37.此外，根据区块22，细胞中的蛋白质表达或可被增加以提高所得肉制品中的生物
量产量。如本文所用，“生物量产量”是指所得肉制品中可消化物质(例如蛋白质)的量，该物质在消耗后可用于能源生产。具体来说，区块22涉及通过改变细胞中的微核糖核酸水平来增加蛋白质表达，并在培养之前对细胞进行操纵。微核糖核酸是一种内源性的、短的、非编码的单链核糖核酸序列，涉及调节转录后基因的表达。区块22涉及通过促进信使核糖核酸(mrna)翻译增加蛋白表达的上调微核糖核酸的数量，和/或通过抑制信使核糖核酸翻译减少蛋白表达的下调微核糖核酸的数量。通过向细胞中引入微核糖核酸、微核糖核酸模拟物或微核糖核酸抑制剂，可以增加或减少微核糖核酸的水平。微核糖核酸模拟物具有与微核糖核酸相同的功能，但在调节蛋白质表达方面可能更稳定和有效。在一些实施例中，电穿孔法可用于将游离型载体引入执行表达特定微核糖核酸指令的细胞。作为替代选择，或与此相互结合，腺相关病毒可以用作携带游离型指令的载体，以表达特定的微核糖核酸。通过转染将目标微核糖核酸抑制剂引入细胞，可以减少目标下调微核糖核酸的数量。要注意的是，根据本发明增加蛋白质表达/生物量产量的方法是在不修改细胞基因组的情况下进行的。
38.图2概要性地描绘了细胞系中增强转录后蛋白质表达的方法。可以增加一个或多个上调微核糖核酸(mirna)，以增加所选蛋白质的信使核糖核酸翻译和蛋白质生产。作为替代选择，或与此相互结合，一个或多个下调微核糖核酸可被抑制剂(抗微核糖核酸)阻断，以增加所选蛋白质的信使核糖核酸翻译和蛋白质生产。
39.鱼鳔主要包括成纤维细胞和胶原蛋白。i型胶原(胶原蛋白i)是鱼鳔中的主要蛋白质，增加培养的鱼鳔细胞中i型胶原的表达可能会提高生物产量。鱼鳔细胞中的i型胶原包括胶原1型α1(col1a1)和胶原1型α2(col1a2)。col1a1和col1a2的表达通过上调微核糖核酸21(mir-21)而增加，因此提高上调微核糖核酸21的水平可提高鱼鳔细胞中胶原1型α1和胶原1型α2的生成。此外，下调微核糖核酸29a(mir-29a)可降低胶原1型α1和胶原1型α2的表达，因此降低下调微核糖核酸29a的水平或阻断下调微核糖核酸29a的作用可提高鱼鳔细胞中胶原1型α1和胶原1型α2的生成。图3-4显示通过提高上调微核糖核酸21水平和通过使用抑制剂(抗mir29a)阻断下调微核糖核酸29a的作用来提高胶原1型α1(图3)和胶原1型α2(图4)的生成。胶原1型α1和胶原1型α2产量的增加使肉制品的产量增加。类似的策略可用于提高其他类型动物细胞中的相关蛋白质水平。
40.图5显示用于培养分离细胞的示例性生物反应器30。细胞附着在由食品级支架34提供的固相支架32上并在其上生长，该支架34固定在生物反应器30的无菌室36中。支架34可以决定肉制品的形状。食品级支架34由基于植物或基于真菌的材料制成，例如但不限于琼脂糖、海藻酸钠、壳聚糖、菌丝体和魔芋葡甘聚糖。固相支架32可以是多孔的，以便细胞可以附着支架32的内表面并在其上生长。向细胞提供营养的培养基通过入口38引入生物反应器30，并通过出口40从生物反应器30中排空。
41.图6所示的生物反应器50类似于图5的生物反应器30，不同的是生物反应器50还包括第二固相52，而第二固相52通过细网54与固相支架32分隔开。第二固相52可包含或支持生物工程细胞，该生物工程细胞会在其原本位置为固相支架32上生长的细胞分泌营养素、生长因子和细胞因子，并可将生物工程细胞与固相支架32上的细胞分离。第二固相52由基于植物的材料制成，类似于固相支架32。营养素、生长因子和细胞因子可渗透网54，细胞则不能渗透网54。图6的生物反应器50允许生物工程细胞与生长细胞共同培养。在某些实施例中，图5和6的生物反应器可以串联布置。在其他实施例中，多个生物反应器30可以与多个生
物反应器50或生物反应器30和50的混合串联布置，以扩大规模。生物反应器30可主要用于生物质生产，而生物反应器50则可用于向生长细胞提供营养、生长因子和细胞因子。
42.图7示例性地演示细胞培养系统100:包括细胞培养单元102、新鲜培养基单元104和废物去除单元106。细胞培养单元102通过泵108a和108b连接到新鲜培养基单元104使得第一流体可以通过泵108a从细胞培养单元102流到新鲜培养基单元104，并且第一流体可以通过泵108b从新鲜培养基单元104流到细胞培养单元102。从而第一流体在细胞培养单元102和新鲜培养基单元104之间循环。
43.新鲜培养基单元104通过泵108c和108d进一步连接到废物去除单元106，使得第二流体可以通过泵108c从新鲜培养基单元104流到废物去除单元106并且第二流体可以通过泵108d从废物去除单元106流到新鲜培养基单元104。从而，第二流体在新鲜培养基单元104和废物去除单元106之间循环。第一流体可以是细胞培养基，其可以包括补充有fbs、生长因子或细胞因子的基础培养基。生长因子或细胞因子可包括但不限于胰岛素生长因子1(igf-1)、胰岛素、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素6受体(il-6r)、白细胞介素11(il-11)、成纤维细胞生长因子(fgf)、表皮生长因子(egf)和转铁蛋白。第二流体可以是新鲜的基础培养基，其可以包括缓冲溶液，该缓冲溶液含有诸如但不限于无机盐(例如氯化钙(cacl2)、氯化钾(kcl)、氯化钠(nacl)、碳酸氢钠(nahco3)、磷酸二氢钠(nah2po4)、硫酸镁(mgso4)等)、氨基酸、维生素(如硫胺素、核黄素、叶酸等)，以及其他成分如葡萄糖、β-巯基乙醇、乙二胺四乙酸(edta)和丙酮酸钠等成分。生长培养基的非限制性示例包括但不限于莱柏维兹的l-15(leibovitz’s l-15)培养基、eagle’s培养基(mem)、培养基199、杜尔贝科的改良eagle培养基(dmem)、ham’s f12营养混合液、ham’s f10营养混合液、maccoy’s 5a培养基、glasgow改良eagle培养基(gmem)、iscove’s改良dulbecco培养基和rpmi 1640。
44.泵108可以是蠕动泵或任何其他类似的合适的泵。
45.细胞培养系统100包括一个或多个容器。每个细胞培养单元102、新鲜培养基单元104和废物去除单元106可以是一个容器。在一些实施例中，细胞培养系统100可以包括多于一个的细胞培养单元102、新鲜培养基单元104和废物去除单元106。多个细胞培养单元102可以并联或串联连接并且彼此靠近设置。多个新鲜培养基单元104可以并联或串联连接并且彼此靠近设置。多个废物去除单元106可以并联或串联连接并且彼此靠近设置。
46.在一些实施例中，细胞培养系统100还可以包括气源，该气源被配置为向细胞培养单元102中的细胞供应气体。气源可以是氧气或二氧化碳。
47.细胞培养单元102被配置为支持支架和培养基，使得细胞可以生长成固体或半固体结构。在一些实施例中，通过将食品级生物兼容性支架附着/粘附到细胞培养单元102的内部，细胞生长成模拟动物器官例如鱼器官的固体或半固体结构。细胞培养物单元102可以被配置为包含至少一种类型的细胞。合适的细胞类型包括但不限于骨、软骨、肌肉、肝脏、皮肤、心脏、肺及其任何组合。在本发明中可以使用其他类型的哺乳动物细胞或鱼细胞。亦可以使用来自其他植物和动物物种的细胞。其他起始细胞可以是各种来源的干细胞，例如间充质干细胞、诱导多能干细胞和卫星细胞。起始细胞也可以是转基因细胞或任何细胞系。也可以使用生物工程细胞。
48.在细胞培养单元102中扩增的不同类型的特化细胞可以通过活体动物的活检获得。
49.细胞培养单元102还可以包括入口和出口，入口被配置成通过泵108b从新鲜培养基单元104接收第一流体，出口被配置成通过泵108a将第一流体移出/释放到新鲜培养基单元104。细胞培养单元102还可以包括被配置为将细胞培养单元102的内部加热到预定温度的加热装置和将细胞培养单元102内的温度保持在所述预定温度的温度控制单元。预定温度可以在大约25℃到45℃的范围内。
50.细胞培养物还可以包括至少一个搅拌器，该搅拌器被配置为以预定速度搅拌细胞培养单元102内的第一流体。预定值可以是大约从每分钟10转(rpm)到300rpm。
51.细胞培养单元102还可以包括出气口和与气源相连的进气口，气源可以是氧气或二氧化碳。氧气或二氧化碳可以通过气体入口供给到细胞培养单元102中以优化细胞培养条件。废气可通过气体出口排放。气体的流动可以由阀门控制。
52.在一些实施例中，细胞培养单元102可以是如图5所示的生物反应器30。然而在一些实施例中，细胞培养单元102可以是如图6所示的生物反应器50。在一些实施例中，细胞培养单元102是容器。在一些实施例中，细胞培养单元102可以是任何尺寸。在一些实施例中，细胞培养单元102的体积可以在0.1l-2000l的范围内。
53.参照图8，新鲜培养基单元104可以包括第一流体入口110和第一流体出口112，其被配置为分别连接到泵108a和泵108b。此外，新鲜培养基单元104还可以包括分别连接泵108d和泵108c的第二流体入口114和第二流体出口116。此外，新鲜培养基单元104可包括至少一个第一透析单元118，第一透析单元118具有由第一透析膜123隔开的第一流体隔室120和第二流体隔室122。第一流体入口110和第一流体出口112连接到第一流体隔室120。第二流体入口114和第二流体出口116连接到第二流体隔室122。不同类型的透析膜123包括纤维素酯(ce)、再生纤维素(rc)或聚偏二氟乙烯(pvdf)可被使用。不同截留分子量(mwco)的透析膜123可用于将所需的大分子保留在第一流体中(例如培养容器中细胞所分泌的生长因子)并允许在第一透析单元118中的第一流体中去除废物。例如，100da
–
1,000,000da的mwco膜，优选500da的mwco膜，可用于保留胰岛素样生长因子(igf，重组形式的大小为7.5kda)和转化生长因子-β(tgf beta，pro tgf-beta大小为44kda)并允许从第一液体中去除乳酸(89da)和氨(17da)。这种膜还可以允许第二流体中的营养物质例如葡萄糖(180da)穿过膜进入第一流体以进行补充。
54.新鲜培养基单元104可以在任何一个或两个隔室中包括至少一个搅拌器，该搅拌器被配置为以预定速度搅拌透析单元内的流体。预定速度可以是大约从10rpm到500rpm。
55.新鲜培养基单元104还可以包括分离的入口和出口，其连接到一个或两个隔室以添加、补充和去除所需的流体。所需的流体可以是细胞培养基、新鲜的基础培养基和/或分化培养基。
56.如图9所示，废物去除单元106可以包括废物入口124和补足出口126，其被配置为分别连接到泵108c和泵108d。此外，废物去除单元106还可以包括废物去除入口128和废物去除出口130。此外，废物去除单元106可以包括至少一个第二透析单元132，第二透析单元132具有一个废物隔室134和一个废物去除隔室136,两者以第二透析膜137隔开。废物入口124和新鲜介质出口116连接到废物隔室134。废物去除入口128和废物出口130连接到废物去除隔室136。废物去除单元106可以使用其他废物去除技术以去除第二流体中的废物。例如，可以通过使第二流体通过沸石作为吸附剂来进行废物去除。沸石是微孔的铝硅酸盐矿
物。例如是方沸石、菱沸石、斜发沸石、片沸石、钠沸石、钙沸石和辉沸石。废物去除单元106可以包括填充床沸石柱。第二流体从废物去除单元106的一端流入，穿过沸石并从废物去除单元106的另一端离开。沸石吸收第二流体中的有毒化学物质或抑制细胞生长的化学物质，例如氨和乳酸。
57.废物去除单元106被配置为去除第二流体中的代谢废物，例如氨和乳酸，并允许废物培养基保留最大量的营养物，例如葡萄糖。100da
–
1,000,000da mwco，优选100da mwco的透析膜可用于允许氨和乳酸进入透析液，而葡萄糖保留在第二流体中。进入废物去除隔室136的透析液可以是磷酸盐缓冲盐水(pbs)或任何其他缓冲液。
58.在一些实施例中，细胞培养单元102、新鲜培养基单元104和废物去除单元106中的每一个可以是可移除的插件模块。上述单元的入口和出口中的每一个可以与细胞培养系统100的泵的入口和出口连接和/或断开。例如，新鲜培养基单元104或废物去除单元106可以被快速更换为将其从系统中拔出并将新单元插入细胞培养系统100。如果其中一个单元发生故障，本实施例可以减少停机时间。此外，每个单元都可以从细胞培养系统100中拔出并独立运行以独立使用。
59.现在阐述有关于利用细胞培养系统100来培养细胞培养物的方法。本文所述的方法可用于培养细胞，例如皮肤、肌肉、脂肪和骨细胞，以生产培养肉。该方法包括提供细胞培养系统100、将含有代谢废物或生长抑制剂的培养基转移到新鲜培养基单元104的第一透析单元118中、在新鲜培养基单元104的第一透析单元118中补充营养物和去除生长抑制剂，将含有代谢废物或生长抑制剂的基础培养基从新鲜培养基单元104的第一透析单元118转移到废物去除单元106，并在废物去除单元106中去除生长抑制剂。
60.将至少一种类型的细胞添加到细胞培养单元102中。合适类型的细胞包括但不限于骨、软骨、肌肉、肝脏、皮肤、心脏、肺及其任何组合。在本发明中可以使用其他类型的哺乳动物细胞或鱼细胞。可以使用来自其他植物和动物物种的细胞。
61.在培养容器中扩增的不同类型的特化细胞可以通过活体动物的活检获得。其他起始细胞可以是各种来源的干细胞，例如间充质干细胞、诱导多能干细胞和卫星细胞。起始细胞也可以是转基因细胞或任何细胞系。
62.通过在无菌室或容器(如细胞培养单元102)中附着/粘附到食品级生物兼容性支架，将细胞生长成模拟动物器官(如鱼器官)的固体或半固体结构。控制细胞培养单元102的温度，于细胞培养单元102的入口引入培养基并从细胞培养单元102的出口释放培养基，以去除化学物质、营养物质和细胞等物质。食品级生物兼容性支架最终成为可食用产品的一部分。
63.将来自胎牛血清(fbs)补充剂或来自重组来源的生长因子和细胞因子引入生物反应器的培养基中以支持细胞生长和增殖。生长因子和细胞因子可以包括但不限于胰岛素生长因子1(igf-1)、胰岛素、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素6受体(il-6r)、白细胞介素11(il-11)、成纤维细胞生长因子(fgf)、表皮生长因子(egf)和转铁蛋白。此应用可以在不存在fbs的情况下，将生物工程细胞与细胞培养单元102中的培养细胞共同培养。生物工程细胞被设计为分泌上述生长因子和细胞因子，并根据生长和增殖的需要将这些生物分子提供给培养的细胞。本公开的共培养方法消除了培养基中对动物源性胎牛血清(fbs)的需要。此外，该共同培养方法在原位向正在生长的分离细胞持续提供食品级特异性生长因子和细胞
因子，并简化生产过程和降低生产成本。然而，在其他实施方案中，fbs、来自重组来源的其他血清或蛋白质可用于提供生长因子、细胞因子和其他营养物质以支持细胞生长。
64.在一些实施例中，可以引入气体以优化细胞培养条件。可以使用氧气和二氧化碳。细胞培养单元102可以包含0-10％的二氧化碳。细胞培养单元102可以包含15-30％的氧气。
65.在一些实施例中，可以控制温度以优化细胞培养条件。不同类型的细胞可能具有不同的最佳培养温度。温度范围可以为25-45℃。
66.在一些实施例中，细胞培养单元102中的培养基被搅拌。由于细胞对剪切应力的反应不同，可以优化培养容器中的搅拌速度以增强细胞的扩增。还可以优化搅拌速度以增强入流培养基和细胞培养单元102内的培养基的混合。搅拌速度可以在10rpm-300rpm的范围内。
67.泵108a可以将培养基从细胞培养单元102转移到新鲜培养基单元104的第一透析单元118。
68.在第一透析单元118中，可以使用不同类型的透析膜，包括ce、rc或pvdf。不同截留分子量(mwco)的透析膜可用于将所需的大分子保留在培养基中(例如，培养容器中的细胞所分泌的生长因子)并允许在第一透析单元118中从培养基中去除废物。例如，100da-1,000,000da mwco膜，优选500da mwco膜，可用于保留胰岛素样生长因子(igf，重组形式的大小为7.5kda)和转化生长因子-β(tgf beta，pro tgf-beta大小为44kda)并允许从培养基中去除乳酸(89da)和氨(17da)。这种膜还可用于允许新鲜基础培养基的营养物质如葡萄糖(180da)穿过膜进入培养基以进行补充。
69.新鲜的基础培养基填充第二流体隔室122，而培养基填充第一流体隔室120以进行透析。例如，乳酸、氨和其他废物通过第一透析膜123从培养基转移到新鲜基础培养基中，并且葡萄糖和其他促进生长的化合物通过第一透析膜123从新鲜基础培养基转移到培养基中。透析速率可以通过改变新鲜基础培养基的体积、透析膜中包含的培养基的体积、膜表面积、温度和通过在透析单元中搅拌的搅动来控制。对于从细胞培养单元102流入第一次透析单元118的第一流体隔室120的流体，也可以通过改变泵送速度(1ml/min-10l/min的范围内)来控制透析单元中培养基的营养补充和废物去除的速率。
70.代谢废物或生长抑制剂从培养基移动到第一透析单元118内的新鲜基础培养基中。生长抑制剂随着时间在新鲜基础培养基中积累。含有积累的生长抑制剂(包括但不限于乳酸、氨)的基础培养基在本文中称为废弃培养基。废弃培养基可以通过泵108c传送到废物去除单元106。废弃培养基中的代谢废物如氨和乳酸可通过废物去除单元106的第二透析单元132处通过透析原理去除。废物去除方法应允许在废弃培养基保留最大量的营养物如葡萄糖。可以使用100da
–
1,000,000da wmco膜，优选100da mwco膜的透析膜，以允许氨和乳酸进入透析液，而葡萄糖保留在废弃培养基中。透析液可以是磷酸盐缓冲液(pbs)或任何其他的缓冲液。透析速率可以通过改变透析液的体积、透析膜137中包含的废弃培养基的体积、膜表面积、温度和通过在透析单元132中搅拌的搅拌来控制。搅拌速度可以在10rpm-500rpm的范围内。废物去除单元106中的废物去除速率也可以通过改变从新鲜介质单元104的第一透析单元118流入废物去除单元106的流体的泵送速度来控制。通过透析清洁的废弃培养基可以被传送回至新鲜培养基单元104的第一透析单元118。泵送速度可以在1ml/min-10l/min的范围内。
71.培养物与新鲜基础培养基单元104和废弃培养基单元106的分离允许细胞培养单元102在整个生产过程中保持安全封闭。任何单元中的污染将仅限于受影响的单元，不会影响其他单元。
72.此外，废物去除单元106通过从第二流体中提取代谢废物来帮助集中、提取和/或收集来自整个细胞培养系统100的代谢废物。然后可以容易地收集和排放整个细胞培养系统100的废物。与传统的细胞培养技术相比，它减少了排放的废物和细胞培养的总体运行成本。如背景部分所讨论的，传统的细胞培养技术丢弃含有营养物质和废物的用过的培养基，并用新的培养基代替它。因此，在常规方法中产生的废物(即用过的培养基)的量/体积大于在本发明中产生的废物的量/体积。
73.然而，新鲜培养基单元104和废物去除单元106有助于降低运行成本并优化用于生长细胞培养物的培养基使用。细胞培养基通常比基础培养基更昂贵，因为细胞培养基含有昂贵的fbs、生长因子或细胞因子。在新鲜培养基单元104的帮助下，细胞培养基不需要被过早丢弃并且可以被更新(即去除其废物并从基础培养基中获得营养)。
74.不同类型的细胞包括但不限于皮肤、骨、软骨、心脏和肝脏，可以在合适的支架中培养以在细胞培养单元102中形成工程组织。各种来源的干细胞，例如间充质干细胞、诱导多能干细胞和卫星细胞也可以在适合组织工程应用的支架中培养。可以将分化培养基的成分添加到第一透析单元118或第二透析单元132中的基础培养基中，用于后续分化在支架中扩增后的干细胞以形成功能性工程组织。例如，骨诱导培养基成分如地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸盐可以添加到基础培养基中，用于支架中干细胞的成骨分化。第一透析膜123的mwco可以在100da-1,000,000da的范围内，优选500da mwco，应该选择允许骨诱导培养基的组分进入培养基。
75.或者，可以在细胞培养单元102中的2d培养表面上扩增干细胞。可以扩增干细胞并用胰蛋白酶消化以获得用于再生医学应用的高密度细胞悬浮液。例如，人间充质干细胞可以从患者中分离出来，并在细胞培养单元102的培养皿中扩增。汇合后，细胞被胰蛋白酶消化以形成高密度细胞悬液。然后将细胞悬液注射到患者的损伤部位进行愈合。
76.例子一
77.hek293细胞培养物在pbs中洗涤并用胰蛋白酶消化以形成细胞密度为2.5e6细胞/ml的细胞悬液。将来自2.5e6细胞/ml悬浮液的200μl细胞悬浮液加到预先切割的方形胶原基支架(1cm x 1cm)上，以制备总细胞数为5e5细胞的组织构建体。组织构建体在37℃和5％co2下孵育4小时。沿每个孔的侧面轻轻加入800μl培养基。然后将组织构建体转移到细胞培养单元102的生物反应器和用于对照的6孔培养板中。在第0天、第4天和第11天，通过明场显微镜捕获支架内的细胞图像。在第0天、第4天和第11天，根据以下方案进行live/dead染色。在第0天、第4天和第11天，收集来自组织培养瓶、对照组和透析单元的培养基用于测量葡萄糖。
78.支架中细胞的live/dead染色
79.1.将calcein am和ethidium homodimer-1(来自thermofisher的live/dead试剂盒)以1:1000加入dpbs以获得染色试剂。
80.2.将样品在dpbs中洗涤一次。
81.3.将样品在200-250μl染色试剂中染色30分钟。
82.4.将样品在dpbs中洗涤一次并在荧光显微镜下观察。
83.结果
84.在生物反应器中形成了可观察到的微组织，但在对照组中没有形成
85.图10a-c显示了生物反应器原型和对照组中组织构建体的生长和细胞活力。生物反应器行显示在工作细胞培养系统原型中培养的细胞。对照行显示在6孔板中培养的细胞。在第0天，如图10a所示，细胞以细胞聚集体的形式附着在支架上。在第4天，如图10b所示，细胞聚集体在生物反应器中长成更大的球状体。在第11天，如图10c所示,球状体在生物反应器中聚集在一起形成微组织，而对照组中的球状体似乎没有明显的生长。live/dead染色表明，生物反应器中的微组织是通过连接有活力的球体形成的，它们比对照组大得多。
86.图11显示了在第11天形成的微组织。在生物反应器中，支架中形成了可观察到的微组织团块，而在对照组中未观察到这些微组织。在胰蛋白酶消化支架后，微组织被释放出来，值得注意的是，生物反应器中的微组织的体积比对照组中的要大得多。
87.图12显示了在生物反应器的细胞培养单元102的培养容器中维持葡萄糖水平。
88.在第0天，本发明的培养容器细胞培养单元102中的葡萄糖浓度＝18.8mmol/l。对照培养板中的葡萄糖浓度＝18.7mmol/l。第一透析单元118中的葡萄糖浓度＝20.9mmol/l。
89.在第4天，本发明的培养容器细胞培养单元102中的葡萄糖浓度＝19.1mmol/l。对照培养板中的葡萄糖浓度＝4.9mmol/l。第一透析单元118中的葡萄糖浓度＝20.0mmol/l。
90.在第11天，本发明的培养容器细胞培养单元102中的葡萄糖浓度＝10.4mmol/l。对照培养板中的葡萄糖浓度＝不可检测。第一透析单元118中的葡萄糖浓度＝12.5mmol/l。
91.如上所示，本发明还将诸如葡萄糖的营养物维持在最佳水平，并且将诸如氨和乳酸的生长抑制剂维持在低水平以实现最佳细胞活力和细胞生长。
92.此外，本发明通过保留细胞分泌的生长因子和减少培养基中动物源性血清的使用来增强细胞扩增过程并降低培养肉工业和组织工程的生产成本。本发明可用于大规模肉类生产。
93.本发明的体外细胞培养肉生产方法提供了具有单个细胞类型的简单组织的肉制品。与其他具有多个细胞类型的养殖肉类相比，具有单个细胞类型的肉类产品更容易制造、开发和商业化。本发明的其他实施例提供了具有多个细胞类型的肉制品。此外，申请人发现一种通过改变生长细胞中的微核糖核酸水平或活性来增加生物质/蛋白质生产的方法。例如，两个关键的微核糖核酸(上调微核糖核酸21和下调微核糖核酸29a)被用于提高鱼鳔细胞中的主要蛋白质(胶原蛋白i)的水平。据申请人所知，改变微核糖核酸水平或活性以提高养殖肉制品中蛋白质/生物量产量的做法尚未被其他人用于开发养殖肉制品此领域。与已知的基因敲入或敲除方法相比，将目标放在微核糖核酸以增加蛋白质产量可能会对细胞造成更少的压力。生物工程细胞将会与生长中的动物细胞共同培养，为生长中的鱼类细胞提供用于原位细胞生长和增殖的食物级生长因子和细胞因子，减少或消除培养基中对源自于动物的胎牛血清需求。共同培养技术亦能够简化生产过程和降低生产成本。
94.此外，养殖肉制品中的营养素可以被定制成更健康的食品。例如，养殖肉制品可根据营养师或个人基因测试的饮食建议来定制。在特定条件下培养细胞可以丰富肉制品中的高密度胆固醇、多不饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸等健康营养素。作为替代选择，或与此相互结合，可以通过在特定条件下培养细胞来减少对健康有害的营养素，如低密度胆固醇和
饱和脂肪酸。微量营养素，如维生素和矿物质，也可能得到加强。养殖肉制品的营养定制可通过各种方式取得，例如但不限于：1)在细胞培养过程中调整喂给生长细胞的营养，和/或2)控制带有不同细胞的分层支架的比例。
95.养殖食品的生产是在清洁、无菌和高度控制的过程中进行的。因此，可将食品中的营养素被微生物(如细菌或真菌)降解此类不希望发生的情形被最小化。因分解营养物质而产生的不良味道和气味亦会被最小化。这种特性使养殖食品在烹饪中有新的用途，并有助于创造出新的食谱。养殖食品的一个例子是从鱼鳔中提取的养殖鱼肚。传统鱼肚中的胺由于在生产过程中被细菌降解而产生不良的鱼腥味和气味。这种不受欢迎的特性限制了食物的用途，导致鱼肚只能用于热食或暖食的菜肴。采用细胞培养技术生产的养殖鱼肚没有令人讨厌的鱼腥味和气味。除了热菜外，养殖鱼肚还可以用于甜品或在冷冻或室温下食用的即食菜。
96.示例性操作程序
97.a.鱼鳔细胞系的开发
98.1.从当地鱼市购买健康的黄鱼、鲈鱼或类似类别的鱼。
99.2.将鱼放在冰上直到细胞分离。
100.3.将鱼浸在10％的漂白剂中。
101.4.在无菌条件下从鱼身上取出鱼鳔。
102.5.用次氯酸清洗器官一次或多次。
103.6.在抗生素培养基(含有400lu/ml青霉素、400pg/ml链霉素的leibovitz's l-15或dmem或emem)清洗器官一次或多次。
104.7.清洗后，将器官切成小块(2-3立方毫米)。
105.8.将切成小块的器官转移到含有0.25％胰蛋白酶/乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲生理盐水的离心管中。
106.9.在室温下连续振荡孵育1小时。
107.10.用100皮米网孔过滤上清液以去除未消化的组织。
108.11.将滤液以200克离心5分钟。
109.12.用完全培养基(含有200lu/ml青霉素、200pg/ml链霉素、10％牛血清的leibovitz's l-15或dmem或emem)重悬细胞沉淀物。
110.13.将细胞接种到t25培养瓶中。
111.14.在24至28℃下孵育。
112.15.第二天去除未附上在组织培养瓶上的细胞。
113.16.每2至3天用新鲜培养基更换一半培养基。
114.17.当细胞形成完整的单层时，细胞被认为已建立。已建立的细胞可以进行继代培养。
115.b.以组织外植体开发鱼鳔细胞系
116.1.从当地鱼市购买健康的黄鱼、鲈鱼或类似类别的鱼。
117.2.将鱼放在冰上直到细胞分离。
118.3.将鱼浸在10％的漂白剂中。
119.4.在无菌条件下从鱼身上取出鱼鳔。
120.5.用次氯酸清洗器官一次或多次。
121.6.在抗生素培养基(含有400lu/ml青霉素、400pg/ml链霉素的leibovitz's l-15或dmem或emem)清洗器官一次或多次。
122.7.清洗后，将器官切成小块(1-2立方毫米)。
123.8.将器官碎片分别放入含有完全培养基(含有200lu/ml青霉素、200pg/ml链霉素、10％牛血清的leibovitz's l-15或dmem或emem)的24孔板中。
124.9.在24至28℃下孵育。
125.10.每2至3天用新鲜培养基更换一半培养基，不要干扰组织外植体。
126.11.孵育组织外植体，直至观察到贴壁细胞。
127.12.取出组织外植体。
128.13.当细胞形成完整的单层时，细胞被认为已建立。已建立的细胞可以进行继代培养。
129.c.以组织外植体开发鱼肌肉细胞系
130.1.从当地鱼市购买健康的石斑鱼、鳕鱼、比目鱼、大比目鱼、比目鱼或类似类别的鱼。
131.2.将鱼放在冰上直到细胞分离。
132.3.将鱼浸在10％的漂白剂中。
133.4.在无菌条件下去除鱼的肌肉。
134.5.用次氯酸清洗组织一次或多次。
135.6.在抗生素培养基(含有400lu/ml青霉素、400pg/ml链霉素的leibovitz's l-15或dmem或emem)清洗组织一次或多次。
136.7.清洗后，将组织切成小块(2-3立方毫米)
137.8.将切成小块的组织转移到含有胶原酶和散酶的磷酸盐缓冲生理盐水的离心管中。
138.9.在室温下连续振荡孵育1小时。
139.10.用100皮米网孔过滤上清液以去除未消化的组织。
140.11.将滤液以200克离心5分钟。
141.12.用完全培养基(含有200lu/ml青霉素、200pg/ml链霉素、10％牛血清的leibovitz's l-15或dmem或emem)重悬细胞沉淀物。
142.13.将细胞接种到t25培养瓶中。
143.14.在24至28℃下孵育。
144.15.第二天去除未附上在组织培养瓶上的细胞。
145.16.每2至3天用新鲜培养基更换一半培养基。
146.17.当细胞形成完整的单层时，细胞被认为已建立。已建立的细胞可以进行继代培养。
147.d.从组织外植体开发鱼肌肉细胞系
148.1.从当地鱼市购买健康的石斑鱼、鳕鱼、比目鱼、大比目鱼、比目鱼或类似类别的鱼。
149.2.将鱼放在冰上直到细胞分离。
150.3.将鱼浸在10％的漂白剂中。
151.4.在无菌条件下去除鱼的肌肉。
152.5.用次氯酸清洗组织一次或多次。
153.6.在抗生素培养基(含有400lu/ml青霉素、400pg/ml链霉素的leibovitz's l-15或dmem或emem)清洗组织一次或多次。
154.7.清洗后，将肌肉切成小块(1-2立方毫米)。
155.8.将肌肉块分别放入含有完全培养基(含有200lu/ml青霉素、200pg/ml链霉素、10％牛血清的leibovitz's l-15或dmem或emem)的24孔板中。
156.9.在24至28℃下孵育。
157.10.每2至3天用新鲜培养基更换一半培养基，不要干扰组织外植体。
158.11.孵育组织外植体，直至观察到贴壁细胞。
159.12.取出组织外植体。
160.13.当细胞形成完整的单层时，细胞被认为已建立。已建立的细胞可以进行继代培养。
161.e.成体干细胞分离和培养
162.1.从当地鱼市购买健康的石斑鱼、鳕鱼、比目鱼、大比目鱼、比目鱼或6个月或更小的类似类别的鱼。
163.2.将鱼放在冰上直到细胞分离。
164.3.将鱼浸在10％的漂白剂中。
165.4.在无菌条件下去除鱼的肌肉。
166.5.用次氯酸清洗组织一次或多次。
167.6.在抗生素培养基(含有400lu/ml青霉素、400pg/ml链霉素的leibovitz's l-15或dmem或emem)清洗组织一次或多次。
168.7.清洗后，将组织切成小块(2-3立方毫米)。
169.8.将切成小块的组织转移到含有胶原酶和散酶的磷酸盐缓冲生理盐水的离心管中。
170.9.在室温下连续振荡孵育1小时。
171.10.用100皮米网孔过滤上清液以去除未消化的组织。
172.11.将滤液以200克离心5分钟。
173.12.用完全培养基(含有200lu/ml青霉素、200pg/ml链霉素、10％牛血清、100ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的leibovitz's l-15或dmem或emem)重悬细胞沉淀。
174.13.在24至28℃下将细胞铺板在未有涂层的板上1小时。
175.14.收集上清液并置于涂有粘连蛋白、明胶、基质胶或类似基质的板上。
176.15.在24至28℃下孵育。
177.16.24小时后，洗去任何松散附着和未附上的细胞。
178.17.每天用完全培养基更换培养基(含有200lu/ml青霉素、200pg/ml链霉素、10％牛血清、100ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的leibovitz'sl-15或dmem或emem)。
179.f.生成和培养诱导性多能干细胞
180.1.转染前2至4天，将细胞置于放有完整培养基(含10％胎牛血清的l15)的组织培
养瓶中。转染当天(第0天)，细胞应约75至90％汇合。
181.2.从涂有明胶的6孔板中吸取培养基，并在每孔更换2毫升新鲜完整培养基。将有涂层的板放置在37℃下，直到可以使用为止。
182.3.置于37℃下解冻epi5
tm
载体，将其放置在湿冰上直到可以使用为止。使用前，对解冻的载体进行短暂离心，将其收集在试管底部。
183.4.在磷酸盐缓冲生理盐水中清洗细胞。
184.5.在含有细胞的培养瓶中添加3毫升0.05％的胰蛋白酶/乙二胺四乙酸。
185.6.在室温下放置培养瓶3分钟。
186.7.在每个培养瓶添加5至8毫升完整培养基。小心地将细胞转移到一个空的、无菌的15毫升锥形管中。
187.8. 用台盼蓝染料排斥细胞活性测定法检查活性。
188.9.离心200克细胞2分钟。
189.10.小心吸取大部分上清液，用完整培养基重新悬浮。
190.11.将涂有明胶的培养皿上的细胞接种到6孔培养皿中，每孔培养50000至100000个细胞，在2毫升完整培养基中以30至60％的汇合度，并在24至28℃下培养过夜。
191.12.预热opti-mem/减血清培养基至室温，并按如下所述制备试管a和试管b。
192.13.在标记为试管a的1.5毫升微型离心管中,分别将1.2微升的两个epi5
tm
重新编程矢量混合物(总计2.4微升)添加到118微升的opti-mem培养基中。添加4.8微升的p3000
tm
试剂并充分混合。
193.14.在标记为试管b含有预先加热121l的opti mem培养基的1.5毫升微型离心管中,稀释3.6微升的lipofectamine 3000试剂。
194.15.为了制备转染主混合物，将试管a的内容物添加到试管b中，并充分混合。
195.16.将转染主混合物在室温下培养5分钟。
196.17.再混合一次，将250微升的转染主混合物加入到向每个孔中。
197.18.在24-28℃下培养过夜。
198.19.转染后24小时，从平板中吸取培养基。向每个孔中添加2毫升n2b27培养基(含有ix n-2补充剂，ix b27补充剂，100ng/ml碱性成纤维细胞生长因子重组蛋白的l15)。
199.20.每天以2毫升n2b27培养基更换旧培养基的方式更换n2b27培养基，共14天。
200.21.第14天吸取用过的n2b27培养基，更换为完整培养基。随后每天在每个孔中更换2毫升的培养基。
201.22.每隔一天在显微镜下观察培养板是否出现表明细胞已转化的细胞团。在转染后15至21天内，诱导性多能干细胞菌落将生长到合适的大小以进行转移。
202.23.菌落在第21天是不同的，可以挑选出来进行进一步的培养和扩展。
203.g.细胞继代培养方法
204.1.取出并丢弃培养基。
205.2.用磷酸盐缓冲生理盐水简短地冲洗细胞，去除所有含有胰蛋白酶抑制剂的微量血清。
206.3.向培养瓶添加2至3毫0.25％胰蛋白酶/乙二胺四乙酸溶液。
207.4.在室温下培养1分钟。
208.5.加入5至8毫升完整生长培养基。
209.6.轻轻移液吸取细胞。
210.7.以1比2至1比3的继代培养比率将适当等分的细胞悬浮液添加到新的培养瓶中。
211.8.在24至28℃下培养。
212.h.悬浮培养适应性
213.1.以适合所述细胞的频率通过胰蛋白酶传代单层培养。
214.2.每次传代时，用磷酸盐缓冲生理盐水清洗细胞单层，并用0.25％胰蛋白酶覆盖。
215.3.室温孵育5分钟。
216.4.用完全培养基灭活酶。
217.5.收获细胞悬液，用台盼蓝染料排斥细胞活力测定法检测细胞活力。
218.6.将细胞悬浮液接种到另一个培养瓶中。
219.7.重复传代，直至悬浮细胞活力等于或大于90％。
220.8.在细胞密度为每毫升0.1至0.5百万的旋转瓶或摇瓶中，用50毫升完整培养基建立悬浮培养基。
221.9.在二氧化碳培养箱中，在最适合单层培养的相同温度、湿度和大气条件下，培养旋转瓶或摇瓶悬浮培养物。
222.10.每隔2至3天用新鲜培养基将细胞密度调节到每毫升0.1至0.5百万。
223.11.通过台盼蓝染料排斥细胞活性测定检查活性。
224.12.于可促进健康细胞生长的细胞密度下建立多个平行培养物。
225.13.使用部分培养物将细胞密度逐渐增加至每毫升100万。
226.14.如果细胞密度增加导致细胞死亡，则丢弃高密度培养物。
227.15.从步骤12重新启动细胞高密度培养的适应。
228.16.当细胞适应悬浮生长时，使用3l生物反应器扩大培养。
229.i.适应无血清培养基(植物水解液)
230.1.在dmem/f12完全培养基(1:1dmem培养基和ham's f12培养基，2至4mm谷氨酰胺，10％胎牛血清)中培养细胞。
231.2.制备无血清培养基(1:1dmem培养基和ham's f12培养基，2至4mm谷氨酰胺，20％植物水解物例如大豆、棉籽、油菜、小麦、酵母或等效物)。
232.3.当细胞达到汇合时，用适应培养基i(40％新鲜完整培养基，40％前代条件培养基，20％无血清培养基)代替培养基。
233.4.每2至3天用台盼蓝染料排斥细胞活性测定法检查活性。
234.5.如果适应导致细胞死亡，则丢弃培养物并重复步骤3。
235.6.当细胞达到汇合时，用适应培养基ii(30％新鲜完整培养基，30％步骤1中细胞的条件培养基，40％无血清培养基)替换培养基。
236.7.每2至3天通过台盼蓝染料排斥细胞活性测定检查活性。
237.8.如果适应导致细胞死亡，则丢弃培养物并重复步骤6。
238.9.当细胞达到汇合时，用适应培养基iii(20％新鲜完整培养基，20％步骤1中细胞的条件培养基，60％无血清培养基)替换培养基。
239.10.每2至3天通过台盼蓝染料排斥细胞活性测定检查活性。
240.11.如果适应导致细胞死亡，则丢弃培养物并重复步骤9。
241.12.当细胞达到汇合时，用适应培养基iv(10％新鲜完整培养基，10％步骤1中细胞的条件培养基，80％无血清培养基)替换培养基。
242.13.每2至3天通过台盼蓝染料排斥细胞活性测定检查活性。
243.14.如果适应导致细胞死亡，则丢弃培养物并重复步骤12。
244.15.当细胞汇合时，用无血清培养基代替培养基。
245.16.每2至3天通过台盼蓝染料排斥细胞活性测定检查活性。
246.17.如果适应导致细胞死亡，则丢弃培养物并重复步骤15。
247.18.无血清培养基的使用量可在每一步骤中逐步增加，即每一步骤增加20％或更少。
248.j.适应无血清培养基(化学定义)
249.1.在dmem/f12完全培养基中培养细胞(1:1dmem培养基和ham'sf12培养基，2至4mm谷氨酰胺，10％胎牛血清)。
250.2.制备无血清培养基(1:1dmem培养基和ham's f12培养基，2至4mm谷氨酰胺，65-130ug/ml抗坏血酸2-磷酸，550-1100ug/ml碳酸氢钠锭，14-28ng/ml亚硒酸钠，19-38ug/ml胰岛素，11-22ug/ml转铁蛋白，100-200ng/ml成纤维细胞生长因子，2-4ng/ml乙型转化生长因子)。
251.3.当细胞达到汇合时，用适应培养基i(40％新鲜完全培养基、40％前传代条件培养基、20％无血清培养基)更换培养基。
252.4.每2至3天通过台盼蓝染料排除细胞活力测定检查活力。
253.5.如果适应导致细胞死亡，丢弃培养物并重复步骤3。
254.6.当细胞达到汇合时，用适应培养基ii(30％新鲜完全培养基、30％步骤1中细胞的条件培养基、40％无血清培养基)更换培养基
255.7.每2至3天通过台盼蓝染料排除细胞活力测定检查活力。
256.8.如果适应导致细胞死亡，丢弃培养物并重复步骤6。
257.9.当细胞达到汇合时，用适应培养基iii(30％新鲜完全培养基、30％步骤1中细胞的条件培养基、40％无血清培养基)更换培养基。
258.10.每2至3天通过台盼蓝染料排除细胞活力测定检查活力。
259.11.如果适应导致细胞死亡，丢弃培养物并重复步骤9。
260.12.当细胞达到汇合时，用适应培养基iv(10％新鲜完全培养基、10％步骤1中细胞的条件培养基、80％无血清培养基)更换培养基。
261.13.每2至3天通过台盼蓝染料排除细胞活力测定检查活力。
262.14.如果适应导致细胞死亡，丢弃培养物并重复步骤12。
263.15.当细胞达到汇合时，用无血清培养基更换培养基。
264.16.每2至3天通过台盼蓝染料排除细胞活力测定检查活力。
265.17.如果适应导致细胞死亡，丢弃培养物并重复步骤15。
266.18.无血清培养基的用量可在每一步骤逐渐增加。例如，每一步骤增加20％或更少。
267.k.增强转录后蛋白质表达
268.1.在完全培养基(leibovitz's l-15或dmem或emem与200iu/ml青霉素、200pg/ml链霉素、10％胎牛血清)或无血清培养基(dmem/f12包含植物水解物或化学定义的化合物)中培养细胞。
269.2.移除并丢弃培养基。
270.3.使用pbs短暂地冲洗细胞以去除所有含有胰蛋白酶抑制剂的血清。
271.4.将2-3ml的0.25％胰蛋白酶/edta溶液添加到培养瓶中。
272.5.在室温下孵育1分钟。
273.6.通过轻轻移液吸出细胞。
274.7.以200g离心细胞2分钟。
275.8.在完全培养基或无血清培养基中重悬细胞。
276.9.向6孔板的每个孔中加入50万个细胞。
277.10.在24-28℃下孵育过夜。
278.11.使用聚乙烯亚胺、脂质体、电穿孔法将微rna寡核苷酸(mir-21、mir-29a、mir-21模拟物、mir-29a模拟物、抗mir-21、抗mir-29a或等效物)转染到细胞中，或其他方法。
279.12.在24-28℃下孵育过夜。
280.13.在相同的温度、湿度和大气的最佳培养条件下，将细胞转移至多层培养瓶、转瓶或摇瓶中的co2培养箱中。
281.l.细胞培养支架(魔芋+树胶)
282.1.用几片藏红花烧开水，直至颜色变成淡黄色。
283.2.取出藏红花，将溶液静置至温热。
284.3.准备所有干料
285.a.魔芋
–
0.5至5％，优选地3％
286.b.泡打粉
–
0.3至3％，优选地3％
287.c.完善的黄原胶
–
0.2至2％，优选地1.5％
288.4.量取100毫升藏红花溶液。
289.5.依次加入泡打粉、刺槐豆胶、黄原胶。加入每种成分后，充分搅拌混合物。
290.6.将魔芋一点一点洒在溶液上。继续搅拌。溶液应该变得糊状。
291.7.将魔芋混合物铺在模具中，厚度约为1至15毫米。
292.8.盖上模具，在室温下静置30分钟以上。
293.9.将模具放入4℃冰箱4小时。
294.10.将模具用小火蒸40分钟。
295.11.将模具在室温下静置2小时。
296.12.将支架在45至55℃下脱水15分钟。
297.m.细胞培养支架(藻酸盐+糯米粉)
298.1.称取0.1至2克(0.1至2％)，优选地约1克(1％)海藻酸钠。
299.2.在搅拌机中加入100毫升水。
300.3.将海藻酸盐粉末加入搅拌机，搅拌至溶解。
301.4.用塑料薄膜盖住容器，将藻酸盐溶液放入冰箱过夜，以消除气泡。
302.5.称取1至10克(1-10％)，优选地5克(5％)左右的糯米粉，放入模具中。
303.6.将海藻酸盐溶液加入模具中，约1至15毫米厚。
304.7.搅拌混合物直至所有粉末溶解。
305.8.用小火蒸30分钟直至定型。
306.9.盖上模具，在室温下静置30分钟。
307.10.称取1％的乳酸钙，搅拌溶解在水中。
308.11.将支架浸入1％的乳酸钙溶液中至少2.5小时，以便在支架周围形成膜。