抗TN-MUC1嵌合抗原受体的制作方法

抗tn-muc1嵌合抗原受体
1.对相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年3月26日提交的英国专利申请号2004371.7的优先权，其内容通过引用并入本文。
3.电子提交的序列表
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发明领域
5.本发明涉及嵌合抗原受体(car)分子、包含此类car分子的多肽、编码此类car分子的多核苷酸以及包含此类多核苷酸的载体。本发明还涉及包含此类car分子、多肽、多核苷酸和载体的免疫效应细胞。本发明还涉及包含此类免疫效应细胞的药物组合物。本发明还涉及此类car分子、多肽、多核苷酸、载体、免疫效应细胞和药物组合物用于治疗包含表达异常糖基化的muc1蛋白的细胞的癌症的用途。
6.发明背景
7.过继性t细胞疗法是对癌症患者具有治愈潜力的变革性药物。为了为患者设计这些有力的自体细胞疗法，使用外周血获取t细胞，然后对其进行基因修饰。将嵌合抗原受体(car)引入这些细胞使它们能够特异性结合选择的抗原。出于运输至并随后杀伤表达匹配抗原的癌细胞的目的，将这些修饰的细胞离体增殖并重新注入患者体内(yeku等人,am soc clin oncol educ book.2017；37:193-204；mcbride等人,wiley interdiscip rev nanomed nanobiotechnol.2019；11(5):e1557)。
8.car是重编程t细胞的特异性、功能和持久性的合成抗原受体。car由与t细胞激活结构域(例如，cd3复合物的ζ链)融合的抗体单链可变片段(scfv)的抗原特异性区和共刺激结构域(例如，cd28或4-1bb)组成。这种构型促进抗原特异性激活并增强人原代t细胞的增殖和抗凋亡功能。
9.car-t细胞对一系列液体肿瘤b细胞恶性肿瘤显示出显著功效；早期临床试验结果表明其在多发性骨髓瘤中具有活性(sadelain等人,nature.2017；545(7655):423-31；june等人,n engl j med.2018；379(1):64-73；brudno等人,nat rev clin oncol.2017；15(1):31-46)。2017年fda批准cd19 car-t用于淋巴瘤和白血病重新激发了开发用于实体瘤的car-t细胞的集中努力。然而，迄今为止，car-t细胞疗法在实体瘤中显示出的功效有限。
10.为了生成针对实体癌的安全有效的t细胞疗法，t细胞必须在整个制备过程中保持高效的杀伤潜力，能够运输到肿瘤，并克服免疫抑制性肿瘤微环境(tme)。主要成功因素之一是抗原靶标的选择。抗原必须在癌细胞表面以足够的量表达，而在正常组织保持低表达，以确保对健康细胞的低交叉反应性(脱靶效应和靶向效应两者)。实体瘤中的car免疫疗法仍然具有挑战性，主要是由于其表达局限于恶性组织的合适表面抗原的缺乏。根据受累的器官组织，抗原靶标的肿瘤外表达可能导致不同严重程度的靶向毒性(watanabe等人,front immunol.2018；9:2486；park等人,sci rep.2017；7(1):14366)。
11.细胞表面相关粘蛋白1(muc1)是携带o-聚糖的具有串联重复序列的大蛋白，并在正常细胞的顶端表面表达。在癌症中具有截短糖型的muc1的异常糖基化形式(图1)在大多数腺癌中过表达。在癌症中发现的最普遍的异常糖型是tn糖型和唾液酸-tn(stn)糖型。数种机制可以导致tn糖型的积累，包括由于cosmc的突变或表观遗传沉默和galnac-ts23的异位表达导致的t合酶活性丧失。在健康组织中，tn抗原很少表达，并且人具有天然的抗tn igm抗体。此外，与muc1在正常上皮中局限于顶端表面不同，muc-1在肿瘤细胞膜上异常过表达(图1)。然而，尽管数据显示异常糖基化主要存在于突变癌细胞的细胞表面，但不能完全排除低水平的异常糖基化的muc1存在于表达muc1蛋白的健康或发炎细胞上(cascio等人,biomolecules.2016；6(4):e39)。最近已经开发了靶向tnmuc1的高亲和力糖肽特异性抗体。小鼠5e5 mab可以通过补体介导的和抗体依赖性的细胞毒性裂解乳腺癌细胞。包含5e5 mab可变结构域的tnmuc1特异性car-t细胞可以消除异种移植模型中的胰腺和白血病，并且与原始抗体相似，显示出对正常组织的反应性可忽略不计的癌症特异性。
12.本发明人已将tn-粘蛋白1(tnmuc1)抗原鉴定为car-t开发的潜在靶标，并已工程化改造特异性靶向tn-muc1抗原的第二代car。靶向tnmuc1的car-t表现出对tnmuc1抗原的高特异性、低水平的基础活化和杀伤tnmuc1阳性肿瘤细胞的高效力。
13.发明概述
14.本发明在第一方面提供了嵌合抗原受体(car)，其包含：
15.a)细胞外结构域，其包含结合异常糖基化的muc1蛋白上的一个或多个表位的人源化抗体或其抗原结合结构域，其中该抗体或其抗原结合结构域包含：
16.与seq id no:28至少90％相同的cdrl1序列；
17.与seq id no:29至少90％相同的cdrl2序列；
18.与seq id no:30至少90％相同的cdrl3序列；
19.与seq id no:31至少90％相同的cdrh1序列；
20.与seq id no:32至少90％相同的cdrh2序列；和
21.与seq id no:33至少90％相同的cdrh3序列，
22.并且其中抗体或其抗原结合片段以与非人源化型式的所述抗体或其抗原结合结构域相比更快的解离速率常数(kd)结合所述表位，和
23.b)跨膜结构域；
24.c)一个或多个共刺激结构域；和
25.d)一个或多个细胞内信号传导结构域。
26.本发明在第二方面还提供了包含根据本发明的第一方面的car的氨基酸序列的多肽。
27.本发明在第三方面还提供了编码根据本发明的第一方面的car的多核苷酸。
28.本发明在第四方面还提供了包含根据本发明的第三方面的多核苷酸的载体。
29.本发明在第五方面还提供了包含根据本发明的第三方面的多核苷酸和/或根据本发明的第四方面的载体的载体生产细胞。
30.本发明在第六方面还提供了免疫效应细胞，其包含根据本发明的第一方面的car、根据本发明的第二方面的多肽、根据本发明的第三方面的多核苷酸或根据本发明的第四方面的载体。
31.本发明在第七方面还提供了药物组合物，其包含根据本发明的第六方面的免疫效应细胞和药学上可接受的赋形剂。
32.本发明在第八方面还提供了生成包含根据本发明的第一方面的car的免疫效应细胞的方法，其包括将根据本发明的第四方面的载体引入免疫效应细胞。
33.本发明在第九方面还提供了根据本发明的第一方面的car、根据本发明的第二方面的多肽、根据本发明的第三方面的多核苷酸、根据本发明的第四方面的载体、根据本发明的第六方面的免疫效应细胞或根据本发明的第七方面的药物组合物，用于癌症的治疗，其中该癌症包含表达异常糖基化的muc1蛋白的细胞。
34.本发明在第十方面还提供了根据本发明的第一方面的car、根据本发明的第二方面的多肽、根据本发明的第三方面的多核苷酸、根据本发明的第四方面的载体、根据本发明的第六方面的免疫效应细胞或根据本发明的第七方面的药物组合物在制备用于癌症治疗的药物中的应用，其中该癌症包含表达异常糖基化的muc1蛋白的细胞。
35.本发明在第十一方面还提供了用于在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的根据本发明的第一方面的car、根据本发明的第二方面的多肽、根据本发明的第三方面的多核苷酸、根据本发明的第四方面的载体、根据本发明的第六方面的免疫效应细胞或根据本发明的第七方面的药物组合物，其中该癌症包含表达异常糖基化的muc1蛋白的细胞。
36.本发明在第十二方面还提供了用于在患有癌症的受试者中增加表达异常糖基化的muc1蛋白的癌细胞中的细胞毒性的方法，其包括以如下的量向受试者施用根据本发明的第一方面的car、根据本发明的第二方面的多肽、根据本发明的第三方面的多核苷酸、根据本发明的第四方面的载体、根据本发明的第六方面的免疫效应细胞或根据本发明的第七方面的药物组合物，与施用前的表达异常糖基化的muc1蛋白的癌细胞的细胞毒性相比，该量足以增加表达异常糖基化的muc1的癌细胞中的细胞毒性。
37.本发明在第十三方面还提供了用于在患有癌症的受试者中减少表达异常糖基化的muc1蛋白的癌细胞的数量的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的根据本发明的第一方面的car、根据本发明的第二方面的多肽、根据本发明的第三方面的多核苷酸、根据本发明的第四方面的载体、根据本发明的第六方面的免疫效应细胞或根据本发明的第七方面的药物组合物，其中与施用前的表达异常糖基化的muc1蛋白的癌细胞的数量相比，治疗有效量足以减少表达异常糖基化的muc1蛋白的癌细胞的数量。
38.本发明在第十四方面还提供了根据本发明的第一方面的car、根据本发明的第二方面的多肽、根据本发明的第三方面的多核苷酸、根据本发明的第四方面的载体、根据本发明的第六方面的免疫效应细胞或根据本发明的第七方面的药物组合物，用于疗法。
39.附图简述
40.图1
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muc1在正常与癌性黏膜/上皮上的表达的示意图。在肿瘤进展时，癌性细胞上发生的muc1的差异表达会导致强烈的过表达、无法控制顶端分布(极性丧失)和异常的低糖基化。
41.图2
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阳性对照蛋白与tnmuc1肽(36-2)与未糖基化muc1(36-4)的结合。
42.图3a-3c
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人源化抗tnmuc1 scfv蛋白上清液的结合谱。
43.图4
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纯化的抗tnmuc1 scfv构建体的sds-page分析。
44.图5
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在biacore测定中测试的muc1肽的示意图，详细说明了tn或stn糖残基的位置：muc1肽(seq id no:97)、tnmuc1肽(完全糖基化；seq id no:96)、tnmuc1肽1(seq id no:98)、tnmuc1肽2(seq id no:99)、stnmuc1肽(seq id no:100)。
45.图6
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汇总人源化scfv蛋白和鼠5e5 scfv蛋白对tnmuc1和stnmuc1肽的结合的ka(1/ms)、kd(1/s)和kd(m)的数据表。
46.图7
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人源化抗tnmuc1 scfv与tnmuc1肽和muc1肽结合的结合谱和亲和力。
47.图8
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鼠5e5 scfv和人源化scfv蛋白与完全糖基化和差异糖基化tnmuc1肽和muc1肽的结合：muc1肽(seq id no:97)、tnmuc1肽(完全糖基化；seq id no:96)、tnmuc1肽1(seq id no:98)、tnmuc1肽2(seq id no:99)。
48.图9
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人源化抗tnmuc1 scfv蛋白与stnmuc1和muc1肽的结合谱和亲和力。
49.图10
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人源化抗tnmuc1 scfv蛋白13p16与以下各种muc1肽的结合：muc1肽(seq id no:97)、tnmuc1肽(完全糖基化；seq id no:96)、tnmuc1肽1(seq id no:98)、tnmuc1肽2(seq id no:99)、stnmuc1肽(seq id no:100)。
50.图11
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tnmuc1阳性mda-mb-468细胞中人源化scfv结合的拟合曲线(代表性数据来自n＝1实验)。
51.图12
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tnmuc1阴性pc3细胞中人源化scfv结合的拟合曲线(代表性数据来自n＝1实验)。
52.图13
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高tnmuc1阳性jurkat细胞中人源化scfv结合的拟合曲线(由于钩状效应的证据，在曲线拟合之前去除了最高浓度16p4(82a)和13p18(19a)的mfi值(代表性数据来自n＝1实验))。
53.图14
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jurkat、mda-mb-468细胞和pc3细胞中人源化scfv 13p16(97a)结合的拟合结合曲线(标准误差条基于来自n＝2实验的数据)。
54.图15
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tnmuc1在jurkat、mda-mb-468和pc3细胞表面的百分比表达。
55.图16a-16d
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质膜蛋白阵列点样模式：图16a：对照点样模式；图16b-16d：来自不同供体的未转导的和bcma car-t转导的细胞。
56.图17
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使用抗人muc1 mab和对照的质膜蛋白阵列点样模式。
57.图18a-18d
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使用未转导的细胞和tnmuc1转导的细胞的质膜蛋白阵列点样模式(预筛选研究)。图18a：对照点样模式；图18b：未转导的t细胞；图18c：bcma car-t细胞；和图18d：tnmuc1 car-t细胞。
58.图19a-19d
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质膜蛋白阵列模式(验证性筛选)。图19a：对照点样模式；图19b：未转导的细胞；图19c：bcma car-t细胞；和图19d：tnmuc1car-t细胞。
59.图20a-20c
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未转导的和转导的5e5 car-t细胞的基础表型。图20a显示转导效率(显示为表达百分比和表达程度)；图20b显示平均cd4+/cd8+比率；图20c显示与未转导的t细胞相比，cd4+与cd8+car-t细胞中的car-t细胞激活(cd69+41bb+)和耗竭(pd1+lag3+tim3+)状态。
60.图21
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来自图20的n＝3个供体的热图，其显示了所有测试样品的t细胞记忆亚群的百分比。
61.图22a-22c
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未刺激的car-t细胞的基础激活的评估：图22a：cd4/cd8比率；图22b：描绘t细胞亚群中cd69+tim3+pd1+细胞的激活/耗竭状态；图22c：上清细胞因子和颗粒酶b
释放。所有图均显示平均应答，误差条表示标准偏差。带条的散点图显示了由不同颜色的圆圈表示的个体供体应答的分布。
62.图23a-23b
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与cd19-bbζ(pgk)(mb049)和gd2-28ζ(ef1a)(mb62)相比，tnmuc-1-bbζ(pgk)car-t细胞的抗原非依赖性信号传导的评估：图23a：与总cd3ζ和gapdh负载对照相关的归一化pcd3ζ信号传导；图23b与gapdh负载对照相关的归一化pzap70信号传导。
63.图24a-24b
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使用毛细管western(peggy-sue)的car-t信号传导转导的检测。图24a：western数据代表与cd19-bbζ(mb049)和tnmuc-1-bbζ(mb040)car-t细胞相比gd2-28ζ(ef1a)(mb062)car-t细胞的激活谱，其中pcd3ζ、pzap70、perk1/2增加并且总iκbα减少；图24b：计算的归一化pcd3ζ信号显示与gd2-28ζ(ef1a)(mb062)car-t细胞相比，cd19-bbζ(mb049)、tnmuc-1-bbζ(mb040)car-t细胞的激活显著降低。
64.图25
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在tnmuc1 pc3肿瘤细胞系存在的情况下测量tnmuc1 car-t细胞激活(通过ifnγ释放)的msd测定(共培养后24小时，数据是n＝4个供体的平均值)。
65.图26a-26c
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tnmuc1 car-t介导的pc3 tnmuc1细胞杀伤的分析。图26a显示mb024的靶标密度依赖性杀伤率，其中高至低的靶标表达分别与最快至最慢的杀伤相关；图26b显示pc3 tnmuc1阳性细胞中72小时活细胞百分比相对于pc3 wt对照的统计学显著性测量；和图26c显示通过msd通过在24小时的ifnγ释放测量的激活。
66.图27
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对pc3.wt和cosmc敲除细胞系的归一化incycyte car-t杀伤应答：归一化动力学tnmuc-1car-t细胞(mb051、mb052、mb053和mb054)杀伤应答显示pc3.wt(tnmuc-1阴性)、pc3.4c11(5％tnmuc-1)和pc3.5f5(100％tnmuc1)细胞系的差异杀伤速率和阈值依赖于靶标表达水平(n＝9)。
67.图28a-28d
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在pc3.wt和cosmc敲除细胞系的阈值端点处获得的kt50和％活细胞：mb051、mb052、mb053和mb054的bonferroni单因素anova检验，其中，图28a显示了针对表达tnmuc-1的细胞系上的car-t细胞计算的kt50，图28b显示tnmuc-1高表达pc3.5f5细胞系上的％活细胞，图28c显示了在tnmuc-1低表达pc3.4c11细胞系上的％活细胞以及图28d显示了tnmuc-1阴性细胞系(pc3.wt)上的％活细胞(n＝9)。
68.图29
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通过car mb024的肽刺激ifnγ活化：显示在与完全糖基化的tnmuc1肽(seq id no：96)以及部分糖基化的tnmuc1肽1(seq id no：98)和stnmuc1肽(seq id no:100)共培养时car mb024释放的ifnγ的图。当在muc1肽(seq id no:97)或tnmuc1肽2(seq id no:99)存在下培养car t细胞时，未看到ifnγ。ifnγ分析通过msd进行。
69.图30
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car t细胞细胞因子和颗粒酶b响应于与jurkat wt和jurkat cosmc+细胞系的共培养的释放：人源化5e5 car t细胞响应于与jurkat wt和jurkat cosmc+肿瘤细胞系共培养24小时后的细胞因子释放。点图显示平均应答，误差条表示标准偏差。仅mb021、mb022和mb024t细胞条件n＝8(4个供体，一式两份)，仅mb025t细胞n＝6(3个供体，一式两份)，car t细胞+cosmc-/cosmc+条件n＝4(4个供体，单次重复)，仅cosmc-和cosmc+靶细胞n＝4。ut＝未转导的t细胞；cosmc(-)＝jurkat wt&cosmc(+)＝jurkatcosmc+肿瘤细胞系。
70.图31a-31c
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与mda-mb-468和mc7f muc1 ko肿瘤细胞系共培养24小时的人源化5e5 car t细胞的流式细胞术分析。图31a：单独培养和共培养24小时后人源化5e5 car t细胞的转导效率和cd4+/cd8+比率。图31b-31c：单独培养和共培养24小时后人源化5e5 car t细胞的细胞内细胞因子水平；图31b：表示对细胞内细胞因子呈阳性的car t细胞的百分比以及
muc1阳性细胞水平渐增时的ifnγ分泌。图39a：在每种细胞系条件下绘制的tnmuc1 car t和ut t细胞的平均ifnγ分泌。数据表示为log10转换的ifnγ浓度(pg/ml)。效应物仅代表在没有靶细胞的情况下培养的tnmuc1 car t细胞。图39b：在每种细胞系条件下tnmuc1 car t细胞与ut t细胞的比较，计算为比率。比率大于1(虚线)表明tnmuc1 car t细胞中的ifnγ释放高于ut t细胞。效应物仅代表在没有靶细胞的情况下培养的tnmuc1 car t细胞。数据是三个供体的平均值，误差条代表95％的置信区间。
79.发明详述
80.概述
81.muc1是在正常细胞顶端表面表达的跨膜糖蛋白，其特征在于广泛的o-糖基化(图1，左)。muc1与其他粘蛋白家族成员一起形成针对病原体和环境攻击的粘液保护层(hattrup和gendler，annu rev physiol.2008；70：431-57)。在癌症中，muc1经常由肿瘤细胞过表达、失去其极性并且重要的是，muc1由截短的聚糖变得异常糖基化(图1，右)。在癌症中发现的最普遍的截短的聚糖是thomsen-nouveau(tn)和唾液酸-tn(stn)糖型(springer,1984)。如本文所用，术语“异常糖基化的muc1蛋白”和“ag-muc1”可以统指所有异常糖基化的muc1蛋白或异常糖基化的muc1蛋白的单个变体，例如tnmuc1、stnmuc1等。
82.增加的ag-muc1水平与相关于不良预后和高死亡率的癌症进展和转移有关(cascio和finn，2016；finn等人，2011)。健康组织和肿瘤组织之间表达水平和糖基化状态的显著差异使得异常糖基化的tn/stn-muc1成为car t细胞疗法的有吸引力的靶标。
83.本发明通常涉及靶向这些ag-muc1蛋白的改进的嵌合抗原受体(car)。本发明的改进的car分子旨在用于预防或治疗表达ag-muc1蛋白的癌症的组合物和方法，从而预防、治疗或改善与表达ag-muc1蛋白的癌症相关联的至少一种症状。在特定实施方案中，本发明涉及使用遗传修饰的免疫效应细胞对表达ag-muc1蛋白的癌症的改进的细胞疗法。
84.本文所预期的过继细胞疗法的改进组合物和方法提供了遗传修饰的免疫效应细胞，该遗传修饰的免疫效应细胞可以容易地扩增，在体内表现出长期持久性，并且表现出对表达ag-muc1的细胞的抗原依赖性细胞毒性。
85.特别是，car-t细胞具有特定的快解离速率和较低亲和力，但是具有高效力，可以最大限度地减少先前在其他基因工程化t细胞疗法中观察到的脱靶、离瘤毒性的可能性，并可以阻止已被描述为具有慢解离速率的car的风险的输注后t细胞耗竭。
86.car分子的关键要求之一是区分肿瘤组织与健康组织的能力。此前研究表明，具有高亲和力的car可以导致对健康组织的附带靶向，从而导致靶向/脱靶、离瘤毒性(johnson等人,2015；park等人,2017；watanabe等人,2018)。因此，比较了慢解离速率和快解离速率的car-t在区分tnmuc1阳性和阴性细胞方面的能力。快和慢解离速率car-t均响应于tnmuc1阳性细胞系分泌ifnγ，然而慢解离速率car-t响应于缺乏muc1蛋白的肿瘤细胞产生ifnγ，而快解离速率car-t则不会。这些数据表明，快解离速率car-t细胞特异性识别tnmuc1靶标，从而最大限度地降低患者中脱靶：离瘤毒性的风险。
87.嵌合抗原受体(car)
88.在各种实施方案中，提供了将免疫效应细胞重定向至表达ag-muc1蛋白的癌细胞的基因工程受体。这些在本文中称为嵌合抗原受体(car)的基因工程受体，是将对期望抗原(例如，ag-muc1)的基于抗体的特异性与激活t细胞受体的细胞内结构域组合以生成表现出
特异性抗ag-muc1细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。术语“嵌合”描述了由来自不同来源的不同蛋白质或dna的部分构成。
89.在特定实施方案中，car包含结合ag-muc1蛋白的细胞外结构域(也称为结合结构域、抗原结合结构域或抗原特异性结合结构域)、跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域。car的抗ag-muc1抗原结合结构域与靶细胞表面上的抗原结合导致car聚集并向含有car的细胞传递激活刺激。car的主要特征是其利用单克隆抗体、可溶性配体或细胞特异性共受体的细胞特异性靶向能力重定向免疫效应细胞特异性的能力，从而触发增殖、细胞因子产生、吞噬作用和/或可以以主要组织相容性(mhc)非依赖性的方式介导表达靶抗原的细胞的细胞死亡的分子产生。
90.细胞外结构域
91.在各种实施方案中，car包含含有抗ag-muc1抗原结合结构域的细胞外结构域；跨膜结构域；一个或多个共刺激信号传导结构域；和一个或多个细胞内信号传导结构域。
92.在特定实施方案中，car进一步包含抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域之间的铰链结构域。car还可以包含任何细胞外结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和/或细胞内信号传导结构域之间的铰链结构域或间隔物结构域。
93.在特定实施方案中，car包含细胞外结合结构域，该细胞外结合结构域包含特异性结合在靶细胞(例如，癌细胞)上表达的ag-muc1蛋白的抗ag-muc1抗原结合结构域。如本文所用，术语“结合结构域”、“细胞外结构域”、“细胞外结合结构域”、“抗原结合结构域”、“抗原特异性结合结构域”和“细胞外抗原特异性结合结构域”可互换使用，并且提供具有特异性结合感兴趣靶抗原(例如，ag-muc1)的能力的car。结合结构域可以衍生自天然、合成、半合成或重组来源。
94.在特定实施方案中，抗ag-muc1抗原结合结构域是抗体或其抗原结合结构域。
95.如本文所用，术语“特异性结合亲和力”或“特异性结合”或“特异性结合(bound)”或“特异性的结合”或“特异性靶向”描述抗ag-muc1抗原结合结构域(或包含其的car)以与背景结合相比更大的结合亲和力与ag-muc1结合。如果结合结构域(或包含结合结构域的car或含有结合结构域的融合蛋白)以例如大于或等于约105m-1
的亲和力或ka(即，具有单位i/m的特定结合相互作用的平衡缔合常数)结合或缔合ag-muc1，则其“特异性结合”至ag-muc1蛋白。在某些实施方案中，结合结构域(或其融合蛋白)以大于或等于约106m-1
、107m-1
、108m-1
、109m-1
、10
10
m-1
、10
11
m-1
或10
12
m-1
的ka结合至靶标。“高亲和力”结合结构域(或其单链融合蛋白)是指具有至少107m-1
、或至少108m-1
、或至少109m-1
、或至少10
10
m-1
、或至少10
11
m-1
、或至少10
12
m-1
或更大的ka的那些结合结构域。
96.可替代地，亲和力可以定义为具有单位m(例如，10-5
m至10-13
m或更小)的特定结合相互作用的平衡解离常数(kd)。根据本公开的结合结构域多肽和car蛋白的亲和力可以使用常规技术，例如通过竞争性elisa(酶联免疫吸附测定)、或通过结合缔合、或使用标记配体的置换测定、或使用表面-等离子共振设备如可购自biacore,inc.,piscataway,nj的biacore t 100、或光学生物传感器技术如分别可购自corning和perkin elmer的epic系统或enspire(另见例如，scatchard,ann ny acad sci.1949；51(4):660；和美国专利号5,283,173；或等同物)容易地确定。
97.kd/ka/kd/ka98.在实施方案中，car:ag-muc1相互作用的平衡解离常数(kd)为500nm或更小、200nm或更小、100nm或更小、10nm或更小、2nm或更小或1nm或更小。可替代地，kd可以在5nm和10nm之间；或在1nm和2nm之间。kd可以在1pm和500pm之间；或在500pm和1nm之间。本领域技术人员将理解kd数值越小，结合越强。kd的倒数(即1/kd)是具有单位m-1
的平衡缔合常数(ka)。本领域技术人员将理解ka数值越大，结合越强。
99.解离速率常数(kd)或“解离速率”描述了car:ag-muc1复合物的稳定性，即每秒衰变的复合物的分数。例如，0.01s-1
的kd相当于每秒衰变1％的复合物。在实施方案中，解离速率常数(kd)为1x10-2 s-1
或更小、1x10-3 s-1
或更小、1x10-4 s-1
或更小、1x10-5 s-1
或更小、或1x10-6 s-1
或更小。kd可以在1x10-5s-1
和1x10-4 s-1
之间；在1x10-4 s-1
和1x10-3 s-1
之间；或在1x10-3 s-1
和1x10-2
s-1
之间。
100.缔合速率常数(ka)或“缔合速率”描述了car:ag-muc1复合物形成的速率。在实施方案中，缔合速率常数(ka)为1x10
6 m-1
s-1
或更小、1x10
5 m-1
s-1
或更小、1x10
4 m-1
s-1
或更小、1x10
3 m-1
s-1
或更小、或1x10
2 m-1
s-1
或更小。ka可以在1x10
6 m-1
s-1
和1x10
5 m-1
s-1
之间；在1x10
4 m-1
s-1
和1x10
3 m-1
s-1
之间；在1x10
3 m-1
s-1
和1x10
2 m-1
s-1
之间。
101.在一个实施方案中，特异性结合的亲和力比背景结合高约2倍、比背景结合高约5倍、比背景结合高约10倍、比背景结合高约20倍、比背景结合高约50倍、比背景结合高约100倍或比背景结合高约1000倍或更多。
102.在特定实施方案中，car的细胞外结构域包含抗体或其抗原结合结构域。“抗体”是指作为多肽的结合剂，该多肽包含至少一个轻链或重链免疫球蛋白可变区，该可变区特异性识别和结合抗原的表位如含有抗原决定簇(如由免疫细胞识别的那些)的脂质、碳水化合物、多糖、糖蛋白、肽或核酸。
[0103]“抗原(ag)”是指可以在动物体内刺激抗体产生或t细胞应答的化合物、组合物或物质，包括注射至动物或由动物吸收的组合物(如包含癌症特异性蛋白质的组合物)。示例性抗原包括但不限于脂质、碳水化合物、多糖、糖蛋白、肽或核酸。抗原与特异性体液或细胞免疫的产物，包括由异源抗原如所公开的抗原诱导的产物反应。在特定实施方案中，靶抗原是ag-muc1抗原。
[0104]“表位”或“抗原决定簇”是指结合剂结合的抗原的区域。
[0105]
抗体包括其抗原结合结构域，如骆驼ig、ig nar、fab片段、fab’片段、f(ab)
’2片段、f(ab)
’3片段、fv、单链fv蛋白(“scfv”)、双-scfv、(scfv)2、微型抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫化物稳定的fv蛋白(“dsfv”)和单结构域抗体(sdab、纳米抗体)和负责抗原结合的全长抗体的部分。该术语还包括基因工程形式，如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)、异源缀合抗体(如，双特异性抗体)及其抗原结合结构域。另参见，pierce catalog和handbook,1994-1995(pierce chemical co.,rockford,il)；kuby,j.,immunology,3
rd ed.,w.h.freeman&co.,new york,1997。
[0106]
如本领域技术人员将理解并如本文所述，完整抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链由可变区和第一、第二和第三恒定区组成，而每条轻链由可变区和恒定区组成。哺乳动物重链分类为α、δ、ε、γ和υ。哺乳动物轻链分类为δ或κ。
[0107]
术语“抗体”在本文中以最广义使用，指具有免疫球蛋白样结构域的分子(例如igg、igm、iga、igd或ige)，并且包括单克隆的、重组的、多克隆的、嵌合的、人的、人源化的、
多特异性的抗体，包括双特异性抗体和异源缀合抗体；单可变结构域(例如，结构域抗体(dab))、抗原结合抗体片段、fab、f(ab’)2、fv、二硫键连接的fv、单链fv、二硫键连接的scfv、双抗体、tandabs等和任何上述内容的修饰型式(有关替代的“抗体”格式的综述，参见holliger和hudson,nature biotechnology,2005,vol 23,no.9,1126-1136)。
[0108]
包含α、δ、ε、γ和υ重链的免疫球蛋白分为免疫球蛋白iga、igd、ige、igg和igm。完整的抗体形成“y”形。y的茎由结合在一起的两条重链的第二和第三恒定区(并且对于ige和igm为第四恒定区)组成，并且在铰链中形成二硫键(链间)。重链γ、α和δ具有由三个串联(在一条线上)ig结构域构成的恒定区和铰链区以增加柔性；重链υ和ε具有由四个免疫球蛋白结构域构成的恒定区。第二和第三恒定区分别称为“ch2区”和“ch3区”。y的每个臂包括与单条轻链的可变区和恒定区结合的单条重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。
[0109]
轻链和重链可变区含有由三个高变区(也称为“互补决定区”或“cdr”)中断的“框架”区。“cdr”定义为抗原结合蛋白的互补决定区氨基酸序列。其为免疫球蛋白重链和轻链的高变区。在免疫球蛋白的可变部分中存在三个重链cdr(或cdr区)和三个轻链cdr(或cdr区)。因此，如本文所用，“cdr”是指所有三个重链cdr、所有三个轻链cdr、所有重链和轻链cdr、或至少两个cdr。
[0110]
在整篇说明书中，全长抗原结合序列内例如抗体重链序列或抗体轻链序列内的可变结构域序列和可变结构域区中的氨基酸残基根据kabat编号惯例编号。类似地，实施例中使用的术语“cdr”、“cdrl1”、“cdrl2”、“cdrl3”、“cdrh1”、“cdrh2”、“cdrh3”遵循kabat编号惯例。更多信息请参见kabat等人，sequences of proteins of immunological interest，第4版，u.s.department of health and human services,national institutes of health(1987)。
[0111]
对于本领域技术人员而言，可变结构域序列和全长抗体序列中的氨基酸残基存在替代的编号惯例是显而易见的。cdr序列也存在替代的编号惯例，例如在chothia等人，nature.1989；342(6252):877-83中列出的那些。抗原结合蛋白的结构和蛋白折叠可以意味着其他残基被认为是cdr序列的部分，并且技术人员会理解为如此。
[0112]
技术人员可用的cdr序列的其他编号惯例包括“abm”(巴斯大学)和“contact”(伦敦大学学院)方法。使用kabat、chothia、abm和contact方法中的至少两种可以确定最小重叠区，以提供“最小结合单位”。最小结合单位可以是cdr的子部分。
[0113]
下表1表示对每个cdr或结合单位使用每种编号惯例的一种定义。表1中使用kabat编号方案对可变结构域氨基酸序列进行编号。应该注意的是，某些cdr的定义可以根据使用的个别出版物而变化。
[0114]
表1
[0115][0116]
因此，提供抗原结合蛋白，其包含以下cdr的任何一种或组合：
[0117]
seq id no:31的cdrh1(dhaih)，(或seq id no:13、19、25、37或43的cdrh1，其中每个与seq id no:13相同)；
[0118]
seq id no:32的cdrh2(hfspgntdikyndkfkg)，(或seq id no:14、20、26、38或44的cdrh1，其中每个与seq id no:32相同)；
[0119]
seq id no:33的cdrh3(stfffdy)，(或seq id no:15、21、27、39或45的cdrh3，其中每个与seq id no:33相同)；
[0120]
seq id no:28的cdrl1(kssqsllnsgdqknylt)，(或seq id no:10、16、22、34或40的cdrl1，其中每个与seq id no:28相同)；
[0121]
seq id no:29的cdrl2(wastres)，(或seq id no:11、17、23、35或41的cdrl2，其中每个与seq id no:29相同)；
[0122]
seq id no:30的cdrl3(qndysyplt)，(或seq id no:12、18、24、36或42的cdrl3，其中每个与seq id no:30相同)；
[0123]
或
[0124]
来自seq id no:53的cdrh1、cdrh2、cdrh3(或来自seq id no:47、49、51、55或57的cdrh1、cdrh2、cdrh3)；
[0125]
来自seq id no:52的cdrl1、cdrl2、cdrl3(或来自seq id no:48、50、54或56的cdrl1、cdrl2、cdrl3)。
[0126]
不同轻链或重链的框架区序列在物种(如人)内相对保守。抗体的框架区，即构成轻链和重链的组合框架区，用于在三维空间中定位和对齐cdr。cdr主要负责与抗原的表位结合。
[0127]
提及“vl”或“vl”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括抗体、fv、scfv、dsfv、fab或本文公开的其他抗体片段的轻链的可变区。适合构建本文所预期的抗ag-muc1 car的轻链可变区的说明性实例包括但不限于seq id no:46、48、50、52、54和56中列出的轻链可变区序列。
[0128]
提及“vh”或“vh”是指免疫球蛋白重链的可变区，包括抗体、fv、scfv、dsfv、fab或本文公开的其他抗体片段的重链的可变区。适合构建本文所预期的抗ag-muc1 car的重链可变区的说明性实例包括但不限于seq id no:47、49、51、53、55和57中列出的重链可变区
序列。
[0129]“单克隆抗体”是由b淋巴细胞的单个克隆或由已转染单个抗体的轻链和重链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法产生，例如通过从骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合体中制备杂交抗体形成细胞。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。
[0130]“嵌合抗体”具有来自一个物种如人的框架残基和来自另一物种如小鼠的cdr(其通常赋予抗原结合)。在特别优选的实施方案中，car包含作为嵌合抗体或其抗原结合结构域的抗原特异性结合结构域。
[0131]
在优选的实施方案中，抗体是特异性结合人ag-muc1蛋白的人抗体(如人单克隆抗体)或其抗原结合结构域。
[0132]
在一个实施方案中，car包含“人源化”抗体或其抗原结合结构域。“人源化抗体”是指一类工程化抗体，其cdr衍生自非人供体免疫球蛋白，分子的其余免疫球蛋白衍生部分衍生自一个(或多个)人免疫球蛋白。此外，可以改变框架支持残基以保持结合亲和力(参见例如，queen等人，proc.natl acad sci usa.1989；86(24)：10029-10032；hodgson等人，biotechnology，1991；9(5)：421-5)。合适的人受体抗体可以是通过与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列同源性而选自常规数据库，例如数据库、los alamos数据库和swiss protein数据库的一种。特征在于与供体抗体的框架区同源性(基于氨基酸)的人抗体可能适合提供用于插入供体cdr的重链恒定区和/或重链可变框架区。可以以类似方式选择能够提供轻链恒定区或可变框架区的合适接受体抗体。应当注意，接受体抗体重链和轻链不需要源自相同的受体抗体。在ep-a-0239400和ep-a-054951中详述了产生这种人源化抗体的方法的非限制性实例。
[0133]
在特定实施方案中，抗ag-muc1抗体或其抗原结合结构域包括但不限于骆驼ig(骆驼科抗体(vhh))、ig nar、fab片段、fab’片段、f(ab)
’2片段、f(ab)
’3片段、fv、单链fv抗体(“scfv”)、双-scfv、(scfv)2、微型抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的fv蛋白(“dsfv”)和单结构域抗体(sdab、纳米抗体)。
[0134]
在特定实施方案中，抗ag-muc1抗体或其抗原结合结构域是scfv。
[0135]
示例性的ag-muc1特异性结合结构域是对ag-muc1特异性的免疫球蛋白可变区，其包含至少一个人框架区。“人框架区”是指人免疫球蛋白可变区的野生型(即天然存在的)框架区，具有少于约50％(例如，优选地少于约45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％)的该区域中的氨基酸缺失或取代(例如，用非人免疫球蛋白框架区的一个或多个氨基酸残基在相应位置)的人免疫球蛋白可变区的改变的框架区，或具有少于约50％(例如，优选地少于约45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％)的该区域的氨基酸缺失或取代(例如，在暴露残基的位置和/或用人免疫球蛋白框架区的一个或多个氨基酸残基在相应位置)的非人免疫球蛋白可变区的改变的框架区，从而在一个实施方案中降低免疫原性。
[0136]
在某些实施方案中，人框架区是人免疫球蛋白可变区的野生型框架区。在某些其他实施方案中，人框架区是在一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个位置具有氨基酸缺失或取代的人免疫球蛋白可变区的改变的框架区。在其他实施方案中，人框架区是在一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个位
置具有氨基酸缺失或取代的非人免疫球蛋白可变区的改变的框架区。
[0137]
在特定实施方案中，ag-muc1特异性结合结构域包含选自人轻链fr1、人重链fr1、人轻链fr2、人重链fr2、人轻链fr3、人重链fr3、人轻链fr4和人重链fr4的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个人框架区(fr)。
[0138]
可以存在于ag-muc1特异性结合结构域中的人frs还包括本文提供的示例性frs的变体，其中示例性frs的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸已取代或缺失。
[0139]
在某些实施方案中，ag-muc1特异性结合结构域包含：(a)人源化轻链可变区，其包含人轻链fr1、人轻链fr2、人轻链fr3和人轻链fr4；和(b)人源化重链可变区，其包含人重链fri、人重链fr2、人重链fr3和人重链fr4。
[0140]
本文提供的ag-muc1特异性结合结构域还包含一个、两个、三个、四个、五个或六个cdr。此类cdr可以是选自轻链的cdrl1、cdrl2和cdrl3以及重链的cdrh1、cdrh2和cdrh3的非人cdr或改变的非人cdr。在某些实施方案中，ag-muc1特异性结合结构域包含(a)轻链可变区，其包含轻链cdrl1、轻链cdrl2和轻链cdrl3，和(b)重链可变区，其包含重链cdrh1、重链cdrh1和重链cdrh3。
[0141]
在一个实施方案中，ag-muc1特异性结合结构域包含在seq id no：10-12、16-18、22-24、28-30、34-36和40-42中列出的轻链cdr序列。在特定实施方案中，ag-muc1特异性结合结构域包含与seq id no:10-12、16-18、22-24、28-30、34-36和40-42中列出的轻链cdr序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸同一性的轻链cdr序列。
[0142]
在一个实施方案中，ag-muc1特异性结合结构域包含在seq id no：13-15、19-21、25-27、31-33、37-39和43-45中列出的重链cdr序列。在特定实施方案中，ag-muc1特异性结合结构域包含具有与seq id no:13-15、19-21、25-27、31-33、37-39和43-45中列出的重链cdr序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸同一性的轻链cdr序列。
[0143]
在特定实施方案中，抗ag-muc1抗体或其抗原结合结构域包含：
[0144]
来自seq id no:52的cdrl1、cdrl2和cdrl3；和
[0145]
来自seq id no:53的cdrh1、cdrh2和cdrh3。
[0146]
在特定实施方案中，抗ag-muc1抗体或其抗原结合结构域包含：
[0147]
与seq id no:28至少90％相同的cdrl1序列；
[0148]
与seq id no:29至少90％相同的cdrl2序列；
[0149]
与seq id no:30至少90％相同的cdrl3序列；
[0150]
与seq id no:31至少90％相同的cdrh1序列；
[0151]
与seq id no:32至少90％相同的cdrh2序列；和
[0152]
与seq id no:33至少90％相同的cdrh3序列。
[0153]
在特定实施方案中，抗ag-muc1抗体或其抗原结合结构域包含：
[0154]
seq id no:28的cdrl1序列；
[0155]
seq id no:29的cdrl2序列；
[0156]
seq id no:30的cdrl3序列；
[0157]
seq id no:31的cdrh1序列；
[0158]
seq id no:32的cdrh2序列；和
[0159]
seq id no:33的cdrh3序列。
[0160]
在特定实施方案中，抗ag-muc1 car抗原结合结构域包含：
[0161]
(a)seq id no:46列出的vl序列和seq id no:47列出的vh序列；
[0162]
(b)seq id no:48列出的vl序列和seq id no:49列出的vh序列；
[0163]
(c)seq id no:50列出的vl序列和seq id no:51列出的vh序列；
[0164]
(d)seq id no:52列出的vl序列和seq id no:53列出的vh序列；
[0165]
(e)seq id no:54列出的vl序列和seq id no:55列出的vh序列；或
[0166]
(f)seq id no:56列出的vl序列和seq id no:57列出的vh序列。
[0167]
在一些实施方案中，抗ag-muc1 car抗原结合结构域是从n端到c端包含vh序列和vl序列的scfv，其中vh和vl序列任选地由接头序列隔开。在其他实施方案中，抗ag-muc1 car抗原结合结构域是从n端到c端包含vl序列和vh序列的scfv，其中vh和vl序列任选地由接头序列隔开。
[0168]
在特定实施方案中，抗-ag-muc1 car抗原结合结构域包含具有与seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6或seq id no:7列出的序列至少90％相同的序列的scfv。
[0169]
在特定实施方案中，抗-ag-muc1 car抗原结合结构域包含具有seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6或seq id no:7列出的序列的scfv。
[0170]
在特定实施方案中，抗ag-muc1 car抗原结合结构域包含具有与选自seq id no：90、91、92、93、94和95的序列至少90％相同的序列的scfv。
[0171]
在特定实施方案中，抗ag-muc1 car抗原结合结构域包含具有选自seq id no：90、91、92、93、94和95的序列的scfv。
[0172]
在某些实施方案中，抗ag-muc1 car抗原结合结构域以小于200纳摩尔(nm)的kd结合异常糖基化的muc1蛋白上的一个或多个表位。
[0173]
在实施方案中，car:ag-muc1相互作用的平衡解离常数(kd)为200nm或更小。可替代地，car:ag-muc1相互作用的kd为1nm至200nm、10nm至200nm、20nm至200nm、50nm至200nm、100nm至200nm、150nm至200nm或170nm至200nm。
[0174]
在其他实施方案中，抗ag-muc1 car抗原结合结构域是人源化抗体或其抗原结合结构域，并且以大于非人源化抗体或其抗原结合结构域的k
off
的解离速率常数(k
off
)结合异常糖基化的muc1蛋白上的一个或多个表位。
[0175]
在特定实施方案中，抗ag-muc1 car相互作用的解离速率常数为至少1x10-3 s-1
。例如，解离速率常数(k
off
)可以是至少1x10-3 s-1
、至少2x10-3 s-1
、至少3x10-3 s-1
、至少4x10-3 s-1
、至少5x10-3 s-1
、至少6x10-3 s-1
、至少7x10-3
s-1
、至少8x10-3 s-1
或至少9x10-3 s-1
。在一些实施方案中，解离速率常数(k
off
)为1x10-3 s-1
至1x10-2 s-1
。在一些实施方案中，解离速率常数(k
off
)为1x10-3 s-1
至1x10-2 s-1
、2x10-3 s-1
至1x10-2 s-1
、3x10-3 s-1
至1x10-2 s-1
、4x10-3 s-1
至1x10-2
s-1
、5x10-3 s-1
至1x10-2 s-1
或6x10-3 s-1
至1x 10-2
s-1
。在一些实施方案中，解离速率常数(k
off
)为2x10-3 s-1
至1x10-2 s-1
。在一些实施方案中，解离速率常数(k
off
)为6x10-3 s-1
至1x10-2 s-1
。
[0176]
car:ag-muc1相互作用的解离速率常数(k
off
)可以通过biacore测量。在某些实施方案中，解离速率常数(k
off
)通过人源化scfv蛋白和tnmuc1肽(如seq id no:96的tnmuc1肽)之间的相互作用的biacore测量来确定。解离速率常数(k
off
)可以如实施例4中详述通过biacore测量。例如，解离速率常数(k
off
)可以通过biacore测量，其中tnmuc1肽捕获在芯片表面，并且人源化scfv蛋白在包含10mm hepes、ph 7.6、150mm nacl、3mm edta和0.05％聚山梨醇酯20的缓冲液中使用300秒缔合随后900秒解离在芯片表面上流动。根据本领域已知的方法，tnmuc1肽可以在n端和/或c端用适当的官能团进行修饰，以允许将肽捕获到芯片表面上。
[0177]
接头
[0178]
在某些实施方案中，car包含各种结构域之间例如在vh和vl结构域之间为了分子的适当间距和构象而添加的接头残基。在特定实施方案中，接头是可变区连接序列。“可变区连接序列”是连接vh和vl结构域并提供与两个亚结合结构域的相互作用相容的间隔物功能的氨基酸序列，使得所得多肽保留对作为包含相同轻链和重链可变区的抗体的相同靶分子的特异性结合亲和力。在特定实施方案中，接头分隔一个或多个重链或轻链可变区、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和/或细胞内信号传导结构域。car包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个接头。在特定实施方案中，接头的长度为约1至约25个氨基酸、约5至约20个氨基酸、或约10至约20个氨基酸、或任何中间长度的氨基酸。在一些实施方案中，接头为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个氨基酸长。
[0179]
接头的说明性实例包括甘氨酸聚合物(g)n；甘氨酸-丝氨酸聚合物(g
1-5s1-5
)n，其中n是至少一、二、三、四或五的整数；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；和本领域已知的其他柔性接头。
[0180]
间隔物结构域
[0181]
在特定实施方案中，car的结合结构域之后是一个或多个“间隔物结构域”，间隔物结构域是指将抗原结合结构域从效应细胞表面移开以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和活化的区(patel等人,gene therapy,1999；6:412-419)。间隔物结构域可以衍生自天然、合成、半合成或重组来源。在某些实施方案中，间隔物结构域是免疫球蛋白的一部分，包括但不限于一个或多个重链恒定区例如ch2和ch3。间隔物结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。
[0182]
在一个实施方案中，间隔物结构域包含igg1、igg4或igd的ch2和ch3区。
[0183]
铰链结构域
[0184]
car的结合结构域之后通常是一个或多个“铰链结构域”，其在将抗原结合结构域定位远离效应细胞表面以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和活化方面发挥作用。car通常在结合结构域和跨膜结构域(tm)之间包含一个或多个铰链结构域。铰链结构域可以衍生自天然、合成、半合成或重组来源。铰链结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。
[0185]
适用于本文所述car的例示性铰链结构域包括衍生自i型膜蛋白如cd8α和cd4的细胞外区的铰链区，该铰链区可以是来自这些分子的野生型铰链区或可以被改变。在另一个实施方案中，铰链结构域包含cd8α铰链区。
[0186]
跨膜结构域
[0187]“跨膜结构域”(tm)是car的部分，其融合细胞外结合部分和共刺激结构域/细胞内信号传导结构域，并将car锚定到免疫效应细胞的质膜上。tm结构域可以分离自或衍生自天然、合成、半合成或重组来源。tm结构域可以分离自或衍生自(即，包含)至少t细胞受体cd3δ、cd3ε、cd3γ、cd3ζ、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd27、cd28、cd33、cd37、cd45、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137(4-1bb)、cd152、cd154、cd278(icos)或pd1的α或β链的跨膜区。在特定实施方案中，tm结构域是合成的并且主要包含疏水残基如亮氨酸和缬氨酸。
[0188]
在一个实施方案中，car包含分离或衍生自cd8α的tm结构域。在另一个实施方案中，car包含衍生自cd8α的tm结构域并且优选地长度在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸之间的短寡核苷酸或多肽接头，该接头连接car的tm结构域和共刺激/细胞内信号传导结构域。基于甘氨酸-丝氨酸的接头提供了特别合适的接头。
[0189]
细胞内信号传导结构域
[0190]
在特定实施方案中，car包含细胞内信号传导结构域。“细胞内信号传导结构域”是指参与将有效抗ag-muc1 car与ag-muc1蛋白结合的信息转导到免疫效应细胞内部以引发效应细胞功能，例如激活、细胞因子产生、增殖和/或细胞毒活性，包括向结合car的靶细胞释放细胞毒因子，或由抗原与细胞外car结构域结合引发的其他细胞反应的car部分。
[0191]
术语“效应器功能”是指免疫效应细胞的特定功能。例如，t细胞的效应器功能可以是细胞溶解活性或包括细胞因子分泌的辅助活性。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指转导效应器功能信号并指导细胞执行特定功能的蛋白质部分。尽管通常可以使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不需要使用整个结构域。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，该截短部分可以用于代替整个结构域，只要其转导效应器功能信号即可。
[0192]
术语细胞内信号传导结构域意在包括足以转导效应器功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
[0193]
众所周知，仅通过tcr生成的信号不足以完全激活t细胞，还需要次级或共刺激信号。因此，t细胞激活可以说是由两类不同的信号传导结构域介导的：通过tcr(例如，tcr/cd3复合物)启动抗原依赖性初级激活的细胞内信号传导结构域和以抗原非依赖性方式提供次级或共刺激信号的共刺激信号传导结构域。在优选的实施方案中，car包含一个或多个“共刺激信号传导结构域”和一个或多个“细胞内信号传导结构域”。
[0194]
细胞内信号传导结构域以刺激方式或抑制方式调节tcr复合物的初级激活。以刺激方式起作用的细胞内信号传导结构域可以含有称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或itam的信号传导基序。
[0195]
适用于特定实施方案的含有细胞内信号传导结构域的itam的说明性实例包括那些分离自或衍生自fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3ε、cd3δ、cd3ζ、cd22、cd66d、cd79a或cd79b的itam。在特别优选的实施方案中，car包含cd3ζ细胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激信号传导结构域。细胞内信号传导结构域和共刺激信号传导结构域可以以任何顺序串联连接至跨膜结构域的羧基端，任选地通过接头区与跨膜结构域的羧基端分隔。
[0196]
共刺激结构域
[0197]
在特定实施方案中，car包含一个或多个共刺激信号传导结构域以增强表达car受
体的t细胞的功效和扩增。如本文所用，术语“共刺激信号传导结构域”或“共刺激结构域”是指共刺激分子的细胞内信号传导结构域。共刺激分子是除抗原受体或fc受体之外的细胞表面分子，它们提供t淋巴细胞在与抗原结合后的高效激活和功能所需的第二信号。此类共刺激分子的说明性实例包括card11、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dap10、lat、nkd2c、slp76、tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、trim和zap70。
[0198]
在一个实施方案中，car包含分离自或衍生自选自cd28、cd134(ox40)和cd137(4-1-bb)的共刺激分子的一个或多个共刺激信号传导结构域。
[0199]
在另一个实施方案中，car包含分离自或衍生自cd137(4-1bb)的共刺激信号传导结构域和分离自或衍生自cd3ζ的细胞内信号传导结构域。
[0200]
在特定实施方案中，本文预期的抗ag-muc1 car包括但不限于seq id no：58、59、60和61中列出的氨基酸序列。
[0201]
在一个实施方案中，抗-ag-muc1 car包含seq id no:58的序列。
[0202]
在一个实施方案中，抗-ag-muc1 car包含seq id no:59的序列。
[0203]
在一个实施方案中，抗-ag-muc1 car包含seq id no:60的序列。
[0204]
在一个实施方案中，抗-ag-muc1 car包含seq id no:61的序列。
[0205]
在一些实施方案中，car包含：
[0206]
a)细胞外结构域，其包含结合异常糖基化的muc1蛋白上的一个或多个表位的抗体或其抗原结合结构域，其中该抗体或其抗原结合结构域以小于200纳摩尔(nm)的kd结合所述表位；
[0207]
b)跨膜结构域；
[0208]
c)一个或多个共刺激结构域；和
[0209]
d)一个或多个细胞内信号传导结构域。
[0210]
在一些实施方案中，car包含：
[0211]
a)细胞外结构域，其包含结合异常糖基化的muc1蛋白上的一个或多个表位的抗体或其抗原结合结构域，其中该抗体或其抗原结合结构域以至少1
×
10-3
s-1
的解离速率常数(k
off
)结合所述表位；
[0212]
b)跨膜结构域；
[0213]
c)一个或多个共刺激结构域；和
[0214]
d)一个或多个细胞内信号传导结构域。
[0215]
在一些实施方案中，car包含：
[0216]
a)细胞外结构域，其包含结合异常糖基化的muc1蛋白上的一个或多个表位的人源化抗体或其抗原结合结构域，其中该抗体或其抗原结合结构域包含：
[0217]
与seq id no:28至少90％相同的cdrl1序列，优选seq id no:28的cdrl1序列；
[0218]
与seq id no:29至少90％相同的cdrl2序列，优选seq id no:29的cdrl2序列；
[0219]
与seq id no:30至少90％相同的cdrl3序列，优选seq id no:30的cdrl3序列；
[0220]
与seq id no:31至少90％相同的cdrh1序列，优选seq id no:31的cdrh1序列；
[0221]
与seq id no:32至少90％相同的cdrh2序列，优选seq id no:32的cdrh2序列；和
[0222]
与seq id no:33至少90％相同的cdrh3序列，优选seq id no:33的cdrh3序列，
[0223]
并且其中抗体或其抗原结合片段以大于包含cdrl1、cdrl2、cdrl3、cdrh1、cdrh2和cdrh3序列的非人源化抗体或其抗原结合结构域的k
off
的解离速率常数(k
off
)结合所述表位；
[0224]
b)跨膜结构域；
[0225]
c)一个或多个共刺激结构域；和
[0226]
d)一个或多个细胞内信号传导结构域。
[0227]
在实施方案中，包含cdrl1、cdrl2、cdrl3、cdrh1、cdrh2和cdrh3序列的非人源化抗体或其抗原结合结构域是鼠抗体或其抗原结合片段。
[0228]
在实施方案中，car包含：
[0229]
a)细胞外结构域，其包含结合异常糖基化的muc1蛋白上的一个或多个表位的人源化单链可变片段(scfv)，其中该scfv包含：
[0230]
seq id no:28的cdrl1序列；
[0231]
seq id no:29的cdrl2序列；
[0232]
seq id no:30的cdrl3序列；
[0233]
seq id no:31的cdrh1序列；
[0234]
seq id no:32的cdrh2序列；和
[0235]
seq id no:33的cdrh3序列，
[0236]
并且其中抗体或其抗原结合片段以大于包含cdrl1、cdrl2、cdrl3、cdrh1、cdrh2和cdrh3序列的非人源化抗体或其抗原结合结构域的k
off
的解离速率常数(k
off
)结合所述表位；
[0237]
b)分离自cd8α的跨膜结构域；
[0238]
c)分离自cd137(4-1bb)的共刺激结构域；和
[0239]
d)分离自cd3ζ的细胞内信号传导结构域。
[0240]
在本发明的其他实施方案中，car包含：
[0241]
(a)细胞外结构域，其包含结合异常糖基化的muc1蛋白上的一个或多个表位的人源化抗体或其抗原结合结构域，其中该抗体或其抗原结合结构域以至少1x10-3 s-1
的解离速率常数(k
off
)结合所述表位并至少具有以下附加特性之一：
[0242]
(i)增加的对表达异常糖基化的muc1蛋白的细胞的特异性；和/或
[0243]
(ii)减少的t细胞耗竭；
[0244]
(b)跨膜结构域；
[0245]
(c)一个或多个共刺激结构域域；和
[0246]
(d)一个或多个细胞内信号传导结构域。
[0247]
增加的car对表达异常糖基化的muc1蛋白的细胞的特异性意味着经修饰以表达所述car的t细胞具有增加的区分表达异常糖基化的muc1蛋白的细胞和不表达异常糖基化的muc1蛋白的细胞的能力。可以使用本领域已知的任何方法确定表达异常糖基化的muc1蛋白的细胞的特异性，如通过测量经修饰以表达本文提供的car的t细胞在与对异常糖基化的muc1蛋白呈阳性或阴性的细胞共培养时的细胞因子释放(例如，ifn-γ释放)。细胞因子释放如ifn-γ释放是t细胞激活的标志物。
[0248]
在异常糖基化的muc1蛋白存在的情况下，具有快解离速率(即更高的解离速率常
数(k
off
))的car也可以导致减少的t细胞耗竭。t细胞耗竭可以通过本领域已知的任何方法来测定，如通过测量经修饰以表达本文提供的car的t细胞的抗原非依赖性(基础)信号传导来测定。car-t细胞的基础激活可以通过在没有抗原的情况下测量pd1、tim3、lag3标志物(耗竭标志物)和干扰素-γ(ifnγ)分泌(激活标志物)的水平来确定。
[0249]
多肽
[0250]
本文预期了多种多肽，包括但不限于car多肽及其片段、包含其的细胞和组合物、抗体和表达多肽的载体。在优选的实施方案中，提供了包含一种或多种car的多肽。在特定实施方案中，car是抗ag-muc1 car，其包含如seq id no：58、59、60或61的任一个列出的氨基酸序列。
[0251]
除非另有说明，“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”可互换使用并且根据常规含义使用，即作为氨基酸序列使用。多肽可以合成或重组产生。多肽不限于特定长度，例如它们可以包含全长蛋白质序列或全长蛋白质的片段，并且可以包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等以及本领域已知的其他修饰，包括天然存在的和非天然存在的修饰。在各种实施方案中，car多肽在蛋白质的n端末端包含信号(或前导)序列，该序列共翻译或翻译后指导蛋白质的转移。可用于本文预期的car的合适信号序列的说明性实例包括但不限于iggl重链信号多肽、cd8α信号多肽或人gm-csf受体α信号多肽。用于car的示例性信号序列显示于seq id no:8中。
[0252]
可以使用多种众所周知的重组和/或合成技术中的任何一种来制备多肽。本文所预期的多肽具体涵盖本公开的car，或具有如本文所预期的car的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。
[0253]
如本文所用，“分离的肽”或“分离的多肽”等是指来自细胞环境以及来自与细胞的其他组分的缔合的肽或多肽分子的体外分离和/或纯化，即其与体内物质没有显著相关性。类似地，“分离的细胞”是指从体内组织或器官中获得并且基本上不含细胞外基质的细胞。
[0254]
多肽包括“多肽变体”。多肽变体可以在一个或多个取代、缺失、添加和/或插入方面不同于天然存在的多肽。此类变体可以是天然存在的或可以例如通过修饰一种或多种上述多肽序列合成产生。
[0255]
多核苷酸
[0256]
在优选的实施方案中，提供了编码一种或多种car多肽的多核苷酸。如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”是指信使rna(mrna)、rna、基因组rna(grna)、正链rna(rna(+))、负链rna(rna(-))、基因组dna(gdna)、互补dna(cdna)或重组dna。多核苷酸包括单链和双链多核苷酸。
[0257]
在各种说明性实施方案中，多核苷酸包括表达载体、病毒载体和转移质粒，以及包含它们的组合物和细胞。在各种说明性实施方案中，多核苷酸编码本文所预期的多肽，包括但不限于seq id no：2-7和10-61中列出的多肽序列。
[0258]
如本文所用，“分离的多核苷酸”是指已从天然存在状态的侧翼序列中纯化的多核苷酸，例如已从通常与该片段相邻的序列中去除的dna片段。“分离的多核苷酸”也指互补dna(cdna)、重组dna或自然界中不存在且由人工制备的其他多核苷酸。
[0259]
多核苷酸可以使用本领域已知和可获得的多种成熟技术中的任何一种来制备、操作和/或表达。为了表达期望的多肽，可以将编码该多肽的核苷酸序列插入适当的载体中。
[0260]
载体
[0261]
本发明提供了包含编码一种或多种如本文所述的car多肽的多核苷酸的载体。
[0262]
如本文所用，术语“载体”是指能够转移或转运另一种核酸分子的核酸分子。转移的核酸通常与载体核酸分子连接，例如插入到载体核酸分子中。载体可以包括在细胞中指导自主复制的序列或可以包括足以允许整合到宿主细胞dna中的序列。有用的载体包括例如质粒(例如，dna质粒)、转座子、粘粒、细菌人工染色体和病毒载体。有用的病毒载体包括例如复制缺陷逆转录病毒和慢病毒。
[0263]
在特定实施方案中，载体是表达载体。表达载体可以用于产生本发明的car和多肽。此外，表达载体可以包括允许产生病毒载体的附加组分，该病毒载体又反过来包含本发明的多核苷酸。病毒载体可以用于将本发明的多核苷酸递送至受试者或受试者的细胞。表达载体的实例包括但不限于质粒、自主复制序列和转座因子。其他示例性载体包括但不限于质粒、噬菌粒、粘粒、转座子、人工染色体如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或pi衍生人工染色体(pac)、噬菌体如λ噬菌体或ml 3噬菌体和动物病毒。
[0264]
表达载体的其他实例是用于在哺乳动物细胞中表达的pclneo载体(promega)；用于慢病毒介导的基因转移和在哺乳动物细胞中表达的plenti4/v5-desttm plenti6/v5-desttm和plenti6.2/v5-gw/lacz(invitrogen)。在特定实施方案中，本文公开的car和多肽的编码序列可以连接到此类表达载体中，用于哺乳动物细胞中表达car和/或多肽。
[0265]
在特定实施方案中，本发明的表达载体是包含本发明多核苷酸的bac。在特定实施方案中，bac另外包含一种或多种多核苷酸，其编码当在生产细胞或包装细胞系中表达时允许病毒载体产生所必需的蛋白质。举例而言，pct申请wo2017/089307和wo2017/089308描述了用于产生逆转录病毒载体，特别是慢病毒载体的表达载体。在特定实施方案中，本发明包括在wo2017/089307和wo2017/089308中描述的包含本发明的多核苷酸的表达载体。
[0266]
表达载体中存在的“控制元件”或“调节序列”是载体的那些非翻译区——复制起点、选择盒、启动子、增强子、翻译起始信号(shine dalgarno序列或kozak序列)、内含子、多腺苷酸化序列、5’和3’非翻译区——其与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和翻译。此类元件的强度和特异性可以有所不同。根据所使用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的合适的转录和翻译元件，包括普遍存在的启动子和诱导型启动子。
[0267]
用于递送的载体
[0268]
本发明还提供了用于将本发明的多核苷酸递送至受试者和/或受试者的细胞的载体。此类载体的实例包括但不限于质粒、自主复制序列、转座元件、噬菌粒、粘粒、人工染色体如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或pi衍生人工染色体(pac)、噬菌体如λ噬菌体或m1 3噬菌体和病毒载体。
[0269]
可用作病毒载体的动物病毒的类别的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒(aav)、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳多空病毒(例如，sv40)。这些载体在本文中称为“病毒载体”。
[0270]
如技术人员将理解的，术语“病毒载体”广泛用于指包括通常促进核酸分子转移或整合进入细胞基因组的病毒衍生核酸元件的核酸分子(例如，转移质粒)或介导核酸转移的病毒颗粒。
[0271]
逆转录病毒是基因递送的常用工具(miller,2000,nature.357:455-460)。在特定
实施方案中，逆转录病毒用于将编码本发明的car的多核苷酸递送至细胞。如本文所用，术语“逆转录病毒”是指将其基因组rna逆转录成线性双链dna拷贝并随后将其基因组dna共价整合到宿主基因组中的rna病毒。一旦病毒整合到宿主基因组中，其就被称为“原病毒”。原病毒作为rna聚合酶ii的模板并指导rna分子的表达，这些rna分子编码产生新病毒颗粒所需的结构蛋白和酶。
[0272]
适用于特定实施方案的说明性逆转录病毒包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(m-mulv)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(momsv)、哈维鼠肉瘤病毒(hamusv)、鼠乳腺肿瘤病毒(mumtv)、长臂猿白血病病毒(galv)、猫白血病病毒(flv)、泡沫病毒属(spumavirus)、friend鼠白血病病毒、鼠干细胞病毒(mscv)和劳斯肉瘤病毒(rsv)以及慢病毒。
[0273]
如本文所用，术语“慢病毒”是指复杂的逆转录病毒的组(或属)。说明性慢病毒包括但不限于：hiv(人免疫缺陷病毒；包括hiv 1型和hiv 2型)；visna-maedi病毒(vmv)病毒；山羊关节炎脑炎病毒(caev)；马传染性贫血病毒(eiav)；猫免疫缺陷病毒(fiv)；牛免疫缺陷病毒(biv)；和猴免疫缺陷病毒(siv)。在一个实施方案中，优选基于hiv的载体主链(即hiv顺式作用序列元件)。
[0274]
逆转录病毒载体，并且更特别地慢病毒载体可以用于实施特定实施方案。因此，如本文所用，术语“逆转录病毒”或“逆转录病毒载体”意在分别包括“慢病毒”和“慢病毒载体”。
[0275]
病毒颗粒通常包括各种病毒组分，有时除核酸外还包括宿主细胞组分。
[0276]
如上所述，术语“病毒载体”可以指能够将核酸转移到细胞中的病毒或病毒颗粒，或者指被转移的核酸本身。病毒载体和转移质粒包含主要衍生自病毒的结构和/或功能遗传元件。术语“逆转录病毒载体”是指主要衍生自逆转录病毒的含有结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。术语“慢病毒载体”是指含有结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒，包括主要衍生自慢病毒的ltr。术语“杂合载体”是指含有逆转录病毒(例如，慢病毒)序列和非慢病毒病毒序列两者的载体、ltr或其他核酸。在一个实施方案中，杂合载体是指包含用于逆转录、复制、整合和/或包装的逆转录病毒序列例如慢病毒序列的载体或转移质粒。
[0277]
在特定实施方案中，术语“慢病毒载体”和“慢病毒表达载体”可用于指代慢病毒转移质粒和/或感染性慢病毒颗粒。在本文提及元件如克隆位点、启动子、调节元件、异源核酸等时，应理解这些元件的序列以rna形式存在于慢病毒颗粒中并且以dna形式存在于dna质粒中。
[0278]
在原病毒的每一末端都有称为“长末端重复”或“ltr”的结构。术语“长末端重复(ltr)”是指位于逆转录病毒dna的末端的碱基对的结构域，就其天然序列而言，它们是直接重复并含有u3、r和u5区。ltr通常为逆转录病毒基因的表达(例如，基因转录物的促进、起始和多聚腺苷酸化)和病毒复制提供基本功能。ltr含有许多调节信号，包括转录控制元件、病毒基因组复制和整合所需的多腺苷酸化信号和序列。病毒ltr分为称为u3、r和us的三个区。u3区含有增强子和启动子元件。u5区是引物结合位点和r区之间的序列并且含有多聚腺苷酸化序列。r(重复)区的两侧是u3和u5区。ltr包含u3、r和u5区，并出现在病毒基因组的5’和3’末端。与5’ltr相邻的是基因组的逆转录所必需的序列(trna引物结合位点)和将病毒rna高效包装成颗粒所必需的序列(psi位点)。
[0279]
如本文所用，术语“包装信号”或“包装序列”是指位于逆转录病毒基因组内的序列，该序列是病毒rna插入病毒衣壳或病毒颗粒所必需的，参见例如clever等人，j virol.1995；69(4):2101-9。几种逆转录病毒载体使用病毒基因组衣壳化所需的最小包装信号(也称为psi[w]序列)。因此，如本文所用，术语“包装序列”、“包装信号”、“psi”和符号“w”用于指在病毒颗粒形成过程中逆转录病毒rna链衣壳化所需的非编码序列。
[0280]
在各种实施方案中，载体包含修饰的5’ltr和/或3’ltr。ltr中的一个或两个可以包含一个或多个修饰，包括但不限于一个或多个缺失、插入或取代。3’ltr的修饰通常通过使病毒具有复制缺陷来提高慢病毒或逆转录病毒系统的安全性。如本文所用，术语“复制缺陷的”是指不能完全、有效复制以致不产生感染性病毒体的病毒(例如，复制缺陷的慢病毒后代)。术语“具有复制能力的”是指能够复制的野生型病毒或突变病毒，使得病毒的病毒复制能够产生感染性病毒体(例如，具有复制能力的慢病毒后代)。
[0281]“自失活”(sin)载体是指复制缺陷的载体，例如逆转录病毒或慢病毒载体，其中称为u3区的右侧(3’)ltr增强子-启动子区已被修饰(例如，通过缺失或取代)以防止病毒转录超出第一轮病毒复制。这是因为在病毒复制过程中，右侧(3’)ltr u3区被用作左侧(5’)ltr u3区的模板，因此如果没有u3增强子-启动子，病毒转录物就无法制备。在进一步的实施方案中，3’ltr被修饰，使得u5区被例如理想的poly(a)序列替换。应当注意，对ltr的修饰如对3’ltr、5’ltr或3’和5’ltr的修饰也包括在内。
[0282]
通过用异源启动子替换5’ltr的u3区域以在病毒颗粒产生期间驱动病毒基因组的转录，提供了额外的安全性增强。可以使用的异源启动子的实例包括例如病毒猿猴病毒40(sv40)(例如，早期或晚期)、巨细胞病毒(cmv)(例如，立即早期)、莫洛尼鼠白血病病毒(momlv)、劳斯肉瘤病毒(rsv)和单纯疱疹病毒(hsv)(胸苷激酶)启动子。典型的启动子能够以不依赖于tat的方式驱动高水平的转录。由于病毒生产系统中没有完整的u3序列，这种替换降低了重组产生具有复制能力的病毒的可能性。在某些实施方案中，异源启动子在控制病毒基因组转录方式方面具有额外优势。例如，异源启动子可以是可诱导的，使得全部或部分病毒基因组的转录将仅在诱导因素存在时发生。诱导因素包括但不限于一种或多种化合物或培养宿主细胞的生理条件如温度或ph。
[0283]
根据某些具体实施方案，大部分或所有病毒载体主链序列衍生自慢病毒，例如hiv-i。然而，应该理解的是，可以使用或组合许多不同来源的逆转录病毒和/或慢病毒序列，并且可以在不损害转移载体执行本文所述功能的能力的情况下在某些慢病毒序列中容纳许多取代和改变。此外，本领域已知多种慢病毒载体，参见naldini等人,(science.1996；272(5259):263-7；proc natl acad sci usa.1996；93(21):11382-8；curr opin biotechnol.1998；9(5):457-63)；zufferey al.,nat biotechnol.1997；15(9):871-5；dull等人,j virol.1998；72(11):8463-71；美国专利号6,013,516；和5,994,136,其中许多可以适用于生产病毒载体或转移质粒。
[0284]
在各种实施方案中，载体包含可操作地连接到编码car多肽的多核苷酸的启动子。
[0285]
在特定实施方案中，载体是非整合载体，包括但不限于游离型载体或在染色体外维持的载体。如本文所用，术语“游离型”是指能够复制而不整合到宿主的染色体dna中并且不会从分裂的宿主细胞中逐渐丢失的载体，也意味着所述载体在染色体外或游离型复制。
[0286]
控制元件
[0287]
在特定实施方案中，载体(包括但不限于表达载体和病毒载体)将包括外源、内源或异源控制序列如启动子和/或增强子。“内源性”控制序列是与基因组中的给定基因天然连接的控制序列。“外源性”控制序列是通过遗传操作(即分子生物学技术)与基因并列放置使得该基因的转录由连接的增强子/启动子指导的控制序列。“异源”控制序列是来自与被遗传操作的细胞不同的物种的外源序列。
[0288]
如本文所用，术语“启动子”是指rna聚合酶结合的多核苷酸(dna或rna)的识别位点。rna聚合酶启动并转录可操作地连接到启动子的多核苷酸。在特定实施方案中，在哺乳动物细胞中起作用的启动子包含位于转录起始位点上游约25至30个碱基处的富含at的区和/或在转录起始处上游70至80个碱基处发现的另一个序列cncaat区，其中n可以是任何核苷酸。
[0289]
术语“增强子”是指含有能够提供增强的转录并且在某些情况下可以独立于它们相对于另一个控制序列的方向而发挥作用的序列的dna片段。增强子可以与启动子和/或其他增强子元件协同或叠加发挥作用。术语“启动子/增强子”是指含有能够提供启动子和增强子功能的序列的dna片段。
[0290]
术语“可操作地连接”是指并列关系，其中所描述的组分处于允许它们以它们预期的方式起作用的关系中。在一个实施方案中，该术语是指核酸表达控制序列(如启动子和/或增强子)和第二多核苷酸序列(例如，感兴趣的多核苷酸)之间的功能连接，其中表达控制序列指导对应于第二序列的核酸的转录。
[0291]
如本文所用，术语“组成型表达控制序列”是指不断地或连续地允许可操作连接的序列转录的启动子、增强子或启动子/增强子。组成型表达控制序列可以是允许在多种细胞和组织类型中表达的“普遍存在的”启动子、增强子或启动子/增强子，或“细胞特异性”、“细胞类型特异性”、“细胞谱系特异性”或“组织特异性”启动子、增强子或启动子/增强子，它们分别允许在有限的多种细胞和组织类型中表达。
[0292]
适用于特定实施方案的说明性普遍存在的表达控制序列包括但不限于巨细胞病毒(cmv)立即早期启动子、病毒性猿猴病毒40(sv40)(例如，早期或晚期)、莫洛尼鼠白血病病毒(mon4lv)ltr启动子、劳斯肉瘤病毒(rsv)ltr、单纯疱疹病毒(hsv)(胸苷激酶)启动子、来自牛痘病毒的h5、p7.5和p11启动子、延伸因子1-α(ef1a)启动子、早期生长反应因子1(egr1)、铁蛋白h(ferh)、铁蛋白l(ferl)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh)、真核翻译起始因子4a1(eif4a1)、热休克70kda蛋白5(hspa5)、热休克蛋白90kdaβ成员1(hsp90b1)、热休克蛋白70kda(hsp70)、β-驱动蛋白(βkin)、人rosa26基因座(irions等人,nature biotechnology 25,1477-1482(2007))、泛素c启动子(ubc)、磷酸甘油酸激酶1(pgk)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(cag)启动子、β-肌动蛋白启动子和骨髓增殖性肉瘤病毒增强子、阴性对照区缺失d1587rev引物结合位点取代(mnd)启动子(challita等人,j virol.69(2)
·
748-55(1995))。
[0293]
在一个实施方案中，载体包含pgk启动子。
[0294]
在特定实施方案中，可以期望表达包含来自t细胞特异性启动子的car的多核苷酸。
[0295]
如本文所用，“条件表达”可以指任何类型的条件表达，包括但不限于诱导型表达；阻遏型表达；在具有特定生理、生物学或疾病状态的细胞或组织中的表达等。该定义不旨在
排除细胞类型或组织特异性表达。某些实施方案提供了感兴趣多核苷酸的条件表达，例如，通过使细胞、组织、生物体等经受导致多核苷酸被表达的处理和条件或导致由感兴趣的多核苷酸编码的多核苷酸的表达增加或减少的处理或条件来控制表达。
[0296]
诱导型启动子/系统的说明性实例包括但不限于类固醇诱导型启动子如编码糖皮质激素或雌激素受体的基因的启动子(可通过相应激素处理诱导)、金属硫蛋白启动子(可通过各种重金属处理诱导)、mx-i启动子(可通过干扰素诱导)、“geneswitch”米非司酮调节系统(sirin等人，2003，gene，323：67)、cumate诱导型基因开关(wo 2002/088346)、四环素依赖性调节系统等。
[0297]
在一些实施方案中，多核苷酸或包含该多核苷酸的细胞利用自杀基因包括诱导型自杀基因来降低直接毒性和/或不受控制的增殖的风险。在具体实施方案中，自杀基因对包含多核苷酸或细胞的宿主没有免疫原性。可以使用的自杀基因的特定实例是caspase-9或caspase-8或胞嘧啶脱氨酶。caspase-9可以使用特定的二聚化化学诱导剂(cid)激活。
[0298]
在某些实施方案中，载体包含导致免疫效应细胞例如t细胞对体内阴性选择易感的基因片段。“阴性选择”是指注入的细胞可以由于个体体内条件的改变而被消除。阴性选择表型可能是由于赋予对所施用的药剂(例如化合物)的敏感性的基因的插入。
[0299]
阴性选择基因是本领域已知的，并且尤其包括以下：赋予更昔洛韦敏感性的单纯疱疹病毒i型胸苷激酶(hsv-i tk)基因(wigler等人，cell i:223,1977)；细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(hprt)基因、细胞腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(aprt)基因和细菌胞嘧啶脱氨酶(mullen等人,proc.natl.acad.sci.usa 89
·
33(1992))。
[0300]
在一些实施方案中，遗传修饰的免疫效应细胞如t细胞，包含进一步包含能够在体外选择具有阴性可选择表型的细胞的阳性标志物的多核苷酸。阳性选择标志物可以是在被引入宿主细胞后表达显性表型的基因，该显性表型允许阳性选择携带该基因的细胞。这种类型的基因在本领域中是已知的，并且尤其包括赋予对潮霉素b抗性的潮霉素-b磷酸转移酶基因(hph)、来自tn5编码对抗生素g418的抗性的氨基糖苷磷酸转移酶基因(neo或aph)、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因、腺苷脱氨酶基因(ada)和多药耐药(mdr)基因。
[0301]
优选地，阳性选择标志物和阴性选择元件连接在一起，使得阴性选择元件的丢失也必然伴随阳性选择标志物的丢失。甚至更优选地，将阳性和阴性选择标志物融合，使得一个的丢失必然导致另一个的丢失。产生作为表达产物的多肽的融合多核苷酸的实例是赋予上述期望的阳性和阴性选择特征的潮霉素磷酸转移酶胸苷激酶融合基因(hytk)。该基因的表达产生了赋予潮霉素b抗性以进行体外阳性选择，并赋予更昔洛韦敏感性以进行体内阴性选择的多肽。参见lupton s.d.,等人,mol.and cell.biology 11:3374-3378,1991。此外，在优选的实施方案中，编码car的多核苷酸存在于含有融合基因的逆转录病毒载体中，特别是存在于在那些赋予潮霉素b抗性以进行体外阳性选择和更昔洛韦敏感性以进行体内阴性选择的逆转录病毒载体，例如描述于lupton,s.d.等人(1991)，同上的hytk逆转录病毒载体中。
[0302]
载体生产
[0303]
在特定实施方案中，细胞(例如，免疫效应细胞)用编码car的逆转录病毒载体(例如，慢病毒载体)转导。例如，用编码本发明的car的载体转导免疫效应细胞。这些转导的细胞可以引发car介导的细胞毒性反应。
[0304]“宿主细胞”包括用载体或多核苷酸在体内、离体或体外电穿孔、转染、感染或转导的细胞。宿主细胞可以包括包装细胞、生产细胞和用病毒载体转导的细胞。在特定实施方案中，将用病毒载体转导的宿主细胞施用于需要治疗的受试者。在某些实施方案中，术语“靶细胞”可与宿主细胞互换使用，是指期望细胞类型的转染、感染或转导细胞。在优选的实施方案中，靶细胞是t细胞。
[0305]
为了获得合适的病毒滴度，通常需要大规模生产病毒载体。病毒颗粒可以通过将转移载体转染到包含病毒结构和/或辅助基因例如gag、poi、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef基因或其他逆转录病毒基因的包装细胞系中来产生。
[0306]
如本文所用，术语“包装载体”是指缺乏包装信号并包含编码一种、两种、三种、四种或更多种病毒结构和/或辅助基因的多核苷酸的表达载体或病毒载体。通常，包装载体包含在包装细胞中，并通过转染、转导或感染引入细胞。转染、转导或感染的方法为本领域技术人员所熟知。在特定实施方案中，通过转染、转导或感染将逆转录病毒/慢病毒转移载体引入包装细胞系，以产生生产细胞或细胞系。在特定实施方案中，包装载体通过包括例如磷酸钙转染、脂质转染或电穿孔的标准方法引入人细胞或细胞系。在一些实施方案中，将包装载体与显性选择标志如新霉素、潮霉素、嘌呤霉素、杀稻瘟素(blastocidin)、博来霉素、胸苷激酶、dhfr、gln合成酶或ada一起引入细胞中，然后在合适的选择标志物存在下选择药物和分离克隆。可选择标志物基因可以与包装载体例如ires或自切割病毒肽编码的基因物理连接。
[0307]
如本文所用，术语“包装细胞系”用于指不含有包装信号但稳定或瞬时表达对于病毒颗粒的正确包装所必需的病毒结构蛋白和复制酶(例如gag、pol和env)的细胞系。包装细胞可以使用任何合适的细胞系来制备。通常，细胞是哺乳动物细胞。在特定实施方案中，用于产生包装细胞系的细胞是人细胞。可以使用的合适的细胞系包括例如cho细胞、bhk细胞、nock细胞、c3h iot1/2细胞、fly细胞、psi2细胞、bosc 23细胞、pa317细胞、wehi细胞、cos细胞、bsc 1细胞、bsc 40细胞、bmt 10细胞、vero细胞、w 138细胞、mrc5细胞、a549细胞、ht1080细胞、hek293细胞、hek293t细胞、b-50细胞、3t3细胞、nih3t3细胞、hepg2细胞、saos-2细胞、huh7细胞、hela细胞、w 163细胞、211细胞和21ia细胞。在优选的实施方案中，包装细胞是hekk293细胞或hek293 t细胞。在另一个优选的实施方案中，细胞是hek293t细胞。
[0308]
如本文所用，术语“生产细胞系”是指能够产生重组逆转录病毒颗粒的细胞系，其包含包装细胞系和包含包装信号的转移载体构建体。感染性病毒颗粒和病毒原液的生产可以使用常规技术进行。生产细胞系包括在wo2017/089307和wo2017/089308中描述的那些细胞系，它们在宿主细胞基因组的单个基因座中包含逆转录病毒载体产生所必需的所有元件。
[0309]
制备病毒原液的方法在本领域中是已知的并且由例如y.soneoka等人(1995)nucl.acids res.23:628-633和n.r.landau al.(1992)j.virol.66:5110-5113进行了说明。可以使用常规技术从包装细胞中收集感染性病毒颗粒。例如，感染性颗粒可以通过细胞裂解或细胞培养物上清液的收集来收集，如本领域已知的。任选地，如果期望，收集的病毒颗粒可以纯化。合适的纯化技术为本领域技术人员所熟知。
[0310]
病毒包膜蛋白(env)决定了最终可以被细胞系产生的重组逆转录病毒感染和转化的宿主细胞的范围。对于慢病毒，如hiv-1、hiv-2、siv、fiv和eiv，env蛋白包括gp41和
gp120。
[0311]
如本文所用，术语“假型”或“伪型”是指其病毒包膜蛋白已被具有优选特征的另一种病毒的包膜蛋白取代的病毒。例如，hiv可以用水泡性口炎病毒g蛋白(vsv-g)包膜蛋白进行假型化，这使得hiv可以感染更广泛的细胞，因为hiv包膜蛋白(由env基因编码)通常将病毒靶向cd4+呈递细胞。在优选的实施方案中，慢病毒包膜蛋白用vsv-g假型化。在一个实施方案中，包装细胞产生用vsv-g包膜糖蛋白假型化的重组逆转录病毒例如慢病毒。
[0312]
在其他实施方案中，病毒载体可以用来自另一种逆转录病毒或无关病毒的包膜蛋白进行假型化。技术人员将理解本发明的病毒载体可以用任何合适的包膜蛋白进行假型化。
[0313]
使用逆转录病毒或慢病毒载体通过病毒感染而不是通过转染的基因或其他多核苷酸序列的递送被称为“转导”。在一个实施方案中，通过感染和原病毒整合将逆转录病毒载体转导到细胞中。在某些实施方案中，如果靶细胞例如t细胞包含通过使用病毒或逆转录病毒载体感染递送至细胞的基因或其他多核苷酸序列，则该细胞是“转导的”。在特定实施方案中，转导细胞在其细胞基因组中包含由逆转录病毒或慢病毒载体递送的一个或多个基因或其他多核苷酸序列。
[0314]
免疫效应细胞
[0315]
在各种实施方案中，提供了经遗传修饰以表达本文预期的car的细胞用于癌症治疗。如本文所用，术语“基因工程”或“遗传修饰”是指将dna或rna形式的额外遗传物质添加到细胞中的总遗传物质中。术语“遗传修饰细胞”、“修饰细胞”和“重定向细胞”可互换使用。如本文所用，术语“基因疗法”是指将额外的遗传物质以dna或rna的形式引入细胞中的总遗传物质中，以恢复、纠正或修饰基因的表达，或为了表达治疗性多肽例如car的目的。
[0316]
在特定实施方案中，本发明预期的car被引入免疫效应细胞中并在免疫效应细胞中表达，从而将它们的特异性重定向到感兴趣的靶抗原例如ag-muc1蛋白。
[0317]“免疫效应细胞”是具有一种或多种效应器功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、细胞因子分泌、adcc和/或cdc的诱导)的免疫系统的任何细胞。本文预期的说明性免疫效应细胞是t淋巴细胞，特别是细胞毒性t细胞(ctl；cd8+t细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(til)和辅助t细胞(htl；cd4+t细胞)。在一个实施方案中，免疫效应细胞包括自然杀伤(nk)细胞。在一个实施方案中，免疫效应细胞包括自然杀伤t细胞。在一个实施方案中，免疫效应细胞包括细胞毒性t淋巴细胞。
[0318]
免疫效应细胞可以是自体的(autologous)/自体的(autogeneic)(“自身”)或非自体的(“非自身”，例如同种异体的、同基因的或异种的)。
[0319]
如本文所用，“自体的”是指来自相同受试者的细胞。
[0320]
如本文所用，“同种异体的”是指比较而言在遗传上与该细胞不同的相同物种的细胞。
[0321]
如本文所用，“同基因的”是指比较而言在遗传上与该细胞相同的不同受试者的细胞。
[0322]
如本文所用，“异种的”是指比较而言与细胞不同物种的细胞。
[0323]
在某些实施方案中，细胞是同种异体的。
[0324]
在某些实施方案中，细胞是自体的。
[0325]
与本文预期的car一起使用的说明性免疫效应细胞包括t淋巴细胞。术语“t细胞”或“t淋巴细胞”是本领域公认的并且旨在包括胸腺细胞、未成熟t淋巴细胞、成熟t淋巴细胞、静息t淋巴细胞或活化t淋巴细胞。t细胞可以是t辅助(th)细胞，例如t辅助i(th1)或t辅助2(th2)细胞。t细胞可以是辅助t细胞(htl；cd4
+
t细胞)cd4
+
t细胞、细胞毒性t细胞(ctl；cd8
+
t细胞)、cd4
+
cd8
+
t细胞、cd4-cd8-t细胞或t细胞的任何其他亚群。适用于特定实施方案的其他说明性t细胞群包括幼稚t细胞和记忆t细胞。
[0326]
如本领域技术人员将理解的，其他细胞也可以用作具有如本文所述的car的免疫效应细胞。特别地，免疫效应细胞还包括nk细胞、nkt细胞、中性粒细胞和巨噬细胞。免疫效应细胞还包括效应细胞的祖细胞，其中此类祖细胞可以在体内或体外被诱导分化成免疫效应细胞。因此，在特定实施方案中，免疫效应细胞包括免疫效应细胞的祖细胞，如包含在衍生自脐带血、骨髓或动员外周血的cd34细胞群中的造血干细胞(hsc)，其在受试者中施用后分化成成熟的免疫效应细胞，或者可以在体外诱导分化成成熟的免疫效应细胞。
[0327]
如本文所用，经基因工程改造以包含ag-muc1特异性car的免疫效应细胞可称为“ag特异性重定向免疫效应细胞”。
[0328]
在特定实施方案中提供了制备表达本发明的car的免疫效应细胞的方法。在一个实施方案中，该方法包括转染或转导分离自个体的免疫效应细胞，使得免疫效应细胞表达本发明的一种或多种car。在某些实施方案中，免疫效应细胞分离自个体并且在体外没有进一步操作的情况下进行遗传修饰。然后可以将这些细胞直接重新施用到个体中。在进一步的实施方案中，免疫效应细胞在被遗传修饰以表达car之前首先在体外被激活和刺激以增殖。就这一点而言，免疫效应细胞可以在被遗传修饰(即，转导或转染以表达本文预期的car)之前和/或之后培养。
[0329]
在特定实施方案中，在本文所述的免疫效应细胞的体外操作或遗传修饰之前，从受试者获得免疫效应细胞。在特定实施方案中，car-修饰的免疫效应细胞包含t细胞。
[0330]
在特定实施方案中，pbmc可以使用本文预期的方法直接遗传修饰以表达car。在某些实施方案中，在分离pbmc后，进一步分离t淋巴细胞，并且在某些实施方案中，细胞毒性和辅助t淋巴细胞可在遗传修饰和/或扩增之前或之后分选成幼稚、记忆和效应t细胞亚群。
[0331]
免疫效应细胞如t细胞可以在使用已知方法分离后进行遗传修饰，或者免疫效应细胞可以在被遗传修饰之前在体外激活和扩增(或在祖细胞的情况下分化)。在特定实施方案中，免疫效应细胞如t细胞用本发明的car进行遗传修饰(例如，用包含编码car的核酸的病毒载体转导)，然后在体外激活和扩增。在各种实施方案中，可以在遗传修饰之前或之后激活和扩增t细胞以表达car。
[0332]
在特定实施方案中，用于癌症治疗的修饰的免疫效应细胞群包含本文公开的car。例如，从被诊断患有癌症的患者(自体供体)获得的外周血单核细胞(pbmc)制备修饰的免疫效应细胞群。pbmc形成可以是cd4
+
、cd8
+
或cd4
+
和cd8
+
的异质的t淋巴细胞群。
[0333]
pbmc还可以包括其他细胞毒性淋巴细胞如nk细胞或nkt细胞。可以将携带本发明的car编码序列的载体引入人供体t细胞、nk细胞或nkt细胞群中。在特定实施方案中，可以使用流式细胞术对成功转导的携带表达载体的t细胞进行分选以分离cd3阳性t细胞，然后进一步增殖以增加这些表达car蛋白的t细胞的数量，此外还使用抗cd3抗体和/或抗cd28抗体和il-2或如本文别处所述的本领域已知的任何其他方法激活细胞。
[0334]
使用标准程序冷冻保存表达car蛋白t细胞的t细胞，用于储存和/或制备用于人受试者。
[0335]
在进一步的实施方案中，例如一种、两种、三种、四种、五种或更多种不同载体的混合物可以用于遗传修饰免疫效应细胞的供体群体，其中每个载体编码如本文预期的不同的嵌合抗原受体蛋白。所得的修饰的免疫效应细胞形成修饰细胞的混合群体，其中一部分修饰细胞表达一种以上不同的car蛋白。
[0336]
t细胞制备方法
[0337]
制备用于人疗法的t细胞的方法是本领域已知的。在优选的实施方案中，通过本文预期的方法制备的t细胞提供了改进的过继免疫治疗组合物。不希望受任何特定理论束缚，据信通过本文预期的特定实施方案中的方法制备的t细胞组合物具有优异的特性，包括增加的存活、在相对缺乏分化的情况下扩增、体内持久性和优异的抗耗竭特性。经修饰以表达抗ag-muc1 car的t细胞显示出较低的对ag-muc1靶标的结合动力学，该t细胞在ag-muc1靶标存在的情况下体内耗竭的可能性较低。抗ag-muc1 car-t细胞耗竭的低趋势保持其效应器功能，导致抑制性受体的低持续表达并保持功能性效应细胞或记忆t细胞的转录状态。由于耗竭阻碍对感染和肿瘤的最佳控制，其不是car-t疗法的期望特征。
[0338]
在一个实施方案中，通过用包含本文预期的抗ag-muc1 car的病毒载体转导t细胞来修饰t细胞。抗ag-muc1 car-t细胞在没有抗原的情况下表现出低水平的基础car激活和干扰素-γ(ifnγ)分泌，这是car-t疗法的期望属性。car对抗原非依赖性(基础)信号传导的倾向可以表明自身聚集导致抗原非依赖性car激活，进而可以导致早期car耗竭，反过来导致治疗效力丧失(ajina和maher，2018；long等人,2015a)。car-t细胞的基础激活是通过pd1、tim3、lag3标志物的水平和car-t在没有抗原的情况下分泌ifnγ的能力来确定的。与未转导的匹配供体t细胞相比，具有低结合动力学的人源化抗ag-muc1 car-t细胞在体外显示出低ifnγ分泌并保留了记忆表型。
[0339]
在一个实施方案中，t细胞通过用包含本文预期的抗ag-muc1 car的病毒载体转导t细胞来修饰，其需要更高的靶标阈值以被激活，从而使其成为“更安全”的car。已经表明，具有高亲和力的car可导致对健康组织的附带靶向，从而导致靶向/脱靶、离瘤毒性(johnson等人，2015；park等人，2017；watanabe等人，2018)。因此，我们在区分tn-muc1阳性和阴性细胞的能力方面比较慢解离速率和快解离速率car t。快解离速率和慢解离速率car t都响应于tn-muc1阳性细胞系分泌ifnγ，然而慢解离速率car t响应于缺乏muc1蛋白的肿瘤细胞产生ifnγ，而快解离速率car t不产生。这些数据表明，快解离速率的抗ag-muc1 car t细胞特异性地识别tn-muc1靶标，从而除了抗耗竭特性外还最大限度地降低患者的脱靶：离瘤毒性风险。
[0340]
药物组合物
[0341]
本文所述的免疫效应细胞可引入用于本文所述的人疾病的治疗的药物组合物中。在一个实施方案中，药物组合物包含任选地与一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂组合的免疫效应细胞。
[0342]
此类组合物包含药学上可接受的载剂，如已知的和可接受的药学实践所要求的，参见例如remington’s pharmaceutical sciences，第16版(1980年)mack publishing co.。
[0343]
药物组合物可以通过注射或连续输注(实例包括但不限于静脉内、腹膜内、皮内、皮下、肌内、眼内和门静脉内)施用。在一个实施方案中，该组合物适用于静脉内施用。
[0344]
遗传修饰的治疗细胞的“治疗有效量”可根据个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及干细胞和祖细胞在个体中引发预期应答的能力等因素而变化。治疗有效量也是其中病毒或转导的治疗细胞的任何毒性或有害作用被治疗上有益作用所抵消的量。术语“治疗有效量”包括有效“治疗”受试者(例如，患者)的量。当指示治疗量时，待施用的组合物的精确量可由医师考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度以及患者(受试者)的状况的个体差异来确定。通常可以说，包含本文所述的t细胞的药物组合物可以以102至10
10
个细胞/kg体重，优选105至106个细胞/kg体重，包括那些范围内的所有整数值的剂量施用。细胞的数量将取决于组合物的最终用途以及其中包含的细胞类型。对于本文提供的用途，细胞的体积通常为一升或更小，可以为500ml或更小，甚至250ml或100ml或更小。因此，期望细胞的密度通常大于106个细胞/ml，例如大于106、107、108或109个细胞/ml。
[0345]
临床相关数量的免疫细胞可以分配到累积等于或超过105、106、107、108、109、10
10
、10
11
或10
12
个细胞的多次输注中。在一些实施方案中，特别是因为所有输注的细胞将被重定向到特定的靶抗原，所以可以施用在106/千克(每名患者106至10
11
)的范围内的较少数量的细胞。可以以这些范围内的剂量多次施用表达car的细胞组合物。对于接受治疗的患者，这些细胞可以是同种异体的、同基因的、异种的或自体的。如果期望，治疗还可以包括施用如本文所述的有丝分裂原(例如，pha)或淋巴因子、细胞因子和/或趋化因子(例如，ifnγ、il-2、il-12、tnfα、il-18和tnfβ、gm-csf、il-4、il-13、flt3-l、rantes、mip1α等)以增强免疫应答的诱导。
[0346]
通常，包含如本文所述激活和扩增的细胞的组合物可用于治疗和预防在免疫功能低下的个体中出现的疾病。特别地，本文预期的包含car-修饰的t细胞的组合物用于癌症治疗。在特定实施方案中，car-修饰的t细胞可以单独施用，或作为药物组合物与载剂、稀释剂、赋形剂和/或与其他组分如il-2或其他细胞因子或细胞群组合施用。在特定实施方案中，药物组合物包含一定量的遗传修饰的t细胞，以及一种或多种药学或生理学可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
[0347]
包含表达car的免疫效应细胞群如t细胞的药物组合物可以包含缓冲剂如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。在特定实施方案中，组合物优选被配制用于胃肠外施用，例如血管内(静脉内或动脉内)、腹膜内或肌肉内施用。
[0348]
液体药物组合物，无论它们是溶液、混悬液还是其他类似形式，可以包括以下一种或多种：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液，优选生理盐水、林格氏液、等渗氯化钠、不挥发油如可以作为溶剂或悬浮介质的合成甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或葡萄糖。胃肠外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。可注射药物组合物优选是无菌的。
[0349]
在一个实施方案中，本文预期的t细胞组合物被配制在药学上可接受的细胞培养
基中。此类组合物适合施用于人受试者。在特定实施方案中，药学上可接受的细胞培养基是无血清培养基。
[0350]
在另一个优选的实施方案中，本文预期的包含t细胞的组合物被配制在包含冷冻保存介质的溶液中。例如，具有冷冻保存剂的冷冻保存介质可用于在解冻后维持高细胞存活力效果。在特定组合物中使用的低温保存介质的说明性实例包括但不限于cryostor cs10、cryostor cs5和cryostor cs2。
[0351]
在特定实施方案中，组合物包含单独或与一种或多种治疗剂联合的有效量的表达car的免疫效应细胞。因此，表达car的免疫效应细胞组合物可以单独施用或与其他已知的癌症治疗如放射疗法、化学疗法、移植、免疫疗法、激素疗法、光动力疗法等联合施用。组合物也可以与抗生素联合施用。此类治疗剂在本领域中可以被接受为如本文所述的特定疾病状态如特定癌症的标准治疗。预期的示例性治疗剂包括细胞因子、生长因子、类固醇、nsaid、dmard、抗炎剂、化疗剂、放疗剂、治疗性抗体或其他活性剂和辅助剂。
[0352]
在某些实施方案中，包含本文公开的表达car的免疫效应细胞的组合物可以与本领域已知的任何数量的化疗剂联合施用。
[0353]
多种其他治疗剂可与本文所述的组合物共同使用。在一个实施方案中，包含表达car的免疫效应细胞的组合物与抗炎剂一起施用。抗炎剂或抗炎药物是本领域已知的。
[0354]
在某些实施方案中，本文所述的组合物与细胞因子共同施用。如本文所用，“细胞因子”是指由一个细胞群释放的作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通用术语。此类细胞因子的实例是本领域已知的。
[0355]
药物组合物可以包括在含有表达car的免疫效应细胞以及其他药物，任选地和/或使用说明的试剂盒中。为方便起见，试剂盒可以包含预定量的试剂和使用说明。该试剂盒还可以包括用于药物组合物施用的装置。
[0356]
术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，是指表现出可以用本文别处预期的基因治疗载体、基于细胞的治疗剂和方法治疗的疾病、病症或病况的症状的任何动物。在优选的实施方案中，受试者包括表现出可以用本文别处预期的基因治疗载体、基于细胞的治疗剂和方法治疗的与癌症相关的疾病、病症或病况的症状的任何动物。合适的受试者(例如，患者)包括实验室动物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物和家养动物或宠物(如猫或狗)。非人灵长类动物，优选地人患者也包括在内。典型的受试者包括已被诊断患有或有患上表达ag-muc1蛋白的癌症的风险的人患者。
[0357]
如本文所用，术语“患者”是指已被诊断患有可以用本文别处公开的基因治疗载体、基于细胞的治疗剂和方法治疗的特定疾病、病症或病况的受试者。
[0358]
如本文所用，术语“治疗”、“处理”及其派生词是指治疗性疗法，并且包括对疾病或病理状况的症状或病理学的任何有益或期望的效果，并且可以包括待治疗的疾病或病况的一种或多种可测量标志物的甚至最小减少。治疗可以任选地涉及疾病或病况的减少，或延迟疾病或病况的进展例如延迟肿瘤生长。“治疗”不一定表示疾病或病况或其相关症状的完全根除或治愈。关于特定病况，治疗意味着：(1)改善病况或病况的生物学表现的一种或多种；(2)干扰(a)导致或引起病况的生物级联中的一个或多个点，或(b)病况的生物学表现的一种或多种；(3)减轻与病况相关的一种或多种症状、作用或副作用或与病症或其治疗相关的一种或多种症状、作用或副作用；(4)减缓病况的进展或病况的生物学表现的一种或多
种。
[0359]
如本文所用，“预防”是指药物如药剂的防治性施用，以显著降低病况或其生物学表现的可能性或严重性，或延迟此类病况或其生物学表现的发作。本领域技术人员将理解“预防”不是绝对的术语。例如，当受试者被认为具有发生癌症的高风险时，如当受试者具有强癌症家族史或当受试者已暴露于致癌物时，防治性治疗是合适的。
[0360]
癌症
[0361]
如本文所用，术语“癌症”、“赘生物”和“肿瘤”可以互换使用并且可以是单数或复数形式，是指已经历恶性转化或经历导致异常或不受调节的生长或过度增殖的细胞变化的细胞。此类变化或恶性转化通常使此类细胞对宿主生物体是病理性的，因此也意在包括已经或能够变为病理性并且需要或能够受益于干预的癌前细胞或前癌细胞。原发性癌细胞(即从恶性转化部位附近获得的细胞)可以通过成熟的技术(如组织学检查)容易地与非癌细胞区分开来。
[0362]
如本文所用，癌细胞的定义不仅包括原发性癌细胞，还包括衍生自癌细胞祖先的任何细胞。这包括转移的癌细胞，以及衍生自癌细胞的体外培养物和细胞系。当提及一种通常表现为实体瘤的癌症时，“临床可检测”的肿瘤是指基于肿瘤块可检测到的肿瘤；例如，通过cat扫描、mr成像、x射线、超声或触诊等程序，和/或由于可从患者获得的样品中的一种或多种癌症特异性抗原的表达而可检测到的程序。换言之，本文中的术语包括任何阶段的细胞、赘生物、癌症和肿瘤，包括临床医生所指的癌前病变、肿瘤、原位生长以及晚期转移性生长。
[0363]
如本文所用，术语“恶性的”是指其中一组肿瘤细胞表现出一种或多种不受控制的生长(即超出正常限度的分裂)、侵袭(即邻近组织的侵入和破坏)和转移(即通过淋巴或血液扩散到身体的其他部位)的癌症。
[0364]“癌细胞”是指癌性生长的单个细胞或组织。癌细胞包括实体癌和液体癌。“肿瘤”或“肿瘤细胞”通常是指由细胞的异常生长形成的肿块或病变，其可以是良性的、前恶性的或恶性的。大多数癌症形成肿瘤，但液体癌症例如白血病，不一定形成肿瘤。对于那些形成肿瘤的癌症，术语癌症(细胞)和肿瘤(细胞)可以互换使用。个体中肿瘤的数量是“肿瘤负荷”，可以测量为肿瘤的数量、体积或重量。
[0365]
在一个实施方案中，靶细胞表达抗原，例如基本上无法在其他正常(期望)细胞表面上发现的靶抗原。
[0366]
在一个实施方案中，靶细胞是骨细胞、骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成软骨细胞、肌细胞、骨骼肌细胞、成肌细胞、肌原细胞、平滑肌细胞、膀胱细胞、骨髓细胞、中枢神经系统(cns)细胞、周围神经系统(pns)细胞、神经胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、色素细胞、上皮细胞、皮肤细胞、内皮细胞、血管内皮细胞、乳腺细胞、结肠细胞、食道细胞、胃肠细胞、胃细胞、结肠细胞、头细胞、颈细胞、牙龈细胞、舌细胞、肾细胞、肝细胞、肺细胞、鼻咽细胞、卵巢细胞、滤泡细胞、宫颈细胞、阴道细胞、子宫细胞、胰腺细胞、胰腺实质细胞、胰腺管细胞、胰岛细胞、前列腺细胞、阴茎细胞、性腺细胞、睾丸细胞、造血细胞、淋巴样细胞或骨髓样细胞。
[0367]
在一个实施方案中，靶细胞表达ag-muc1蛋白。在一个实施方案中，靶细胞是造血细胞、食道细胞、肺细胞、卵巢细胞、宫颈细胞、胰腺细胞、胆囊或胆管细胞、胃细胞、结肠细
胞、乳腺细胞、杯状细胞、肠上皮细胞、干细胞、内皮细胞、上皮细胞或任何表达ag-muc1蛋白的细胞。
[0368]
在一个实施方案中，靶细胞是表达ag-muc1蛋白的实体癌细胞。
[0369]
可以被特定实施方案中预期的组合物和方法靶向的细胞的说明性实例包括但不限于以下实体癌的细胞：肾上腺癌、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑/cns癌、乳腺癌、支气管肿瘤、心脏肿瘤、宫颈癌、胆管上皮癌、软骨肉瘤、脊索瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、导管原位癌(ductal carcinoma in situ，dcis)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、鼻腔神经胶质瘤(esthesioneuroblastoma)、尤因氏肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、眼癌、输卵管癌、纤维组织肉瘤、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道基质瘤(gist)、生殖细胞肿瘤、胶质瘤、胶质母细胞瘤、头颈癌、成血管细胞瘤、肝细胞癌、下咽癌、眼内黑色素瘤、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、平滑肌肉瘤、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、肺类癌瘤、恶性间皮瘤、髓样癌、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、默克尔细胞癌、中线道癌、口腔癌、粘液肉瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性肿瘤、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、少突神经胶质瘤、口癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰岛细胞瘤、乳头状癌、副神经节瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性腹膜癌、前列腺癌、直肠癌、视网膜母细胞瘤、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、皮脂腺癌、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、小肠癌、胃癌、汗腺癌、滑膜瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、血管癌、外阴癌和肾母细胞瘤。
[0370]
在另一个实施方案中，细胞是表达ag-muc1蛋白的实体癌细胞。可以用组合物预防、治疗或改善的示例性表达ag-muc1的实体癌细胞包括但不限于：食管癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、胆管癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、肾癌和乳腺癌。
[0371]
在特定实施方案中，靶细胞是表达ag-muc1蛋白的液体癌细胞或血液癌细胞。
[0372]
可以用特定实施方案中预期的组合物预防、治疗或改善的液体癌或血液癌的说明性实例包括但不限于：白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。可以由特定实施方案中预期的抗stn car靶向的细胞的说明性实例包括但不限于以下白血病的细胞：急性淋巴细胞性白血病(all)、t细胞急性淋巴细胞性白血病、急性髓系白血病(aml)、成髓细胞、早幼粒细胞、髓单核细胞、单核细胞、红白血病、毛细胞白血病(hcl)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)和慢性髓系白血病(cml)、慢性髓单核细胞性白血病(cnnl)和真性红细胞增多症。
[0373]
增加细胞毒性的方法
[0374]
本文预期的遗传修饰的免疫效应细胞提供改进的过继免疫治疗的方法，用于预防、治疗和改善表达ag-muc1蛋白的癌症，或用于预防、治疗或改善与表达ag-muc1蛋白的癌症相关的至少一种症状。
[0375]
在各种实施方案中，本文预期的遗传修饰的免疫效应细胞提供了改进的过继免疫治疗方法，用于增加受试者中表达ag-muc1蛋白的癌细胞的细胞毒性或用于减少受试者中表达ag-muc1蛋白的癌细胞的数量。
[0376]
在特定实施方案中，通过用本文预期的car对原代免疫效应细胞进行遗传修饰，将原代免疫效应细胞的特异性重定向至表达ag-muc1蛋白的细胞例如癌细胞。在各种实施方
案中，病毒载体用于用编码car的特定多核苷酸对免疫效应细胞进行遗传修饰，所述car包含抗ag-muc1抗体或结合ag-muc1的抗原结合结构域；铰链结构域；跨膜(tm)结构域和一个或多个共刺激结构域；和一个或多个细胞内信号传导结构域。
[0377]
在一个实施方案中，提供了一种细胞疗法，其中对t细胞进行基因修饰以表达靶向在癌细胞上表达的ag-muc1表达蛋白的car，并且将car t细胞注入有此需要的受体。注入的细胞能够杀伤受体中引起疾病的细胞。与抗体疗法不同，car t细胞能够在体内复制，从而引起可以导致持续的癌症治疗的长期持续性。
[0378]
在一个实施方案中，car t细胞可以经历稳健的体内t细胞扩增并且可以持续延长的时间。在另一个实施方案中，car t细胞演变成可以被重新激活以抑制任何额外的肿瘤形成或生长的特定的记忆t细胞。
[0379]
在特定实施方案中，包含含有本文预期的car的免疫效应细胞的组合物用于与表达ag-muc1蛋白的癌细胞或癌症干细胞相关的病症的治疗。
[0380]
如本文所用，短语“改善至少一种症状”是指减少待治疗受试者的疾病或病症的一种或多种症状。在特定实施方案中，待治疗的疾病或病症是癌症，其中一种或多种改善的症状包括但不限于虚弱、疲劳、气短、容易瘀伤和出血、频繁感染、淋巴结肿大、腹胀或腹痛(由于腹部器官增大)、骨骼或关节疼痛、骨折、计划外体重减轻、食欲不振、盗汗、持续轻度发烧和排尿减少(由于肾功能受损)。
[0381]“增强”或“促进”或“增加”或“扩大”通常是指本文预期的组合物，例如编码car的遗传修饰的t细胞或载体与对照分子/组合物引起的反应相比产生、引发或引起更大的生理反应(即下游效应)的能力。可测量的生理反应可以包括t细胞扩增、激活、持久性的增加和/或癌细胞杀伤能力的增加，以及从本领域的理解和本文描述中显而易见的其他反应。“增加的”或“增强的”量通常是“统计上显著的”量，并且可以包括1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、50、100、200、500或更多倍于由对照组合物产生的反应的增加。
[0382]“减少”或“降低”或“减轻”或“减弱”或“消除”通常是指本文预期的组合物与对照分子/组合物引起的反应相比产生、引发或引起更小的生理反应(即下游效应)的能力。“减少的”或“降低的”的量通常是“统计上显著的”的量，并且可以包括1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、50、100、200、500或更多倍于由对照组合物产生的反应(参考反应)或特定细胞谱系中的反应的减少。
[0383]
在一个实施方案中，在有此需要的受试者中治疗癌症的方法包括施用有效量，例如治疗有效量的包含本文预期的遗传修饰的免疫效应细胞的组合物。施用的数量和频率将通过患者的病症、患者疾病的类型和严重程度等因素等确定，但适当的剂量可以通过临床试验确定。
[0384]
本领域普通技术人员将认识到，可能需要多次施用本文预期的组合物以影响期望的疗法。例如，组合物可以在1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年、5年、10年或更长的跨度内施用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次。
[0385]
在一个实施方案中，向有此需要的受试者施用有效量的组合物以增加受试者对癌症的细胞免疫应答。免疫应答可以包括由能够杀伤受感染细胞的细胞毒性t细胞、调节性t细胞和辅助性t细胞应答介导的细胞免疫应答。主要由能够激活b细胞从而导致抗体产生的辅助t细胞介导体液免疫应答也可以被诱导。可以使用多种技术来分析由组合物诱导的免
疫应答的类型，这些技术在本领域中详细描述；例如，current protocols in immunology，由john e.coligan,ada m.kruisbeek,david h.margulies,ethan m.shevach,warren strober编辑(2001)john wiley&sons,ny,n.y.)
[0386]
在t细胞介导的杀伤的情况下，car配体结合启动car信号传导至t细胞，导致诱导t细胞产生或释放能够通过各种机制诱导靶细胞凋亡的蛋白质的多种t细胞信号传导通路的激活。这些t细胞介导的机制包括(但不限于)细胞内细胞毒性颗粒从t细胞到靶细胞中的转移、可以直接(或通过募集其他杀伤效应细胞间接)诱导靶细胞杀伤的促炎细胞因子的t细胞分泌、以及在与靶细胞上的同源死亡受体(例如fas)结合后诱导靶细胞凋亡的t细胞表面上的死亡受体配体(例如fasl)的上调。
[0387]
尽管为了清楚理解的目的已经通过说明和示例的方式对前述实施方案进行了一些详细描述，但是根据本文预期的教导，本领域的普通技术人员将容易地明白某些改变和修改可以在不背离所附权利要求的精神或范围的情况下进行。以下实施例仅通过说明而非限制的方式提供。本领域技术人员将容易地认识到多种非关键参数可以改变或修改以产生基本相似的结果。
实施例
[0388]
本发明人通过人源化衍生自鼠源mab 5e5的vl和vh免疫球蛋白结构域生成scfv(car的靶结合部分)(等人，2006)。vl和vh的人源化以scfv格式进行。尽管与完全鼠scfv相比具有不同的动力学概况，人源化scfv在biacore测定中保留对tn/stn-muc1肽的特异性。采用表达含有人源化tn/stn-muc1特异性scfv的car的工程化人t细胞以生成显示人源化tn-muc1 car t的体外效力和特异性的关键数据。
[0389]
实施例1-结合结构域的生成
[0390]
已开发出高亲和力糖肽特异性抗体以靶向tnmuc1(等人，2006)(tarp等人，2007)。小鼠5e5 mab以1.7nm的亲和力结合乳腺癌细胞，并且可以通过补体介导的和抗体依赖性的细胞毒性裂解乳腺癌细胞(lavrsen等人，2013)。包含5e5 mab可变结构域的tnmuc1特异性car-t细胞可以消除异种移植模型中的胰腺和白血病，并且与原始抗体相似，对正常组织表现出癌症特异性和可忽略不计的反应性(posey等人，2016)。
[0391]
计算机方法用于产生鼠5e5 vh和vl的人源化变体并克隆一组人源化scfv构建体用于随后的蛋白质表达和靶结合表征。此外，该研究旨在通过考虑人源化过程中使用的框架模板和恢复的鼠氨基酸(回复突变)来预测每个scfv的免疫原性风险。
[0392]
方法
[0393]
鼠scfv表达构建体的设计和分子克隆
[0394]
鼠5e5 vh和vl的氨基酸序列(表2-kabat定义的cdr残基加下划线)以vl-vh和vh-vl方向组合以生成两个scfv分子的氨基酸序列。scfv序列包含位于vl和vh链之间的(g4s)3接头、n端campath信号肽(mgwsciilflvatatgvhs)和c端六his标签(hhhhhh，vl-vh scfv)或c端七his标签(hhhhhhh，vh-vl scfv)。
[0395]
表2-来自鼠mab 5e5的vl和vh ig结构域的氨基酸序列
[0396][0397]
使用软件leto 1.0.26(entelechon gmbh)生成密码子优化的dna序列。然后将它们修饰以包括含有限制性内切酶位点hindiii后跟kozak序列的5’衔接物，以及含有串联stop密码子和限制性内切核酸酶位点ecori的3’衔接物。dna序列作为双链片段(gblock)由integrated dna technologies(idt)inc.合成。
[0398]
其中多克隆位点已被修饰的ptt5主链和gblock用hindiii和ecori限制性内切核酸酶消化。t4 dna连接酶用于连接切割载体主链并切割gblock插入片段。将连接混合物转化到neb 5-α感受态大肠杆菌中(亚克隆效率)，并在补充有100μg/ml羧苄青霉素和1％w/v葡萄糖的lb琼脂板上选择阳性转化体。培养推定克隆的菌落，提取质粒dna，并对dna进行sanger测序以鉴定正确的克隆。
[0399]
衍生自鼠mab 5e5的人源化vh和vl链的氨基酸序列的计算机生成
[0400]
鉴定了涵盖鼠mab 5e5的vl和vh结构域内的3个互补决定区(cdr)的氨基酸序列(表)。根据这些，生成了vh和vl序列，其中kabat定义的cdr(kabat等人,1991)被掩蔽(由表示未指定氨基酸的单字母氨基酸符号x代替)(表-被掩蔽的残基加下划线)。将这四个序列用作基本局部比对搜索工具(basic local alignment search tool，blast)算法(altschul等人,1997)的输入，以从人v基因(重、κ、λ)种系数据库中鉴定相似的框架。此外，来自5e5vh和vl的框架4氨基酸序列用于鉴定相似的人j基因区段。
[0401]
表3-其中cdr已被掩蔽的来自鼠mab 5e5的vl和vh ig结构域的氨基酸序列
[0402][0403]
基于它们与5e5序列的同一性、v基因的个体和配对频率的内部分析以及先前使用特定模板进行传统人源化的经验，选择人v和j基因区段作为模板框架。
[0404]
将选定的人v基因框架与相应的鼠vh和vl序列进行比较，以鉴定可以在该位置进行回复突变至相应的小鼠氨基酸的潜在位点(kabat编号)。使用用于确定某些框架位置在cdr构象(和抗原结合亲和力)的可能维持中的重要性的内部整理的证据规则，来鉴定被认为最重要的回复突变(初级突变)和重要性较低的回复突变(次级突变)。通过使用软件chemical computing group(ccg)molecular operating environment(moe)2016.0802构建小鼠5e5fv结构域的3d同源模型来检查已鉴定的回复突变的空间聚类程度。通过将小鼠cdr直接移植到选定的人种系模板中生成最初的人源化vh和vl序列(链h0和l0)。使用回复突变位点的明显空间聚类以通过同时引入空间聚类突变来减少含有人源化链的回复突变的变体的潜在数量。
[0405]
总共生成了6个人源化vh氨基酸序列(h0
–
h5)和4个人源化vl氨基酸序列(l0
–
l3)。
[0406]
人源化scfv表达构建体的设计和分子克隆
[0407]
人源化vh和vl链的氨基酸序列以vl-vh方向系统组合以生成24个scfv分子的氨基酸序列。此外，还组装了由vh-vl方向的l3和h3链组成的单个scfv。scfv序列包含vl和vh链之间的(g4s)4接头、n端campath信号肽(mgwsciilflvatatgvhs)和c端六his标签(aaahhhhhh、vl-vh scfv)或c端七his标签(aaahhhhhhh，h3-l3 scfv)。使用软件leto1.0.26(entelechon gmbh)对scfv蛋白质序列进行反向翻译和密码子优化。
[0408]
此外，两个对照α-tnmuc1 scfv分子使用专利申请wo2015/159076中包含的信息设计。人源化抗体ab1和ab2(显示具有与5e5相当的与tnmuc1的结合)的vh和vl氨基酸序列经受与上述相同的过程，对衍生自ab1和ab2的两个scfv分子生成密码子优化的dna序列。
[0409]
所有密码子优化的dna序列均经修饰以包括5’和3’衔接物，并如上所述合成。
[0410]
表达构建体的分子克隆如上所述完成，除了在连接步骤期间，或者根据标准方法每个连接反应使用一个插入物，或者使用其中最多达6个插入物被包含在单个连接反应中的多重方法。保持单个插入物与载体的摩尔比为约3:1。
[0411]
免疫原性风险预测
[0412]
人源化scfv分子和vl-vh鼠scfv的氨基酸序列(其中campath信号肽和c端his标签被去除)用于免疫原性风险预测。从该过程中排除了衍生自wo2015/159076的两个人源化对照scfv。使用百分位阈值为3的tepredict(antonets,2010)用多个mhc ii类同种异型矩阵(singh,2001)预测跨scfv序列的t细胞表位。使用内部perl脚本，针对人抗体种系序列和tregitope序列的数据库(de groot,2008)对预测的9-mer肽表位序列进行扫描，并去除与这些序列匹配的任何肽。通过将剩余t细胞表位的数量相加来生成免疫原性风险评分。将得分针对临床环境中具有已知免疫原性应答的测试组抗体的相似得分进行排名。
[0413]
结果
[0414]
5e5 vh和vl的人源化
[0415]
基于由连接至ighj6(人种系免疫球蛋白重链ighj6 j基因)的ighv1-69(人种系免疫球蛋白重链ighv1-69 v基因)组成的框架，生成了六条人源化vh链(命名为h0、h1、h2、h3、h4和h5)(表)。基于由连接至igkj2(人种系免疫球蛋白κ轻链igkj2 j基因)的igkv4-1(人种系免疫球蛋白κ轻链igkv4-1(b3)v基因)组成的框架，生成了四条人源化vl链(命名为l0、l1、l2和l3)(表)。
[0416]
表4-人源化vh链h0至h5
[0417]
[0418][0419]
表5-人源化vl链l0至l3
[0420][0421][0422]
所有十条人源化链保留了在各自的5e5 vh和vl链中发现的完整鼠cdr。l0和h0不含回复突变，所有其他链含有已鉴定的回复突变簇的不同组合(表)。
[0423]
表6-所采用的回复突变
[0424][0425]
表达构建体
[0426]
对两种鼠scfv构建体(vl-vh和vh-vl)进行了克隆和序列验证。对25个内部人源化scfv表达构建体中的24个进行了克隆和序列验证。未克隆编码l0-h0 scfv的构建体。对专利申请衍生的两种人源化对照scfv构建体进行了克隆和序列验证。
[0427]
下面描述了hek293 6e细胞中内部人源化scfv和对照scfv的异源表达以及存在于细胞培养物上清液中的分泌的scfv与muc1和tnmuc1肽的结合的表征。从这项工作中，选择了六个内部人源化分子与对照分子中的一个一起进行进一步的工作。选定的内部人源化scfv的氨基酸序列详述于表7。
[0428]
表7-六个选定的内部人源化scfv的氨基酸序列
[0429][0430]
实施例2
–
筛选人源化抗tnmuc1 scfv分子(car结合剂部分)的表达和靶结合
[0431]
本研究的目的是通过20ml hek 293 6e悬浮培养物的瞬时转染来表达二十六个编码抗tnmuc1 scfv的构建体，并表征上清液中存在的分泌scfv的表达和靶结合。构建体中的二十四个编码内部人源化scfv构建体。此外，还检查了两个对照构建体(10d1和10d2)。使用sds-page和octet测定以评估存在于上清液中的scfv蛋白的相对表达水平。此外，评估了上清液中的scfv与生物素化的未糖基化的muc1和糖基化的tnmuc1肽的结合。
[0432]
方法
[0433]
hek 293 6e悬浮培养物
[0434]
hek 293 6e细胞的悬浮培养物在转染前进行培养。在补充有10％普朗尼克(pluronic)和1％遗传霉素的freestyle 293培养基中制备250ml储备培养物。每周将培养物分离3次，使活细胞密度至5.00x105细胞/ml。
[0435]
octet测定
[0436]
设计并从cambridge research biosciences(crb)订购在整个肽的丝氨酸和苏氨酸氨基酸处含有tn糖残基的生物素化的20氨基酸肽(如tarp，sorensen等人，2007所述)，称为“tnmuc1肽”(生物素-peg2-gv-t(acnh-a-gal)-s(acnh-a-gal)-apd-t(acnh-a-gal)-rpapgs(acnh-a-gal)-t(acnh-a-gal)-appah-酰胺(seq id no:76))。作为对照，非糖基化的muc1肽也以相同的序列排列，但在丝氨酸和苏氨酸氨基酸上没有tn残基，称为“muc1肽”(生物素-[peg2]-gvtsapdtrpapgstappah-酰胺(seq id no:77))。在75％dmso/25％pbs中将muc1和tnmuc1肽重悬浮至5mg/ml。然后将肽等分并储存在-80℃。除了6d10和6d11之外，在octet测定中测试的上清液详细列于表8。
[0437]
表8
–
小规模转染中表达的抗tnmuc1 scfv构建体的参考
[0438]
[0439][0440]
将scfv编码构建体瞬时转染到hek 293 6e悬浮培养物中
[0441]
瞬时转染分为四个单独批次进行。使用293fectin转染试剂将每个质粒构建体的20μg dna转染到单独的20ml hek 293 6e细胞培养物中，其中活细胞密度为1.85x106细胞/ml。在一个转染批次中制备含有未转染细胞的培养物作为阴性对照；将293fectin转染试剂添加到培养物中但不添加质粒。将培养物置于具有5％co2的124rpm的37℃振荡恒温箱中。
[0442]
在转染后72小时，使用vi-cell细胞计数器和存活力分析仪(beckman coulter)测量每种培养物的存活力(％)和活细胞密度(细胞/ml)。当培养物已达到≤70％的存活力时，通过在4℃下以2844xg离心二十分钟收获培养物，并通过0.2μm millipore过滤器过滤。过滤后的上清液在4℃储存直至需要进行后续分析。
[0443]
通过sds page分析上清液
[0444]
将20μl每种上清液与7μl 4x还原性sds page样品缓冲液混合，并将样品在98℃加热五分钟。将样品以15μl每孔加载到nupage novex 4-12％bis-tris 12孔凝胶上，并且凝胶在200v的1x mes sds电泳缓冲液中电泳约四十分钟。将seeblue plus2蛋白质标志物加载到每个凝胶上作为参考。用instantblue蛋白质染料对已分离的蛋白质条带进行染色并
对凝胶进行成像。
[0445]
通过octet测定分析上清液
[0446]
人源化抗tnmuc1 scfv蛋白表达水平的量化
[0447]
使用前，将octet ni-nta传感器浸泡在1x pbsf缓冲液中10分钟。使用了2x16孔头(well head)并在单个时间点捕获与ni-nta传感器结合的量。将纯上清液加载到ni-nta传感器上，并在一个报告点获取所有构建体的数据，以获得上清液中带6his标签的scfv蛋白相对于彼此的表达水平。
[0448]
将130μl的未转染培养基和每种人源化抗tn muc1 6xhis-scfv上清液添加到测定板中，其中空白孔中加入130μl缓冲液。
[0449]
本测定能够对人源化抗tn muc1 scfv构建体的上清液进行相对定量，因为在octet测定中与ni-nta传感器的结合能够使得不同构建体的表达仅相对于彼此测量。
[0450]
octet结合实验-人源化抗tn muc1 scfv与生物素化muc1肽
[0451]
生物素化的muc1肽(7-36-4)和tnmuc1肽(7-36-2)在octet运行缓冲液(1x pbsf)中稀释至10μg/ml，并加载到octet sa(链霉亲和素)传感器上。阳性对照蛋白在octet测定中以500nm的单一浓度进行测试。所有人源化抗tn muc1 scfv表达上清液均以纯态测定。
[0452]
数据使用数据采集软件fort
é
bio 8.0.2.5版和数据分析软件fort
é
bio 8.0.2.3版分析。
[0453]
结果与讨论
[0454]
将scfv编码构建体瞬时转染到hek 293 6e悬浮培养物中
[0455]
将编码人源化抗tnmuc1 scfv的构建体瞬时转染到hek 293 6e细胞中以生成含有分泌的scfv的培养物上清液。内部人源化抗tnmuc1 scfv通过sds-page显示出不同水平的表达。表达通过octet测定的进一步分析表明，所有分子都具有高于未转染和空白样品所见水平的显著表达。在转染点(0小时)和转染后72小时记录每种培养物的存活力(％)和活细胞密度(细胞/ml)(表9)。
[0456]
表9：瞬时转染结果
[0457]
小规模转染的汇总结果(0-36、0-40、0-43和0-45)。在转染点(0h)和72小时(72h)记录存活力(％)和活细胞密度(细胞/ml)。如果培养物的存活力≤70％，则收获培养物，并收集上清液。
[0458]
[0459]
[0460][0461]
上清液的sds-page分析
[0462]
通过sds-page对细胞培养物上清液中的scfv表达水平进行的评估以及随后对凝胶进行的目视检查显示分子之间的水平差异显著(数据未显示)。
[0463]
由未转染细胞生成的对照上清液未显示出scfv表达。所有含有轻链l0(不含有回复突变；6d2到6d6)的内部人源化scfv分子均稳健表达并在相应的上清液中包含主要的蛋白质产物。重链h0(不含有回复突变；构建体6d7、6d13和6d19)或轻链l3(构建体6d19至6d24)的存在似乎与减少的表达相关(就可以通过目视检查推断的而言)。类似地，具有vh-vl方向的单个分子(h3-l3，构建体6d25)也似乎具有降低的表观表达。两种对照scfv分子(在构建体10d1和10d2中编码)均显示出稳健的表达水平。
[0464]
包括人源化抗tnmuc1 scfv与生物素化muc1肽的结合的octet测定分析
[0465]
通过sds-page凝胶的目视检查评估的定性表达水平和通过octet测定确定的相对定量表达水平似乎良好地相关。
[0466]
所有阳性对照均与tnmuc1肽(36-2)特异性结合，其中未观察到与未糖基化的muc1肽(36-4)的结合(图2)。对于所测试的任何对照蛋白或上清液，均未观察到与muc1肽(36-4)的结合。对于人源化抗-tn-muc1 scfv构建体(6d4、6d6、6d12、6d16、6d18和6d24)以及对照构建体10d1的选择，观察到tn-muc1肽(36-2)结合的选择性(图3a-3c)。
[0467]
在通过octet结合测定显示与tnmuc1肽(36-2)结合的内部人源化scfv中，除了由构建体6d24的转染产生的上清液外，均通过sds-page显示出明显的考马斯染色条带。
[0468]
两种对照(10d1和10d2)通过sds-page分析和octet测定均显示出稳健的表达。引人注目的是，只有从10d1表达的scfv显示出与tnmuc1肽(36-2)的结合。在这些构建体中编码的两个vl-vh scfv衍生自两种人源化完整抗体(ab1和ab2)，该scfv显示出具有与鼠mab 5e5相当的与tnmuc1的结合。对10d2中编码的scfv(衍生自ab2的scfv)缺乏结合的解释是，将vl和vh结构域重新格式化为scfv已经消除了在完整抗体中观察到的结合特性。
[0469]
基于检测表达的人源化scfv与tnmuc1肽(36-2)特异性结合的octet测定结果，选择6个内部人源化scfv(在构建体6d4、6d6、6d12、6d16、6d18和6d24中编码)以及人源化对照scfv(在10d1中编码)用于大规模表达和纯化。
[0470]
实施例3-蛋白纯化表征
[0471]
选定的人源化scfv在哺乳动物细胞(hek 293 6e细胞)中表达，通过亲和层析从所得上清液中纯化。
[0472]
实验准备
[0473]
本研究中使用的scfv构建体在表10和11中进行了描述。本研究中使用的scfv构建体含有c端6x-his标签，以允许通过亲和层析从细胞上清液中纯化。这些构建体是从先前表达和测试的二十六个构建体中筛选出来的(参见以上实施例2)。hek 293 6e细胞的悬浮培养物在转染前进行培养。在补充有0.1％普朗尼克和500μg/ml遗传霉素的freestyle 293培养基中制备250ml储备培养物。每周将培养物分离3次，使活细胞密度至5.00x105细胞/ml。
[0474]
表10：筛选后的抗tnmuc1单链fv构建体(质粒和蛋白质)的命名和参考编号
[0475]
筛选后的抗tnmuc1单链fv构建体(质粒和蛋白质)的命名和参考编号
[0476][0477][0478]
表11：人源化抗tnmuc1单链fv构建体信息
[0479]
人源化抗tnmuc1单链fv构建体信息，包括scfv蛋白id编号、氨基酸序列和分子量(道尔顿)。
[0480]
[0481][0482]
实验方案
[0483]
将scfv编码构建体瞬时转染到hek 293 6e悬浮培养物中
[0484]
使用293 fectin转染试剂将每个质粒构建体的250μg dna转染到单独的250ml hek 293 6e细胞培养物中(活细胞密度为1.85x106细胞/ml)。将培养物置于具有5％co2的124rpm的37℃振荡恒温箱中。在48和72小时，分别向培养物补充6.2ml胰蛋白胨(200g/l)和6.2ml 3m果糖。
[0485]
从转染后48小时开始，每24小时使用vi-cell细胞计数器和存活力分析仪(beckman coulter)测量每种培养物的存活力(％)和活细胞密度(细胞/ml)。一旦培养物达到≤70％存活力，通过在4℃下以4415xg离心三十分钟收获培养物，并通过0.22μm millipore过滤器过滤。过滤后的上清液在4℃储存直至需要进行蛋白纯化。
[0486]
scfv构建体的单步亲和蛋白纯化和随后的蛋白表征
[0487]
单步亲和蛋白纯化
[0488]
通过express系统从所得的上清液中纯化scfv蛋白。将上清液以5ml/分钟加载到用缓冲液a(50mm hepes ph 7.5、400mm nacl、20mm咪唑)预平衡的5ml histrap excel柱上。加载后，将柱在两个柱体积的缓冲液a中以5ml/分钟的速度清洗至基线。在50％缓冲液b(50mm hepes ph 7.5、400mm nacl、1m咪唑)的逐步洗脱中洗脱蛋白质。将该柱保持在三个柱体积的50％缓冲液b中。在该步骤期间，在88a的纯化中收集0.5ml级分，然后在所有后续纯化中收集1ml级分。继续洗脱步骤直至返回基线，然后在三个柱体积的100％缓冲液b下进行洗脱步骤。
[0489]
在所得色谱图上280nm处观察到的单峰表明感兴趣的蛋白质的洗脱。合并对应于该峰的级分并转移至5000mw截止离心浓缩器。将样品从缓冲液b缓冲交换到60ml pbs中，以将纯化的蛋白质与存在于缓冲液b中的咪唑分离。将样品浓缩至≤1ml。通过nanodrop测定浓度并将纯化的蛋白质在pbs中稀释以获得1mg/ml的最终浓度。将最终的蛋白质产物等分并储存在-80℃以备将来使用。完成表征后，为纯化的蛋白质分配scfv蛋白id编号(表11)。
[0490]
sds-page
[0491]
在合并之前从级分中取出30μl样品以通过sds-page进行可视化。添加10μl 4x还原性sds-page样品缓冲液并将样品在95℃加热十分钟。每个样品加载20μl，并在1
×
mes sds电泳缓冲液中的nupage novex 4-12％bis-tris凝胶上以200v运行四十分钟。凝胶在摇动平台上用instant blue染色过夜，在水中脱色并通过syngene gbox(syngene)成像。
[0492]
将最终纯化的蛋白质在sds-page上运行，作为蛋白质大小和纯度的视觉确认。
[0493]
分析尺寸排阻色谱(asec)
[0494]
使用两种不同的仪器进行分析sec。使用具有sil-20ac自动进样器和连接到superdex s75 10/300柱的spd-20a uv/vis检测器(shimadzu)的shimadzu lc-20ab液相色谱系统评估纯化的蛋白质(97a、19a和77a的首次纯化)的均一性。在mqpbs运行缓冲液中以0.5ml/分钟运行50μl注射体积的浓度为1mg/ml的每个蛋白质样品。labsolutions软件计算检测到的峰的面积百分比。这些值用于在microsoft excel中计算其均一性。
[0495]
使用连接到tskgel qc-pak 300柱(agilent)的agilent 1260infinity ii评估纯化的蛋白质(88a、82a、89a、94a和77a的第二次纯化)的均一性。在mqpbs运行缓冲液中以0.5ml/分钟运行50μl注射体积的浓度为1mg/ml的每个蛋白质样品。lab advisor软件用于计算检测峰的面积百分比和均一性。
[0496]
质谱法
[0497]
使用开放存取质谱仪(qtof-ultima，waters)测量每种蛋白质的完整质量。将0.5μl注射体积的浓度为1mg/ml的每个蛋白质样品加载到仪器上。根据设备说明通过masslynx软件分析所得的色谱图。
[0498]
肽质量指纹图谱
[0499]
77a的完整质量未通过质谱法验证。进行肽质量指纹图谱(pmf)以确认蛋白质身份(表11)。
[0500]
在还原性sds page样品缓冲液中制备蛋白样品，并将10μg蛋白质加载到1x mes sds运行缓冲液中的nupage novex 4-12％bis-tris凝胶上，以200v持续四十分钟。凝胶在摇动平台上用instant blue染色过夜，在水中脱色并成像。将凝胶提交给pmf的开放存取设备。
[0501]
结果与讨论
[0502]
将scfv构建体瞬时转染到hek 293 6e悬浮培养物中
[0503]
记录每个转染培养物的存活力(％)和活细胞/ml的细胞密度(表12)。这些实验的结果是，七个人源化抗tnmuc1 scfv编码构建体被成功转染到在指数期生长的hek 293 6e悬浮细胞的250ml培养物中。从所得上清液中纯化scfv蛋白并表征。
[0504]
表12：瞬时转染结果
[0505]
七个单链fv构建体250ml hek 293 6e细胞培养物瞬时转染的汇总结果。在转染0小时(0h)、48小时(48h)、72小时(72h)、96小时(96h)、144小时(144h)和168小时(168h)的点测量以下变量：存活力(％)、活细胞密度(细胞/ml)。在≤70％时收获细胞。
[0506][0507]
scfv构建体的单步亲和蛋白纯化和随后的蛋白表征
[0508]
六个人源化抗tnmuc1 scfv分子加上一个对照通过hek 293 6e细胞中的哺乳动物表达成功表达。这些蛋白质通过亲和层析从所得上清液(250ml上清液)中成功纯化。通过sds page在还原条件下运行该批次中纯化样品的5μg等分试样，显示纯化的蛋白质的纯度和正确的分子量(图4)。这些属性由asec和质谱法分析支持(数据未显示)。纯化的scfv蛋白用于进一步的体外实验，其结果用于选择scfv编码区以重新格式化为car。
[0509]
实施例4
–
人源化抗tnmuc1 scfv蛋白的biacore分析
[0510]
在biacore测定中测试了纯化的人源化抗tnmuc1 scfv蛋白与tnmuc1和stnmuc1肽的结合。还确定了与scfv结合的tnmuc1肽内的表位。
[0511]
方法
[0512]
实验准备
[0513]
scfv蛋白的生成、肽的制备
[0514]
如上实施例3中详述生成人源化scfv蛋白(对于测试的人源化scfv分子的细节参见表13)。
[0515]
表13：在biacore测定中测试的人源化scfv蛋白
[0516][0517]
设计并从cambridge research biosciences(crb)订购在整个肽的丝氨酸和苏氨酸氨基酸处含有tn糖残基的生物素化20氨基酸肽(如tarp，sorensen等人，2007所述)。作为对照，非糖基化的muc1肽也以相同的序列排序，但在丝氨酸和苏氨酸氨基酸上没有tn或stn残基。为了确定人源化抗tnmuc1 scfv蛋白与tn肽结合的表位，订购了另外两种差异糖基化肽，其中一种在文献中报道由scfv蛋白结合的肽的ser/thr氨基酸上含有tn糖残基，一种在据报道scfv蛋白不结合的丝氨酸和苏氨酸氨基酸上含有tn糖残基(如tarp，sorensen等人，2007所述)。
[0518]
这些肽的序列和id号在表14中详述，并在图5中示意性地表示。
[0519]
表14：muc1、tnmuc1和stnmuc1肽信息
[0520][0521]
捕获水平确定-制备capture芯片的表面
[0522]
在这些实验中使用的测定格式中，生物素化的肽被捕获到cap芯片(配体)上以生成活性表面，并且scfv蛋白通过芯片表面(分析物)。用于动力学测量的活性表面旨在确保较低的最大分析物结合容量(rmax)。这有助于通过减少分析物传输限制来测量快速缔合和解离速率。对于最高性能的biacore系统中的蛋白质-蛋白质相互作用，rmax的合适值在20-100ru(响应单位)范围内。
[0523]
ru中表面的理论分析物结合能力由以下等式给出：
[0524]
靶标捕获水平＝rmax x mwt配体/化学计量x mwt分析物
[0525]
在这些实验的情况下：
[0526]
·
配体mw(肽)＝2500da
[0527]
·
分析物mw(抗tn muc1 scfv)＝27000da*
[0528]
·
化学计量：1
[0529]
·
rmax＝100(以防止重新结合事件)
[0530]
靶标捕获水平＝rmax x mwt配体/化学计量x mwt分析物
[0531]
＝100x 2500/1x 27000
[0532]
＝11ru
[0533]
*此分子量作为scfv分子的平均分子量用于所有测试的scfv蛋白。
[0534]
通过上述计算，理论上每个循环需要捕获11ru的每种肽。
[0535]
实验方案
[0536]
tnmuc1和stnmuc1肽的捕获水平测定
[0537]
根据制造商的说明，将cap芯片(来自biotin capture试剂盒)对接到biacore t200仪器中以过夜水合。当芯片对接时(第一次或存储后)，传感器芯片的表面需要用3x1分钟的再生溶液(来自biotin capture试剂盒)注射进行调理。再生溶液通过将3份再生原液1(8m盐酸胍)与1份再生原液2(1m naoh)混合来制备。传感器芯片的参比流动池和活性流动池均使用以10μl/min的流速3x60秒的再生溶液注射进行调节。
[0538]
所有生物素化肽均在biacore运行缓冲液(1x hbs-ep
+
＝10mm hepes ph7.6,150mm nacl,3mm edta,0.05％聚山梨醇酯20)中稀释，用于初始捕获到capture芯片以确定所需的结合水平，如上述等式中详述。捕获水平测定实验仅在活性流动池上进行。由于该测定格式中的参比流动池含有biotin capture试剂，无法检查与参比流动池的任何非特异性结合，因为生物素化肽会结合活性流动池和参比流动池两者。
[0539]
biotin capture试剂(来自biotin capture试剂盒)以2μl/min的流速被捕获到活性流动池上，其中接触时间为300秒，然后是60秒的稳定期。
[0540]
将配体(生物素化肽)以10μl/min的流速以及120秒的结合时间通过活性流动池，然后是60秒的解离阶段，其中biacore运行缓冲液以10μl/min的流速注入。
[0541]
使用如前所述制备的再生溶液再生biotin capture芯片。
[0542]
从捕获实验中获得的捕获每种肽的y值用于计算获得接近11ru的捕获水平所需的捕获长度。首先，将tnmuc1(36-2)和muc1(36-4)肽稀释并捕获到cap芯片上的biotin capture试剂上。使用在该实验中获得的y值以确定在结合分析测定中应捕获肽多长时间，以提供接近所需理论值的捕获水平，如上文详述。由于在实践中捕获的量可能低于理论值(由于并非所有蛋白质均具有活性)，因此在这些实验中以更高的捕获水平为目标，以确保获得接近11ru的捕获水平。
[0543]
结合测定
[0544]
将biotin capture试剂以2μl/min的速度捕获到活性流动池和参比流动池上300秒。将生物素化的肽在biacore运行缓冲液(如上所述)中稀释，并仅以10μl/min的流速捕获到活性流动池上，以获得上述等式中计算的捕获水平。
[0545]
人源化抗tnmuc1 scfv蛋白在500、125、31.25、7.8、1.9、0nm下通过参比流动池和活性流动池，用于以300秒的缔合与tnmuc1和muc1肽结合，然后用biacore运行缓冲液以30μl/min的流速解离900秒。
[0546]
为了与stnmuc1肽结合，所有人源化抗tnmuc1 scfv蛋白在1000、250、62.5、15.6、3.9、0.98、0nm下通过参比活性池和活性流动池，用于以520秒的缔合与stnmuc1和muc1肽结合，然后用1x hbs-ep
+
以30μl/min的流速解离900秒。由于与tnmuc1肽相比，人源化抗tnmuc1 scfv蛋白对stnmuc1肽的预期亲和力更低，因此这些实验使用了更高浓度的scfv。为了获得更好的传感图曲率，这些实验的缔合时间也从300秒增加到520秒。900秒的解离时间足够进行这些实验。
[0547]
在这两种情况下，biotin capture芯片均如上所述进行了再生。
[0548]
为每个人源化scfv蛋白对tnmuc1和stnmuc1肽的结合生成了n＝2数据。在所有实验中，muc1肽均用作阴性对照。
[0549]
使用biacore t200评估软件v3.0以分析数据。获得的数据已拟合到其中rmax参数设置为局部的1:1结合模型。由于这是捕获实验，因此局部rmax参数将真正具有反映，因为蛋白质每次重新捕获并且理论上每次重新捕获时表面略有不同，每次可能产生略有不同的捕获。计算所有人源化抗tnmuc1 scfv蛋白的动力学参数(kd、kd和ka)。
[0550]
结果与讨论
[0551]
人源化抗tnmuc1 scfv蛋白与tnmuc1(36-2/65-1)和muc1(36-4)肽的结合
[0552]
测试了所有七个纯化的人源化抗tnmuc1 scfv蛋白与tnmuc1(36-2)和muc1(36-4)肽的结合。人源化抗tnmuc1 scfv蛋白与完全糖基化的tnmuc1肽和stnmuc1肽特异性结合，而未见与muc1肽的结合(图7、图9和表15)。所有实验都获得了可重复的n＝2数据，并且获得的值已被平均。表15显示了所有人源化抗tnmuc1 scfv蛋白与tnmuc1肽(36-2)结合获得的ka、kd和kd值。除了scfv蛋白16-p4和13-p16之外，所有scfv都获得了相当的ka、kd和kd值，该值来自如图7中看到的传感图形状并且数值详述于表15，与其他scfv蛋白相比，完全糖基化的tnmuc1肽(36-2)具有更快的kd(解离速率)和反过来更低的kd。
[0553]
表15：人源化抗tnmuc1 scfv蛋白与tnmuc1(36-2)的结合
[0554][0555][0556]
tnmuc1肽内人源化抗tnmuc1 scfv蛋白的表位的确定
[0557]
测试了四个scfv蛋白(16-p4、11-p12、13-p16、13-p18)以及从creative biolabs获得的鼠5e5 scfv蛋白(23-p1)与muc1(36-4)和完全糖基化的tnmuc1肽(65-1)以及差异糖基化的tnmuc1肽(96-1和96-2)的结合，以确定人源化scfv蛋白在tnmuc1肽上的结合表位。这些实验表明人源化抗tnmuc1 scfv蛋白与完全糖基化的tnmuc1肽(65-1)和差异糖基化的
tnmuc1肽1(96-1)具有等同结合，而未观察到与muc1肽(36-4)或与tnmuc1肽2(96-2)的结合。在这些实验中获得的数据证实了所测试肽中人源化抗tnmuc1 scfv蛋白的表位。图8所示的传感图显示了人源化抗-tnmuc1 scfv蛋白与两种肽(65-1和96-1)的相当的缔合和解离，其中动力学参数的值显示在图6中。鼠5e5 scfv蛋白也显示出与完全糖基化肽(65-1)和差异糖基化肽(96-1)相当的结合，如图10可见。测试了两个批次的完全糖基化tnmuc1肽(65-1和36-2)，其中在批次之间观察到人源化抗tnmuc1 scfv的相当的结合。该数据汇总在图6中。
[0558]
人源化抗tnmuc1 scfv蛋白与stnmuc1和muc1肽的结合
[0559]
如上所述，测试了四种scfv蛋白以及鼠5e5 scfv蛋白与muc1和stnmuc1(35-1)肽的结合。显示人源化scfv蛋白与stn肽(35-1)特异性结合，而与muc1肽(36-4)没有结合。然而，发现它们与在creative biolabs生成的鼠5e5 scfv蛋白相比对stnmuc1肽具有约10倍更低的亲和力，如图6和9可见。如在tnmuc1结合实验中所见，与scfv蛋白11p12和13p18相比，scfv蛋白16p4和13p16显示对stn肽(35-1)具有更快的kd(解离速率)以及反过来更低的kd，如图6和9可见。
[0560]
总之，观察到人源化抗tnmuc1 scfv蛋白与tnmuc1(36-2、65-1、96-1)和stnmuc1(35-1)肽的特异性结合，而未观察到与muc1(36-4)肽的结合。该测定突出显示了针对人源化scfv蛋白获得的两种不同的结合谱，其中16p4和13p16显示具有更快的kd(解离速率)，而11p12和13p18具有相对更慢的kd(解离速率)。在这些实验中显示所有测试的人源化scfv蛋白和鼠5e5 scfv蛋白结合tnmuc1肽内的相同表位。
[0561]
本实验只测试了car分子的scfv片段，最终的car分子无法在该测定系统中测试。在实施例12中描述的肽刺激测定中进行了与这些肽结合的等效car的进一步表征。13p16 scfv与所有测试肽的结合汇总在图10中。
[0562]
实施例5-细胞结合方法
[0563]
通过流式细胞术测定纯化的scfv蛋白与tnmuc1阳性和阴性肿瘤细胞系的结合。本研究的目的是根据通过流式细胞术确定的tnmuc1阳性和阴性肿瘤细胞系中滴定的scfv蛋白的相对结合效率来区分car构建体的人源化scfv区域。
[0564]
实验准备
[0565]
黏附细胞培养
[0566]
黏附的mda-mb-468和pc3细胞系通过每周两次以1:3的分裂比传代维持在培养物中。将细胞单层用dpbs洗涤，然后用tryple express(te)孵育几分钟。一旦分离，将细胞重悬在适当的细胞培养基中(最终体积等于所用te的5倍体积)并接种到新鲜的细胞培养瓶中。将细胞保存在37℃和5％co2的加湿培养箱中直至需要。
[0567]
悬浮细胞培养
[0568]
通过将10％的汇合细胞培养物转移到新鲜的细胞培养瓶中，然后加入适当体积的细胞生长培养基(最终分裂比为1:10)，每周传代两次，从而将jurkat细胞维持在培养物中。将细胞保存在37℃和5％co2的加湿培养箱中直至需要。
[0569]
用于流式细胞术测定的细胞制备
[0570]
分离细胞并将细胞重悬在适当的细胞培养基中或转移到falcon管中。然后用dpbs 1:5稀释每种细胞悬液的样品(以提供0.5ml的最终体积)，并使用vi-cell xr细胞存活率分
析仪(使用默认细胞类型设置)测定每种细胞悬液的每ml活细胞数(基于台盼蓝排除)。然后将细胞悬液在适当的细胞培养基中稀释并以6.25x104个活细胞/cm2的密度接种到新鲜的细胞培养瓶中。细胞在37℃和5％co2的加湿培养箱中孵育48小时(或直至需要)。在测定当天，将细胞从烧瓶中分离，重悬在适当的细胞培养基中(如果合适)，并如前所述计算活细胞数/ml。然后将细胞悬液以500xg离心5分钟，然后以4x106个活细胞/ml的密度将细胞沉淀重悬在facs缓冲液中。
[0571]
实验方案
[0572]
细胞结合测定
[0573]
在dpbs中将scfv蛋白稀释至62.5nm并分配到96孔v底板的a行中，然后在facs缓冲液中进行1:4连续稀释到板中以提供每孔25μl(最终体积)(facs缓冲液仅在h行)。抗-hist-pe检测抗体在dpbs中1:5稀释，25μl/孔分配到含有连续稀释的scfv蛋白的孔中，然后在4℃下避光孵育板1小时，以使用抗-hist-pe检测抗体预复合scfv蛋白。如前所述制备细胞悬液，然后将其分配到板中(50μl/孔)，然后在4℃避光下再孵育板1小时。通过在200μl/孔(最大体积)的facs缓冲液中重悬细胞并以500xg离心细胞5分钟来洗涤细胞，然后去除上清液并重复洗涤步骤两次以上以洗涤细胞。将细胞沉淀重悬于200μl/孔的含有1μg/ml(最终)dapi和2mm(最终)edta的facs缓冲液中，然后使用cytoflex s流式细胞仪采集数据。
[0574]
靶标表达测定
[0575]
将细胞悬液(如前所述制备)分配到96孔板v底板(25μl/孔)中，并用facs缓冲液将体积增加到200μl/孔，然后以500xg离心细胞5分钟。将细胞重悬在100μl/孔的在facs缓冲液中稀释至5μg/ml的一抗中(或仅酌情使用等浓度的同种型抗体/facs缓冲液)。将细胞在4℃下孵育45分钟。然后如前所述用facs缓冲液洗涤细胞3次，然后将细胞沉淀重悬于100μl/ml在facs缓冲液中以1:1000稀释的山羊抗小鼠pe缀合的二抗中并在4℃下再孵育细胞45分钟。然后洗涤细胞，重悬于补充有dapi和edta的facs缓冲液中，并如前所述获取数据。
[0576]
测试的人源化scfv蛋白是：9p1(88a)、16p4(82a)、11p6(89a)、11p12(94a)、13p16(97a)、13p18(19a)和13p24(7a)(参见上表13)。
[0577]
数据分析
[0578]
细胞结合测定数据
[0579]
原始数据使用flowjo分析。按细胞系和门分组的孔样品设置为使用每个细胞系的仅细胞孔样品来区分活的单个阳性细胞，然后再将门应用于相同组中的孔样品。将中值荧光强度(mfi)值导出到prism并转换为对数刻度(即x＝log(x))，然后使用可变斜率4参数方程：y＝底部+(顶部-底部)/(1+10^((-pec50-x)*希尔斜率))拟合数据。在曲线拟合之前去除在jurkat细胞中观察到最高浓度的人源化scfv蛋白的钩状效应的证据处的mfi值。通过prism计算标准误差值。为本报告生成的数据对先导分子的选择没有帮助，因此没有对这些数据进行统计分析方法。
[0580]
靶标表达测定数据
[0581]
如前所述，原始数据使用flowjo分析。从每个细胞系的一抗孔中减去同种型对照孔中的pe阳性百分比值，并使用prism作图。
[0582]
结果与讨论
[0583]
数据表明，所有的人源化scfv蛋白都以scfv浓度和tnmuc1表达依赖性方式选择性
地与表达tnmuc1的肿瘤细胞(tnmuc1阳性mda-mb-468肿瘤细胞)结合。参见图11中的代表性数据。除11p6(89a)和11p12(94a)外，基于n＝2实验计算所有人源化scfv蛋白的平均ec50和pec50值，其中平均ec50浓度范围从13p18(19a)的1.68nm至28p24(77a)的84.38nm；11p6(89a)和11p12(94a)的ec50浓度分别为4.968nm和34.2nm(基于n＝1实验数据)。参见表16。
[0584]
与9p1(88a)、16p4(82a)、11p6(89a)和13p18(19a)相比，13p16(97a)人源化scfv蛋白显示出降低的结合效力，其中ec50值为约11nm，而最有效的人源化scfv蛋白的ec50值为5nm或更低。
[0585]
表16:mda-mb-468细胞中scfv蛋白结合的pec50和ec50值
[0586][0587]
通过prism为tnmuc1阴性对照pc3细胞中9p1(88a)、11p6(89a)、11p12(94a)、13p18(19a)人源化scfv蛋白的结合生成ec50值(数据未显示)。图12中的代表性数据还显示了在最高scfv蛋白浓度下的钩状效应的一些证据；然而，图12中的数据伴随的负希尔斜率值(希尔斜率值未显示)表明在pc3细胞中没有人源化scfv蛋白结合的证据。
[0588]
图13中的代表性拟合mfi数据显示与mda-mb-468细胞(图11)相比，高阳性tnmuc1阳性对照jurkat细胞中所有人源化scfv蛋白的结合增加，对应于jurkat、mda-mb-468和pc3细胞的代表性tnmuc1膜表达数据(图15)。
[0589]
图14中n＝2实验的拟合曲线具体证实了13p16(97a)与tnmuc阳性mda-mb-468和高tnmuc阳性jurkat细胞的选择性结合；同样地，与jurkat、mda-mb-468和pc3细胞的代表性tnmuc1膜表达数据相关(图15)。在jurkat细胞的重复实验中，在16p4(82a)和13p18(19a)的最高浓度下观察到钩状效应的证据，在仅2次重复实验中的1次中也观察到9p1(88a)和11p6(89a)钩状效应的证据(在曲线拟合之前去除mfi值)。
[0590]
实施例6—临床前安全性
[0591]
这些研究的目的是使用质膜蛋白阵列评估tnmuc1 car-t细胞的脱靶结合。
[0592]
方法
[0593]
实验方案
[0594]
生成car-t细胞以支持试点研究
[0595]
根据制造商的说明，使用histopaque(sigma，目录号10771)和accuspin管(sigma，目录号a7054)从人血液中分离外周血单核细胞(pbmc)。将细胞重悬于texmacs培养基中。将il-2(100iu/ml)和transact t细胞活化珠(1:100稀释)添加到pbmc中，细胞在37℃和5％co2的加湿培养箱中孵育两天。pbmc用bcma载体bcma-030转导，其中moi为2.75，并在37℃和
5％co2下孵育两天。细胞在texmacs培养基中维持，并且在整个培养期间il-2为100iu/ml。转导后13天收获细胞并以1x108个细胞/ml冷冻。生成未转导的细胞作为阴性对照。t细胞批次由三个供体生成。
[0596]
通过使用流式细胞术(macsquant analyzer 10)和apc通道检测具有alexa fluor 647缀合的bcma-fc的car表达来确定转导效率。数据使用flowjo v10.1分析。
[0597]
生成car-t细胞以支持预筛选、初步筛选和确认筛选
[0598]
根据制造商的说明，使用histopaque(sigma，目录号10771)和accuspin管(sigma，目录号a7054)从人血液中分离pbmc。将细胞重悬于texmacs培养基中。将il-2(100iu/ml)和transact t细胞活化珠(1:100稀释)添加到pbmc中，细胞在37℃和5％co2的加湿培养箱中孵育两天。pbmc用bcma载体bcma-030(其中moi为2.4)或tnmuc1载体mb-037(其中moi为5)转导，并在37℃和5％co2下孵育两天。细胞在texmacs培养基中维持，并且在整个培养期间il-2为100iu/ml。转导后12天收获细胞，并以1x108个细胞/ml冷冻在crystor cs5冷冻培养基中。生成未转导的t细胞作为阴性对照。t细胞由一个供体生成。
[0599]
bcma car-t细胞的转导效率通过使用流式细胞仪(macsquant analyzer 10)测量与bcma-af647的结合来确定。tnmuc1 car-t细胞的转导效率通过使用pe缀合的抗lngfr ab和流式细胞术(macsquant analyzer 10)测量lngfr表达来确定。数据使用flowjo v10.1分析。
[0600]
质膜蛋白阵列
[0601]
试点研究
[0602]
将供体t细胞添加到固定的未转染hek293细胞和过表达bcma、已知t细胞相互作用物和对照蛋白的hek293细胞的载玻片中。bcma特异性car-t细胞相对于背景的结合水平允许选择合适的供体进行预筛选、初步筛选和确认筛选。
[0603]
从纯肽开始，将阳性对照tnmuc1肽以连续稀释的方式点样到载玻片上。肽用小鼠抗人muc1 mab克隆5e5检测，然后用alexa fluor 647缀合抗小鼠igg(h+l)抗体检测。
[0604][0605]
预筛选研究
[0606]
将未转导的t细胞和car转导的t细胞添加到固定的未转染hek293细胞和过表达bcma、已知t细胞相互作用物和对照蛋白的hek293细胞的载玻片中。
[0607]
初步筛选
[0608]
对于初步筛选，使用反向转染在人hek293细胞中分别表达4070个编码全长人质膜蛋白的蛋白质。将细胞在13个微阵列载玻片上一式两份排列并固定。在每张载玻片上一式四份地点样表达载体pires-hegfr-ires-zsgreen1，以确保达到或超过转染效率的最小阈值。先前已将1.5的最小阈值确定为背景上的平均pires-hegfr-ires-zsgreen1信号。
[0609]
未转导的t细胞和car转导的t细胞用cell tracer red染料标记，并以预先优化的
t细胞与hek293细胞的比例用于质膜蛋白阵列。
[0610]
确认筛选
[0611]
一式两份地点样编码初级筛选中识别的命中的载体，并用于反向转染人hek293细胞。固定细胞并随后用阳性和阴性muc1肽点样。设置了重复的载玻片。将来自供体90928的未转导的t细胞和转导的t细胞(每张载玻片3.2x107个细胞)或抗人muc1 ab(10μg/ml)应用于质膜蛋白阵列。用alexafluor 647缀合的抗小鼠igg(h+l)抗体检测抗人muc1结合。
[0612]
数据分析
[0613]
流式细胞术：数据使用flowjo v10.1分析。
[0614]
质膜蛋白阵列：通过荧光成像评估结合，并使用imagequant软件(ge)对转导效率进行定量。使用未转染的hek293细胞区域确定背景结合水平。
[0615]
蛋白质“命中”被定义为相较于背景水平显示出升高信号的重复点。这是通过使用imagequant软件上网格化的图像进行目视检查来实现的。根据重复点的强度，命中被分类为“强、中、弱或非常弱”。
[0616]
结果与讨论
[0617]
生成car-t细胞以支持试点研究
[0618]
bcma-af647用于确定bcma car-t细胞的转导效率。在转导和扩增过程的第7天，供体12021、30865和90928的转导效率分别为85.5％、80.3％和69.6％(表17)。在转导和扩增过程的第14天，供体12021、30865和90928的转导效率分别为62.2％、50.6％和55.8％。
[0619]
表17：生成car-t细胞以支持预筛选
[0620][0621]
生成car-t细胞以支持初步筛选和确认筛选
[0622]
转导后12天测定转导效率。bcma car-t细胞的转导效率为63.1％(表18)。使用应用于转导的t细胞的相同门控策略，0.8％的未转导的t细胞落入正门。使用抗lngfr ab，tnmuc1、mb-037、car-t细胞的转导效率为29.2％。使用应用于转导的t细胞的相同门控策略，1.4％的未转导的t细胞落入正门。
[0623]
表18：生成car-t细胞以支持初步筛选和确认筛选
[0624][0625]
质膜蛋白阵列：试点研究
[0626]
hek转导的细胞的点样模式如图16a所示。观察到未转导的t细胞与已知t细胞相互作用物(pvr、cd244、tnfsf4、icoslg、cd86)的结合(图16b-d)。观察到bcma转导的t细胞与bcma转染的hek293细胞的结合(图17)。三个供体之间的结合强度相当。
[0627]
质膜蛋白阵列：预筛选
[0628]
选择供体90928进行初步筛选。
[0629]
hek转导的细胞的点样模式显示在图18a-18d中。观察到未转导的t细胞与已知t细胞相互作用物(pvr、cd244、tnfsf4、icoslg、cd86)的结合。观察到bcma转导的t细胞与bcma转染的hek293细胞的结合。tnmuc1转导的t细胞与tnmuc1或muc1肽没有结合。
[0630]
质膜蛋白阵列：初步筛选
[0631]
通过在imagequant上分析荧光，总共确定了28个命中。染色的强度从非常弱到强。
[0632]
质膜蛋白阵列：确认筛选
[0633]
28次命中的点样模式显示在图19a-19d中。观察到未转导的t细胞与已知t细胞相互作用物的结合。针对具有强强度的bcmacar-t细胞鉴定了一种特异性相互作用物。针对tnmuc1 car-t细胞鉴定了两种car特异性相互作用物。这些是dcc神经轴突导向因子1受体(dcc)(中等强度)和选择素p配体(selplg)(非常弱/弱强度)。
[0634]
总之，在筛选car-t细胞与过表达4070个人蛋白质的完整文库的人hek293的结合后，未转导的t细胞显示出与许多已知的t细胞相互作用物的结合。用作阳性对照的bcma car-t细胞显示出以强强度与bcma的单一特异性相互作用。tnmuc1 car-t细胞显示以中等强度与dcc神经轴突导向因子1受体的结合和以非常弱/弱强度与选择素p配体结合。在tnmuc1 car-t细胞与tnmuc1或muc1肽之间未观察到结合。由于观察到中等强度的结合，进一步评估了与dcc神经轴突导向因子1受体的结合(参见实施例16)。与选择素p配体的结合非常弱/弱，其被认为是低置信度结合剂，因此不会进一步评估该蛋白质。
[0635]
实施例7
–
car表达对t细胞表型的影响
[0636]
本研究的目的是通过与未转导的t(ut)和t细胞的鼠形式进行比较，使用12色表型面板来表征七个人源化tnmuc1 car-t细胞在转导后14天处于基础状态(未被攻击)的表型状态。测试的人源化tnmuc1 car t细胞包括hucar020-26并且鼠car t细胞包括mb004(小鼠形式阳性tnmuc1 car t)和mb007(缺乏信号传导结构域4-1bb和cd3z的小鼠形式阴性tnmuc1 car t)。设计的12色表型面板包括谱系(cd3和cd8)、激活/耗竭检查点(lag3、tim3和pd1)、记忆子集(cd45ra和ccr7)和car转导(zsgreen)生物标志物。我们采用了具有计算数据分析算法的机器学习平台cytobank来分析生成的高维流数据。使用flowlogic进行并行数据分析。
[0637]
方法
[0638]
实验准备
[0639]
从供体编号为91860、91462和92091的前体实验中制备纯化的t细胞(所有转导的car t细胞在构建体中都有zsgreen基因表达)。简而言之，t细胞(转导后14天)在含有texmacs培养基加100u il-2的6孔细胞培养板中培养。过夜孵育后，收获未受攻击的t细胞，并在染色前使用ut t细胞将每个样品归一化至32％的相同转导效率(te)以用于比较目的。测试的t细胞包括未转导的t(ut)、mb004(鼠形式阳性tnmuc1 car t)、mb007(缺乏信号传导结构域4-1bb和cd3z的小鼠形式阴性tnmuc1 car t)和mb020-26(人源化形式阳性tnmuc1 car t)。
[0640]
实验方案
[0641]
fc阻断和细胞表面染色
[0642]
将储存浓度为5mg/ml的人igg用作fc阻断剂(1:50稀释)。用dpbs洗涤t细胞两次，然后加入40μl在bd brilliant染色缓冲液中以1:50稀释的过量无关人igg同种型对照，并在室温下孵育15分钟进行fc受体阻断。然后用40μl的2x浓缩抗体混合物对细胞进行染色，该混合物含有在bd brilliant染色缓冲液中稀释的所有抗体-荧光染料缀合物。将细胞与抗体混合物在室温下于黑暗中孵育30分钟。然后用dpbs洗涤细胞两次，然后加入100μl在dpbs中以1:2000稀释的活性染料zombie nir。在室温下将细胞与活性染料于黑暗中孵育15分钟后，细胞再用dbps洗涤两次，然后在bd lsrii流式细胞仪上进行读数。
[0643]
细胞仪设置和补偿
[0644]
每天使用cs&t珠来评估细胞仪性能并为准确的应用程序设置提供信息，以便在每个时间点比对数据采集。在facsdiva中采集样品数据之前，使用用每种抗体荧光染料缀合物染色的invitrogen ultra comp ebeads计算补偿。
[0645]
数据分析
[0646]
使用flowlogic 7.2.1软件和cytobank 7.0平台分析流式细胞术数据以产生主要指标和图表。激活状态定义为cd69+41bb+共表达t细胞。耗竭状态定义为lag3+tim3+pd1+共表达t细胞。记忆子集定义为干细胞记忆/幼稚(tscm/幼稚：cd45ra+、ccr7+)、效应记忆(tem：cd45ra-、ccr7-)、中央记忆(tcm：cd45ra+、ccr7-)和终末分化效应记忆(temra：cd45ra-、ccr7+)。通过将每个供体内的所有条件与mb007(非信号传导car对照)进行比较，将数据归一化以说明供体之间的变异性。graphpad prism 7用于绘制代表来自3个供体的结果的指标。使用单因素方差分析和dunnett的多重比较检验在graphpad prism中应用统计分析。
[0647]
结果与讨论
[0648]
转导效率(te)和cd4+/cd8+比率
[0649]
基于zsgreen阳性细胞的百分比，使用ut t细胞将car-t样品归一化至在所有供体(n＝3)中的总te为约32％(图20a)。然而，cd4+t细胞亚群具有更高的te(约30-50％)，相较于cd8+t细胞亚群(约20-30％)具有供体之间的变异性。这些转导的t细胞的阳性程度也高度依赖于供体，尤其是cd4+t细胞亚群。通常，cd4/cd8比率也是供体依赖性的，与所有其他car-t样品相比，ut和mb007 car t细胞具有更多的cd8+亚群(图20b)。
[0650]
t细胞的激活和耗竭状态的分析
[0651]
在这项研究中，采用12色流式细胞术面板评估具有3个供体的10种产物的基础表型，即7个人源化tnmuc1 car t构建体(mb020-26)、小鼠tnmuc1 car-t(mb004)、非特异性car-t对照(mb007)和未转导的t细胞(ut)。激活状态由共表达cd69和41bb的细胞定义，耗竭状态由共表达pd1、lag3和tim3的细胞定义。总体而言，在基础水平上，除了mb004和mb026，所有样品都处于低激活状态和耗竭状态(图20c)。总体趋势表明，在基础水平上，与所有其他样品相比，mb004和mb026 t细胞似乎具有相对更高的激活(cd69+41bb+)和耗竭(pd-1+lag-3+tim-3+)状态，mb023 t细胞表现出中高状态，可能表明高自我激活/早期耗竭趋势。
[0652]
t细胞的记忆亚群的分析
[0653]
在基础水平上，供体之间存在细微的t记忆亚群变化。这可以通过传统的流式细胞术门控分析和使用荧光扣除对照(fmo)的手动门控来揭示。就百分比而言，除了供体92091在所有未转导的样品和转导的样品中几乎没有任何tem和tcm亚群，所有样品中未转导的t细胞和转导的t细胞的记忆亚群没有重大差异。所有三个供体均显示人源化car mb004和mb026 t细胞具有略高百分比的tscm/幼稚(和tcm)亚群(图21)。
[0654]
尽管供体之间的变异性很高，但观察到与所有其他人源化car t细胞相比，mb004和mb026通常具有相对更高的激活水平(cd69+41bb+)。它们还表现出显著更高的耗竭水平(pd-1+lag-3+tim-3+)，这可能表明这些car t构建体具有高度的自我激活/早期耗竭情况。
[0655]
实施例8
–
人源化tnmuc-1 car-t细胞的强直信号传导(抗原非依赖性信号传导)
[0656]
本研究的目的是评估强直信号传导(抗原非依赖性信号传导)对体外人源化tnmuc-1 car-t细胞的影响。表现出强直信号传导的car-t细胞导致体外t细胞功能受损和耗竭以及体内功效低下。强直信号传导受car结构、接头或铰链、信号传导结构域、表面表达位置和水平等特征的组合影响。本实施例中研究的人源化tnmuc-1-bbζ(pgk)car-t细胞由人源化5e5 scfv、4-1bbζ胞质结构域组成，该car-t细胞没有igg1 ch2-ch3接头，使用具有pgk启动子和lngfr检测基序的慢病毒载体转导生成。
[0657]
方法
[0658]
实验准备
[0659]
car-t细胞解冻和培养
[0660]
在使用冷冻car-t细胞的情况下，将细胞在37℃的水浴中半解冻，并在无菌条件下在安全柜中用1ml冷texmacs培养基重悬，直到沉淀完全解冻。在15ml falcon管中使用冷texmacs培养基将细胞悬液体积调整至总体积为10ml，并在室温(rt)下以300
×
g离心5分钟。去除上清液，将保留的细胞沉淀在10ml的texmacs培养基中重悬两次。
[0661]
对于解冻或新鲜细胞的重悬和培养，将洗涤后所得的细胞沉淀在室温下重悬于2ml texmacs培养基中，并使用细胞计数器获得细胞密度。将细胞重悬，在含有100u/ml il-2的texmacs培养基中将密度调整为2
×
106个细胞/ml。在lngfr富集之前，将7ml重悬的细胞转移到24深孔g-rex板的各个孔中，并在37℃和5％co2的加湿培养箱中放置24小时。
[0662]
car-t细胞lngfr富集
[0663]
使用easysep人cd271正选试剂盒和easysep右旋糖酐rapidspheres正选表达lngfr的car-t孔。将cat-t细胞收获到15ml falcon管中，并在室温下以300
×
g离心5分钟，去除上清液。在补充有测定试剂盒中提供的5μl easysep人fcr阻断物和10μl easysep人cd271正选混合物的200μl texmacs培养基中将细胞沉淀重悬至10至20
×
106个细胞的密
度，并转移到u底非组织培养物处理的96孔板并在室温下孵育15分钟。将10μl easysep右旋糖酐rapidspheres添加到含有细胞悬液的各个孔中，并在室温下孵育15分钟。通过添加60μl洗涤缓冲液(含有2％胎牛血清(fbs)和2mm edta的dpbs(不含钙和镁))重悬细胞悬液，并将板置于easyplate easysep磁铁上并孵育10分钟。在不扰动细胞沉淀的情况下，使用多通道移液器小心去除细胞上清液，并使用200μl洗涤缓冲液重复洗涤循环四次。最后一次洗涤后，将细胞重悬于200μl补充有10u/ml人il-2的texmacs培养基中，并转移到含有6.5ml补充有10u/ml的人il-2的texmacs培养基的g-rex板的每个孔中，并置于37℃和5％co2的加湿培养箱中24小时，随后进行测定。
[0664]
裂解物生成和蛋白质定量
[0665]
通过将1片complete
tm
stop和phosstop
tm
溶解在1ml冷ripa缓冲液中制备裂解缓冲液并储存在冰上。
[0666]
将car-t和未转导的t细胞从培养物中收获到15ml falcon
tm
管中，并使用细胞计数器获取细胞密度。将体积当量的2
×
106个细胞转移到另一个15ml falcon
tm
管中。将细胞在室温下以300xg离心5分钟，并去除上清液。将细胞沉淀重悬于1ml的冷dpbs(含钙和镁)中并转移到1.5ml eppendorf
tm
管中。使用eppendorf
tm
微量离心机在4℃下以2000rpm离心细胞5分钟，然后去除上清液。使用100μl移液器去除残留的上清液。通过在1小时时段内以20分钟间隔重复吸取70μl冷裂解缓冲液来裂解所得细胞沉淀。将裂解物在4℃下以13,500rpm离心5分钟，然后将20μl等分试样在干冰上快速冷冻。等分试样可在-80℃下长期储存。
[0667]
使用bsa测定法定量裂解物中的蛋白质水平，其中bsa在以下浓度下滴定：0、25、125、250、500、750、1000、1500和2000μg/ml。将20μl bsa滴定液一式两份转移，并将单个细胞裂解物样品转移到96平底孔聚苯乙烯nunc板中。工作试剂通过用10ml试剂a稀释剂稀释200μl bca试剂b来制备。将200μl工作试剂添加到含有bsa或细胞裂解物的各个孔中。使用多滴板摇动器将板摇动30秒，并在室温下孵育2小时，然后在clariostar读板器上读数。
[0668]
实验方案
[0669]
car-t细胞上清液中细胞因子释放的测定
[0670]
cs&t珠用于评估细胞仪性能。在facs diva中采集样品数据之前，使用用每种抗体荧光染料缀合物染色的invitrogen ultra comp ebeads计算补偿。car-t和未转导的t细胞从培养物中收获到15ml falcon管中，并在室温下以300
×
g离心5分钟。将来自每个样品的50μl上清液等分到96孔v底测定板中。
[0671]
将bd
tm
cba人th1/th2细胞因子试剂盒ii和bd
tm
cba人颗粒酶b flex set d7组合成一个多重测定并用于测定il2、il4、il6、il10、ifnγ、tnfα和颗粒酶-b。冻干测定标准品在1ml细胞培养基中复溶，100μl复溶样品用于进行1比2、11点连续稀释以确定校准图。使用50μl细胞培养基确定背景细胞因子水平。
[0672]
在2ml微量离心管中制备由4μl每个cba人th1/th2细胞因子试剂盒ii捕获珠和0.5μl cba人颗粒酶b flex set d7捕获珠组成的用于每个测试样品孔的珠混合物并涡旋。类似地，在另一个2ml微量离心管中通过将0.5μl cba人颗粒酶b flex set d7 pe检测试剂添加到25μl cba人th1/th2细胞因子试剂盒ii pe检测试剂中制备用于每个测试样品孔的pe检测试剂预混液。将25μl捕获珠预混液和25μl pe检测试剂预混液分别添加到50μl上清液和50μl测定标准液中。将测定板密封并在室温下在设置为600转/分钟(rpm)的板振荡器上
于黑暗中孵育3小时。
[0673]
将测定板以300xg离心5分钟并去除上清液。用100μl cba人th1/th2细胞因子试剂盒ii洗涤缓冲液洗涤珠两次，并将其重悬于60μl洗涤缓冲液中，然后在bd lsrii细胞仪上采集样品。
[0674]
car-t细胞表型的确定
[0675]
car-t和未转导的t细胞从培养物中收获到15ml falcon管中，并使用细胞计数器获得细胞密度。取出2
×
105个细胞并在室温下以300
×
g离心5分钟，去除上清液，并在dpbs中洗涤细胞。在重复离心并去除上清液后，通过添加过量的在bd brilliant染色缓冲液中以1:50稀释的无关抗人igg同种型对照来阻断fc受体。在室温下，在40μl中进行fc受体阻断15分钟。随后用40μl的2x浓缩抗体混合物对细胞进行染色，该混合物含有在bd brilliant染色缓冲液中稀释的所有抗体-荧光染料缀合物。将细胞与抗体混合物在室温下于黑暗中孵育30分钟。然后用dpbs洗涤细胞两次，并在100μl活性染料zombie aqua(在dpbs中1:2000稀释)中在室温下于黑暗中孵育15分钟。再用dbps洗涤细胞两次，然后用bd lsrii流式细胞仪读取。
[0676]
cs&t珠用于评估细胞仪性能。在facs diva中采集样品数据之前，使用用每种抗体荧光染料缀合物染色的invitrogen ultra comp ebeads计算补偿。
[0677]
下游信号传导的测定(peggy-sue
tm
)
[0678]
测定试剂和梯子通过用40μl的milliq水复溶测定试剂盒中提供的二硫苏糖醇(dtt)来制备。生物素化的梯子用16μl milliq水、2μl样品缓冲液、2μl复溶dtt稀释，并将16μl转移到250μl pcr管中。荧光标记物用20μl dtt和20μl样品缓冲液稀释。将3μl荧光标记物等分试样分配到250μl pcr管中。
[0679]
使用ripa缓冲液将细胞裂解物稀释至370μg/ml，并将12μl等分试样转移到含有3μl荧光标记物的pcr管中。将荧光裂解物混合物和生物素化的梯子涡旋，然后使用eppendorf
tm
微量离心机以2000rpm的速度离心，并放置在设定为95℃的热循环仪加热块上5分钟。将样品在冰上冷却，并将10μl生物素化的梯子和荧光细胞裂解物等分到如板图所限定的384孔peggy-sue
tm
测定板的各个孔中。
[0680]
使用样品缓冲液将15μl pcd3ζ、pzap70和总iκbα、3μl总cd3ζ、perk1/2和0.3μl gapdh抗体稀释至300μl的最终体积。将150μl luminol
tm
稀释到150μl过氧化物中。
[0681]
将20μl稀释的抗体、luminol
tm-过氧化物混合物、milliq水、分离基质、堆积基质、hrp缀合链霉亲和素和抗兔二抗分装到如板图所限定的各个孔中。将384孔测定板以1000
×
g离心1分钟以去除气泡，然后加载到peggy-sue
tm
机器上。
[0682]
试剂和材料
[0683]
用于car-t细胞生成的pbmc供体
[0684]
car-t细胞和未转导的t细胞来自6名健康人供体(#92205、90774、92084、90244、92190和92192)的外周血来源的单个核细胞(pbmc)。测定中测试的car-t细胞详述于表19。
[0685]
表19：car-t参考编号和构建体组分
[0686][0687]
数据分析
[0688]
使用flowlogic 7.2.1软件进行流式细胞术数据分析，产生主要指标和图表。比较cd4+和cd8+t细胞亚群的激活和耗竭标志物cd69、tim3和pd1的表达和共表达。
[0689]
使用flowlogic 7.2.1软件进行cba数据分析，产生主要指标(中值荧光强度值)。graphpad prism 7用于使用多项式：二阶(y＝a+b*x+c*x^2)非线性曲线拟合模型计算标准曲线。来自标准曲线的插值用于确定以pg/ml为单位的上清细胞因子的浓度。
[0690]
使用compass for sw软件(peggy-sue
tm
)进行抗原非依赖性信号传导数据分析，产生主要指标。在此处，使用软件确定各种染色的峰下面积(aup)，并根据gapdh(总蛋白质负荷)水平的aup对应答进行归一化。
[0691]
对于磷酸-cd3ζ，归一化涉及：
[0692]
归一化
[0693]
合并了来自最多6个供体的两个独立实验的数据。进行bonferroni单因素方差分析以显示测试car-t和对照car-t细胞之间的统计差异。graphpad prism 7用于绘制代表最多达6个供体结果的所有数据。
[0694]
结果与讨论
[0695]
在lngfr富集和24小时恢复培养后，来自6个供体的所有car-t细胞的转导效率达到了80％。评估了tnmuc-1-bbζ(pgk)car-t细胞的强直信号传导(抗原非依赖性信号传导)，其中应答以cd19-bbζ(pgk)(mb049)和gd2-28ζ(ef1a)(mb062)car-t细胞为基准。强直信号
传导的水平由一系列测定法确定，包括：上清液中细胞因子的基础水平(ifnγ、tnfα和颗粒酶b)、通过测量激活(cd69)和耗竭(pd-1和lag-3)标志物的连续t细胞表型的分化、以及增强的抗原非依赖性信号传导(pcd3ζ、pzap70、perk和iκbα)的测量。
[0696]
t细胞上的car表达水平由总cd3ζ染色预估。与使用pgk启动子表达的car相比，使用具有ef1a启动子的慢载体转导表达的gd2 car赋予更高水平的染色。与ef1a启动子上的相同构建体相比，在gd2-28ζ(pgk)(mb060)car-t细胞上观察到更低水平的磷酸化cd3ζ、细胞因子释放以及激活和耗竭表型的分化。这再次证实了载体的效率可以通过car的过表达来诱导强直信号传导(gomes-silva等人，2017)。与cd19-bbζ(pgk)(mb049)car-t细胞相比，gd2-bbζ(pgk和efla)(mb059和mb061)car-t细胞未显示强直信号传导的任何增加。然而，与gd2-bbζ(pgk和ef1a)(mb059和mb061)car-t细胞相比，gd2-28ζ(pgk和ef1a)(mb060和mb062)car-t细胞显示强直信号传导的增加。gd2-28ζ(ef1a)(mb062)car-t细胞的强直信号传导效应进一步增强。数据再次证实，与cd28ζ跨膜和胞质结构域相比，4-1bbζ胞质结构域降低了强直信号传导的水平，而与所使用的慢病毒载体转导启动子无关(long等人，2015)。然而，gd2-28ζcar-t细胞包括不存在于gd2-bbζcar-t细胞上的igg1 ch2-ch3细胞外接头，这也可能有助于观察到的强直信号传导水平(frigault等人，2015)(mamonkin等人，2016)。
[0697]
通常，在该测定中取样的3个供体中，存在与cd8+t细胞相比略多的cd4+t细胞(图22a)。与cd8+t细胞相比，cd4+t细胞表现出组合的激活(cd69)和耗竭(pd-1、tim-3)表型的更高表达，这一特征在所有car-t细胞中都是一致的。当研究三阳性(cd69、pd-1和tim-3)、仅双阳性耗竭(pd-1、tim-3)或仅pd-1概况时，该激活和耗竭表型的趋势得到保留(图22b)。
[0698]
测试tnmuc-1-bbζ(pgk)car-t细胞的细胞因子释放(ifnγ、tnfα和颗粒酶b)以及激活(cd69)和耗竭(tim-3、pd-1)显示出类似于没有强直信号传导的cd19-bbζ(pgk)(mb049)和gd2-bbζ(pgk和ef1a)car-t(mb059、mb061)细胞所观察到的曲线。观察到tnmuc-1-bbζ(pgk)和gd2-28ζ(pgk)(mb060)car-t细胞的细胞因子释放、激活和耗竭表型略有增加。然而，该细胞因子释放、激活和耗竭表型显著低于gd2-28ζ(ef1a)(mb062)所观察到的。该数据表明在所有四种人源化tnmuc-1-bbζ(pgk)car-t细胞中观察到的强直信号传导的最低水平。
[0699]
与gd2-28ζ(ef1a)car-t细胞(mb062)相比，所有tnmuc-1-bbζ(pgk)car-t细胞(mb037至mb041)赋予更低的激活和耗竭表型。对于tnmuc-1-bbζ(pgk)car-t细胞和gd2-28ζ(pgk)car-t细胞(mb060)观察到的激活和耗竭表型相当。然而，与未转导的t细胞、cd19-bbζ(pgk)(mb049)或gd2-bbζ(pgk和ef1a)car-t细胞(mb059,mb061)相比，人源化tnmuc-1-bbζ(pgk)的激活和耗竭表型显示出略有增加(图22b)。
[0700]
从基础细胞因子释放概况来看，与gd2-28ζ(ef1a)(mb062)相比，tnmuc-1-bbζ(pgk)和gd2-28ζ(pgk)(mb060)car-t细胞赋予显著降低的ifnγ、颗粒酶b和tnfα水平(bonferroni单因素方差分析)。cd19-bbζ(mb049)和gd2-bbζ(pgk和ef1a)(mb059、mb061)car-t细胞赋予检测最低的基础细胞因子释放(图22c)。
[0701]
通过t细胞受体的交联和测量pcd3z、pzap70、perk的动力学增加和前几分钟内总iκbα峰值的减少来进行下游t细胞信号传导检测的优化。与tnmuc-1-bbζ(pgk)、cd19-bbζ(pgk)(mb049)、gd2-bbζ(pgk和ef1a)和gd2-28ζ(pgk)car-t细胞相比，gd2-28ζ(ef1a)car-t细胞(mb062)的下游信号传导分析赋予pcd3ζ和pzap70、perk的增加以及iκbα的减少(图23a
和图24a)。从peggy-sue
tm
western测定中检测到的信号传导概况来看，与gd2-28ζ(ef1a)(mb062)相比，人源化tn-muc-1-bbζ(pgk)和gd2-28ζ(pgk)(mb060)car-t细胞赋予显著更低的pcd3ζ水平。与阴性对照cd19-bbζ(pgk)(mb049)一致，所有人源化tnmuc-1-bbζ(pgk)car-t细胞的pcd3ζ水平相似。该数据再次证实tnmuc-1car-t细胞的强直信号传导水平不足以对体外car-t细胞功能产生不利影响。
[0702]
裂解物从2
×
106个car-t细胞中获得，上样前将浓度归一化为370μg/ml。使用peggy-sue
tm
高通量毛细管western技术评估蛋白质水平。pcd3ζ的归一化水平根据来自最多6个供体的总cd3ζ和gapdh加载对照计算。从结果分析来看，与cd19-bbζ(pgk)(mb049)car-t细胞相比，人源化tnmuc-1-bbζ(pgk)car-t细胞(mb037至mb041)没有在pcd3ζ或pzap70水平上赋予显著差异。然而，与tnmuc-1-bbζ(pgk)car-t细胞相比，对于gd2-28ζ(ef1a)检测到显著更高水平的pcd3ζ。对于gd2-bbζ(pgk或ef1a)(mb059和mb061)car-t细胞观察到低pcd3ζ信号(图23a)。对pzap70的类似分析证实了gd2-28ζcar(ef1a)(mb062)的最高信号水平，并且在tnmuc-1-bbζ(pgk)、cd19-bbζ(pgk)(mb049)或gd2-bbζ(pgk或ef1a)car-t细胞间没有显著差异(图23b)。
[0703]
确定了tnmuc-1-bbζcar(mb040)、cd19-bbz car(mb049)和gd2-28ζ(ef1a启动子)car(mb062)car-t细胞在tcr信号传导通路上的下游信号转导映射。在此处，为从供体90244获得的car-t细胞建立了car特异性总cd3ζ、pcd3ζ、pzap70、perk1/2、总iκbα的水平。如western印迹(图24a)所示，与cd19-bbζ(mb049)和tnmuc-1-bbζ(mb040)car-t细胞相比，gd2-28ζcar(mb062)显示升高水平的总cd3ζ、pcd3ζ、pzap70和perk1/2以及降低水平的总iκbα。
[0704]
实施例9
–
人源化tnmuc1 car-t对tnmuc1肿瘤细胞系的细胞毒性
[0705]
该研究的目的是评估tnmuc1 car-t在杀伤测定中与阳性和阴性tnmuc1肿瘤细胞系共培养时的细胞毒性和特异性。具体而言，在72小时的时间进程中，在xcelligence测定中实时测量了car-t细胞的细胞毒性。此外，在与肿瘤细胞共培养24小时后，通过使用msd测定法测量ifnγ释放来评估car-t细胞的激活。
[0706]
方法
[0707]
通过将tnmuc1 car-t与肿瘤细胞系共培养来评估tnmuc1 car-t的功能。在转导后第14天使用car-t细胞。以xcelligence测定法实时测量直接细胞毒性，在添加t细胞前20小时接种肿瘤细胞。与两种阳性tnmuc1细胞系mda-mb-468和mcf7 wt在xcelligence中运行共培养72小时。此外，通过测量与k562、mcf7 wt和mcf7 muc1 ko细胞系培养24小时后分泌的ifnγ水平来评估car-t功效。在两组独立实验中设置了三个供体的实验。
[0708]
实验准备
[0709]
t细胞制备
[0710]
在转导后第14天，从24孔g-rex板中收获t细胞。对t细胞进行计数并在完全rpmi培养基中稀释至1x10^6细胞/ml。将t细胞以300xg离心5分钟，并在10ml完全rpmi培养基中洗涤，并以300xg再次离心5分钟。t细胞以1x106细胞/ml重悬。将car-t归一化为跨供体的最低转导效率。转导效率基于来自流式细胞术分析的阳性zsgreen群体百分比。通过用未转导(ut)t细胞稀释至固定数量和体积的t细胞来进行归一化。
[0711]
实验方案
[0712]
xcelligence细胞毒性测定
[0713]
xcelligence rtca仪器(acea biosciences)用于该阻抗实验。96孔e板(acea biosciences)的每个孔都装有50μl靶细胞培养基，以便在添加靶细胞之前测量背景阻抗。将靶细胞mda-mb-468和mcf7 wt分离并以20,000个细胞/孔的密度(mda-mb-468和mcf-7wt)接种。将50μl每个细胞系添加到96孔e板的适当孔中。接种靶细胞后，将e-板在室温下放置15-30分钟，以使靶细胞黏附到孔上。然后将e板转移到rtca仪器(在细胞培养培养箱内)，并立即开始以1小时间隔进行数据记录持续整个实验时间进程。接种后约20小时，暂停数据采集，并以0.2:1的car-t与靶细胞比率对mda-mb-468和mcf-7wt细胞系添加效应细胞。存在的对照是仅靶细胞、仅效应细胞和靶细胞加100％裂解(0.5％triton x)孔。然后将e板放回仪器中并重新开始实验。在相同条件下设置额外的共培养物用于细胞因子分析。
[0714]
细胞系接种密度(细胞/孔)mda-mb-46820000mcf740000mda-mb-46830000mcf720000
[0715]
人ifnγ细胞因子测定
[0716]
将k562、mcf7 wt和mcf7 ko细胞系分离并计数。细胞在rpmi培养基中洗涤并以300xg离心。将细胞以1x106个细胞/ml重悬。然后将5x104个细胞以100μl添加到96孔板中。然后将100μl归一化t细胞以2.5:1的e:t比率(效应基于转导的t细胞)添加到板中，并在37℃、5％co2下共培养24小时。将板离心24小时后，收集上清液并储存在-80度。对于msd分析，将样品在室温下解冻。在稀释剂1中稀释样品和校准品。具体而言，用990μl稀释剂1稀释10μl校准品原液。使用1:4连续稀释来制备6个额外的校准品稀释液。稀释剂1仅用于最终稀释。样品在稀释剂1中按1:10稀释，然后将25μl的每个样品加入msd板中。在板的前两列中一式两份地添加校准品。将板密封并在室温下振荡孵育2小时。使用洗板机将板用含有0.5％吐温(sodexo)的pbs洗涤3次。将检测抗体在稀释剂100中稀释(60μl ab+2.94ml稀释剂100/msd板)。加入25μl检测抗体后，将板密封并在室温下振荡孵育2小时。如前所述洗涤板。然后，将150μl 2x读取缓冲液添加到每个孔中，然后在msd sector 600imager上读取。数据使用excel和prism软件分析。简而言之，实验值对应于来自共培养物的释放的ifn-γ的量。
[0717]
数据分析
[0718]
xcelligence
[0719]
阻抗的变化记录为细胞指数(ci)。将细胞指数归一化为效应细胞添加点—称为归一化细胞指数(nci)。下面的等式用于通过将数据归一化为microsoft excel中的靶细胞生长来计算活细胞百分比和细胞溶解百分比。
[0720]
归一化至靶细胞(具有裂解)＝(((共培养效应细胞)-100％裂解)/(靶细胞
–
100％裂解))*100
[0721]
msd
[0722]
数据使用excel和prism软件分析。简而言之，对应于来自共培养物释放的ifnγ量的实验值已通过线性插值计算(已对吸光度值进行插值以计算浓度)。回归曲线使用增加浓度(pg/ml)的：ifnγ(最高值：10.000pg/ml)。
[0723]
结果与讨论
[0724]
细胞系糖酵解和细胞系生物标志物的差异可导致细胞系之间的差异杀伤。muc1可以通过tn或stn不同地糖基化，这将影响不同细胞系之间的杀伤率和量。xcelligence测定表明，mda-mb-468和mcf7细胞系之间的杀伤率和总体百分比不同。通过xcelligence细胞毒性在供体内的car-t之间没有发现重大差异。mb024可以有效靶向tnmuc1阳性细胞，其水平与mb004小鼠和mb020人阳性对照car-t相当。
[0725]
mb024对tnmuc1肿瘤细胞系的细胞毒性的评估
[0726]
评估了六种人源化tnmuc1 car-t在细胞毒性测定中的功效和特异性。通过xcelligence测定实时测量tnmuc1 car-t细胞毒性的验证，其中使用阻抗测量随时间追踪细胞生长。两种表达tnmuc1的乳腺细胞系(mcf7和mda-mb-468)由六种tnmuc1 car-t靶向，并且每小时测量一次细胞毒性持续总计72小时，其中阻抗的缺乏与肿瘤细胞杀伤相关。由于对照靶细胞的过度汇合，细胞毒性分析仅在最高达35小时内有效。供体0277的ut细胞具有异常的交叉反应，因此该供体被排除在分析之外，从而总共有5个供体。尽管mb024在72小时时存活的细胞百分比在供体之间差异高达20％，但对于供体中的tnmuc1 car-t细胞之间的细胞毒性没有发现显著差异。
[0727]
mb024与在mda-mb-468细胞上测试的其他car-t具有相同的kt50值。由于mcf7细胞系没有生长到合适的密度，因此没有通过测定标准并被排除在分析之外，因此省略了mcf7细胞上的三个供体(91031、0277、91666)的结果，仅考虑了mcf7细胞上的供体92091、91860和91462用于分析(图31b)。与mda-mb-468相比，mb024在mcf7细胞上具有更慢的kt50，但与对mda-mb-468细胞的杀伤相比，mcf7细胞系上的供体间变异性较小。
[0728]
tnmuc1 car-t动力学测量达到50％杀伤的时间(kt50)以及mda-mb-468细胞系上的平均kt50(a)和mcf7 wt细胞上的平均kt50(b)的汇总表如下表20所示。
[0729]
表20：xcelligence测定中tnmuc1 car-t细胞的杀伤动力学(kt50)
[0730]
(a)mda-mb-468细胞系上的tnmuc1细胞毒性kt50值
[0731][0732][0733]
(b)mcf7细胞系上的tnmuc1细胞毒性kt50值
[0734][0735]
*n/a-未达到50％杀伤
[0736]
通过评估ifnγ细胞因子评估t细胞激活
[0737]
与在xcelligence上看到的数据相似，结果表明mb024 tnmuc1 car-t在与tnmuc1阳性细胞共培养时分泌ifnγ，表明t细胞激活是car-t与靶抗原相互作用的结果。通过与k562、mcf7 wt和mcf7 muc1 ko细胞系共培养后的ifnγ释放测量通过靶向tnmuc1的mb024激活。mb024在与tnmuc1阳性细胞系相互作用时以及与ut和抗cd19 car-t对照相比时显示出t细胞激活。mb024在mcf7 ko上没有显示任何水平的激活，不同于mb022、mb023、mb025和mb026在没有muc1的情况下在mcf7 muc1 ko细胞系上被激活。此外，在观察ifnγ释放的基础水平时，mb024未显示ifnγ分泌，而mb026具有高基础激活水平。
[0738]
因此，car-t在mcf7细胞系上的ifnγ释放表明mb024优于其他测试的car-t。除mb021和mb024外，6个供体的所有car-t在mcf7 muc1 ko细胞系上培养时均显示激活。mb024在没有靶细胞系的情况下也显示没有基础ifnγ释放水平。当考虑tnmuc1 car-t的潜在交叉反应蛋白时，甚至在没有muc1蛋白的情况下，所有car-t分子都可以识别细胞系中存在的其他糖蛋白上的tn和stn聚糖。鉴于tn-聚糖仅在肿瘤中表达，由于其肿瘤特异性引起的关注较少，但是stn-聚糖在正常组织中以低水平表达以及car-t可能的交叉反应表明不利的安全概况。总之，mb024可以靶向并有效杀伤tnmuc1肿瘤细胞系，并且对tnmuc1阳性细胞系具有特异性。
[0739]
实施例10-靶标密度的影响
[0740]
该研究的目的是评估tnmuc1 car-t在xcelligence和msd测定中的细胞毒性和特异性。使用表达不同水平tnmuc1的重组细胞系，我们基于不同的细胞毒性介导的杀伤来区分car-t。在72小时的时间进程的xcelligence测定中实时以及通过msd测量来自24小时共培养物的ifnγ释放来测量细胞毒性。
[0741]
方法
[0742]
通过建立tnmuc1 car-t与tnmuc1阳性和阴性肿瘤细胞系的共培养物来进行tnmuc1 car-t的功能研究。在加入肿瘤细胞系之前，使car-t细胞在解冻后恢复24小时。使用相同的细胞系和e:t比率平行设置msd和xcelligence板。在两组独立的实验中设置了四个供体的实验。
[0743]
实验准备
[0744]
t细胞解冻和复苏
[0745]
将1ml冷冻t细胞等分试样在室温下半解冻，然后转移到15ml冰冷的细胞培养基中。将t细胞在室温下以300xg离心10分钟，然后重悬于15ml冷细胞培养基中。反复离心后，将t细胞重悬于2ml室温细胞培养基中。计数t细胞，并将细胞浓度调整为2x106个细胞/ml。t
细胞在37℃和5％co2的加湿培养箱中的24孔平底细胞悬浮板中含有100u/ml il-2的培养基中培养24小时。
[0746]
用cd40抗体包被e板用于在xcelligence中测试悬浮细胞系
[0747]
用组织培养级水将束缚溶液(tethering solution)稀释10倍。然后，使用这种束缚溶液从500μg/ml开始稀释抗cd40抗体，以达到4μg/ml的最终浓度(125倍稀释度)。e板(acea biosciences)的适当孔用50μl抗cd-40工作溶液包被，室温孵育3小时，用pbs(-/-)洗涤两次并用50μl靶细胞培养基孵育1小时，然后进行背景测量。
[0748]
实验方案
[0749]
xcelligence细胞毒性测定
[0750]
xcelligence rtca仪器(acea biosciences)用于该阻抗实验。96孔e板(acea biosciences)的每个孔都装有50μl靶细胞培养基，以便在添加靶细胞之前测量背景阻抗。将黏附的靶细胞解离并接种于密度为20,000(所有pc3细胞系和arh 77wt)或40,000(mcf-7wt和mcf-7ko)细胞/孔的悬浮细胞系。将50μl每个细胞系添加到96孔e板的适当孔中。接种靶细胞后，将e-板在室温下放置15-30分钟，以使靶细胞黏附到孔上。然后将e-板转移到rtca仪器(在细胞培养箱内)，并立即开始以10分钟的间隔记录数据持续6小时，然后以1小时的间隔进行剩余的实验。接种后约20小时，暂停数据采集，对于pc3细胞系和arh77 wt，以1:1的效应物与靶标比率添加效应细胞，对于mcf-7wt和mcf-7ko，以0.5:1的效应物与靶标比率添加效应细胞。存在的对照是仅靶标细胞、仅效应细胞和靶标加100％裂解(0.5％triton x)孔。然后将e板放回仪器中并重新开始实验。在相同条件下设置额外的共培养物用于细胞因子分析。xcelligence数据如上文实施例9所述进行分析。
[0751]
人ifnγ细胞因子测定
[0752]
在xcelligence共培养设置期间，将重复的板设置于平底96孔板中并孵育24小时。将板离心后，在共培养后24小时收集上清液并储存在-80℃直至在室温下解冻用于msd。
[0753]
在稀释剂1中稀释样品和校准品。用990μl稀释剂1稀释10μl校准品原液。使用1:4连续稀释来制备6个额外的校准品稀释液。稀释剂1仅用于最终稀释。样品在稀释剂1中以1:10稀释，然后将25μl的每个样品添加到msd板中。在板的相对侧一式两份地添加校准品。将板密封并在室温下振荡孵育2小时。使用洗板机将板用pbs+0.5％吐温(sodexo)洗涤3次。将检测抗体在稀释剂100中稀释(60μl ab+2.94ml稀释剂100/msd板)。添加25μl检测抗体后，将板密封并在室温下振荡孵育2小时。如前所述洗涤板。将150μl 2x读取缓冲液添加到每个孔中，然后在msd sector 600imager上读取。msd数据如上文实施例9所述进行分析。
[0754]
统计计算
[0755]
线性混合效应模型与细胞系的car交互项以及周、板和供体的随机截距项一起使用，分别针对24、48和72小时中的每一个。使用这些模型，使用以下公式计算“细胞存活百分比与阴性对照细胞系的差异”的线性对比：
[0756]
存活百分比的差异＝(细胞系中的car-t应答-细胞系中的ut应答)-(对照细胞系中的car应答-对照细胞系中的ut应答)
[0757]
结果与讨论
[0758]
tnmuc1对tnmuc1肿瘤细胞系的细胞毒性的功能评价
[0759]
在内源性表达细胞系中，tnmuc1细胞表面表达水平可以显著变化。通过使用在实
验之间保持表达水平恒定的重组细胞系，其可以在当使用不同的供体提供car-t时实现准确的实验重复。通过使用一系列靶标水平，car-t可以通过动力学和ifnγ测量来区分。
[0760]
xcelligence细胞毒性测定用于研究tnmuc1 car-t细胞对不同水平的表达tnmuc1的肿瘤细胞的差异靶向和杀伤的能力。添加t细胞后每小时实时测量细胞毒性，持续72小时。在该测定中，对以高(100％)、中(60％)和低(5％)百分比阳性表达tnmuc1的三种重组pc3肿瘤细胞系与它们的pc3 wt阴性对照进行了测试。mcf7 wt和mcf7 muc1 ko细胞系也用作实验对照。我们发现tnmuc1 pc3 5f5细胞系在t细胞添加2小时内表现出靶向细胞毒性，在24小时仅对于mb022观察到显著杀伤。与对照细胞系相比，其他细胞在24小时内未见任何杀伤。
[0761]
在48小时时，所有car-t都显示出对mcf7 wt、pc3 2b6和pc3 5f5的一定水平的杀伤。然而，mb021是唯一对pc3 2b6有显著杀伤的car-t。虽然mb022和mb025在这个48小时的时间点显示对mcf7 wt的显著杀伤，但mb021和mb024没有。尽管mcf7和pc3细胞之间的e:t靶标比率不同(分别为0.5:1和1:1)，但在72小时时间进程结束时，所有car-t均显示对mcf7 wt、pc3 2b6和pc3 5f5的100％杀伤并且对pc3 4c11没有观察到杀伤。虽然可以看到mb021对pc3 4c11的一些杀伤，但在统计学上并不显著(表21)。总体而言，在mcf7 wt和pc3 2b6上观察到最显著的杀伤，即使这些细胞系具有低于pc3 5f5的tnmuc1表达。
[0762]
表21：tnmuc1 car-t对tnmuc1阳性细胞系的细胞毒性相对于阴性对照细胞系的统计学意义
[0763]
[0764][0765]
通过ifnγ细胞因子释放评估t细胞激活
[0766]
当与高阳性tnmuc1肿瘤细胞系共培养时，mb022和mb024 car t细胞分泌高水平的ifnγ。在pc3 cosmc ko细胞系2b6上的ifnγ释放最高，对于mb021和mb024检测到约8000pg/ml，而mb022和mb025达到10000pg/ml的等效水平(图26)。在pc3 5f5细胞系上也看到了类似的趋势，但其中ifnγ水平更低(3000pg/ml
–
5000pg/ml)。mb021和mb024在pc34c11或pc3 wt细胞系上未显示激活。总体而言，与mb025相比，mb024表达少2倍的ifnγ释放，但阳性和阴性细胞之间的表达水平存在很大差异，其中没有pc3 wt激活或基础表达(图26)。
[0767]
结果表明，存在tnmuc1 car-t细胞特异性接合并杀伤其靶细胞系所需的表达阈值。car-t细胞与仅表达5％tnmuc1的pc3 4c11细胞系共培养时在xcelligence和msd中未显示细胞毒性作用。mb024可以完全消除pc3 5f5(高表达)和pc3 2b6(中表达)细胞系，尽管从pc3 5f5释放的ifnγ水平更低，但观察到pc3 2b6的细胞溶解动力学更慢。
[0768]
实施例11
–
表达tnmuc-1的pc3细胞系的功能性car-t细胞杀伤
[0769]
本研究的目的是根据其特异性杀伤表达tnmuc-1的靶细胞的倾向来选择tnmuc-1car-t细胞。
[0770]
方法
[0771]
实验方案
[0772]
car-t细胞解冻和培养
[0773]
car-t细胞和未转导(ut)的t细胞衍生自3名健康人供体(#92159、92160和2764)的外周血来源的单个核细胞(pbmc)。在使用冷冻car-t细胞的情况下，将细胞在37℃的水浴中半解冻，然后用1ml冷texmacs
tm
培养基重悬浮，直到沉淀完全解冻。在15ml管中使用冷texmacs
tm
培养基将细胞悬液体积调整为总体积10ml，并在室温(rt)下以300
×
g离心5分钟。去除上清液，将保留的细胞沉淀在10ml的texmacs
tm
培养基中重悬两次。
[0774]
对于解冻或新鲜细胞的重悬和培养，将洗涤后得到的细胞沉淀重悬于室温下的2ml texmacs
tm
培养基中，并使用细胞计数器获得细胞密度。将细胞重悬，并在含有100u/ml il-2的texmacs
tm
培养基中将密度调整为2
×
106个细胞/ml。将7ml重悬的细胞转移到24深孔g-rex板的各个孔中，并在37℃和5％co2的加湿培养箱中放置24小时，然后进行共培养设
置。
[0775]
下文详述了在该测定中测试的car-t细胞。
[0776]
car-t细胞载体
[0777]
名称独特idlv.vsvg.sin.pgk.h-scfv.d4.muc1car.wmb-051lv.vsvg.sin.pgk.h-scfv.d6.muc1car.wmb-052lv.vsvg.sin.pgk.h-scfv.d16.muc1car.wmb-053lv.vsvg.sin.pgk.h-scfv.d18.muc1car.wmb-054
[0778]
在incucyte s3
tm
上进行细胞杀伤测定的共培养设置
[0779]
测试了三种细胞系：pc3 cosmc ko克隆5f5(pc3.5f5)、pc3 cosmc ko克隆4c11(pc3.4c11)和pc3 wt(pc3.wt)。通过在37℃的加湿培养箱中用5ml tryple
tm
处理细胞表面5分钟将靶细胞(pc3.wt、pc3.5f5和pc3.4c11)从t175烧瓶中取出。轻轻敲击烧瓶以取出细胞并用15ml预热的细胞培养基(rpmi+10％热灭活fbs+1％丙酮酸钠+1％mem-neaa+1％glutamax)中和tryple
tm
。将细胞悬液收集到50ml falcon
tm
管中并以300xg离心10分钟。在获得的细胞沉淀处去除上清液，重悬于10ml细胞培养基中。在细胞计数器上获得细胞密度，将细胞在细胞培养基中重悬至0.4
×
106个细胞/ml。如测定板图所示，将100μl细胞转移到测定板的各个孔中，然后转移到36.5℃/5％co2的加湿的incucyte
tm
s3中24小时，然后进行car-t细胞共培养。
[0780]
从相应的测定孔中取出细胞上清液，用100μl含有500nm cytotox
tm
red试剂的新鲜细胞培养基替换，然后将板转移到36.5℃/5％co2的加湿incucyte
tm
s3中，然后添加效应细胞。
[0781]
将car-t和未转导的t细胞收获到15ml falcon
tm
管中，并使用细胞计数器获取细胞密度。将细胞在室温下以300xg离心5分钟，并去除上清液。将细胞沉淀重悬于细胞培养基中至密度为0.45
×
106个细胞/ml，并将100μl car-t和未转导的t细胞转移到各孔中，如测定板图所示。将测定板置于37℃/5％co2的加湿incucyte
tm
s3中。图像采集安排在6天的时间跨度内以2小时的间隔进行。
[0782]
数据分析
[0783]
图像分析
[0784]
获得了代表以下详述条件的图像集，用于设置图像掩码。
[0785]-car-t细胞和靶细胞共培养2小时和96小时
[0786]-未转导的t细胞和靶细胞共培养2小时和96小时
[0787]-仅靶细胞2小时和96小时
[0788]-仅car-t细胞2小时和96小时
[0789]-仅未转导的细胞2小时
[0790]
进行图像分析以确保对描述靶细胞杀伤的总红色面积增加的具体可视化和总红色面积掩码生成以确定总面积(μm2/图像)。
[0791]
图像数据归一化与分析
[0792]
将各个car-t和未转导的t细胞的总面积导出到windows excel中。在适用于windows的graphpad prism 6.02版、graphpad软件中，将各个car-t和未转导的t细胞的原
始数据和归一化活细胞百分比作为时间函数绘制，以表示总簇面积的增加(μm2/图像)。归一化计算如下详述：
[0793]
使用下列公式计算每个car-t细胞的细胞杀伤效应：
[0794]
归一化应答取决于该实验中t＝1和t＝第n个读取时的最佳car-t杀伤效果，其中使用的等式为：
[0795]
a.确定共培养背景应答(cbg)＝共培养应答
–
(仅效应细胞+仅靶标应答)
[0796]
b.确定活细胞百分比＝{[平均值(最佳car-t-cbg
tn
的最大cbg)]/[平均值(最佳car-t-cbg
t1
的最大cbg)]}
×
100
[0797]
获得在三个pc3 cosmc敲除细胞系(pc3.5f5-28小时、pc3.4c11
–
44小时和pc3.wt
–
60小时)测试的来自3个t细胞供体的每次重复(n＝9个数据点)的各个终点处的活细胞百分比。使用适用于windows的graphpad prism版本6.02、graphpad软件绘制数据。进行bonferroni单因素方差分析测试以确定不同细胞系中测试car-t细胞的活细胞应答百分比之间的显著差异。
[0798]
结果与讨论
[0799]
该研究的目的是确定可以检测到靶细胞系的car-t特异性杀伤的靶标表达阈值。car设计的主要挑战是确保检测和消除肿瘤细胞而不影响健康组织。因此，该研究还应该能够在未检测到tnmuc-1靶标表达的情况下检测pc3.wt细胞上观察到的任何非特异性杀伤作用。
[0800]
在这项研究中，不具有检测标签的car-t细胞由人源化5e5 scfv与cd8跨膜和4-1bbζ胞质区域组成，通过外周血来源的单个核细胞(pbmc)的慢病毒转导生成并冷冻保存。将细胞重新引入新鲜培养物中，并重新评估car-t细胞活力和转导效率。在此处，所有的car-t细胞都赋予了大于80％的存活率，其中car转导效率大于80％。
[0801]
从归一化的细胞杀伤应答来看，未转导的t细胞对任一靶细胞系均未显示任何特异性杀伤。mb052和mb054在60小时的终点赋予对pc3.wt细胞系一定程度的杀伤作用。在同一时间点，mb051和mb053的这种杀伤效果并不明显。在60小时终点对测试car-t细胞进行bonferroni单因素方差分析显示mb052和mb054 car-t细胞对pc3.wt靶细胞系的杀伤有显著差异。在60小时终点，mb052和mb054的平均活细胞百分比低于mb051、mb053和未转导的t细胞(图27和28，a和b)。然而，观察到的mb052和mb054的杀伤水平不足以预测在60小时终点达到杀伤50％的靶细胞系(kt50)的时间。
[0802]
同样，与mb051和mb053相比，mb052和mb054在44小时终点也显示对pc3.4c11细胞系增加的杀伤水平。bonferroni单因素方差分析赋予了活细胞百分比水平的显著差异(图28c)。从k
t
50分析来看，mb052和mb054赋予了36-38小时的k
t
50范围，而mb051和mb053的k
t
50更慢，范围为45-49小时。
[0803]
在pc3.5f5细胞系上测试赋予高水平tnmuc-1的car-t细胞的结果显示显著增强杀伤，其中在28小时达到完全杀伤终点。终点的bonferroni单因素方差分析显示mb051、mb052和mb053的活细胞百分比几乎没有差异。在mb051和mb054之间观察到唯一的显著差异。由于增强的杀伤应答，k
t
50与在低tnmuc-1表达pc3.4c11细胞系上测试时相比短得多。此处计算的k
t
50为11-14小时，其中四种car-t细胞之间没有显著差异(图28a-28d)。
[0804]
从表达增加水平的tnmuc-1的pc3.wt和cosmc敲除细胞系的实验中获得的结果证
实了代表性的tnmuc-1car-t细胞的杀伤活性增加。通过使用不同水平的tnmuc1证明，存在tnmuc1 car-t细胞特异性接合并杀伤其靶细胞系所需的表达阈值。car-t细胞在与不表达tnmuc-1的pc3.wt孔系共培养时没有或表现出较差的细胞毒性作用。mb051和mb053没有在60小时终点赋予对pc3.wt细胞系杀伤的显著差异。然而，与未转导的t细胞或mb051和mb054在tnmuc-1阴性细胞系(pc3.wt)上观察到的相比，mb052和mb054显示出显著增加的杀伤水平。这一观察结果可能与慢解离速率驱动机制有关，其中与mb051和mb053相比，mb052和mb054的scfv赋予了更慢的解离速率和更高的亲和力。
[0805]
随着pc3.4c11细胞系上tnmuc-1表达增加5％，存在足够的靶标使car-t细胞接合并杀伤。由于pc3.4c11细胞系上的低tnmuc-1表达水平，与pc3 5f5(高表达)相比，观察到的最大杀伤阈值在39-50％之间。在44小时的时间点实现了这种杀伤水平。与mb052和mb054相比，mb051和mb053赋予更高的活细胞阈值百分比和更长的kt50，表明对pc3.4c11细胞更慢的杀伤速率(表22)。因此，在tnmuc-1高表达细胞系(pc3.5f5)上，在28小时内实现了接近100％的靶细胞杀伤。car-t细胞在12
–
14小时的范围内赋予平均k
t
50，其中在任何一个测试的克隆中，杀伤速率没有显著差异(表23)。
[0806]
数据证实了理解靶标密度、car-t细胞表达和car亲和力之间的相互作用对驱动特异性肿瘤细胞杀伤的重要性。此处显示了mb051和mb053与mb052和mb054相比具有更好的安全性概况，其中对靶细胞的差异杀伤取决于tnmuc-1表达水平。
[0807]
表22：tnmuc-1car-t细胞在pc3.4c11和pc3.5f5细胞系上的外推平均值和标准偏差k
t
50
[0808][0809]
表23：在设定阈值下获得的相应ut和car-t细胞的平均活细胞百分比和标准偏差
–
pc3.wt(60小时)、pc3.4c11(44小时)和pc3.5f5(28小时)
[0810][0811]
实施例12-肽刺激测定
[0812]
本研究的目的是(i)验证biacore先前的发现，这些发现表明用于开发mb024的scfv能够结合tn和stn muc1两者；(ii)证明mb024 car-t细胞仅在报告的表位处结合tn muc1肽。
[0813]
方法
[0814]
实验准备
[0815]
scfv蛋白的生成、肽的制备
[0816]
如前所述生成人源化scfv蛋白。
[0817]
设计并从cambridge research biosciences(crb)订购在整个肽的丝氨酸和苏氨酸氨基酸处含有tn糖残基的生物素化20聚体氨基酸肽。作为对照，非糖基化的muc1肽也以相同的序列排序，但在丝氨酸和苏氨酸氨基酸上没有碳水化合物残基。为了确定人源化抗tnmuc1 scfv蛋白与tn肽结合的表位，订购了另外两种差异糖基化肽，其中一种含有在文献中报道由scfv蛋白结合的肽的ser/thr氨基酸上的tn糖残基，一种含有据报道scfv蛋白不结合的丝氨酸和苏氨酸氨基酸上的tn糖残基。
[0818]
还从crb设计并订购了在文献中报道的表位处含有丝氨酸和苏氨酸残基的stn糖残基的生物素化20聚体氨基酸肽。
[0819]
这些肽的序列在下文详述并在图5中显示。
[0820]
最初，仅订购了tnmuc1(36-2)和muc1(36-4)肽。由于它们在水溶液中的溶解度未知，这些初始肽在75％dmso/25％pbs中复溶至5mg/ml。从使用muc1和tnmuc1肽的初步实验来看，因为在用于测定之前在缓冲液中进行了如此大的稀释，所以dmso是无害的。因此，为了提高稳定性，所有剩余的肽、stnmuc1(35-1)和差异糖基化的tnmuc1肽(96-1、96-2)在后续日期订购，在100％dmso中复溶并在无菌条件下等分。复溶溶液的这种差异对测定中的肽没有影响。所有肽等分试样均储存在-80℃直至用于实验。
[0821]
t细胞制备
[0822]
将一瓶冷冻的t细胞在室温下半解冻，然后转移到10ml冰冷的细胞培养基中。将t细胞在室温下以300xg离心10分钟，然后重悬于15ml冷pbs中。反复离心后，将t细胞重悬于2ml室温细胞培养基中。计数t细胞并将细胞浓度调整为1x106个细胞/ml。然后将t细胞添加到肽包被的板上。
[0823]
实验方案
[0824]
t细胞表面的car检测
[0825]
为了确认t细胞上的car表达，通过流式细胞术分析t细胞的zsgreen表达。简而言之，将100μl t细胞样品转移至96孔v型底板并在macs quant 10(miltenyi)流式细胞仪上进行分析。
[0826]
肽测定
[0827]
在测定的第一天，将链霉亲和素高结合96孔板平衡至室温并用150μl pbs/孔洗涤3次。在pbs中以2μm的储备浓度制备肽用于测定，然后进行1比2连续稀释，涵盖0.5至0.0078μm的浓度范围。然后将生物素化的muc1肽添加到测定板(100μl/孔)并在室温下孵育1.5小时。孵育后，如上所述将板洗涤3次。此时，将tnmuc1 car t细胞添加到板中，每孔100μl中1x105个细胞。然后将板在37℃和5％co2下孵育24小时。
[0828]
第二天，将板以300g旋转5分钟。收集上清液并储存在-80℃以通过msd进行后续ifnγ分析。
[0829]
通过msd的ifnγ产生分析
[0830]
储存的上清液在室温下解冻。根据制造商的说明制备样品和校准品，并将25μl每个样品添加到msd板中。在板的相对侧一式两份地添加校准品。将板密封并在室温下振荡孵育。使用洗板机将板用pbs+0.5％吐温(sodexo)洗涤3次。检测抗体在稀释剂100中稀释。添加25μl检测抗体后，将板密封并在室温下振荡孵育1.5小时。如前所述洗涤板。将150μl 2x读取缓冲液添加到每个孔中，然后在msd sector 600imager上读取。
[0831]
肽
[0832][0833][0834]
car t细胞
[0835][0836]
数据分析
[0837]
流式细胞术数据分析
[0838]
数据在macs quantify 2.8.1618.16380软件上分析。
[0839]
ifnγ数据分析
[0840]
初始ifnγ量化计算在msd discovery workbench 4.0.12.12(msd)上进行。然后将数据传输到graphpad prism 8.0.2(graphpad software,inc)进行绘图分析。
[0841]
在r版本3.5.1中进行了统计分析。使用lme4包拟合混合模型，使用emmeans包计算边际均值和线性对比。随机截距包括供体、板和实验日期。固定的相互作用效应适用于浓度、处理和肽。为了减少异方差，使用反双曲正弦变换(为了处理零点)对浓度进行了变换，
并且在建模之前对ifnγ释放进行了log10变换。这些被反向转换以显示可解释的结果。使用具有4个自由度的自然样条(使用aic确定)对反双曲正弦变换浓度进行建模。剂量反应曲线之间的线性对比，对于未转导的t细胞(ut)和mb024之间、每对肽之间的ifnγ释放差异(作为倍数变化)，在原始实验中使用的浓度下计算并表示为倍数变化以及fdr校正的p值。
[0842]
结果
[0843]
zsgreen转导效率分析
[0844]
mb024和cd19 car t细胞与zsgreen标签共表达，用于分析t细胞上的car表达。供体90774、92187和92205显示出从25％到30％的转导水平。供体92804的转导率更高，呈现为对mb024为55％以及对cd19 car-t为58％。
[0845]
需要注意的是，来自供体90774的cd19 car的转导非常差(3％)。这可能是由于转导期间或流式测定期间的技术错误。
[0846]
肽刺激ifn-g激活
[0847]
图29显示在完全糖基化的tnmuc1肽(65-1)、差异糖基化的tnmuc1肽1(96-1)和stn肽(35-1)存在下mb024 car t细胞的特异性ifnγ释放。在该测定中观察到供体之间的变化。观察每个供体的剂量应答曲线。在四个不同的供体中检测到的最大ifnγ范围为1000至4000pg/ml。
[0848]
当与非糖基化muc1肽(36-4)和差异糖基化tnmuc1肽2(96-2)(其中存在据报道scfv蛋白不结合的tn糖(tarp，sorensen等人，2007))共培养时，tnmuc1 car t细胞未显示ifnγ释放。
[0849]
此外，我们对所有供体进行了ifnγ释放的荟萃分析(表24和表25)。比较每个t细胞组(未转导、mb024和car19)中的所有肽，显示在stnmuc1(35-1)与tnmuc1(65-1)和tnmuc1肽1存在下t细胞释放ifnγ的微小差异(96-1)。这种差异在0.015和0.03μm的肽浓度下是显著的，其中p值《0.0001(表25)。
[0850]
p值计算还显示tn muc1肽2(96-2)、完全糖基化tnmuc1肽(65-1)和stn muc1(35-1)之间存在显着差异(p值》0.0001)；并且与未糖基化的muc1(36-4)(表24)没有差异，统计学上证实tnmuc1肽2不能激活car t细胞。
[0851]
表24：对mb024与muc1的ifnγ应答
[0852]
[0853][0854]
表25：对mb024与tnmuc1的ifnγ应答
[0855]
[0856][0857]
讨论
[0858]
肽刺激测定的设计旨在分析：(i)tn和stn muc1肽存在下t细胞激活的差异；(ii)tnmuc1 car识别随机tn正序列的能力。
[0859]
本研究中的数据显示，在stnmuc1(35-1)和tnmuc1(65-1)的浓度非常低(0.015和0.03μm之间)时，mb024 car t细胞的ifnγ释放存在显著差异。这支持来自biacore测定的数据，该数据显示用于生成mb024的scfv可以与stnmuc1结合，但具有比与tnmuc1的结合更低的亲和力。然而，在高于0.03μm的浓度下，这种差异会消失，这表明在tn或stn muc1存在
下，超过某个阈值时mb024将被同样地激活。
[0860]
了解car对其靶标的特异性对于t细胞免疫疗法的安全性至关重要。肽刺激测定的结果表明，当与tnmuc1肽2(96-2)共培养时，mb024 car t细胞没有被激活。该肽在随机序列中而不是在表位中包含tn糖。下一步将评估tn糖基化阳性的同源序列，以充分确认tnmuc1 car对tn/stn muc1的特异性。
[0861]
总之，这项研究证实了biacore数据，并揭示了在肽浓度较低的情况下，car在tn存在下比stn muc1存在下释放更多的ifnγ。另外，随机tn阳性序列无法激活mb024。
[0862]
实施例13
–
在与tn/stnmuc-1阳性和阴性靶细胞系共培养中评估人源化5e5 car t细胞候选的tn/stnmuc-1特异性
[0863]
本研究的目的是通过评估car t细胞与t细胞白血病细胞jurkat克隆e6-1和用cosmc转导的jurkat共培养时的激活来确定4种人源化5e5 car t候选细胞(mb021、mb022、mb024和mb025)对细胞表面tn/stnmuc-1的靶标特异性。
[0864]
方法
[0865]
实验准备
[0866]
人源化5e5 car t细胞生成
[0867]
如前所述生成car-t细胞。
[0868]
细胞系生成
[0869]
通过用pg3.pgk.cosmc.izw慢病毒载体以四个moi(1,3,5&10)转导来修饰jurkat克隆e6-1细胞以表达cosmc基因。流式细胞术用于评估tn/stnmuc-1的转导效率和细胞表面表达。选择以moi为10的cosmc转导的jurkat的合并群体，随后作为tn/stnmuc1阴性细胞系用于与car t细胞共培养。
[0870]
t细胞解冻和复苏
[0871]
将1ml冷冻t细胞等分试样在室温下半解冻，然后转移到15ml冷细胞培养基中。将t细胞在室温下以300xg离心10分钟，然后重悬于15ml冷细胞培养基中。反复离心后，将t细胞重悬于2ml温(37℃)细胞培养基中。计数t细胞并将细胞浓度调整为2x106个细胞/ml。t细胞在37℃和5％co2的加湿培养箱中的6孔平底细胞悬浮板中含有100u/ml il-2的培养基中培养24小时。
[0872]
细胞表面tn/stnmuc-1、muc-1、stn和tn染色用于流式细胞术分析
[0873]
jurkat wt和jurkat cosmc+细胞系用facs缓冲液(dpbs+2％fbs+0.05％叠氮化钠)洗涤两次。1x105个细胞分别对于tn/stnmuc-1、muc-1、总stn和总tn进行染色。tn/stnmuc-1、muc-1和stn间接染色；在50μl用facs缓冲液中稀释的一抗中进行染色，并在室温下于黑暗中孵育45分钟。然后用facs缓冲液洗涤细胞两次，然后加入50μl用facs缓冲液稀释的brilliant violet 421
tm
山羊抗小鼠二抗，并在室温下于黑暗中孵育45分钟。用dpbs再洗涤细胞两次，然后重悬于100μl含有稀释至1:2000的sytox advanced活性染料的dpbs中。tn直接染色；在50μl用facs缓冲液中稀释的抗体中进行染色，并在室温下于黑暗中孵育45分钟。然后用facs缓冲液洗涤细胞两次，然后重悬于100μl含有稀释至1:2000的sytox orange活性染料的dpbs中。样品在lsrii细胞仪上运行。bd cs&t珠用于在获取数据之前评估细胞仪性能。
[0874]
实验方案
[0875]
共培养设置
[0876]
通过将所需数量的car t细胞添加到2x10
5 jurkat wt或2x10
5 jurkat cosmc+肿瘤细胞系中，在平底48孔板中以1:1的car-t：靶细胞比率设置共培养。car-t：靶细胞比率是根据car-t细胞的转导效率百分比计算的，其中转导效率在不同car t细胞之间归一化(参见实验准备中的人源化5e5 car t细胞生成)。将共培养物在37℃和5％co2的加湿培养箱中培养24小时。在24小时时收集200μl上清液，然后在-80℃下冷冻用于随后的细胞因子测量。
[0877]
上清细胞因子检测-细胞因子珠阵列(cba)测定
[0878]
bd
tm
cba人th1/th2细胞因子试剂盒ii和bd
tm
cba人颗粒酶b flex set d7组合成一个多重测定，用于分析il2、il4、il6、il10、ifnγ、tnfα和颗粒酶b的上清细胞因子水平。通过将每个试剂盒中提供的每种细胞因子的冻干蛋白混合并在1ml细胞培养基(用作测定稀释剂)中复溶来制备测定最高标准品。最高标准品在细胞培养基中1:2连续稀释11倍，以创建范围为10,000
–
0pg/ml的测定标准品。仅细胞培养基用作测定背景。上清液使用细胞培养基以1:2稀释。将4μl cba人th1/th2细胞因子试剂盒ii捕获珠(含有所有6种细胞因子的捕获珠)和0.5μl cba人颗粒酶b flex set d7捕获珠(以1:50稀释颗粒酶b捕获珠)用于每个测试样品。还通过将25μl cba人th1/th2细胞因子试剂盒ii pe检测试剂与0.5μl cba人颗粒酶b flex set d7 pe检测试剂(以1:50稀释颗粒酶b pe检测试剂)混合制备pe检测试剂预混液用于每个测试样品。将25μl捕获珠预混液和25μl pe检测试剂预混液同时添加到50μl上清液和50μl测定标准品中。将板密封并在室温下于黑暗中振荡(600rpm)孵育3小时。加入100μl cba人th1/th2细胞因子试剂盒ii洗涤缓冲液洗涤板，并以300xg离心5分钟。重复洗涤，然后重悬于60μl洗涤缓冲液中并在lsrii细胞仪上运行。bd cs&t珠用于在获取数据之前评估细胞仪性能。
[0879]
用于流式细胞术的抗体和活性染料
[0880]
[0881][0882]
数据分析
[0883]
使用flowlogic 7.2.1软件分析流式细胞术数据，产生主要指标和图表。在microsoft excel和graphpad prism 7中分析来自细胞因子珠阵列测定的指标。使用graphpad prism 7绘制结果。
[0884]
graphpad prism 7用于使用多项式：二阶(y＝a+b*x+c*x^2)非线性曲线拟合模型计算标准曲线。来自标准曲线的插值用于确定以pg/ml为单位的上清细胞因子的浓度。
[0885]
结果
[0886]
肿瘤细胞系的表征
[0887]
jurkat wt(cosmc-)细胞对细胞表面tn/stnmuc-1表达为100％阳性，相比之下jurkat cosmc+细胞上的表达为1％。hmfg2抗体检测到的muc-1表达在jurkat wt和jurkat cosmc+细胞系中均较低，分别为约10％和5％。
[0888]
细胞因子对tn/stnmuc-1阳性肿瘤细胞的应答
[0889]
所有4种人源化car-t细胞都分泌细胞因子和颗粒酶b以响应与tn/stnmuc-1阳性的jurkat wt(cosmc-)肿瘤细胞的共培养(图30)。与mb021和mb024 car-t细胞相比，mb022和mb025 car-t细胞显示出更强的应答，其中在共培养24小时后在上清液中检测到更高的细胞因子和颗粒酶b水平。mb021和mb024 car t细胞在释放的细胞因子和颗粒酶b的平均水平上具有相当的概况。mb022和mb025显示出一些相似性，但总体而言，与mb022相比，mb025具有更高的细胞因子和颗粒酶b释放，并且是所有4种car构建体中最高的释放。没有应用统计分析。
[0890]
细胞因子对tn/stnmuc-1阴性肿瘤细胞的应答
[0891]
所有4种人源化car t细胞均未显示响应于与tn/stnmuc-1阴性的jurkat cosmc+肿瘤细胞的共培养的细胞因子或颗粒酶b释放。在与jurkat cosmc+的共培养物中检测到的细胞因子和颗粒酶b水平与在单独培养的car-t细胞中检测到的相当。car构建体之间没有观察到差异。没有应用统计分析。
[0892]
讨论
[0893]
所有4种人源化5e5 car t细胞都对表达tn/stnmuc-1的肿瘤细胞显示出抗原特异性反应性。基于评估的细胞因子，所有4种car t细胞均显示出强烈的th1、肿瘤介导的应答，并释放高水平的ifnγ、tnfα、il-2以及颗粒酶b。在测试的4种car构建体中，mb025对抗原刺激显示出最强总体应答，特别是产生大量的颗粒酶b。
[0894]
除了证明抗原特异性外，所有4种人源化5e5 car t细胞均未显示出对tn/stnmuc-1阴性细胞的脱靶反应性，其细胞因子和颗粒酶b水平与单独培养的car-t细胞相当。这共同
证明了所有4种人源化5e5 car-t细胞候选在本系统中既有效又安全。
[0895]
cosmc是t合酶功能所必需的t合酶伴侣蛋白。t合酶催化tn抗原延伸为对正常细胞典型的复杂o-聚糖结构。cosmc的引入消除了jurkat细胞中内源性tn/stnmuc1的表达。这是通过作为恢复正常细胞糖基化结果的tn和stn表达的丧失来介导的。tn/stn糖型的丧失以及随后tn/stnmuc-1表达的丧失减弱了所有4种car-t细胞的激活，该激活显示这些car的特异性并且部分由tn和/或stn识别驱动。有趣的是，这些car-t细胞使用mcf7 muc1 ko细胞(也是tn/stnmuc1-)攻击显示出mb022和mb025而不是mb021或mb024的非特异性应答，其中mb022和mb025在24小时共培养后产生高水平的ifnγ和颗粒酶b。在mcf7细胞中敲除muc-1提供了研究car特异性的模型，其中通常在mcf7 wt细胞上表达的tn/stnmuc-1的识别随着muc-1表达的丧失而被消除。然而，muc-1的缺失并不能解决异常糖基化以及tn和stn在其他蛋白质(如其他粘蛋白)上表达的可能性。因此，mb022和mb025对mcf7 muc-1ko细胞的反应性可能是识别除muc-1以外的其他蛋白质上的tn或stn的结果。这也可以解释与mb021和mb024相比，mb022和mb025对jurkat wt细胞的更高的细胞因子和颗粒酶b应答。
[0896]
除了表征jurkat细胞上的tn/stnmuc-1表达外，还测定了总muc-1表达。在jurkat wt(cosmc-)和jurkat cosmc+细胞中，显示总muc-1表达显著低于tn/stnmuc-1表达。预计总muc-1将以与tn/stnmuc-1相同或更高的水平表达。然而，在jurkats细胞中一直观察到这种情况。hmfg2是用于确定muc-1表达的单克隆抗体，通过识别muc-1肽dtr基序获得特异性，而5e5识别对muc-1肽上的tn/stn聚糖特异的糖肽表位。总muc-1和tn/stnmuc-1之间的差异很可能与hmfg2和5e5对muc-1的不同结合表位有关。hmfg2结合的缺乏也可能是jurkats固有的，因为hmfg2的使用在其他细胞系中更可预测。muc-1聚类、构象或肽序列都可以是促成因素。还显示出hmfg2结合受muc1的糖基化状态的影响。尽管如此，基于5e5对muc-1上的tn/stn的特异性，我们确信muc-1在jurkat细胞上表达并被tn/stn糖型异常糖基化。
[0897]
总之，已经证明所有4种人源化5e5 car t细胞都非常有效，如通过对tn/stnmuc-1阳性肿瘤细胞的强烈th1应答所证明的。此外，所有这些都将正常组织固有的复杂聚糖与肿瘤特异性截短的tn/stn糖型区分开来。
[0898]
实施例14
–
人源化tnmuc1 car t产品的多功能性评估
[0899]
本研究的目的是评估tnmuc1 car t细胞响应于抗原攻击分泌一系列功能性细胞因子的能力，功能性细胞因子包括白细胞介素2(il2)、ii型干扰素(ifnγ)、肿瘤坏死因子α(tnfα)和颗粒酶酶b(grz b)。设计改进的方案以将细胞表面、细胞内染色(ics)和上清细胞因子测量结合在一起，为人源化car产品构建完整的细胞因子概况。ics用于检查tnmuc1 car t细胞在与阳性细胞系mda-mb-468共培养24小时后能够以何水平分泌效应细胞因子(grzb、ifnγ、tnfα)和刺激性(il-2)细胞因子(与阴性细胞系mcf7-ko相比)。细胞计数珠阵列(cba)和luminex测定用于关联在与mda-mb-468共培养后24小时后上清液中grzb、ifnγ、tnfα和il-2(以及作为cba测定的附加细胞因子的il-4、6、10)的实际分泌细胞因子量(与mcf7-ko相比)。
[0900]
方法
[0901]
实验准备
[0902]
t细胞解冻和复苏
[0903]
在转导后第12天，所测试的t细胞是未转导的t(ut)细胞和hucar021、022、024和
025(在构建体中具有zsgreen基因表达的tnmuc1 5e5 car t的人源化形式)细胞。将来自三个供体(n＝3)的冷冻纯化的人源化car t细胞的1ml等分试样在室温下半解冻，然后转移到15ml冷细胞培养基中。t细胞在室温下以300xg离心10分钟，然后重悬于15ml冷细胞培养基中。反复离心后，将t细胞重悬于2ml温(37℃)细胞培养基中。计数t细胞并将细胞浓度调整为2x106个细胞/ml。t细胞在37℃和5％co2的加湿培养箱中的6孔平底细胞悬浮板中含有100u/ml il-2的培养基中培养24小时。
[0904]
肿瘤细胞铺板和共培养设置
[0905]
收获人乳腺癌mda-mb-468和mcf7 muc1 ko细胞并重悬于温细胞培养基中，并且在添加人源化car t细胞之前，将mda-mb-468和mcf7 muc1 ko细胞以每孔1x106个细胞铺板在6孔板中过夜。对于共培养，通过将未转导的t细胞或转导的hucar t细胞以1:1的效应物：靶标比率添加到含有肿瘤细胞的6孔板中对板进行设置。t细胞的确切数量是根据每个car t细胞的转导效率百分比计算的，其中通过添加ut细胞将转导效率归一化为所有四种人源化car-t构建体的最低百分比。转导效率显示为通过流式细胞术分析确定的zsgreen阳性细胞的百分比。将共培养物在加湿培养箱中在37℃和5％co2下培养24小时。第二天，收集500μl上清液，然后在-80℃中冷冻以进行后续细胞因子分析。然后将细胞内蛋白质转运抑制剂brefeldin a(bfa)单独添加到t细胞中，并以1:2000的稀释度将其添加到共培养样品中以实现细胞内细胞因子染色。在37℃和5％co2下进一步孵育4小时。随后，收集每个样品中的所有细胞用于细胞表面标记和细胞内细胞因子染色。
[0906]
mda-mb-468和mcf7 muc1 ko细胞的额外孔在染色的同一天进行铺板，以评估铺板24小时后的细胞表面tn/stnmuc1和muc1表达。在铺板时，还对mda-mb-468和mcf7 muc1 ko细胞的tn/stnmuc1和muc1表达进行了表征。
[0907]
细胞表面tn/stnmuc1和muc1表达
[0908]
将mda-mb-468和mcf7 muc1 ko细胞从培养瓶中分离，然后用dpbs洗涤两次。然后通过加入50μl在facs缓冲液中稀释的一抗，并在室温下于黑暗中孵育45分钟分别对1x105个细胞进行细胞表面tn/stnmuc1和muc1染色。然后用facs缓冲液洗涤细胞两次，然后加入50μl用facs缓冲液稀释的brilliant violet 421
tm
山羊抗小鼠二抗，并在室温下于黑暗中再孵育45分钟。用dpbs再洗涤细胞两次，然后重悬于100μl含有稀释至1:2000的sytox advanced活性染料的dpbs中，然后在5激光lsr ii细胞仪上运行。
[0909]
细胞仪设置和补偿
[0910]
每天使用cs&t珠来评估细胞仪性能并为准确的应用程序设置提供信息，以便在每个时间点对齐数据采集。在facsdiva中采集样品数据之前，使用分别用每种抗体荧光染料缀合物染色的invitrogen ultra comp ebeads计算补偿。
[0911]
实验方案
[0912]
fc阻断和细胞表面染色
[0913]
收集细胞后，所有样品用dpbs洗涤两次，然后用100μl在dpbs中以1:2000稀释的活性染料zombie aqua染色，并在室温下于黑暗中孵育15分钟。car-t细胞在染色后用dpbs洗涤两次。然后通过将细胞重悬于40μl以1:50稀释(储备浓度：5mg/ml)的含有过量的无关人igg同种型对照的facs缓冲液中室温于黑暗中孵育15分钟进行fc受体阻断。然后在室温下于黑暗中加入40μl含有在facs缓冲液中稀释的cd3和cd8抗体-荧光染料缀合物的2x浓缩抗
体混合物30分钟对car-t细胞进行染色。
[0914]
细胞内细胞因子染色
[0915]
在细胞表面染色孵育后，car t细胞用200μl facs缓冲液洗涤两次，然后在100μl bd fix/perm缓冲液中于4℃于黑暗中固定20分钟。然后用100μl dpbs洗涤car t细胞两次，并在200μl bd perm/wash缓冲液中洗涤后透化。然后用50μl在bd perm/洗涤缓冲液中稀释的含有所有细胞内细胞因子(il-2、ifnγ、tnfα、gmzb)抗体-荧光染料缀合物的抗体混合物对car t细胞进行染色，并在室温下于黑暗中孵育45分钟。car t细胞用200μl bd perm/洗涤缓冲液再洗涤两次，然后重悬于100μl dpbs中。样品在lsrii细胞仪上进行分析。
[0916]
使用细胞因子珠阵列(cba)测定检测上清细胞因子
[0917]
将bd
tm
cba人th1/th2细胞因子试剂盒ii和bd
tm
cba人颗粒酶b flex set d7组合成一个多重测定，用于分析il2、il4、il6、il10、ifnγ、tnfα和颗粒酶b的上清细胞因子水平。冷冻的上清液在室温下解冻。通过将每个试剂盒中提供的每种细胞因子的冻干蛋白混合并在1ml细胞培养基(用作测定稀释剂)中复溶来制备测定最高标准品。测定最高标准品在细胞培养基中连续稀释以产生测定标准品。将50μl上清液和测定标准品转移至96孔v底板进行测定。将4μl cba人th1/th2细胞因子试剂盒ii捕获珠和0.5μl cba人颗粒酶b flex set d7捕获珠(以1:50稀释颗粒酶b捕获珠)用于每个测试样品。还通过将25μl cba人th1/th2细胞因子试剂盒ii pe检测试剂与0.5μl cba人颗粒酶b flex set d7 pe检测试剂(以1:50稀释颗粒酶b pe检测试剂)混合制备pe检测试剂预混液用于每个测试样品。将25μl的捕获珠预混液和25μl的pe检测试剂预混液同时添加到上清液和测定标准液中。将板密封并在室温下于黑暗中振荡(600rpm)孵育3小时。加入100μl cba人th1/th2细胞因子试剂盒ii洗涤缓冲液洗涤板，并以300xg离心5分钟。重复洗涤然后重悬于60μl洗涤缓冲液中，然后在lsrii细胞仪上运行。
[0918]
使用luminex测定检测上清细胞因子
[0919]
使用测定试剂盒中提供的pcr 8试管条以4倍连续稀释复溶抗原标准组。将96孔板连接到手持式磁性洗板机上。首先将磁珠溶液涡旋30秒，然后将50μl磁珠溶液添加到板中，并用150μl洗涤缓冲液(1x)洗涤一次。将板从手持式磁性洗板机中取出，将50μl标准品、对照品或样品添加到每个孔中，然后密封，在室温下振荡孵育120分钟。孵育后，将96孔板放回手持式磁性洗板机上，并用150μl洗涤缓冲液(1x)洗涤两次。接下来，加入25μl检测抗体混合物，密封并在板振荡器上以500rpm在室温下孵育30分钟。将板放回手持式磁性洗板机上并用150μl洗涤缓冲液(1x)洗涤两次。加入50μl链霉亲和素-pe溶液，密封并在板振荡器上以500rpm在室温下孵育30分钟。最后，将板放回手持式磁性洗板机上，用150μl洗涤缓冲液(1x)洗涤两次，然后每孔加入120μl读取缓冲液，密封并室温下振荡5分钟，然后放入luminex
tm
仪器“bio-plex 3d悬浮测定系统”进行数据采集。
[0920]
数据分析
[0921]
使用flowlogic 7.2.1软件分析流式细胞术数据，产生主要指标和图表。在microsoft excel和graphpad prism 7中分析指标。门控策略：在转导的(zsgreen+)和未转导的(zsgreen
–
)t细胞群中比较cd4+和cd8+t细胞亚群。仅显示car t细胞的转导群体数据。将百分比和中值荧光强度值作为主要指标导出。graphpad prism 7用于绘制代表来自4个供体的结果的指标。
[0922]
对于cba测定：graphpad prism v7软件用于使用多项式：二阶(y＝a+b*x+c*x^2)非线性曲线拟合模型计算标准曲线。
[0923]
来自标准曲线的插值用于确定以pg/ml为单位的细胞因子的浓度。
[0924]
对于luminex测定：luminex xponent v4.2软件用于在机器上获取数据，bioplex manager v6.1用于分析包括标准曲线生成和通过标准曲线插值计算的样品浓度(以pg/ml为单位)的数据。在graphpad prism中进行绘图以进行样品比较。
[0925]
结果
[0926]
转导效率(te)和cd4+/cd8+比率
[0927]
与单一培养样品相比，在与两种肿瘤细胞系(mda-mb-468和mcf7muc1 ko)共培养24小时后，所有四种hucar的te(基于zsgreen阳性细胞百分比)略有下降(图31a左图和中图)。与单一培养样品相比，在与两种肿瘤细胞系共培养24小时后，所有四种hucar的转导cd4+/cd8+比率没有明显变化。然而，在未转导的t细胞样品中存在更多的cd8+细胞(约70％)，而所有转导的样品中的大多数细胞是cd4+细胞(图31a右图)。
[0928]
细胞内细胞因子分析
[0929]
为了评估细胞因子的表达水平，在单次培养或与tnmuc1阳性细胞系mda-mb-468或阴性细胞系mcf7-ko共培养t细胞后24小时进行细胞内染色。表达水平通过细胞的阳性百分比和阳性程度评估，以中值荧光强度(mfi)表示(图31，b&c)。总体而言，所有四种hucar响应于mba-mb-468的tnmuc1特异性抗原攻击对所有测试的细胞因子都显示出相似的表达模式。在没有来自肿瘤细胞(即仅t细胞)的情况下，mb022和mb025的应答略高于mb021和mb024。具体而言，与cd8+亚群相比，il-2在cd4+亚群中显示约两倍量的tnmuc1诱导的特异性百分比表达。与cd4+亚群相比，ifnγ在cd8+亚群中显示约两倍量的tnmuc1特异性表达。tnfα在cd4+亚群和cd8+亚群中表现出相似的趋势。如预期的那样，颗粒酶b主要在所有cd8+亚群中表达，甚至在没有刺激的情况下，一个供体74也显示出高组成水平的颗粒酶b。对于mb021和mb024，对mcf7-ko系的应答与mda-mb-468相似，而mb022和mb025对所有细胞因子和cd4+和cd8+t细胞的颗粒酶b的应答约是mcf7-ko系的两倍。在组间观察到mfi的类似趋势，尽管与显示为百分比表达的数据相比，其效果更为适中和易变。
[0930]
上清细胞因子分析
[0931]
为了评估t细胞在上清液中分泌的实际细胞因子分泌量，我们使用了两种技术，即细胞因子珠阵列(cba)测定和luminex测定(图32a-32b)。总体而言，两种测定均显示，与在没有肿瘤细胞的情况下培养的hucar相比，在与该tnmuc1阳性细胞系共培养后，所有四种hucar都分泌细胞因子以响应mda-mb-468的tnmuc1特异性抗原攻击。然而，当与tnmuc1阴性细胞系mcf7-ko共培养时，mb022和mb025表现出比mb021和mb024相对更高的应答。
[0932]
在与mda-mb-468共培养的tnmuc1特异性激活后，car-t细胞之间的il-2、ifnγ、tnfα和颗粒酶b分泌水平相似，显著高于ut和t细胞单独样品。值得注意的是，与任何其他样品条件相比，与mda-mb-468肿瘤细胞共培养的所有4种hucar中的il-6具有显著更高的分泌。使用cba分析和luminex分析系统观察到了相似的结果。
[0933]
肿瘤细胞系的表征
[0934]
为了表征细胞系，我们将其用于测定，我们还在ics和上清液收集之前使用5e5-cb抗体评估了tnmuc1表达水平并且使用hmfg2抗体评估了muc1表达。流式细胞术分析显示，
mda-mb-468细胞具有约10％tnmuc1阳性细胞，而mcf7-ko细胞对muc1和tnmuc1表达均为阴性(图33)。
[0935]
讨论
[0936]
car t疗法的成功取决于涉及一系列效应细胞和机制的广泛免疫应答。据报道，car t细胞疗法中的高度多功能t细胞与临床应答显著相关。最近的研究表明，多功能的和未耗竭的t细胞，尤其是干细胞记忆细胞，对于延长治疗的持续性至关重要。评估了人源化tnmuc1 car t细胞分泌四种功能性细胞因子(包括刺激性细胞因子-il-2、效应细胞因子-ifnγ、tnfα和细胞毒性颗粒酶-grzb)的能力。通过与tnmuc1阳性mda-mb-468或阴性mcf7-ko细胞系共培养比较了它们响应于抗原攻击的分泌水平。单独培养样品用作基础水平比较。还将细胞表面、细胞内染色(ics)和上清细胞因子测量结合在一起为人源化car产品构建了完整的细胞因子谱。ics用于检查t细胞产品在与阳性和阴性细胞系共培养24小时后能够分泌什么-il-2、grzb、ifnγ和tnfα。细胞计数珠阵列(cba)和luminex测定用于关联这些细胞因子在与mda-mb-468和mcf7-ko细胞共培养后24小时在上清液中的实际分泌细胞因子量。在与mda-mb-468肿瘤细胞共培养的所有四种hucar中，炎性细胞因子il-6的分泌明显高于任何其他样品条件，如果它是由t细胞分泌的，则可能表明其具有抗肿瘤作用。但它也可能由mda-mb-468肿瘤细胞本身分泌。il-6是多功能细胞因子，由于其广泛的免疫和造血活性以及诱导急性期应答的强大能力，在宿主防御中起核心作用。越来越多的证据表明，il-6是主动免疫应答过程中淋巴细胞激活、增殖和存活的关键因素。
[0937]
四种测试的hucar的t细胞多功能性测定的一般总结如下表26所示。该表显示了在考虑细胞能够在细胞内分泌什么与上清液中的实际分泌后，四种检查的细胞因子的总体表达水平。总体一致的趋势是细胞能够分泌的越多，在上清液中观察到的实际分泌越多。我们观察到mb022和mb025似乎对没有muc1和tnmuc1的表达的阴性细胞系mcf7-ko具有非常高的非特异性。相比之下，mb021和mb024对tnmuc1表现出相对较高的特异性，如在car-t细胞与muc1阴性细胞系-mcf7-ko共培养时，分泌的细胞因子显著较低的水平所证明。
[0938]
表26：hucar mb021、mb022、mb024和mb025的t细胞多功能测定总结
[0939][0940]
了解关键细胞因子的复杂多功能性以及分析细胞表面表型生物标志物将有助于
确定它们与car t疗法中患者应答的关系。例如，虽然il-2可以在体内支持car t细胞，并且已经在临床前和许多临床试验中进行了测试，但据报道其实际上可能优先激活和诱导treg的增殖。这些数据突出了il-2在car t疗法中的复杂作用。其它将多功能性与t细胞亚群关联的研究表明，多功能cd4+t细胞(ifnγ+/il2+/tnfα+)与膀胱癌患者的无复发生存率显著相关。此外，高度多功能的t细胞应与其增殖潜力和凋亡率相关。例如，由于高度多功能的记忆t细胞据报道可能共同产生许多细胞因子(如ifnγ、tnfα和il-2)，因此它们可以变成细胞溶解性并强烈增殖。这些细胞还具有相当大的存活能力，并且可以在没有抗原的情况下长期维持。
[0941]
使用多功能强度指数等测量的进一步应用将把高维、单细胞蛋白质分泌数据整合到代表检查样品的整体活性的单一的指标中。这些测量有助于揭示car t细胞亚群的可能相关性和最终增强先导选择的治疗机制。
[0942]
实施例15：tn-muc1 car-t响应于肿瘤细胞系的体外增殖
[0943]
对car t疗法的临床应答可以部分归因于输注后工程化t细胞在体内的强烈扩增和持久性。因此，增殖可用于测量体外car t细胞的潜在治疗功效。本研究的目的是确定tnmuc1 car-t细胞对表达tn/stn-muc1抗原(“tn-muc1”)的肿瘤细胞系的增殖能力。
[0944]
方法
[0945]
实验准备
[0946]
car t细胞的生成和制备
[0947]
如前所述生成car-t细胞。
[0948]
通过流式细胞术检测细胞表面tn-muc1、muc1和bcma表达
[0949]
用tryple
tm
express从培养瓶中分离细胞系pc3(cosmc ko)5f5克隆(pc3 5f5)、pc3 wt和arh77克隆10b5(arh77 bcma)，并在facs缓冲液(dpbs+2％fbs+0.5％叠氮化钠)中洗涤。然后将细胞以300xg离心5分钟，并在facs缓冲液中重悬至1x106个细胞/ml，以准备染色。1x105个细胞分别用于tn-muc1、muc1(hmfg2)和bcma染色。tn-muc1、muc1间接染色：在50μl用facs缓冲液中稀释的一抗中进行染色，并在4℃于黑暗中孵育45分钟。然后用facs缓冲液洗涤细胞两次，然后加入50μl用facs缓冲液稀释的brilliant violet 421
tm
山羊抗小鼠二抗，并在4℃于黑暗中再孵育45分钟。用dpbs再洗涤细胞两次，然后重悬于含有稀释至1:2000的sytox橙色活性染料的100μl dpbs中。bcma直接染色：在50μl用facs缓冲液中稀释的抗体中进行染色，并在4℃于黑暗中孵育45分钟。然后用facs缓冲液洗涤细胞两次，然后重悬于100μl含有稀释至1:2000的sytox orange活性染料的dpbs中。样品在cytoflex细胞仪上运行。cytoflex qc微珠用于在获取数据之前评估细胞仪性能。
[0950]
实验方案
[0951]
car t/ut t细胞的vpd450增殖染料标记
[0952]
在低il-2中培养48小时后，在15ml falcon中收获t细胞。然后将t细胞在10ml杜氏磷酸盐缓冲盐水缓冲液(dpbs)中洗涤两次，在dpbs中计数并重悬至10x106个细胞/ml的浓度。将在dpbs中稀释的4μm(2x)浓度的vpd450增殖染料添加到t细胞中，使其体积为初始细胞悬液的两倍(vpd450的最终反应浓度为2μm)。未标记的t细胞对照仅与dpbs一起孵育。将t细胞与vpd450在37℃下避光孵育15分钟。孵育后，将t细胞在10ml dpbs中洗涤一次，然后在10ml室温共培养基中洗涤。t细胞在共培养基中孵育15分钟，以允许vpd450染料的乙酸盐水
xr上计数。将细胞以4e6细胞/ml重悬，并将2e6细胞接种到96孔深孔板中。使用转染试剂293fectin用8μg质粒转染细胞。将细胞在37℃和5％co2下孵育72小时。转染后，通过流式细胞仪分析细胞系以确定dcc神经轴突导向因子1受体和用作转染标志物的zsgreen的表达。将细胞溶液样品铺板到v底96孔聚丙烯板中，用facs缓冲液洗涤，并在室温下用50μl的40μg/ml人igg溶液封闭5分钟。细胞用facs缓冲液洗涤，并用50μl 10μg/ml小鼠抗dcc一抗(bd pharmingen，#554223)或50μl 10μg/ml小鼠igg1同种型对照ab在室温(rt)下染色30分钟。细胞用facs缓冲液洗涤两次，并用50μl的5μg/ml apc抗小鼠igg1二抗(biolegend，#406610)在室温下染色30分钟。细胞用facs缓冲液洗涤两次并用100μl的1μg/ml dapi溶液染色，然后使用cytoflex s流式细胞仪或macsquant analyzer 10流式细胞仪进行分析。
[0983]
dcc表达的检测-qpcr
[0984]
基于sybr green的实时qpcr用于dcc mrna表达的相对定量。rna用rneasy plus mini试剂盒(qiagen)提取。然后根据制造商的指南，使用superscript
tm
iv第一链合成系统将总rna逆转录为cdna。针对用作参考对照的内源性actb对转基因衍生的dcc进行量化和归一化。
[0985]
dcc表达的检测-western印迹
[0986]
细胞沉淀在50μl含有蛋白酶抑制剂的ripa缓冲液中冰上裂解，孵育三次，每次5分钟，每次孵育之间涡旋30秒。将细胞裂解物在4℃下以13,000xg离心15分钟，然后将裂解物转移到新试管中，确保没有转移细胞碎片。根据制造商的总蛋白定量方案进行pierce bca测定。根据制造商的方案进行nupage sds电泳。将膜、滤纸和印迹垫在转移缓冲液中浸泡30分钟，并将sds凝胶在转移缓冲液中孵育3分钟。在xcell ii转移模块中设置转移夹层，凝胶在30v和170ma下转移1小时。将膜在pbs中洗涤，在odyssey封闭缓冲液中封闭，然后用一抗染色随后二抗染色，然后使用licor odyssey成像仪和lite studio软件进行成像。
[0987]
hek细胞上tn-muc1和muc1表达的分析
[0988]
将细胞溶液样品置于v底聚丙烯96孔板中，用facs缓冲液洗涤，并在室温下用50μl的40μg/ml人igg溶液封闭5分钟。洗涤细胞并用50μl的1μg/ml 5e5 ab、50μl的2μg/ml hmfg2 ab(absolute antibody，ab.00712-1.1)或50μl的1μg/ml小鼠igg1同型对照ab在4℃染色45分钟。细胞用facs缓冲液洗涤两次，并用50μl的2μg/ml bv421山羊抗小鼠igg二抗(biolegend，405317)在4℃下染色45分钟。细胞用facs缓冲液洗涤两次，并用100μl sytox aadvanced(1比2000稀释液)染色，并在室温下孵育10分钟，然后在cytoflex s流式细胞仪上进行分析。
[0989]
car-t细胞和细胞系的共培养
[0990]
转染后48小时，收获hek细胞(未转染的、zsgreen转染的和dcc-zsgreen转染的)、wt jurkat细胞和cosmc jurkat细胞，计数并用pbs洗涤，然后在rpmi培养基中重悬至2e6细胞/ml的细胞密度。将car t细胞在texmacs培养基中解冻、洗涤并重悬至1e6个细胞/ml的密度。向细胞溶液中加入il-2(终浓度100iu/ml)。将细胞铺板到平底24孔细胞培养板中，每孔加入1e6个细胞，并在37℃和5％co2的加湿培养箱中培养24小时。在24小时的恢复期后，从24孔板中收获t细胞，重新计数，并将来自每个细胞群的6e6细胞转移到15ml管中。将细胞用pbs洗涤两次并重悬于rpmi培养基中以达到2e6细胞/ml的细胞密度。
[0991]
将100μl(每孔2e5个细胞)的细胞系和100μl(每孔2e5个细胞)的t细胞接种到96孔
dickinson所预测的分子量范围(168-175kda)内。
[1002]
共培养和msd
[1003]
单个氨基酸不同的mb051 car-t细胞和mb053 car-t细胞用于共培养测定，其中未转导的t细胞用作对照，以降低可以导致不相关car t细胞群的非预期激活的不相关car和未表征的细胞系之间的未知相互作用的风险。共培养实验的结果表明，mb051和mb053 car t细胞与表达dcc的hek细胞共培养产生大量ifn-γ，其水平是与作为tn-muc1阳性对照的野生型jurkat细胞共培养时产生的ifn-γ量的两倍以上。对于所有供体，当mb051 car t细胞与表达dcc的hek细胞共培养时产生更高的ifn-γ，这可能证明dcc和最初在以上实施例6中筛选的mb051 car t细胞之间的相互作用更强。mb053 car t细胞与表达dcc的t细胞共培养产生的ifn-γ量几乎是mb053 car t细胞与野生型jurkat细胞共培养的两倍，但mb051 car t细胞与表达dcc的hek细胞共培养时产生的ifn-γ比野生型jurkat细胞高4-5倍。
[1004]
如图36所示，当未转导的t细胞与细胞系共培养时，存在ifn-γ产生的背景水平。当mb051和mb053 car t细胞与未转染的和zsgreen转染的hek细胞一起培养时，观察到ifn-γ产生的背景水平增加。当mb051和mb053 car t细胞与dcc转染的hek细胞共培养时，观察到ifn-γ产生的最高峰，其中mb051和mb053 car t细胞的ifn-γ产量分别比未转导的t细胞增加5473倍和3239倍。当mb051和mb053 car t细胞与tn-muc1阳性对照wt jurkat细胞共培养时，ifn-γ产量的倍数变化更低，其中mb051和mb053 car t细胞的ifn-γ产量分别比未转导的t细胞增加1937倍和1280倍。
[1005]
当mb051和mb053 car t细胞与未转染的hek细胞和zsgreen转染的hek细胞共培养时，ifn-γ的背景水平有所增加，这可能表明hek细胞系中的低tn-muc1表达水平。供体pr19x128768和pr19w128773在单独的t细胞群中也具有增加的背景ifn-γ产生，这可能表明这些供体中的低基础激活水平。
[1006]
总之，结果验证了上述实施例6的结果，证实了mb051 car t细胞与dcc的结合。正在进行进一步的研究以研究tn-muc1 car t细胞在dcc的生理水平上的结合，因为这些实验显示dcc处于过表达水平。
[1007]
实施例17:tn-muc1 car-t在cdx nsg小鼠模型中的体内功效
[1008]
本研究的目的是评估tn-muc1 car-t细胞(mb053)在体内诱导靶向杀伤表达tn-muc1的前列腺癌细胞系pc3 5f5的能力。tn-muc1阳性细胞系(pc3 5f5)用作细胞衍生异种移植物(cdx)，植入nsg(nod scid gamma小鼠)小鼠模型中。bcma car-t细胞用作阴性对照。
[1009]
方法
[1010]
肿瘤细胞接种和t细胞给药
[1011]
pc3 5f5前列腺细胞系用于通过向小鼠皮下注射2x106个肿瘤细胞建立肿瘤异种移植模型。通过异氟醚-氧气混合物在室中将动物短暂麻醉并移至面对锥体。右侧后腹剃毛，然后用酒精擦拭。将细胞重悬于pbs中，然后在冰上与基质胶(1:1pbs/细胞：基质胶)充分混合。每只小鼠皮下注射总体积为100ul的基质胶和含有细胞的pbs溶液。
[1012]
当肿瘤可触及(约100mm3)时，car t细胞通过尾静脉注射以每只小鼠1x107个细胞的剂量进行静脉内给药。肿瘤植入后17天，当通过卡尺测量的平均肿瘤体积达到约100mm3时，小鼠通过尾静脉注射以每只小鼠1x107个细胞的剂量静脉内接种mb053 tn-muc1 car-t、pbs或bcma car-t细胞(非相关特异性的car t)。
[1013]
肿瘤测量
[1014]
用卡尺测量所有小鼠的肿瘤大小，每周记录三次，然后每周记录两次体重。使用excel计算肿瘤体积，如下所示：
[1015]
肿瘤体积＝肿瘤长度*(肿瘤宽度^2)*0.5
[1016]
由于终点标准如肿瘤体积，在各个终点处淘汰小鼠并收获组织。对于pbs对照和mb053 car-t细胞组，收集肿瘤和重要器官(肾、心脏、脾、脑和肺)并用10％缓冲福尔马林盐水(bfs)固定最长达48小时以进行组织病理学检查。没有从bcma组小鼠中收集肿瘤或器官。
[1017]
血液收集
[1018]
研究中收集所有小鼠的血液样品两次—肿瘤接种后6天(用作基线)和car t细胞给药后7天，以评估通过car t细胞释放的血液中细胞因子的水平。
[1019]
血清细胞因子测定msd
[1020]
为了评估mb053 tnmuc1 car t细胞和bcma car t细胞分泌的细胞因子水平，从所有小鼠收集两次血液样品(约100μl)。第一次收集在car t细胞给药前的第7天进行并代表基线(第0天)。第二次血液收集在car t细胞给药后7天(第7天)进行。使收集的全血在室温(rt)下凝结至少30分钟。一旦凝结，将血液以12500rpm离心3分钟以获得血清，将其在-80℃冷冻直至用于测定。收集的所有小鼠血清样品在室温中解冻，并根据制造商的说明使用针对il-2、ifn-γ和tnf-α的检测抗体(检测抗体混合物)进行分析。
[1021]
在msd sector 600imager上读取板，并使用r版本3.6.1中的brms包进行数据分析。使用msd外推值分析血清细胞因子浓度变化的量化。这种量化在两个技术复制中重复-即两个单独的板。对照组的许多观察结果非常低，以至于它们低于给定小鼠/时间/细胞因子浓度的定量限(《lloq)。
[1022]
结果与讨论
[1023]
mb053 tnmuc1 car-t细胞对cdx荷瘤小鼠肿瘤生长的影响
[1024]
在给药前一天分别使用流式细胞术和抗fab检测试剂和bcma ab测量mb053 tnmuc1 car t细胞和bcma car t细胞的转导效率。此外，还进行了基本t细胞表型，其中测量了cd3+/cd4+/cd8+群体。两种car t细胞样品均显示出高细胞活力(98-99％)，mb053 car-t细胞的转导效率测定为45.92％，bcma car-t细胞的转导效率测定为74.22％。使用mb053 car-t细胞和bcma car-t细胞之间的ut细胞将转导效率归一化为50％。
[1025]
mb053 car-t细胞具有强大的抗肿瘤作用，如用mb053 car-t细胞处理的荷瘤cdx小鼠的肿瘤体积急剧减少导致肿瘤清除所证明。相比之下，在用pbs或bcmacar t细胞处理的荷瘤cdx小鼠中未观察到肿瘤体积减少或肿瘤清除。事实上，即使在研究终点之前的较早时间点(研究第31天)，用mb053 car-t细胞处理的cdx荷瘤小鼠也显示出肿瘤体积的统计学显著减少(图37)。组织病理学检查证实，肿瘤仅存在于给药pbs或bcma car t细胞的cdx荷瘤小鼠中。相比之下，在用mb053 car-t细胞处理的荷瘤cdx小鼠中，肿瘤部位仅包含胶原蛋白、脂肪组织和骨骼肌的可变混合物但根本没有肿瘤细胞。值得注意的是，将给药bcma car t的cdx荷瘤小鼠与pbs对照组进行比较时，没有观察到肿瘤体积的差异。
[1026]
总体而言，mb053 car t细胞在cdx荷瘤小鼠体内的施用导致肿瘤缩小。将mb053 car t细胞注射到荷瘤小鼠体内导致肿瘤体积快速缩小，从而导致肿瘤完全清除。相比之下，向荷瘤小鼠注射pbs或对照bcma car t(非相关特异性的car)不会导致肿瘤体积减小。
mb053 car t细胞控制肿瘤生长，如卡尺测量所示。有趣的是，甚至在研究终点之前(研究第30天)，与给药bcma car t细胞或pbs对照组的荷瘤cdx小鼠相比，给药mb053car t细胞的荷瘤cdx小鼠的肿瘤体积显著减少。此外，组织病理学检查证实了用mb053 car t细胞处理的荷瘤cdx小鼠的肿瘤部位不存在肿瘤细胞。
[1027]
血清细胞因子释放以评估t细胞激活
[1028]
为了确认mb053 car-t细胞对tn-muc1阳性肿瘤的功能应答，测量了血清中th1细胞因子(ifn-γ、il-2和tnf-α)的水平。通过car t细胞的th1细胞因子分泌表明与car t细胞的靶标和功能性激活有关。发现与第0天的处理前细胞因子水平相比，给药mb053 car-t细胞的cdx荷瘤小鼠的所有三种细胞因子具有更高的水平(图38a)。mb053 car-t细胞组血清中的ifn-γ水平显著高于pbs组血清中的细胞因子水平(图38b)。与处理后的pbs和bcma组相比，在mb053 car-t细胞组中观察到il-2的分泌增加的趋势；然而，分泌的水平相当低并且与生物学无关。总体而言，在所有细胞因子中，ifn-γ分泌水平在mb053 car-t细胞组处理后显示出最显著的增加。
[1029]
这些结果表明，在注射了mb053 car t细胞的小鼠中，在t细胞给药后第7天，ifn-γ和tnf-α的升高的血清水平支持了肿瘤体积减小的结果。ifn-γ和tnf-α的升高的血清水平表明mb053 car t细胞与靶标成功结合，随后的激活导致car t细胞的细胞因子分泌。因此，mb053 car t细胞对植入nsg小鼠的cdx肿瘤表现出高细胞毒功效。
[1030]
通过cd3 ihc检测mb053 car-t细胞在肿瘤和小鼠组织中的分布
[1031]
在用mb053 car-t细胞处理的cdx荷瘤小鼠的肿瘤部位，存在少量的人t淋巴细胞。它们通常以明显随机的方式散布在整个位点中。人t淋巴细胞在用pbs处理的任何cdx荷瘤小鼠的肿瘤中均不存在。还值得一提的是，通过组织病理学评估，没有证据表明mb053 car-t细胞在小鼠组织中存在毒性。此外，在pbs和bcma组中也没有值得注意的微观变化。
[1032]
实施例18:评估tn-muc1 car t对低浓度tn-muc1阳性肿瘤细胞的应答
[1033]
本研究的目的是通过评估与tn-muc1阳性和阴性同基因细胞系共培养24小时后上清液中的干扰素-γ(ifnγ)分泌来测量响应于低水平tn-muc1阳性细胞的mb053 car t细胞的功能活性。
[1034]
方法
[1035]
实验准备
[1036]
car t细胞生成
[1037]
扩增来自3个供体的tnmuc1 car t细胞和ut t细胞，检查转导效率(te)并冷冻。
[1038]
肿瘤细胞系制备
[1039]
pc-3 5f5和jurkat 6e具有超过90％的tn-muc1阳性细胞，并用作阳性对照(100％tn-muc1)。pc-3wt和jurkat cosmc ki具有少于1％的tn-muc1阳性细胞，并用作阴性对照。将同基因pc-3细胞系(pc-3 5f5和pc-3wt)稀释至3x105个细胞/ml，将同基因jurkat细胞系(jurkat 6e和jurkat cosmc ki)稀释至5x105个细胞/ml。
[1040]
生成由20％阳性tn-muc1细胞与80％tn-muc1阴性细胞混合的总体积为10ml的20％tn-muc1阳性的群体。随后对20％tn muc-1阳性细胞群进行四点系列1比2稀释，以获得5ml的10％、5％、2.5％和1.25％tn-muc1阳性条件。然后通过流式细胞术检查tn-muc1在所有生成的细胞系表面上的表达。
[1041]
实验方案
[1042]
t细胞流式细胞术的方案
[1043]
将t细胞(每种条件2x105个细胞)与50μl抗fab(10.4μg/ml)在4℃下孵育45分钟。用facs缓冲液(dpbs、2％fbs、0.05％叠氮化钠)洗涤细胞两次。随后将t细胞与50μl链霉素-pe二抗(1μg/ml)在4℃下孵育45分钟。用facs缓冲液(dpbs、2％fbs、0.05％叠氮化钠)洗涤细胞两次。将细胞用100μl dapi活性染料(1μg/ml)重悬。数据在macsquant分析仪流式细胞仪上获取。使用flowjo进行分析，使用未染色的对照进行门控。使用macsquant校准珠评估细胞仪性能的每日qc。
[1044]
共培养设置方案
[1045]
将每孔100μl 5x10
4 jurkat细胞和每孔3x10
4 pc-3细胞铺板到96孔组织培养板中。将100μl细胞培养基添加到板的所有剩余孔中。在将培养板在37℃、5％co2的加湿培养箱中孵育24小时，然后添加t细胞。
[1046]
mb053 car t细胞和ut t细胞以1:1car-t与靶标比率添加到铺板的靶细胞中，其中效应物数量基于mb053 car t细胞的50％转导效率。ut t细胞的数量等于添加的mb053 car t细胞的总数。将100μl mb053 car t细胞、ut t细胞或培养基添加到96孔细胞培养板中。将培养板在37℃、5％co2的加湿培养箱中孵育24小时，然后进行ifnγ检测。
[1047]
msd测定的方案(ifnγ检测)
[1048]
从含有共培养物的板上收获50μl上清液并转移到96孔v底聚丙烯板中，以300g离心5分钟。上清液在稀释剂2(msd)中以1:30的比例稀释。在稀释剂2中制备ifnγ校准品以生成1230pg/ml的储备液，并在室温下平衡30分钟。将200μl校准品转移到96孔聚丙烯v底板中。随后在稀释剂2中进行8点1比4连续稀释。
[1049]
msd测定板用150μl洗涤缓冲液(pbs，0.05％吐温)洗涤3次，然后晾干30分钟。将25μl稀释的上清液和校准剂量反应曲线转移到各自的msd板上。将板密封并在板振荡器上以每分钟600转(rpm)的速度在室温下孵育2小时。孵育后，将板用150μl洗涤缓冲液洗涤3次。在稀释剂3(msd)中稀释检测抗体，并将25μl抗体转移至msd测定板。将板密封并在板振荡器上以600rpm在室温下孵育2小时。孵育后，将板洗涤3次。在msd sector600imager上读取之前，将150μl 2x读取缓冲液添加到每个孔中。使用用于推断ifnγ浓度的msd discovery软件分析数据。
[1050]
结果与讨论
[1051]
tn-muc1阳性细胞的百分比限定了ifnγ分泌的水平
[1052]
通过分别用tn-muc1阴性细胞系jurkat cosmc ki或pc-3wt稀释tn-muc1阳性细胞系jurkat 6e或pc-3 5f5来实现降低tn-muc1阳性细胞的比率。结果，在jurkat细胞中(tn-muc1阳性细胞：82.7％、19.3％、9.8％、4.8％、2.4％、1.4％、0.05％)和pc-3细胞中(tn-muc1阳性细胞：93％、15％、8％、4％、2.4％、1.6％、0.77％)获得了一系列含有不同水平tn-muc1阳性细胞的混合同基因细胞系(图2)。pc-3wt细胞系(0.77％)和jurkat cosmc ki细胞系(0.05％)中存在一小部分tn-muc1阳性细胞。
[1053]
mb053 car t细胞与一系列混合同基因细胞系的共培养证明了ifnγ的tn-muc1阳性依赖性分泌。相比之下，当这些混合的同基因细胞系与ut t细胞共培养时，没有检测到明显的ifnγ分泌(图39a)。
[1054]
将t细胞产生的ifnγ的浓度转化为倍增反应。简而言之，对于每个混合细胞群共培养，mb053 car t细胞产生的ifnγ量除以其各自的ut t细胞对照产生的ifnγ量。将ifnγ的倍数增加与jurkat细胞(0.05％tn-muc1阳性细胞)和pc-3细胞(0.77％tn-muc1阳性细胞)中的最低百分比tn-muc1阳性条件进行比较。对于jurkat衍生的细胞群，当与单独培养的mb053 car t细胞(仅效应物)相比时，最低tn-muc1阳性细胞群之间没有显著增加。相反，对于pc-3衍生的细胞群，当与仅效应物的应答相比时，最低tn-muc1阳性细胞群之间出现显著增加。所有随后的tn-muc1阳性的增加都使衍生自jurkat和pc-3的所有细胞群的ifnγ水平显著增加。
[1055]
本研究中的数据证实，mb053 car-t细胞可以识别并发挥功能性应答，这是由在极低水平的tn-muc1阳性细胞存在下的ifnγ分泌所限定的。mb053 car-t细胞证明ifnγ分泌的剂量依赖性应答与tn-muc1阳性水平相关，tn-muc1阳性水平与混合同基因细胞群中tn-muc1阳性细胞的数量相关。相较于通过与相同混合细胞群共培养的ut t细胞中所观察到的，mb053 car-t细胞与具有少量tn-muc1阳性细胞(1.4％jurkat；1.6％pc-3)的混合细胞群共培养导致ifnγ释放在统计学上显著增加(图39b)。虽然mb053 car t细胞没有显示响应于tn-muc1阴性jurkat ki细胞系的任何激活，但在与仅有0.77％tn-muc1阳性细胞的pc-3细胞系共培养的mb053 car t细胞中观察到ifnγ释放的统计学显著增加。
[1056]
序列表
[1057]
seq id no:1:mb004 scfv的氨基酸序列
[1058][1059]
seq id no:2:具有信号肽的mb021 scfv的氨基酸序列
[1060][1061]
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[1070][1071]
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[1072]
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[1073]
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[1074]
ggggsggggsggggs
[1075]
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[1076]
kssqsllnsgdqknylt
[1077]
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[1078]
wastres
[1079]
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[1080]
qndysyplt
[1081]
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[1082]
dhaih
[1083]
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[1084]
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[1085]
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[1086]
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[1087]
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[1088]
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[1089]
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[1090]
wastres
[1091]
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[1092]
qndysyplt
[1093]
seq id no:19:mb022 cdrh1的氨基酸序列
[1094]
dhaih
[1095]
seq id no:20:mb022 cdrh2的氨基酸序列
[1096]
hfspgntdikyndkfkg
[1097]
seq id no:21:mb022 cdrh3的氨基酸序列
[1098]
stfffdy
[1099]
seq id no:22:mb023 cdrl1的氨基酸序列
[1100]
kssqsllnsgdqknylt
[1101]
seq id no:23:mb023 cdrl2的氨基酸序列
[1102]
wastres
[1103]
seq id no:24:mb023 cdrl3的氨基酸序列
[1104]
qndysyplt
[1105]
seq id no:25:mb023 cdrh1的氨基酸序列
[1106]
dhaih
[1107]
seq id no:26:mb023 cdrh2的氨基酸序列
[1108]
hfspgntdikyndkfkg
[1109]
seq id no:27:mb023 cdrh3的氨基酸序列
[1110]
stfffdy
[1111]
seq id no:28:mb024 cdrl1的氨基酸序列
[1112]
kssqsllnsgdqknylt
[1113]
seq id no:29:mb024 cdrl2的氨基酸序列
[1114]
wastres
[1115]
seq id no:30:mb024 cdrl3的氨基酸序列
[1116]
qndysyplt
[1117]
seq id no:31:mb024 cdrh1的氨基酸序列
[1118]
dhaih
[1119]
seq id no:32:mb024 cdrh2的氨基酸序列
[1120]
hfspgntdikyndkfkg
[1121]
seq id no:33:mb024 cdrh3的氨基酸序列
[1122]
stfffdy
[1123]
seq id no:34:mb025 cdrl1的氨基酸序列
[1124]
kssqsllnsgdqknylt
[1125]
seq id no:35:mb025 cdrl2的氨基酸序列
[1126]
wastres
[1127]
seq id no:36:mb025 cdrl3的氨基酸序列
[1128]
qndysyplt
[1129]
seq id no:37:mb025 cdrh1的氨基酸序列
[1130]
dhaih
[1131]
seq id no:38:mb025 cdrh2的氨基酸序列
[1132]
hfspgntdikyndkfkg
[1133]
seq id no:39:mb025 cdrh3的氨基酸序列
[1134]
stfffdy
[1135]
seq id no:40:mb026 cdrl1的氨基酸序列
[1136]
kssqsllnsgdqknylt
[1137]
seq id no:41:mb026 cdrl2的氨基酸序列
[1138]
wastres
[1139]
seq id no:42:mb026 cdrl3的氨基酸序列
[1140]
qndysyplt
[1141]
seq id no:43:mb026 cdrh1的氨基酸序列
[1142]
dhaih
[1143]
seq id no:44:mb026 cdrh2的氨基酸序列
[1144]
hfspgntdikyndkfkg
[1145]
seq id no:45:mb026 cdrh3的氨基酸序列
[1146]
stfffdy
[1147]
seq id no:46:mb021 vl的氨基酸序列
[1148][1149]
seq id no:47:mb021 vh的氨基酸序列
[1150][1151]
seq id no:48:mb022 vl的氨基酸序列
[1152][1153]
seq id no:49:mb022 vh的氨基酸序列
[1154][1155]
seq id no:50:mb023 vl的氨基酸序列
[1156][1157]
seq id no:51:mb023 vh的氨基酸序列
[1158][1159]
seq id no:52:mb024 vl的氨基酸序列
[1160][1161]
seq id no:53:mb024 vh的氨基酸序列
[1162][1163]
seq id no:54:mb025 vl的氨基酸序列
[1164][1165]
seq id no:55:mb025 vh的氨基酸序列
[1166][1167]
seq id no:56:mb026 vl的氨基酸序列
[1168][1169]
seq id no:57:mb026 vh的氨基酸序列
[1170][1171]
seq id no:58:mb051 car的氨基酸序列
[1172][1173]
seq id no:59:mb052 car的氨基酸序列
[1174][1175][1176]
seq id no:60:mb053 car的氨基酸序列
[1177][1178]
seq id no:61:mb054 car的氨基酸序列
[1179][1180]
seq id no:62:来自鼠mab 5e5的vl结构域
[1181][1182]
seq id no:63:来自鼠mab 5e5的vh结构域
[1183][1184]
seq id no:64:具有掩蔽cdr的来自鼠mab 5e5的vl结构域
[1185][1186]
seq id no:65:具有掩蔽cdr的来自鼠mab 5e5的vh结构域
[1187][1188]
seq id no:66:人源化vh链h0
[1189][1190]
seq id no:67:人源化vh链h1
[1191][1192]
seq id no:68:人源化vh链h2
[1193][1194]
seq id no:69:人源化vh链h3
[1195][1196]
seq id no:70:人源化vh链h4
[1197][1198]
seq id no:71:人源化vh链h5
[1199][1200]
seq id no:72:人源化vl链l0
[1201][1202]
seq id no:73:人源化vl链l1
[1203]
[1204]
seq id no:74:人源化vl链l2
[1205][1206]
seq id no:75:人源化vl链l3
[1207][1208]
seq id no:76:tn-muc1肽(完全糖基化)
[1209]
生物素-peg2-gv-t(acnh-a-gal)-s(acnh-a-gal)-apd-t(acnh-a-gal)-rpapgs(acnh-a-gal)-t(acnh-a-gal)-appah-酰胺
[1210]
seq id no:77:muc1肽(非糖基化)
[1211]
生物素-[peg2]-gvtsapdtrpapgstappah-酰胺
[1212]
seq id no:78:人源化抗-tnmuc1 scfv构建体88a(包括六-his标签)
[1213][1214][1215]
seq id no:79:人源化抗-tnmuc1 scfv构建体82a(包括六-his标签)
[1216][1217]
seq id no:80:人源化抗-tnmuc1 scfv构建体89a(包括六-his标签)
[1218][1219]
seq id no:81:人源化抗-tnmuc1 scfv构建体94a(包括六-his标签)
[1220][1221]
seq id no:82:人源化抗-tnmuc1 scfv构建体97a(包括六-his标签)
[1222][1223]
seq id no:83:人源化抗-tnmuc1 scfv构建体19a(包括六-his标签)
[1224][1225]
seq id no:84:人源化抗-tnmuc1 scfv构建体77a(包括六-his标签)
[1226][1227]
seq id no:85:tnmuc1肽1(部分糖基化)
[1228]
生物素-peg2-gv-tsapd-trpapgs(acnh-a-gal)-t(acnh-a-gal)-appah-酰胺
[1229]
seq id no:86:tnmuc1肽2(部分糖基化)
[1230]
生物素-peg2-gv-t(acnh-a-gal)-s(acnh-a-gal)-apd-t(acnh-a-gal)-rpapgstappah-酰胺
[1231]
seq id no:87:stnmuc1肽
[1232]
生物素-[peg]2-gvtsapdtrpapg-[ser(sial-acnh-a-gal)]-[thr(sial-acnh-a-gal)]-appah-酰胺
[1233]
seq id no:88:tnmuc1肽
[1234]
gv-t(acnh-a-gal)-s(acnh-a-gal)-apd-t(acnh-a-gal)-rpapgs(acnh-a-gal)-t(acnh-a-gal)-appah-酰胺
[1235]
seq id no:89:muc1肽
[1236]
gvtsapdtrpapgstappah-酰胺
[1237]
seq id no:90:mb021 scfv的氨基酸序列
[1238][1239]
seq id no:91:mb022 scfv的氨基酸序列
[1240][1241]
seq id no:92:mb023 scfv的氨基酸序列
[1242][1243]
seq id no:93:mb024 scfv的氨基酸序列
[1244][1245]
seq id no:94:mb025 scfv的氨基酸序列
[1246][1247]
seq id no:95:mb026 scfv的氨基酸序列
[1248][1249]
seq id no:96:tnmuc1肽
[1250]
gv-t(acnh-a-gal)-s(acnh-a-gal)-apd-t(acnh-a-gal)-rpapgs(acnh-a-gal)-t(acnh-a-gal)-appah
[1251]
seq id no:97:muc1肽
[1252]
gvtsapdtrpapgstappah
[1253]
seq id no:98:tnmuc1肽1
[1254]
gvtsapdtrpapgs(acnh-a-gal)t(acnh-a-gal)appah
[1255]
seq id no:99:tnmuc1肽2
[1256]
gvt(acnh-a-gal)s(acnh-a-gal)apdt(acnh-a-gal)rpapgstappah
[1257]
seq id no:100:stnmuc1肽
[1258]
gvtsapdtrpapg-[ser(sial-acnh-a-gal)]-[thr(sial-acnh-a-gal)]-appah