对CD47、PD-L1具特异性的抗体及其用途的制作方法

cdr2；及(iii)包含seq id no：18的氨基酸序列的vh cdr3。任选地，vl包含(i)包含seq id no：19的氨基酸序列的vl cdr1；(ii)包含seq id no：20的氨基酸序列的vl cdr2；及(iii)包含seq id no：21的氨基酸序列的vl cdr3。任选地，vh包含seq id no：1、3、7、8或9的氨基酸序列。任选地，vl包含seq id no：2或6的氨基酸序列。任选地，vh包含seq id no：1或3的氨基酸序列且vl包含seq id no：2的氨基酸序列。任选地，以下中的一者或两者：(i)vh包含seq id no：1的氨基酸序列的变体，其中变异序列包含与seq id no：1相比一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个氨基酸取代；及(ii)vl包含seq id no：2的氨基酸序列的变体，其中变异序列包含与seq id no：2相比一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个氨基酸取代。任选地，取代为保守氨基酸取代。任选地，取代是在不在cdr区内的残基中。
8.在一些实施方式中，本文提供特异性结合于cd47的抗体，其中抗体包含：vh，其包含seq id no：1的氨基酸序列；及vl，其包含seq id no：2的氨基酸序列。在一些实施方式中，本文提供特异性结合于cd47的抗体，其中抗体包含：vh，其包含seq id no：3的氨基酸序列；及vl，其包含seq id no：2的氨基酸序列。
9.在一些实施方式中，本文提供特异性结合于cd47的经分离抗体，其中抗体包含vh，其包含qvqlvqsgae vkkpgssvkv sckasgytft nyaiswvrqa pgqglewmgg isplfgtany aqkfqgrvti tadeststay melsslrsed tavyycardg grssdvgwyv gamdvwgqgt lvtvss(seq id no：7)或其变体的vh序列，其中所述序列在seq id no：7的位置27、30、31、50、52、53、54、55、99、100、104、105、108、113或114中的一或多处具有变异氨基酸。任选地，抗体还包含vl，其包含(i)包含seq id no：19或53的氨基酸序列的vl cdr1；(ii)包含seq id no：20或54的氨基酸序列的vl cdr2；及(iii)包含seq id no：21或55的氨基酸序列的vl cdr3。任选地，vl包含seq id no：2或6的氨基酸序列。
10.在一些实施方式中，本文提供特异性结合于cd47的经分离抗体，其中抗体包含vh，其包含qvqlvqsgae vkkpgssvkv sckasgytft nyaiswvrqa pgqglewmgg isplfgtany aqkfqgrvti tadeststay melsslrsed tavyycardg grssdvgwyv gamdvwgqgt lvtvss(seq id no：7)或其变体的vh序列，其中(a)第27位的氨基酸为g(y27g)；(b)第30位的氨基酸为s(t30s)；(c)第31位的氨基酸为s(n31s)；(d)第50位的氨基酸为r(g50r)；(e)第52位的氨基酸为i(s52i)；(f)第53位的氨基酸为g(p53g)；(g)第54位的氨基酸为i(l54i)；(h)第55位的氨基酸为l(f55l)；(i)第99位的氨基酸为e(d99e)；(j)第100位的氨基酸为a、s、q或v(g100a、g100s、g100q或g100v)；(k)第105位的氨基酸为e(d105e)；(l)第108位的氨基酸为y、f或a(w108y、w108f或w108a)；(m)第113位的氨基酸为l或i(m113l或m113i)；(n)第114位的氨基酸为e(d114e)；(o)第53位的氨基酸为g且第105位的氨基酸为e；(p)第53位的氨基酸为g且第114位的氨基酸为e；(q)第54位的氨基酸为a且第114位的氨基酸为e；(r)第54位的氨基酸为a且第102位的氨基酸为a；(s)第54位的氨基酸为a且第104位的氨基酸为e；(t)第27位的氨基酸为g、第54位的氨基酸为i；且第100位的氨基酸为a；(u)第27位的氨基酸为g、第54位的氨基酸为i、第100位的氨基酸为a且第113位的氨基酸为l；(v)第27位的氨基酸为g、第54位的氨基酸为i、第100位的氨基酸为a且第113位的氨基酸为i；(w)第30位的氨基酸为s、第31位的氨基酸为s、第54位的氨基酸为i且第100位的氨基酸为a；(x)第27位的氨基酸为g、第31位的氨基酸为s、第54位的氨基酸为i、第100位的氨基酸为a且第113位的氨基酸为l；(y)第30位的氨基酸为s、第31位的氨基酸为s、第54位的氨基酸为i、第100位的氨基酸为a
dyaapvkgrf tisrddsknt lylqmnslkt edtavyyctt dpgsywdsvy ggmdywgqgt lvtvss(seq id no：11)或其变体的vh序列，其中(a)第56位的氨基酸为e(d56e)且第57位的氨基酸为e或a(g57e或g57a)；(b)第61位的氨基酸为q、e、a或s(d61q、d61e、d61a或d61s)且第62位的氨基酸为e、s、q、a(y62e、y62s、y62q或y62a)；(c)第103位的氨基酸为i(g103i)；(d)第104位的氨基酸为a、h、y、e或i(s104a、s104h、s104y、s104e或s104i)；(e)第105位的氨基酸为h(y105h)；(f)第107位的氨基酸为s、l或y(d107s、d107l或d107y)；(g)第109位的氨基酸为s(v109s)；(h)第112位的氨基酸为a或s(g112a或g112s)；或(i)第113位的氨基酸为l(m113l)。任选地，抗体还包含vl，其包含(i)包含seq id no：19或53的氨基酸序列的vl cdr1；(ii)包含seq id no：20或54的氨基酸序列的vl cdr2；及(iii)包含seq id no：21或55的氨基酸序列的vl cdr3。任选地，vl包含seq id no：2或6的氨基酸序列。
16.在本文所提供的抗体的一些实施方式中，抗体选自：fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、fd片段、fv片段、单链fv片段(scfv)、二硫键稳定fv(dsfv)片段、单域抗体(dab)片段、单克隆抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、三特异性抗体，多特异性抗体、双特异性异源二聚体双功能抗体、双特异性异源二聚体igg、多克隆抗体、经标记抗体、人源化抗体、人类抗体及其片段。任选地，抗体包含人类或人源化vh构架及人类或人源化vl构架。任选地，抗体为双特异性抗体。
17.在本文提供的双特异性抗体的一些实施方式中，双特异性抗体特异性结合于cd47及pd-l1。任选地，抗体包含第一抗原结合部分及第二抗原结合部分，其中第一抗原结合部分特异性结合于cd47且第二抗原结合部分特异性结合于pd-l1，其中第一抗原结合部分包含vh及vl，其中第二抗原结合部分包含vh及vl，且其中第一抗原结合部分的vl的氨基酸序列及第二抗原结合部分的vl的氨基酸序列具有相同氨基酸序列。任选地，第一抗原结合部分的vl的氨基酸序列及第二抗原结合部分的vl的氨基酸序列包含如seq id no：2中所示的氨基酸序列或相比于seq id no：2包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个氨基酸取代的其变体。任选地，第一抗原结合部分的vl的氨基酸序列及第二抗原结合部分的vl的氨基酸序列包含如seq id no：6中所示的氨基酸序列或相比于seq id no：6包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个氨基酸取代的其变体。任选地，取代为保守氨基酸取代。任选地，取代是在不在cdr区内的残基中。
18.在一些实施方式中，本文提供一种cd47/pd-l1双特异性抗体，其包含特异性结合于cd47的第一抗原结合部分及特异性结合于pd-l1的第二抗原结合部分，其中第一抗原结合部分包含vh及vl，其中第二抗原结合部分包含vh及vl，且其中以下中的一者、两者、三者或所有四者：(a)第一抗原结合部分vh包含如seq id no：1、3、7、8或9中所示的vh序列的vh cdr1、vh cdr2及vh cdr3；(b)第一抗原结合部分vl包含如seq id no：2中所示的vl序列的vl cdr1、vl cdr2及vl cdr3；(c)第二抗原结合部分vh包含如seq id no：4、5、10、11或12中所示的vh序列的vh cdr1、vh cdr2及vh cdr3；及(d)第二抗原结合部分vl包含如seq id no：2或6中所示的vl序列的vl cdr1、vl cdr2及vl cdr3。任选地，以下中的一者、两者、三者或所有四者：(a)第一抗原结合部分vh包含(i)包含seq id no：13、14、15、22、23、25、26、27、31、32、33、37、38或39的氨基酸序列的vh cdr1；(ii)包含seq id no：16、17、28、29、34或35的氨基酸序列的vh cdr2；及(iii)包含seq id no：18、24、30、36或40的氨基酸序列的vh cdr3；(b)第一抗原结合部分vl包含(i)包含seq id no：19或53的氨基酸序列的vl cdr1；
(ii)包含seq id no：20或54的氨基酸序列的vl cdr2；及(iii)包含seq id no：21或55的氨基酸序列的vl cdr3；(c)第二抗原结合部分vh包含(i)包含seq id no：41、42、43、47、48或49的氨基酸序列的vh cdr1；(ii)包含seq id no：44、45、50、51、58或59的氨基酸序列的vh cdr2；及(iii)包含seq id no：46、52、56、57或60的氨基酸序列的vh cdr3；及(d)第二抗原结合部分vl包含(i)包含seq id no：19或53的氨基酸序列的vl cdr1；(ii)包含seq id no：20或54的氨基酸序列的vl cdr2；及(iii)包含seq id no：21或55的氨基酸序列的vl cdr3。任选地，以下中的一者、两者、三者或所有四者：(a)第一抗原结合部分vh包含(i)包含seq id no：13、14或15的氨基酸序列的vh cdr1；(ii)包含seq id no：16或17的氨基酸序列的vh cdr2；及(iii)包含seq id no：18的氨基酸序列的vh cdr3；(b)第一抗原结合部分vl包含(i)包含seq id no：19的氨基酸序列的vl cdr1；(ii)包含seq id no：20的氨基酸序列的vl cdr2；及(iii)包含seq id no：21的氨基酸序列的vl cdr3；(c)第二抗原结合部分vh包含(i)包含seq id no：41、42或43的氨基酸序列的vh cdr1；(ii)包含seq id no：44或45的氨基酸序列的vh cdr2；及(iii)包含seq id no：46的氨基酸序列的vh cdr3；及(d)第二抗原结合部分vl包含(i)包含seq id no：19的氨基酸序列的vl cdr1；(ii)包含seq id no：20的氨基酸序列的vl cdr2；及(iii)包含seq id no：21的氨基酸序列的vl cdr3。任选地，以下中的一者、两者、三者或所有四者：(a)第一抗原结合部分vh包含在seq id no：1或3的氨基酸序列中；(b)第一抗原结合部分vl包含seq id no：2的氨基酸序列；(c)第二抗原结合部分vh包含seq id no：4的氨基酸序列；及(d)第二抗原结合部分vl包含seq id no：2的氨基酸序列。
19.在一些实施方式中，本文提供一种cd47/pd-l1双特异性抗体，其包含特异性结合于cd47的第一抗原结合部分及特异性结合于pd-l1的第二抗原结合部分，其中抗体包含：包含如seq id no：1中所示的氨基酸序列的第一抗原结合部分vh、包含如seq id no：2中所示的氨基酸序列的第一抗原结合部分vl、包含如seq id no：4中所示的氨基酸序列的第二抗原结合部分vh，及包含如seq id no：2中所示的氨基酸序列的第二抗原结合部分vl。
20.在一些实施方式中，本文提供一种cd47/pd-l1双特异性抗体，其包含特异性结合于cd47的第一抗原结合部分及特异性结合于pd-l1的第二抗原结合部分，其中抗体包含：包含如seq id no：3中所示的氨基酸序列的第一抗原结合部分vh、包含如seq id no：2中所示的氨基酸序列的第一抗原结合部分vl、包含如seq id no：4中所示的氨基酸序列的第二抗原结合部分vh，及包含如seq id no：2中所示的氨基酸序列的第二抗原结合部分vl。
21.在一些实施方式中，本文提供一种经分离抗体，其包含特异性结合于cd47的第一抗原结合部分及特异性结合于pd-l1的第二抗原结合部分，其中第一抗原结合部分包含vh及vl，其中第二抗原结合部分包含vh及vl，且其中(a)第一抗原结合部分vh包含(i)包含seq id no：13、14或15的氨基酸序列的vh cdr1；(ii)包含seq id no：16或17的氨基酸序列的vh cdr2；及(iii)包含seq id no：18的氨基酸序列的vh cdr3；且(b)第二抗原结合部分vh包含(i)包含seq id no：41、42或43的氨基酸序列的vh cdr1；(ii)包含seq id no：44或45的氨基酸序列的vh cdr2；及(iii)包含seq id no：46的氨基酸序列的vh cdr3。任选地，第一抗原结合部分vh包含如seq id no：1中所示的氨基酸序列，且第二抗原结合部分vh包含如seq id no：4中所示的氨基酸序列。任选地，(a)第一抗原结合部分vl包含(i)包含seq id no：19的氨基酸序列的vl cdr1；(ii)包含seq id no：20的氨基酸序列的vl cdr2；及(iii)包含
seq id no：21的氨基酸序列的vl cdr3；且(b)第二抗原结合部分vl包含(i)包含seq id no：19的氨基酸序列的vl cdr1；(ii)包含seq id no：20的氨基酸序列的vl cdr2；及(iii)包含seq id no：21的氨基酸序列的vl cdr3。任选地，第一抗原结合部分vl包含如seq id no：2中所示的氨基酸序列且第二抗原结合部分vl包含如seq id no：2中所示的氨基酸序列。
22.在一些实施方式中，本文提供一种经分离双特异性抗体，其包含特异性结合于cd47的第一抗原结合部分及特异性结合于pd-l1的第二抗原结合部分，其中第一抗原结合部分包含本文提供的任何抗cd47抗体的vh及vl，且其中第二抗原结合部分包含本文提供的任何抗pd-l1抗体的vh及vl。
23.在一些实施方式中，在本文所提供的双特异性抗体中，双特异性抗体包含fc结构域。任选地，fc结构域为igg1 fc结构域、igg2 fc结构域或igg4 fc结构域。任选地，fc结构域的第一fc链及第二fc链含有一个或多个促进第一fc链与第二fc链的结合的修饰。任选地，第一fc链及第二fc链各自包含至少一个相比于野生型fc链的氨基酸修饰，以形成杵(knob)或臼(hole)，且其中fc链中的一者包含杵且另一fc链包含臼。任选地，包含杵的fc链包含突变y349c和/或t366w中的一者或两者，且其中包含臼的fc链包含突变s354c、t366s、l368a和/或y407v中的一者、两者、三者或所有四者(编号根据eu索引)。
24.在一些实施方式中，本文提供一种cd47/pd-l1双特异性抗体，其包含：包含seq id no：61或63的氨基酸序列的抗cd47重链及包含seq id no：64的氨基酸序列的抗pd-l1重链。任选地，抗体还包含：包含seq id no：62的氨基酸序列的抗cd47轻链及包含seq id no：62的氨基酸序列的抗pd-l1轻链。任选地，抗cd47轻链及抗pd-l1轻链具有相同氨基酸序列。
25.在一些实施方式中，本文提供一种cd47/pd-l1双特异性抗体，其中抗体包含第一抗体重链、第二抗体重链、第一抗体轻链及第二抗体轻链；其中所述第一抗体重链包含seq id no：61的氨基酸序列且该第二抗体重链包含seq id no：64的氨基酸序列；且其中第一抗体轻链及第二抗体轻链均包含seq id no：62的氨基酸序列。
26.在一些实施方式中，本文提供一种cd47/pd-l1双特异性抗体，其中抗体包含第一抗体重链、第二抗体重链、第一抗体轻链及第二抗体轻链；其中第一抗体重链包含seq id no：63的氨基酸序列且第二抗体重链包含seq id no：64的氨基酸序列；且其中第一抗体轻链及第二抗体轻链均包含seq id no：62的氨基酸序列。
27.在本文所提供的抗体中，在一些实施方式中，抗体中的一个或多个重链可能不具有c端赖氨酸。举例而言，在一些实施方式中，在本文提供的cd47/pd-l1双特异性抗体中，抗体中的一个或多个重链可不具有c端赖氨酸。举例而言，在包含seq id no：61、63或64的氨基酸序列的本文所提供的双特异性抗体中，本文亦包括在seq id no：61、63或64的氨基酸序列中不具有c端赖氨酸的抗体。
28.在本文提供的cd47/pd-l1双特异性抗体的一些实施方式中，抗pd-l1抗体可变区对pd-l1的亲和力大于抗cd47抗体可变区对cd47的亲和力。任选地，抗pd-l1抗体可变区对pd-l1的亲和力大于抗cd47抗体可变区对cd47的亲和力100倍与1000倍之间或1000倍与5000倍之间。任选地，以下中的一者或两者：(i)抗pd-l1抗体可变区kd在0.1～1nm之间或在0.05～5nm之间，和/或(ii)抗cd47抗体可变区kd在10～500nm之间、在10～1000nm之间或在5～1000nm之间。
29.在本文提供的cd47/pd-l1双特异性抗体的一些实施方式中，抗体是人类、人源化或嵌合抗体。
30.在一些实施方式中，本文提供cd47/pd-l1双特异性抗体，其包含第一抗体重链、第二抗体重链、第一抗体轻链及第二抗体轻链，其中以下中的一者、两者或全部三者：(a)第一抗体重链具有由具有atcc保藏号pta-126910的atcc保藏的质粒的插入物的核酸序列编码的氨基酸序列；(b)第二抗体重链具有由具有atcc保藏号pta-126911的atcc保藏的质粒的插入物的核酸序列编码的氨基酸序列；及(c)第一抗体轻链及第二抗体轻链具有由具有atcc保藏号pta-126912的atcc保藏的质粒的插入物的核酸序列编码的氨基酸序列。
31.在一些实施方式中，本文提供医药组合物，其包含治疗有效量的本文所提供的抗体(例如单特异性或双特异性抗体)及医药学上可接受的载剂。
32.在一些实施方式中，本文提供包含编码如本文所提供的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸、包含多核苷酸的载体或包含载体或重组多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方式中，本文提供包含seq id no：67～74中的任一者的核苷酸序列的多核苷酸。
33.在一些实施方式中，本文提供宿主细胞，其包含以下中的一者、两者或全部三者：(a)重组多核苷酸，其包含编码具有seq id no：1或3的氨基酸序列的vh的核苷酸序列；(b)重组多核苷酸，其包含编码具有seq id no：4的氨基酸序列的vh的核苷酸序列；及(c)重组多核苷酸，其包含编码具有seq id no：2的氨基酸序列的vl的核苷酸序列。任选地，宿主细胞包含以下中的一者、两者或全部三者：(a)重组多核苷酸，其包含编码具有seq id no：61或63的氨基酸序列的重链的核苷酸序列；(b)重组多核苷酸，其包含编码具有seq id no：64的氨基酸序列的重链的核苷酸序列；及(c)重组多核苷酸，其包含编码具有seq id no：62的氨基酸序列的轻链的核苷酸序列。任选地，宿主细胞以重组方式产生本文所提供的抗体。任选地，宿主细胞为细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系。任选地，哺乳动物细胞系为cho细胞系。
34.在一些实施方式中，本文提供一种产生抗体或双特异性抗体的方法，其包含在引起本文所提供的抗体或双特异性抗体的产生的条件下培养本文所提供的宿主细胞，且纯化所产生的抗体或双特异性抗体。
35.本文亦提供本文所提供的抗体、双特异性抗体、医药组合物、多核苷酸、载体或宿主细胞在制造药剂中的用途。
36.本文亦提供本文所提供的抗体、双特异性抗体或医药组合物的用途，其用作药剂。任选地，抗体、双特异性抗体、医药组合物或药剂用于治疗癌症。
37.在一些实施方式中，本文提供一种治疗有需要的个体的疾病的方法，该方法包含向个体施用有效量的本文所提供的抗体、双特异性抗体或医药组合物。任选地，治疗疾病的方法包含调节或刺激免疫反应或功能。任选地，后天性及先天性免疫反应或功能均经调节或刺激。任选地，疾病为感染。任选地，疾病为癌症。任选地，方法还包含向个体施用第二治疗剂。任选地，第二治疗剂为抗癌剂。任选地，抗癌剂为tlr促效剂，诸如tlr3促效剂、tlr7/8促效剂或tlr9促效剂；cdk抑制剂，诸如cdk4/6或cdk 2/4/6抑制剂；或parp抑制剂，诸如奥拉帕尼(olaparib)、瑞卡帕尼(rucaparib)、尼拉帕尼(niraparib)或拉唑帕尼(talazoparib)。任选地，tlr9促效剂为cpg24555、cpg10103、cpg7909(pf-3512676)、cpg1018。任选地，cdk抑制剂为pf-06873600或帕泊昔布(palbociclib)。
38.在一些实施方式中，本文提供的cd47/pd-l1双特异性抗体加上tlr促效剂(例如tlr9促效剂)的组合具有比任一种试剂的个别抗癌活性更大的抗癌活性。在一些实施方式中，组合具有协同抗癌活性。
39.在一些实施方式中，本文提供的cd47/pd-l1双特异性抗体加上cdk抑制剂(例如cdk 2/4/6抑制剂)的组合具有比任一种试剂的个别抗癌活性更大的抗癌活性。在一些实施方式中，组合具有协同抗癌活性。
40.在一些实施方式中，本文提供一种增强个体的免疫反应的方法，该方法包含向个体施用有效量的本文所提供的抗体、双特异性抗体或医药组合物。
41.在一些实施方式中，本文提供一种抑制或减少个体中癌细胞生长的方法，该方法包含向个体施用有效量的本文所提供的抗体、双特异性抗体或医药组合物。在一些实施方式中，相对于在无抗体或双特异性抗体存在下的癌细胞生长，本文提供的本文提供的抗体、双特异性抗体或医药组合物抑制或减少癌细胞生长至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％或至少10％。
42.在一些实施方式中，本文所提供的抗体或双特异性抗体以以下亲和力结合于食蟹猴红细胞和/或血小板：其分别为对人类红细胞和/或血小板具有的亲和力的至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％或至少10％。
43.在一些实施方式中，本文提供本文所提供的抗体、双特异性抗体或医药组合物，其用于本文所提供的治疗方法中。在一些实施方式中，本文提供本文所提供的抗体、双特异性抗体或医药组合物，其用于治疗个体的癌症和/或增强个体免疫反应。在一些实施方式中，本文提供本文所提供的抗体、双特异性抗体或医药组合物在制造用于本文所提供的治疗方法中的药剂中的用途。在一些实施方式中，药剂用于治疗个体的癌症和/或增强个体免疫反应。
44.在一些实施方式中，本文涉及癌症，癌症为胃癌(gastric cancer)、肉瘤、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(hodgkin's lymphoma)、白血病、头颈癌、胸腺癌、上皮癌、唾液腺癌、肝癌、胃癌(stomach cancer)、甲状腺癌、肺癌(包括例如非小细胞肺癌)、卵巢癌、乳癌、前列腺癌、食道癌、胰腺癌、神经胶质瘤、成神经胶质细胞瘤、脑瘤、白血病、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、肾癌、膀胱癌、尿道上皮癌、子宫颈癌、绒膜癌、结肠癌、口腔癌、皮肤癌或黑素瘤。
【附图说明】
45.图1描绘来自测试bsab1(实心圆形)、抗cd47抗体p01a11_75(实心菱形)、抗pd-l1抗体p06b05_245(空心正方形)或对照抗体(空心圆形)对巨噬细胞对人类nci-h292肿瘤细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)活性的作用的实验的数据。y轴描绘在如x轴上所示的各抗体浓度下已吞噬的肿瘤细胞的％。
46.图2a、图2b及图2c描绘来自在ct26小鼠肿瘤模型中测试bsab3及其他相关抗体的抗肿瘤功效的实验的数据。在图2a、图2b及图2c中所描绘的实验中，携带ct26肿瘤的小鼠用对照抗体(实心圆形)、抗cd47单特异性抗体(空心正方形)、抗pd-l1单特异性抗体(实心三角形，点由实线连接)、抗cd47单特异性抗体与抗pd-l1单特异性抗体(倒空心三角形)、
bsab3(实心菱形，点由虚线连接)或fc无效bsab3(fc-null bsab3)(空心圆形)处理。在图2a中，x轴展示处理后天数，且y轴展示以mm3为单位的肿瘤体积。在图2b中，x轴展示处理后天数，且y轴展示体重百分比。在图2c中，x轴展示处理后天数，且y轴展示存活百分比。
47.图3a及图3b描绘来自在mc38小鼠肿瘤模型中测试不同剂量的bsab3的抗肿瘤功效的实验的数据。在图3a及图3b中所描绘的实验中，携带mc38肿瘤的小鼠用对照同型抗体(实心圆形)、10mg/kg bsab3(空心正方形)、20mg/kg bsab3(实心三角形)或40mg/kg bsab3(空心圆形)处理。在图3a中，x轴展示肿瘤接种后天数，且y轴展示以mm3为单位的肿瘤体积。在图3b中，x轴展示肿瘤接种后天数，且y轴展示体重百分比。
48.图4a及图4b描绘来自在b16f10小鼠肿瘤模型中测试bsab3的抗肿瘤功效的实验的数据。在图4a及图4b中所描绘的实验中，携带b16f10肿瘤的小鼠用对照同型抗体(实心圆形)或20mg/kg bsab3(实心三角形)处理。在图4a中，x轴展示肿瘤接种后天数，且y轴展示以mm3为单位的肿瘤体积。在图4b中，x轴展示肿瘤接种后天数，且y轴展示体重百分比。
49.图5a、图5b、图5c及图5d描绘来自在携带mc38肿瘤的小鼠中测试当bsab3与耗乏或抑制各种类别的免疫细胞的不同抗体共施用时，bsab3的抗肿瘤功效的实验的数据。在图5a中所描绘的实验中，小鼠用对照同型抗体(实心圆形)、bsab3(空心圆形)、bsab3+抗cd8 mab(实心倒三角形)、bsab3+抗cd4 mab(实心三角形)或bsab3+抗cd4 mab+抗cd8 mab(空心菱形)处理。在图5b中所描绘的实验中，野生型c57bl/6小鼠或batf3-/-小鼠用对照同型抗体或bsab3处理。图5b描绘来自用对照抗体(实心圆形)处理的野生型小鼠、用bsab3处理的野生型小鼠(空心圆形)、用对照抗体处理的batf3-/-小鼠(空心正方形)及用bsab3处理的batf3-/-小鼠(实心三角形)的数据。在图5c中所描绘的实验中，小鼠用对照同型抗体(实心圆形)、bsab3(空心圆形)或bsab3+抗csf1r mab(实心倒三角形)处理。在图5d中所描绘的实验中，小鼠用对照同型抗体(实心圆形)、bsab3(空心圆形)或bsab3+抗nk1.1mab(实心倒三角形)处理。在图5a、图5b、图5c及图5d中的每一者中，x轴展示肿瘤接种后天数，且y轴展示以mm3为单位的肿瘤体积。
50.图6描绘来自测试在nsg免疫缺陷小鼠中bsab1及bsab2针对mda-mb-231人类乳癌细胞的抗肿瘤功效的实验的数据。携带mda-mb-231肿瘤的小鼠用对照同型抗体(实心圆形)、1mg/kg bsab1(实心三角形)、5mg/kg bsab1(空心菱形)、10mg/kg bsab1(空心三角形)、1mg/kg bsab2(空心圆形)、5mg/kg bsab2(实心菱形)或10mg/kg bsab2(实心正方形)处理。x轴展示处理后天数，且y轴展示以mm3为单位的肿瘤体积。
51.图7描绘来自在mc38小鼠肿瘤模型中测试bsab3与tlr9促效剂的组合的抗肿瘤功效的实验的数据。携带mc38肿瘤的小鼠用对照同型抗体(实心圆形)、bsab3(空心正方形)、tlr9促效剂(实心倒三角形)或bsab3及tlr9促效剂(空心三角形)处理。x轴展示肿瘤接种后天数，且y轴展示以mm3为单位的肿瘤体积。
52.图8描绘来自在b16f10小鼠肿瘤模型中测试bsab3与cdk2/4/6抑制剂的组合的抗肿瘤功效的实验的数据。携带b16f10肿瘤的小鼠用对照同型抗体(实心圆形)、bsab3(实心三角形)、cdk2/4/6抑制剂(空心正方形)或bsab3及cdk2/4/6抑制剂(空心菱形)处理。x轴展示肿瘤接种后天数，且y轴展示以mm3为单位的肿瘤体积。
53.【实施方式】
54.本文提供特异性结合于cd47的抗体、特异性结合于pd-l1的抗体及特异性结合于
cd47及pd-l1的双特异性抗体。本文进一步提供共有共同轻链的双特异性抗体。本文亦提供相关核酸、组合物及制造及使用抗体的方法。
55.【通用技术】
56.除非另外指明，否则本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学的常规技术，其完全属于此项技术技能范畴内。此类技术在诸如以下的文献中充分解释：molecular cloning：a laboratory manual，第二版(sambrook等人1989)cold spring harbor press；oligonucleotide synthesis(m.j.gait编1984)；methods in molecular biology,humana press；cell biology：a laboratory notebook(j.e.cellis编1998)academic press；animal cell culture(r.i.freshney编，1987)；introduction to cell and tissue culture(j.p.mather及p.e.roberts,1998)plenum press；cell and tissue culture：laboratory procedures(a.doyle、j.b.griffiths及d.g.newell编，1993-1998)j.wiley and sons；methods in enzymology(academic press公司)；handbook of experimental immunology(d.m.weir及c.c.blackwell编)；gene transfer vectors for mammalian cells(j.m.miller及m.p.calos编，1987)；current protocols in molecular biology(f.m.ausubel等人编，1987)；pcr：the polymerase chain reaction,(mullis等人编，1994)；current protocols in immunology(j.e.coligan等人编，1991)；short protocols in molecular biology(wiley and sons,1999)；immunobiology(c.a.janeway及p.travers,1997)；antibodies(p.finch,1997)；antibodies：a practical approach(d.catty.编，irl press,1988-1989)；monoclonal antibodies：a practical approach(p.shepherd及c.dean编，oxford university press,2000)；using antibodies：a laboratory manual(e.harlow及d.lane(cold spring harbor laboratory press,1999)；the antibodies(m.zanetti及j.d.capra编，harwood academic publishers,1995)；以及在适用时，在以上参考文献的后续版本及对应网站中解释。
57.现将使用以下定义及实例藉助于参考详细地描述本发明。本文所提及的所有专利及公开，包括此类专利及公开内揭示的所有序列均以引用的方式明确并入。
58.【定义】
59.除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语、符号以及其他科学术语或术语集旨在具有熟习本发明关于的技术者通常理解的含义。举例而言，如在本文中的诸如“a和/或b”的词组中使用的术语“和/或”旨在包括a及b；a或b；a(单独)；及b(单独)。同样，如诸如“a、b和/或c”的词组中所使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施例中的每一者：a、b及c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a及c；a及b；b及c；a(单独)；b(单独)；及c(单独)。在一些情况下，出于清楚起见和/或为了方便参考，在本文中定义具有通常所理解含义的术语，且本文中包括此类定义不应必然解释为表示与此项技术中通常所理解存在实质性差异。
60.如本文所用，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”及“该”包括其对应复数个提及物。
61.如本文所用，数值范围包括定义范围的数值。
62.本文中提及“约”某值或参数包括(及描述)针对该值或参数本身，以及针对可比该参数的所陈述数值低或高多达10％的值或参数的实施例。举例而言，“约5mg/kg”的剂量包
括5mg/kg且亦包括4.5mg/kg与5.5mg/kg之间的任何值。在时间段(年、月、周、天等)的情境内使用术语“约”的情况下，术语“约”意谓时间段加或减下一从属时间段的一个量(例如约1年意谓11-13个月；约6个月意谓6个月加或减1周；约1周意谓6-8天等)或在指定值的10百分比内，以更大者为准。
63.如本文所用，分别地，核酸以5'至3'方向自左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向自左向右书写。对于此项技术的定义及术语，从业者尤其可参考sambrook等人，1989及ausubelfm等人，1993。应理解，本发明不限于所描述的特定方法、方案及试剂，因为其可变化。
64.在本文中术语“多肽”、“寡肽”、“肽”及“蛋白质”可互换使用以指任何长度的氨基酸链。举例而言，链可相对短(例如10～100个氨基酸)或更长。链可为直链或分支链，其可包含经修饰的氨基酸，和/或可间杂有非氨基酸。术语亦涵盖已经天然或干预修饰的氨基酸链；例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，诸如与标记组分结合。定义内亦包括例如含有氨基酸的一或多种类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及此项技术中已知的其他修饰的多肽。应理解，多肽可作为单链或结合链出现。
[0065]“抗体”为能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区的抗原识别位点特异性结合于诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等目标的免疫球蛋白分子。如本文所用，术语不仅涵盖完整多克隆或单克隆抗体，而且除非另外规定，否则涵盖与完整抗体竞争特异性结合的其任何抗原结合部分、包含抗原结合部分的融合蛋白及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰组态。抗原结合部分包括例如fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、结构域抗体(dab，例如鲨鱼及骆驼抗体)、包括互补决定区(cdr)的片段、单链可变片段抗体(scfv)、最大抗体、微型抗体、胞内抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、v-nar及双-scfv及含有足以使得特异性抗原结合于多肽的免疫球蛋白的至少一部分的多肽。抗体包括任何类别的抗体，诸如igg、iga或igm(或其子类)，且抗体不必为任何特定类别。免疫球蛋白可视其重链的恒定区的抗体氨基酸序列而归为不同类别。存在五种主要类别的免疫球蛋白：iga、igd、ige、igg及igm，且其中若干者可进一步分成子类(同型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1及iga2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ及μ。不同类别的免疫球蛋白的子单元结构及三维组态已为人所熟知。
[0066]
抗体的“可变区”是指单独或呈组合形式的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。如此项技术中已知，重链及轻链的可变区各自由四个由亦称为可变区的三个互补决定区(cdr)所连接的构架区(fr)组成；且促进形成抗体的抗原结合位点。若需要目标可变区的变体，尤其在cdr区外(亦即，在构架区中)的氨基酸残基中具有取代，则适当的氨基酸取代，优选地，保守氨基酸取代可由比较目标可变区与其他抗体的可变区(其含有与目标可变区相同的典型类别中的cdr1及cdr2序列)来鉴别(chothia及lesk,j mol biol 196(4)：901-917,1987)。
[0067]
在某些实施方式中，cdr的明确分界及包含抗体的结合位点的残基的鉴别由解析抗体的结构和/或解析抗体-配体复合物的结构来实现。在某些实施方式中，其可由本领域技术人员已知的各种技术中任一者来实现，诸如x射线结晶法。在某些实施方式中，可采用各种分析方法以鉴别或近似鉴别cdr区。在某些实施方式中，可采用各种分析方法以鉴别或近似鉴别cdr区。此类方法的实例包括但不限于kabat定义、chothia定义、abm定义、接触定
义(contact definition)及构形定义。kabat定义为用于编号抗体中的残基的标准方法且通常用以鉴别cdr区。参见例如johnson及wu,2000,nucleic acids res.,28：214-8。chothia定义类似于kabat定义，但chothia定义考虑某些结构环区域的位置。参见例如chothia等人，1986,j.mol.biol.,196：901-17；chothia等人，1989,nature,342：877-83。abm定义使用由oxford molecular group所研发的模型化抗体结构的计算机程序的整合套件。参见例如martin等人，1989,proc natl acad sci(usa),86:9268-9272；“abm
tm
,a computer program for modeling variable regions of antibodies,”oxford,uk；oxford molecular有限公司。abm定义使用知识数据库与全始算法(ab initio method)的组合将来自一级序列的抗体的三级结构模型化，该等全始算法诸如由以下所描述者：samudrala等人，1999，“ab initio protein structure prediction using a combined hierarchical approach”,proteins,structure,function and genetics增刊，3:194-198。接触定义基于可用复杂晶体结构的分析。参见例如maccallum等人，1996,j.mol.biol.,5:732-45。在另一方法，在本文中称为cdr的“构形定义”中，cdr的位置可作为向抗原结合贡献焓的残基鉴别。参见例如makabe等人，2008,journal of biological chemistry,283:1156-1166。再其他cdr边界定义可能不严格遵循以上方法中的一者，但仍然将与kabat cdr的至少一部分重迭，但其可鉴于以下预测或实验发现而缩短或延长：特定残基或残基组并不显著影响抗原结合。如本文所用，cdr可指由此项技术中已知的任何方法，包括方法的组合所定义的cdr。本文中所用的方法可利用根据此等方法中任一者所定义的cdr。对于任何含有超过一个的cdr的给定实施例，cdr可根据kabat定义、chothia定义、扩展定义(extended)、abm定义、接触定义和/或构形定义中的任一者定义。
[0068]
如本文所用，术语“fc链”是指抗体重链的c端区，且视同型而定包含两个至三个恒定域。如本文所用，fc链可包含原生或变异fc序列。除非本文中另外规定，否则fc链或恒定区中氨基酸残基的编号根据eu编号系统，亦称为eu索引，如kabat等人，sequences of proteins of immunological interest，第5版，public health service,national institutes of health,bethesda,md,1991中所述。
[0069]
如本文所用，术语“fc结构域”是指包含两个fc链的抗体的区域。举例而言，在标准igg形式中，抗体具有两条重链，其皆具有fc链。共同地，两条fc链在本文中被称为“fc结构域”。
[0070]“野生型fc链”包含与自然界中发现的fc链的氨基酸序列一致的氨基酸序列。“野生型”人类igg fc意谓天然存在于人类群体内的氨基酸的序列。当然，正如个体之间fc序列可略有不同一般，野生型序列可发生一或多种改变且仍保持在本发明的范畴内。
[0071]“变异fc链”包含由于至少一个氨基酸修饰而与野生型fc链的氨基酸序列不同的氨基酸序列，但保留野生型fc链的至少一个效应功能。在一些实施方式中，相比于野生型fc链，变异fc链具有至少一个野生型fc链中的氨基酸取代，例如约一个至约十个氨基酸取代，且优选约一个至约五个氨基酸取代。本文中的变异fc链将优选与野生型fc链具有至少约80％序列一致性，且最优选与其具有至少约90％序列一致性，更优选与其具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％序列一致性。在一些实施方式中，fc链包含部分或所有野生型铰链区(通常在其n端)。在一些实施方式中，fc多肽不包含功能性或野生型铰链区。
[0072]
如本文所用，术语“铰链区”包括此项技术中已知的含义，其说明于例如janeway等人，immunobiology：the immune system in health and disease,elsevier science有限公司，ny(第4版，1999)；bloom等人，protein science,6:407-415,1997；及humphreys等人，j.immunol.methods,209:193-202,1997中。
[0073]
如本文所用，术语“连接”、“融合(fused)”及“融合(fusion)”可互换使用以指由任何手段，包括化学结合或重组手段使两个或更多个组件或组件接合在一起。
[0074]
如本文所用，术语“共价连接”意谓特定部分直接彼此共价键合，或经由一个或多个介入部分，诸如连接肽或部分间接彼此共价接合。
[0075]
如本文所用，术语“基因融合的”及“基因融合”是指两个或更多个蛋白质、多肽或其片段经由其个别肽主链，经由编码彼等蛋白质、多肽或片段的单一多核苷酸分子的基因表达的共线性、共价连接或连结。此类基因融合引起单一连续基因序列的表达。
[0076]
如本文所用，术语“修饰”是指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失；化学连接于蛋白质的部分的改变；或蛋白质，例如抗体功能的修饰。举例而言，修饰可为改变的抗体功能或改变的连接于蛋白质的碳水化合物结构。如本文所用，“氨基酸修饰”是指抗体中的一个或多个氨基酸残基的突变(取代)、插入(添加)或缺失。术语“氨基酸突变”指示至少一个现存氨基酸残基经另一不同氨基酸残基的取代(例如置换氨基酸残基)。术语“氨基酸缺失”指示在氨基酸序列中的预定位置移除至少一个氨基酸残基。举例而言，突变l234a指示抗体fc区中第234位的氨基酸残基赖氨酸经氨基酸残基丙氨酸取代(赖氨酸经丙氨酸取代)(编号根据eu索引编号系统)。
[0077]
术语“试剂”在本文中用以指示生物大分子、由生物材料制成的提取物、生物大分子的混合物、化合物、化合物的混合物和/或化合物与生物大分子的混合物。术语“治疗剂”是指具有生物活性的试剂。
[0078]“人源化”抗体是指包含来自非人类可变区的氨基酸残基及来自人类构架区的氨基酸残基的嵌合抗体。优选地，人源化抗体为人类免疫球蛋白(接受体抗体)，其中来自接受体的互补决定区(cdr)的残基经具有所要特异性、亲和力及能力的来自诸如小鼠、大鼠或兔的非人类物种(供体抗体)的cdr的残基置换。人源化抗体可包含如以下的残基：既不存在于接受体抗体中亦不存在于所导入的cdr或构架序列中，但经包括以进一步改良且优化抗体效能。
[0079]“人类抗体”为具有以下氨基酸序列的抗体：对应于由人类所产生和/或已使用制造如本文所揭示的人类抗体的技术中的任一者所制造的抗体的氨基酸序列。人类抗体的此定义特别排除包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。
[0080]
术语“嵌合抗体”意指可变区序列来源于一个物种且恒定区序列来源于另一物种的抗体，诸如可变区序列来源于小鼠抗体且恒定区序列来源于人类抗体的抗体。
[0081]“单特异性抗体”是指每分子包含一个或多个抗原结合位点以使得抗体的任何及所有结合位点特异性识别抗原上的相同表位的抗体。因此，在单特异性抗体具有超过一个抗原结合位点的情况下，结合位点彼此竞争结合于一个抗原分子。
[0082]
如本文所用，“双特异性抗体”是对至少两个不同表位具有结合特异性的分子。在一些实施方式中，双特异性抗体可同时结合两个不同抗原。在其他实施方式中，两个不同表位可存在于同一抗原上。
[0083]
如本文所用，“目标抗原”、“目标细胞抗原”、“肿瘤抗原”或“肿瘤特异性抗原”是指目标细胞，例如肿瘤中的细胞，诸如癌细胞或肿瘤基质的细胞表面上所呈现的抗原决定子。
[0084]
如本文所用，“经分离抗体”是指自其天然环境的至少一种组分鉴别及分离和/或回收的抗体。举例而言，自生物体的至少一种组分、或自其中抗体天然存在或天然产生的组织或细胞分离或移除的抗体出于本发明的目的为“经分离抗体”。经分离抗体亦包括重组细胞内的原位抗体。经分离抗体为已经受至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施例，经分离抗体可实质上不含其他细胞材料和/或化学物质。
[0085]
如本文所用，术语“接头”是指长度为两个或更多个氨基酸的氨基酸序列。接头可由中性极性或非极性氨基酸组成。接头的长度可为例如2～100个氨基酸，诸如长度在2与50个氨基酸之间，例如长度为3、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。接头可为“可裂解”的，例如由自裂解或酶裂解或化学裂解进行。氨基酸序列中的裂解位点及在此类位点裂解的酶及化学物质为此项技术中熟知的且亦描述于本文中。
[0086]
如本文所用，术语“二硫键”或“半胱氨酸-半胱氨酸二硫键”是指两个半胱氨酸之间的共价相互作用，其中半胱氨酸的硫原子经氧化以形成二硫键。二硫键的平均键能为约60kcal/mol，相比于氢键的1～2kcal/mol。在本发明的上下文中，形成二硫键的半胱氨酸位于单链抗体的构架区内且用以使抗体的构形稳定化。半胱氨酸残基可例如由定点突变诱发引入，使得稳定二硫键可在分子内产生。
[0087]
如本文关于抗体所用，术语“竞争”是指第一抗体或其抗原结合片段(或部分)以足够类似于第二抗体或其抗原结合部分的结合的方式结合于表位，以使得与第一抗体在第二抗体不存在的情况下的结合相比，第一抗体在第二抗体存在下与其同源表位结合的结果可检测地减少。第二抗体在第一抗体存在下与其表位的结合亦可检测地减少的替代情况可以如此，但不必如此。亦即，第一抗体可抑制第二抗体与其表位的结合，而第二抗体不抑制第一抗体与其各表位的结合。然而，当各抗体可检测地抑制另一抗体与其同源表位或配体的结合时，无论程度相同、较大抑或较小，均称抗体彼此“交叉竞争”结合其各一个或多个表位。本发明涵盖竞争及交叉竞争抗体两者。无论此类竞争或交叉竞争发生的机制(例如位阻、构形变化或结合于共同表位或其部分)如何，本领域技术人员基于本文中所提供的教导内容将了解，此类竞争和/或交叉竞争抗体涵盖于且可适用于本文中所揭示的方法中。
[0088]
如本文所用，“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“adcc”是指细胞介导的反应，其中表达fc受体(fcr)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀手(nk)细胞、嗜中性粒细胞及巨噬细胞)识别目标细胞上的经结合抗体且随后引起目标细胞的溶解。相关分子的adcc活性可使用活体外adcc分析加以评估，诸如美国专利5,500,362或5,821,337中所描述的分析。此类分析中适用的效应细胞包括外周血液单核细胞(pbmc)及nk细胞。可替代地或另外，相关分子的adcc活性可在活体内，例如在动物模型中评估，诸如clynes等人，pnas(usa),95:652-656,1998中所揭示的动物模型。
[0089]
如本文所用，“补体依赖性细胞毒性”或“cdc”是指目标在补体存在下的溶解。补体活化路径由补体系统的第一组件(c1q)结合于与同源抗原复合的分子(例如抗体)来起始。为了评估补体活化，可以进行cdc分析，例如如gazzano-santoro等人，j.immunol.methods,202：163,1996中所述。
[0090]
如本文所用，术语“免疫特异性结合”、“免疫特异性识别”、“特异性结合”、“特异性
识别”及类似术语是指特异性结合于抗原(例如表位或免疫复合物)且不特异性结合于另一分子的分子，例如结合域。特异性结合于抗原的分子可以较低亲和力结合于其他肽或多肽，如由此项技术中已知的分析，例如免疫分析、biacore
tm
或其他分析所测定。优选地，特异性结合抗原的分子不与其他蛋白质交叉反应。
[0091]
术语“表位”是指在称为互补位的抗体的抗原结合区中的一或多处能够由抗体识别、接触和/或结合的分子的部分。单一抗原可具有多于一个的表位。因此，不同抗体可结合于抗原上的不同区域且可具有不同生物作用。表位通常由诸如氨基酸或糖侧链的分子的化学活性表面组组成，且具有特定三维结构特征以及荷质比特征。如本文所用，表位可为构形或线性的。构形表位由来自线性多肽链的不同区段的空间并置氨基酸产生。线性表位为由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。在某些实施方式中，表位可包括抗原上的糖类、磷酰基或磺酰基的部分。
[0092]
如本文所用，术语“抗原表位”定义为如由此项技术中熟知的任何方法，例如由常规免疫分析所测定，抗体可特异性结合的多肽的部分。“非线性表位”或“构形表位”包含抗原蛋白内的非连续多肽(或氨基酸)，该抗原蛋白与对表位具有特异性的抗体结合。一旦确定抗原上的所要表位，则有可能例如使用本文所述的技术产生针对该表位的抗体。
[0093]
当关于抗体与蛋白质或肽的相互作用使用时，术语“特异结合”或“特异性结合”是指取决于蛋白质上特定结构(亦即抗原决定子或表位)的存在的相互作用；换言的，抗体识别且结合于特定蛋白质结构而非一般地结合于蛋白质。举例而言，若抗体对表位“a”具有特异性，则含有表位a(或游离未标记a)的蛋白质在含有经标记“a”及抗体的反应中的存在将减少结合于抗体的经标记a的量。
[0094]
在某些实施方式中，“特异性结合”是指例如抗体以约0.1nm或更小，但更通常小于约1μm的kd结合蛋白质。在某些实施方式中，“特异性结合”是指抗体有时以至少约0.1μm或更小、在其他时间至少约0.01μm或更小且在其他时间至少约1nm或更小的kd结合目标。由于不同物种中的同源蛋白质之间的序列一致性，特异性结合可包括识别超过一个物种中的蛋白质(例如人类cd47及小鼠cd47)的抗体。同样，由于不同蛋白质的多肽序列的某些区域内的同源性，所以特异性结合可包括识别超过一种蛋白质的抗体。应理解，在某些实施方式中，特异性结合第一目标的抗体或结合部分可或可不特异性结合第二目标。因此，“特异性结合”不一定需要(尽管其可包括)排他性结合，亦即结合于单一目标。因此，在一些实施方式中，抗体可特异性结合超过一个目标。在某些实施方式中，多个目标可结合于抗体上的同一抗原结合位点。举例而言，抗体可在某些情况下包含两个相同抗原结合位点，其中的每一者特异性结合两个或更多个蛋白质上的相同表位。在某些替代实施方式中，抗体可为多特异性的且包含至少两个具有不同特异性的抗原结合位点。作为非限制性实例，双特异性抗体可包含识别一种蛋白质上的表位的一个抗原结合位点且还包含识别第二蛋白质上的不同表位的第二不同抗原结合位点。提及结合一般但未必意谓着特异性结合。
[0095]
特异性结合于抗原的抗体可以较低亲和力结合于其他肽或多肽，如由此项技术中已知的分析，例如免疫分析、biacore
tm
或其他分析所测定。优选地，特异性结合抗原的抗体不与其他蛋白质交叉反应。
[0096]
当关于抗体与蛋白质或肽的相互作用使用时，术语“非特异性结合”或“背景结合”是指不取决于特定结构的存在的相互作用(亦即，抗体一般地结合于蛋白质，而非特定结
构，诸如表位)。
[0097]
如本文所用，术语“k
on”或“k
a”是指抗体与抗原缔合的速率常数。
[0098]
如本文所用，术语“k
off”或“k
d”是指抗体自抗体/抗原复合物解离的速率常数。
[0099]
如本文所用，术语“k
d”是指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
[0100]
可例如使用基于表面等离子体共振的生物传感器，以在分析物关于结合经由捕捉试剂在低容量下固定于传感器表面上的配体为单价的条件下表征分析物/配体相互作用，分别测定缔合及解离速率常数k
on
及k
off
，以测定kd及其他比率。可例如使用如karlsson等人，anal.biochem349,136-147,2006中所述的动力学滴定方法或使用多循环动力学分析进行分析。选择用于给定分析的传感器芯片、捕捉试剂及分析缓冲剂以使配体稳定捕捉至传感器表面上，使分析物与表面的非特异性结合最小化，且产生根据myszka,j.mol.recognit12,279-284,1999中的建议适于动力学分析的分析物结合反应。每分析物/配体相互作用的分析物结合反应经双重参考且拟合至1:1朗谬(langmuir)“质量传输受限模型(mass transport limited model)”，其中ka、kd及r
max
为如myszka及morton等人，biophys.chem 64,127-137(1997)中所描述的全局参数。平衡解离常数kd由动力学速率常数的比率推导，kd＝k
off
/k
on
。此类测定优选在25℃或37℃下进行。通常，使用全抗体及单体(例如cd47蛋白质或pd-l1蛋白质)测量速率常数(k
on
/ka及k
off
/kd)及平衡解离常数。
[0101]
如本文所用，术语“结合亲和力”一般是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合搭配物(例如抗原)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对(例如抗体与抗原)成员之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子x对其搭配物y的亲和力一般可由解离常数(kd)表示。分子x对其搭配物y的亲和力一般可由解离常数(kd)表示。举例而言，kd可为约200nm、150nm、100nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm、8nm、6nm、4nm、2nm、1nm或更强。亲和力可由此项技术中已知的常用方法，包括本文所描述的彼等方法来测量。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原且倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原且倾向于较长时间保持结合状态。此项技术中已知多种测量结合亲和力的方法，其中任一者可用于本发明的目的。特别是，术语“结合亲和力”旨在指特定抗原-抗体相互作用的解离速率。kd为解离速率(rate of dissociation)(亦称为“解离速率(off-rate)(k
off
)”)与缔合速率(association rate)(或“缔合速率(on-rate)(k
on
)”)的比率。因此，kd等于k
off
/k
on
且表示为摩尔浓度(m)。因此kd越小则结合亲和力越强。因此，与1nm的kd相比，1μm的kd指示弱结合亲和力。抗体的kd值可使用此项技术中充分确立的方法测定。一种测定抗体kd的方法为由使用表面等离子体共振(spr)，通常使用生物传感器系统，诸如biacore系统。biacore动力学分析包含分析抗原与在表面上具有固定分子(例如包含表位结合域的分子)的芯片的结合及解离。另一种用于测定抗体的kd的方法是由使用生物层干扰测量(bio-layer interferometry)，通常使用技术(octet qke系统，fortebio)。
[0102]
关于本发明的双特异性抗体，诸如抗体、其片段或衍生物，“生物学上活性”、“生物活性”及“生物特征”除非另外规定，否则意谓着具有结合于生物学分子的能力。
[0103]
如本文所用，术语“多核苷酸”、“核酸”及“核苷酸序列”包括dna分子(例如cdna或基因组dna)、rna分子(例如mrna)、dna及rna分子的组合或杂交dna/rna分子及dna或rna分子的类似物。此类类似物可使用例如核苷酸类似物产生，其包括但不限于肌苷或三苯甲基
化碱基(tritylated base)。此类类似物亦可包含dna或rna分子，其包含对分子提供有益属性，诸如核酸酶抗性或跨细胞膜能力的增加的经修饰的主链。核酸或核苷酸序列可为单链、双链的，可含有单链及双链部分，且可含有三链部分，但优选为双链dna。
[0104]
如本文所用，术语“分离”是指自其原始环境(例如天然环境，若其为天然存在的)移出的材料。举例而言，存在于活动物中的天然存在的多核苷酸或多肽不为分离的，但与天然系统中的共存材料中的一些或全部分离的相同多核苷酸或多肽为分离的。此类多核苷酸可为载体的一部分和/或此类多核苷酸或多肽可为包含该多核苷酸或多肽的组合物，例如混合物、溶液或悬浮液或包含经分离细胞或经培养细胞的一部分，且仍为分离的，因为该载体或组合物并非其天然环境的一部分。本文所提供的任何分子可为分离的。
[0105]
如本文所用，术语“可操作地连接”是指所描述的组件处于准许其以其预期方式起作用的关系中的情境。举例而言，“可操作地连接”于编码序列的控制序列以使得编码序列的表达在适合于控制序列或与控制序列兼容的条件下实现的方式接合。一般而言，“可操作地连接”是指连接的dna序列邻接，且在分泌前导序列的情况下，邻接且处于阅读阶段。然而，增强子不必为邻接的。连接由在方便的限制位点处接合来实现。若此类位点不存在，则根据常规实践使用合成寡核苷酸接附子或接头。
[0106]
如本文所用，“载体”是指构建体，其能够在宿主细胞中递送，且优选表达一或多种相关基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸dna或rna表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的dna或rna表达载体、囊封于脂质体中的dna或rna表达载体，及某些真核细胞，诸如生产细胞。
[0107]
如本文所用，术语“表达控制序列”或“控制序列”是指实现与其接合的编码序列的表达所必需的多核苷酸序列。此类控制序列的性质视宿主生物体而不同。举例而言，在原核生物中，此类控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点及终止子，及在一些情况下，增强子。因此，术语“控制序列”旨在至少包括其存在为表达所必需的所有组件，且亦可包括其存在有利的额外组件，例如前导序列。
[0108]“宿主细胞”包括可为或已成为用于并入多核苷酸插入物的一个或多个载体的接受体的个别细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，且后代可能归因于天然、偶然或故意突变而不一定与原始母细胞完全一致(在形态或基因组dna互补序列方面)。宿主细胞包括活体内经本发明的一或多种多核苷酸转染的细胞。
[0109]
如本文所用，“哺乳动物细胞”包括提及来源于哺乳动物，包括人类、大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠、黑猩猩或猕猴的细胞。细胞可在活体内或活体外培养。
[0110]
如本文所用，术语“纯化产物”是指已与产物通常结合的细胞成分和/或与可存在于相关样品中的其他类型的细胞分离的产物制备物。
[0111]
如本文所用，“实质上纯的”是指至少50％纯(亦即，无污染物)、更优选至少90％纯、更优选至少95％纯、又更优选至少98％纯、且最优选至少99％纯的材料。
[0112]
如本文所用，术语“癌症”或“癌性”是指或描述哺乳动物中的生理病状，其特征通常为不受调控的细胞生长、由异常不可控细胞生长产生的赘瘤或肿瘤。在一些实施方式中，癌症是指尚未转移，保持局部化的恶性原发肿瘤。在其他实施方式中，癌症是指恶性肿瘤，其已侵袭及破坏邻近身体结构且扩散至远程部位。在一些实施方式中，癌症与特定癌症抗原相关。
[0113]
如本文所用，术语“恶性细胞”或“恶性病”是指侵袭性和/或能够进行转移的肿瘤或肿瘤细胞，亦即癌细胞。
[0114]
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是用于获得有益或所要临床结果的方法。出于本发明的目的，治疗定义为向个体，例如患者施用抗cd47、抗pd-l1或抗cd47/抗pd-l1抗体分子(例如cd47单克隆抗体、pd-l1单克隆抗体或cd47/pd-l1双特异性抗体)。此类投药可例如由向个体直接投药或由施用于返回至个体的来自个体的分离组织或细胞。抗cd47、抗pd-l1或cd47/pd-l1抗体分子可单独或与一或多种试剂组合施用。治疗可为治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、改善、缓和、改良或影响病症、病症的症状或对病症，例如癌症的倾向性。
[0115]
如本文所用，术语“个体”旨在包括任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人类、非人类灵长类动物、啮齿动物及其类似动物，其将为特定治疗的接受体。举例而言，个体可为患有癌症的患者(例如人类患者或兽医学患者)。通常，术语“个体(subject)”、“个体(individual)”及“患者”关于人类个体在本文中可互换使用。
[0116]
除非另外指出，否则本发明的术语“非人类动物”包括所有非人类脊椎动物，例如非人类哺乳动物及非哺乳动物，诸如非人类灵长类动物、绵羊、犬、牛、鸡、两栖动物、爬行动物、小鼠、大鼠、兔或山羊等。
[0117]
如本文所用，术语“医药学上可接受”是指由联邦政府或州政府的管理机构批准(或可批准)或列举于美国药典(u.s.pharmacopeia)或其他公认药典中用于动物，包括人类的产物或化合物。
[0118]
如本文所用，术语“医药学上可接受的赋形剂、载剂或佐剂”或“可接受的医药载剂”是指可与至少一种本发明的抗体一起向个体施用，且不会破坏抗体的活性的赋形剂、载剂或佐剂。当以足以递送治疗作用的剂量与抗体一起施用时，赋形剂、载剂或佐剂应为无毒性的。
[0119]
如本文所用，术语“改善”是指与未施用本发明的抗体分子相比一或多种症状的减轻或改良。“改善”亦包括缩短或减少症状的持续时间。
[0120]
如本文所用，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”及“预防(prevention)”是指由于施用预防剂或治疗剂预防个体的病症的一或多种症状的复发或发作。
[0121]
如本文所用，“有效量”、“治疗有效量”、“治疗足够量”或“有效剂量”是指治疗剂的任何量，其在向个体单次或多次剂量施用时，有效或足以预防、愈合、改善、治疗或管理疾病、病症或副作用，或降低疾病或病症的进展速率，或延长治愈、减轻、缓解或改良患有如本文所描述的病症的个体的病状，超出在无此类治疗的情况下所预期的状况。该术语在其范畴内亦包括有效增强正常生理功能的量。可在施用一或多种治疗剂的情形下考虑有效量，且若与一或多种其他试剂结合可达成或达成所期望的结果，则单一试剂可视为以有效量给与。
[0122]
如本文所用，肿瘤或癌症的“生长抑制”是指减缓、中断、遏制或阻止其生长和/或转移且不一定指示完全消除肿瘤生长。
[0123]
效能为以产生既定强度的作用所需的量表示的治疗剂活性的度量。相较于在低浓度下引起较小反应的较低效能的试剂，高效试剂在低浓度下引起更大反应。效能为亲和力及功效的函数。功效是指治疗剂在与目标配体结合时产生生物反应的能力及此反应的定量
量值。如本文所用，术语“半数最大有效浓度(ec
50
)”是指在指定暴露时间之后引起介于基线与最大值之间一半的反应的治疗剂浓度。治疗剂可引起抑制或刺激。ec
50
值常用，且在本文中用作效能的度量。
[0124]
如本文所用，“组合疗法”或“组合”施用是指使用超过一种预防剂和/或治疗剂。术语“组合疗法”或“组合”的使用不限制向患有病症的个体施用预防剂和/或治疗剂的次序。换言的，组合疗法可由用治疗剂分开、依序或同时治疗进行。在“依序投药”的情况下，当第二试剂被施用或在个体中变得具有活性时，第一个施用的试剂可正对个体发挥一些生理作用。
[0125]
如本文所用，关于施用预防剂和/或治疗剂的术语“同时施用”是指施用试剂，使得个别试剂同时存在于个体内。同时施用可受以单一组合物，或同时或在类似时间施用的单独组合物形式调配的分子影响。依序施用可根据需要按任何次序。
[0126]
如本文所用，“cd47”是指哺乳动物分化丛集47(cd47)蛋白质，优选人类cd47蛋白质。人类cd47的氨基酸序列及相关信息提供于例如uniprotkb编号a0a0a1tsg4下，其出于所有目的以引用的方式并入本文中。
[0127]
通常，cd47的天然存在的等位基因变体具有与uniprotkb编号a0a0a1tsg4中所述的蛋白质至少95％、97％或99％一致的氨基酸序列。cd47蛋白质表征为一种跨膜蛋白，其属于免疫球蛋白超家族，且与各种配体，诸如信号调节蛋白α(sirpα)、凝血栓蛋白-1(tsp-1)及膜整合素相互作用。cd47由各种类型的癌细胞过度表达。cd47配体sirpα表达于先天性免疫系统的各种细胞上，诸如巨噬细胞及树突状细胞(dc)。cd47与sirpα的结合抑制表达sirpα的免疫细胞的活性，且由此使得肿瘤细胞能够逃避先天性免疫系统监视。
[0128]
如本文所用，“结合于cd47的抗体”、“识别cd47的抗体”、“抗cd47抗体”、“抗cd47抗体分子”、“特异性结合cd47的抗体”、“cd47抗体”或其类似物包含含有至少一个特异性结合于cd47的结合域的分子。本发明的cd47抗体分子包括与cd47相互作用或识别cd47，例如结合(例如特异性结合)于cd47，例如人类cd47、小鼠cd47、大鼠cd47、食蟹猴cd47的其抗体。
[0129]
如本文所用，“pd-l1”是指哺乳动物程序性死亡-配体1(pd-l1)蛋白质，优选人类pd-l1蛋白质。pd-l1亦称为cd274或b7-h1。人类pd-l1的氨基酸序列及相关信息提供于例如uniprotkb编号q9nzq7下，其出于所有目的以引用的方式并入本文中。
[0130]
通常，pd-l1的天然存在的等位基因变体具有与uniprotkb编号q9nzq7中所述的蛋白质至少95％、97％或99％一致的氨基酸序列。pd-l1蛋白质表征为涉及抑制免疫系统的后天性队组，例如由结合于pd-1的跨膜蛋白。pd-l1由各种类型的癌细胞过度表达。pd-l1为受体pd-1的配体，pd-1在后天性免疫系统的细胞，诸如t细胞上表达。pd-l1与pd-1的结合抑制表达pd-1的免疫细胞的活性，且由此使得肿瘤细胞能够逃脱表达pd-1的免疫细胞(例如效应t细胞)。
[0131]
如本文所用，“结合于pd-l1的抗体”、“识别pd-l1的抗体”、“抗pd-l1抗体”、“抗pd-l1抗体分子”、“特异性结合pd-l1的抗体”、“pd-l1抗体”或其类似物包含含有至少一个特异性结合于pd-l1的结合域的分子。本发明的pd-l1抗体分子包括与pd-l1相互作用或识别pd-l1，例如结合(例如特异性结合)于pd-l1，例如人类pd-l1、小鼠pd-l1、大鼠pd-l1、食蟹猴pd-l1的其抗体。
[0132]
如本文所用，术语“cd47/pd-l1双特异性抗体”是指经设计以特异性结合于cd47及
pd-l1的分子。
[0133]
如本文所用，“第一多肽”为将与第二多肽结合的任何多肽。第一多肽及第二多肽在界面相接。除界面以外，第一多肽可包含一个或多个额外域，诸如“结合域”(例如抗体可变域、受体结合域、配体结合域或酶域)或抗体恒定域(或其部分)，包括ch2、ch1及cl域。通常，第一多肽将包含至少一个来源于抗体的结构域。此域适宜地为恒定域，诸如抗体的ch3结构域，且可形成第一多肽的界面。例示性第一多肽包括抗体重链多肽、组合抗体恒定域与异源多肽、受体多肽、配体多肽及抗体可变域多肽的结合域的嵌合体(例如双特异性抗体)。
[0134]
除界面以外，第二多肽亦可包含额外域，诸如“结合域”(例如抗体可变域、受体结合域、配体结合域或酶域)，或抗体恒定域(或其部分)，包括ch2、ch1及cl域。通常，第二多肽将包含至少一个来源于抗体的域。此域适宜地为恒定区，诸如抗体的ch3域，且可形成第二多肽的界面。例示性第二多肽包括抗体重链多肽、组合抗体恒定域与异源多肽及抗体可变域多肽的结合域的嵌合体(例如双特异性抗体)。
[0135]
如本文所用，术语“复合”或“复合的”是指两个或更多个经由并非肽键的键和/或力(例如，范德华力(van der waals)、疏水性力、亲水性力)彼此相互作用的分子的结合。在一个实施方式中，复合物为异多聚体。应理解，如本文所用，术语“蛋白质复合物”或“多肽复合物”包括蛋白质复合物中与蛋白质结合的非蛋白质实体(例如包括但不限于化学分子，诸如毒素或检测剂)的复合物。
[0136]
尽管可在本发明的实践或测试或测试中使用与本文所述类似或等效的任何材料及方法，但现描述优选材料及方法。
[0137]
【材料与方法】
[0138]
已描述用于产生抗体的各种技术，其包括用于制造单克隆抗体的传统融合瘤方法、用于制造抗体(包括嵌合抗体，例如人源化抗体)的重组技术、在转殖基因动物中产生抗体及用于制备“完全人类”抗体的最近描述的噬菌体呈现技术。
[0139]
本文提供制造本文所提供的抗体中的任一者的方法。本发明的抗体可由此项技术中已知的程序制造。多肽可由抗体的蛋白分解或其他降解、由如上文所描述的重组方法(亦即，单一或融合多肽)或由化学合成来产生。抗体的多肽(尤其至多约50个氨基酸的较短多肽)宜由化学合成来制造。化学合成的方法为此项技术中已知的且为市售的。举例而言，抗体可由采用固相方法的自动化多肽合成器产生。亦参见美国专利第5,807,715号；第4,816,567号；及第6,331,415号。
[0140]
用于制备双特异性抗体的任何适合方法均可用于制备本文所提供的双特异性抗体(例如视抗体特点及组件的选择而定)。
[0141]
根据一种制造双特异性抗体的方法，使具有所要结合特异性的抗体可变域与免疫球蛋白恒定区序列融合。融合优选与包含至少部分的铰链、ch2及ch3区的免疫球蛋白重链恒定区进行。在一些实施方式中，含有轻链结合位点的第一重链恒定区(ch1)可存在于融合物中的至少一者中。在一些实施方式中，编码免疫球蛋白重链融合物及必要时免疫球蛋白轻链的多核苷酸可插入单独表达载体中，且可共转染至适合宿主生物体中。在其他实施方式中，当相等比率的至少两条多肽链的表达产生高产率时或当比率不具有特定显著性时，可将两条或全部三条多肽链的编码序列插入一个表达载体中。
[0142]
在一个方法中，双特异性抗体是由一个臂中的具有第一结合特异性的杂交免疫球
蛋白重链及另一臂中的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。此不对称结构(其中免疫球蛋白轻链仅处于双特异性分子的一半中)有助于使所要双特异性化合物与不合需要的免疫球蛋白链组合分开。此方法描述于pct公开第wo94/04690号中。
[0143]
在另一方法中，双特异性抗体由一个臂中的第一铰链区中的氨基酸修饰构成，且第一铰链区中的经取代氨基酸与另一臂中的第二铰链区中的相应氨基酸具有相反电荷。该方法描述于国际专利申请案第pct/us2011/036419号(wo2011/143545)中。
[0144]
在另一方法中，由改变或工程改造第一与第二fc链之间的界面来增强所要异多聚或异源二聚体蛋白质(例如双特异性抗体)的形成。在此方法中，双特异性抗体可由ch3区构成，其中所述ch3区包含第一ch3多肽及第二ch3多肽，其在一起相互作用以形成ch3界面，其中ch3界面内的一个或多个氨基酸使均二聚体形成不稳定且在静电上不会不利于均二聚体形成。该方法描述于国际专利申请案第pct/us2011/036419号(wo2011/143545)中。在一些实施方式中，双特异性抗体的一个fc链可在人类igg2的铰链区中的位置223及228(例如(c223e或c223r)及(p228e或p228r))及ch3区中的位置409(例如k409r(eu编号方案))包含氨基酸修饰，且双特异性抗体的另一fc链可在人类igg2的铰链区中的位置223、225及228(例如(c223e或c223r)、(e225r)及(p228e或p228r))及ch3区中的位置368(例如l368e(eu编号方案))包含氨基酸修饰。在其他实施方式中，双特异性抗体的一个fc链可在人类igg2的铰链区中的位置223及228(例如(c223e或c223r)及(p228e或p228r))及ch3区中的位置368(例如l368e(eu编号方案))包含氨基酸修饰，且双特异性抗体的另一fc链可在人类igg2的铰链区中的位置223、225及228(例如(c223e或c223r)、(e225r)及(p228e或p228r))及ch3区中的位置409(例如k409r(eu编号方案))包含氨基酸修饰。在一些实施方式中，双特异性抗体可在人类igg1的铰链区中的位置221及228(例如(d221r或d221e)及(p228r或p228e))及ch3区中的位置409或368(例如k409r或l368e(eu编号方案))包含氨基酸修饰。在一些实施方式中，双特异性抗体可在人类igg4的铰链区中的位置228(例如(p228e或p228r))及ch3区中的位置409或368(例如r409或l368e(eu编号方案))包含氨基酸修饰。
[0145]
在一些实施方式中，双特异性抗体在fc链中可具有杵-臼突变。举例而言，在一些实施方式中，在具有杵-臼突变的双特异性抗体中，抗体fc结构域的第一fc链具有一个或多个突变以形成“杵”，且抗体fc结构域的第二fc链具有一个或多个突变以形成“臼”(或反的亦然)。抗体的例示性杵-臼工程改造描述于美国专利第5,731,168号、pct公开第wo2009089004号、美国公开第20090182127号、marvin及zhu,acta pharmacologica sincia(2005)26(6):649-658及kontermann(2005)acta pharacol.sin.,26:1-9中。
[0146]“杵”是指自第一多肽(例如，第一fc链)的界面突出的至少一个氨基酸侧链，且因此可定位于邻近第二多肽(例如，第二fc链)中的补偿性臼中，以便使异源二聚体体稳定化，且由此相对于均二聚体形成促进异源二聚体体形成。杵可存在于原始界面中或可以合成方式(例如由改变编码界面的核酸)引入。通常，编码第一多肽的界面的核酸经改变以编码杵。为达成此目的，编码第一多肽中的至少一个原始氨基酸残基的核酸经编码至少一个侧链体积大于原始氨基酸残基的“导入”氨基酸残基的核酸置换。用于形成杵的某些导入残基通常为天然存在的氨基酸残基且优选选自精氨酸(r)、苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)及色氨酸(w)。
[0147]“臼”是指至少一个自第二多肽(例如第二fc链)的界面凹入且因此容纳邻近第一多肽(例如第一fc链)中的对应杵的氨基酸侧链。臼可存在于原始界面中或可以合成方式
(例如由改变编码该界面的核酸)引入。通常，编码第二多肽的界面的核酸经改变，以编码该臼。为达成此目的，编码第二多肽的至少一个原始氨基酸残基的核酸被编码至少一个侧链体积比原始氨基酸残基小的“导入”氨基酸残基的dna置换。用于形成臼的某些导入残基通常为天然存在的氨基酸残基且优选选自丙氨酸(a)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)及缬氨酸(v)。
[0148]
如本文所用，术语“界面”通常是指存在于可涉及第一多肽及第二多肽接点的域中的任何氨基酸残基。“原始氨基酸”残基为被侧链体积可比原始残基更小或更大的“导入氨基酸”残基置换的残基。导入氨基酸残基可为天然存在或非天然存在的氨基酸残基，但优选为前者。“天然存在”的氨基酸残基为由遗传密码编码的彼等残基。“非天然存在”的氨基酸残基是指不由遗传密码编码，但能够共价结合多肽链中的一个或多个相邻氨基酸残基的残基。非天然存在的氨基酸残基的实例为正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸及其他氨基酸残基类似物，诸如ellman等人，meth.enzym.202:301-336(1991)中所述者。
[0149]
在一些实施方式中，双特异性抗体可具有wo2016166629中所提供任一双特异性抗体的任何特点或特征。
[0150]
视情况存在的双特异性抗体形式为基于共价连接双特异性异源二聚体双功能抗体结构的fv衍生策略，亦称为双亲和力再靶向蛋白质，其描述于例如以下文献中：美国专利公开第2007/0004909号、2009/0060910号及2010/0174053号。
[0151]
一旦已获得编码本发明的分子(亦即结合域)的核酸序列，即可由重组dna技术，使用此项技术中熟知的技术制造用于产生该分子的载体。
[0152]
编码本发明的抗体(例如抗cd47抗体、抗pd-l1抗体或cd47/pd-l1双特异性抗体)结合域的多核苷酸可包括可操作地连接于抗体编码序列的表达控制多核苷酸序列，其包括此项技术中已知的天然相关或异源启动子区。表达控制序列可为载体中能够转化或转染真核宿主细胞的真核启动子系统，但亦可使用用于原核宿主的控制序列。一旦载体已并入适当的宿主细胞系中，宿主细胞便在适合于表达核苷酸序列的条件下繁殖，且视需要用于收集及纯化抗体。真核细胞系包括cho细胞系、各种cos细胞系、hela细胞、骨髓瘤细胞系、经转化的b细胞或人类胚胎肾细胞系。
[0153]
在一个实施方式中，编码本发明抗体的dna是使用常规程序(例如由使用能够特异性结合于编码抗体重链及轻链的基因的寡核苷酸探针)分离及定序。dna一经分离，则可置放于表达载体中，该等载体接着转染至原本不产生免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞，诸如猴cos细胞、cho细胞或骨髓瘤细胞中，以在重组宿主细胞中达成单克隆抗体的合成。dna亦可经修饰以例如改良对应抗体的一或多种特性(例如结合亲和力、免疫原性等)。
[0154]
【抗cd47抗体】
[0155]
在一些实施方式中，本文提供抗cd47抗体。
[0156]
在一个实施方式中，提供抗cd47抗体，其包含(a)重链可变区(vh)，其包含seq id no：1、3、7、8或9中所示的vh序列的vh互补决定区一(vh cdr1)、vh互补决定区二(vh cdr2)，及vh互补决定区三(vh cdr3)；和/或(b)轻链可变区(vl)，其包含如seq id no：2或6中所示的vl序列的vl互补决定区一(vl cdr1)、vl互补决定区二(vl cdr2)及vl互补决定区三(vl cdr3)。
[0157]
在另一实施方式中，提供一种抗cd47抗体，其具有如表1中所列的vh中的任一者和/或vl序列中的任一者。表1中，带下划线的序列为根据kabat的cdr序列且粗体是根据
chothia的cdr序列。在一个实施方式中，本发明提供一种包含vh和/或vl的抗体，其中：(a)vh包含seq id no：1、3、7、8或9；和/或(b)vl包含seq id no：2或6。
[0158]
【表1：例示性抗cd47 vh及vl序列】
[0159][0160]
在一些实施方式中，本文提供的抗cd47抗体包含vh及vl，其中vh包含seq id no：1的序列且vl包含seq id no：2的序列。在一实施方式中，本文提供的抗cd47抗体包含vh及vl，其中vh包含seq id no：3的序列且vl包含seq id no：2的序列。在一实施方式中，本文提供的抗cd47抗体包含vh及vl，其中vh包含seq id no：7的序列且vl包含seq id no：2的序列。在一实施方式中，本文提供的抗cd47抗体包含vh及vl，其中vh包含seq id no：9的序列且vl包含seq id no：2的序列。在一实施方式中，本文提供的抗cd47抗体包含vh及vl，其中vh包含seq id no：8的序列且vl包含seq id no：6的序列。
[0161]
在一些实施方式中，本文提供的抗cd47抗体具有与具有不同结合特异性的多种不同抗体中相同的vl氨基酸序列。因此，对于本文所提供的各种抗体，抗体可具有不同vh序列，但具有相同vl序列。尽管此等抗体具有相同vl序列，但因为其具有不同vh序列，所以其具有彼此不同的结合亲和力和/或特异性。在一些实施方式中，共有相同vl序列的本文所提供的抗体特异性结合于不同抗原。举例而言，本文提供具有共有相同氨基酸序列的vl的抗cd47及抗pd-l1抗体。由超过一种抗体共有的本文所提供的vl序列在本文中称为“共同轻链”。表1提供作为本文所提供的抗体的一部分的各种共同轻链的序列信息。举例而言，“共同轻链1”vl由以下不同抗cd47及抗pd-l1抗体共有：cd47_p01a11_75；cd47_p01a11_497；
cd47_p01a11_亲本；cd47_p01a08_亲本；pd-l1_p06b05_245；pd-l1_p06b05_亲本；pd-l1_p06a09_亲本。在另一实例中，“共同轻链2”vl由以下不同抗cd47及抗pd-l1抗体共有：cd47_p14d04_亲本；pd-l1_d04d09_亲本vl。
[0162]
本发明亦提供针对cd47的抗体的cdr部分。
[0163]
在一个实施方式中，提供一种抗cd47抗体，其具有如表2中所列的vh cdr序列中的任一者和/或vl cdr序列中的任一者。在一个实施方式中，本发明提供一种特异性结合于cd47的抗体，其中所述抗体包含：(a)vh，其包含(i)包含seq id no：13、14、15、22、23、25、26、27、31、32、33、37、38或39的vh cdr1；(ii)包含seq id no：16、17、28、29、34或35的vh cdr2；及(iii)包含seq id no：18、24、30、36或40的vh cdr3；和/或(b)vl，其包含(i)包含seq id no：19或53的vl cdr1；(ii)包含seq id no：20或54的vl cdr2；及(iii)包含seq id no：21或55的vl cdr3。
[0164]
【表2：例示性抗cd47 cdr序列】
[0165]
no：10的氨基酸序列且vl包含seq id no：6的氨基酸序列。在一实施方式中，本文所提供的抗pd-l1抗体包含vh及vl，其中vh包含seq id no：11的氨基酸序列且vl包含seq id no：2的氨基酸序列。在一实施方式中，本文所提供的抗pd-l1抗体包含vh及vl，其中vh包含seq id no：12的氨基酸序列且vl包含seq id no：2的氨基酸序列。
[0175]
【表3：例示性抗pd-l1 vh及vl序列】
[0176][0177]
本发明亦提供针对pd-l1的抗体的cdr部分。
[0178]
在一个实施方式中，提供一种抗pd-l1抗体，其具有如表4中所列的vh cdr序列中的任一者和/或vl cdr序列中的任一者。在一个实施方式中，本发明提供一种特异性结合于pd-l1的抗体，其中抗体包含：(a)vh，其包含：(i)包含seq id no：41、42、43、47、48或49的vh cdr1；(ii)包含seq id no：44、45、50、51、58或59的vh cdr2；及(iii)包含seq id no：46、52、56、57或60的vh cdr3；和/或(b)vl，其包含(i)包含seq id no：19或53的vl cdr1；(ii)包含seq id no：20或54的vl cdr2；及(iii)包含seq id no：21或55的vl cdr3。
[0179]
【表4：例示性抗pd-l1 cdr序列】
[0180]
[0181][0182]
在一些实施方式中，本文提供一种抗pd-l1抗体，其中vh包含seq id no：4、5、10、11或12的序列，或在序列中具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代的其变体；和/或其中vl包含seq id no：2或6的序列，或在序列中具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代的其变体。任选地，取代为保守氨基酸取代。任选地，取代不在cdr区中。
[0183]
本发明亦涵盖本文提供的抗pd-l1抗体的scfv。亦涵盖单链抗体的其他形式，诸如双功能抗体或微型抗体。
[0184]
在一些实施方式中，本文所提供的抗pd-l1抗体为单克隆抗体。任选地，抗pd-l1抗体为人类抗体或人源化抗体。
[0185]
【cd47/pd-l1双特异性抗体】
[0186]
在一些实施方式中，本文提供cd47/pd-l1双特异性抗体。
[0187]
cd47/pd-l1双特异性抗体至少包含第一抗原结合部分(其特异性结合于cd47)及
第二抗原结合部分(其特异性结合于pd-l1)。在一些实施方式中，第一抗原结合部分包含第一vh且第二抗原结合部分包含第二vh。在一些实施方式中，第一抗原结合部分包含第一vh及第一vl，且第二抗原结合部分包含第二vh及第二vl。在一些实施方式中，第一vl及第二vl的氨基酸序列相同。
[0188]
本文提供的cd47/pd-l1双特异性抗体可含有本文提供的抗cd47抗体中的任一者(例如作为第一抗原结合部分)及本文提供的抗pd-l1抗体中的任一者(例如作为第二抗原结合部分)。
[0189]
在一些实施方式中，提供cd47/pd-l1双特异性抗体，其包含特异性结合于cd47的第一抗原结合部分及特异性结合于pd-l1的第二抗原结合部分，其中第一抗原结合部分包含vh和/或vl，其中：(a)vh包含seq id no：1且(b)vl包含seq id no：2；且第二抗原结合部分包含vh和/或vl，其中：(a)vh包含seq id no：4；且(b)vl包含seq id no：2。
[0190]
在一些实施方式中，提供cd47/pd-l1双特异性抗体，其包含特异性结合于cd47的第一抗原结合部分及特异性结合于pd-l1的第二抗原结合部分，其中第一抗原结合部分包含vh和/或vl，其中：(a)vh包含seq id no：3且(b)vl包含seq id no：2；且第二抗原结合部分包含vh和/或vl，其中：(a)vh包含seq id no：4；且(b)vl包含seq id no：2。
[0191]
在一些实施方式中，提供cd47/pd-l1双特异性抗体，其包含特异性结合于cd47的第一抗原结合部分及特异性结合于pd-l1的第二抗原结合部分，其中第一抗原结合部分包含如表2中所列的vh cdr序列中的任一者，且其中第二抗原结合部分包含如表4中所列的vh cdr序列中的任一者。
[0192]
在一些实施方式中，本文提供一种cd47/pd-l1双特异性抗体，其包含特异性结合于cd47的第一抗原结合部分及特异性结合于pd-l1的第二抗原结合部分，其中双特异性抗体含有如表5中所示的抗cd47抗体中的任一者的vh及vl或其cdr，且其中双特异性抗体含有如表5中所示的抗pd-l1抗体中的任一者的vh及vl或其cdr。
[0193]
【表5：抗cd47及抗pd-l1抗体的vh及vl序列】
[0194]
抗体vh seq id no:vl seq id no:cd47_p01a11_7512cd47_p01a11_49732cd47_p01a11_亲本72cd47_p14d04_亲本86cd47_p01a08_亲本92pd-l1_p06b05_24542pd-l1_p04d09_11356pd-l1_p04d09_亲本106pd-l1_p06b05_亲本112pd-l1_p06a09_亲本122
[0195]
在一些实施方式中，本文提供结合于cd47和/或pd-l1且与本文所述的抗体竞争结合于各抗原的抗体，例如与cd47_p01a11_75、cd47_p01a11_497、cd47_p01a11_亲本、cd47_p14d04_亲本或cd47_p01a08_亲本竞争结合于cd47，或与pd-l1_p06b05_245、pd-l1_p04d09_113、pd-l1_p04d09_亲本、pd-l1_p06b05_亲本或pd-l1_p06a09_亲本竞争结合于
pd-l1。
[0196]
如本文所述的抗体针对cd47或pd-l1的结合亲和力(kd)可为约0.001nm至约6500nm。在一些实施方式中，结合亲和力是约以下中的任一者：6500nm、6000nm、5500nm、4500nm、4000nm、3500nm、3000nm、2500nm、2000nm、1500nm、1000nm、750nm、500nm、400nm、300nm、250nm、200nm、150nm、100nm、75nm、50nm、45nm、40nm、35nm、30nm、25nm、20nm、19nm、17nm、16nm、15nm、10nm、8nm、7.5nm、7nm、6.5nm、6nm、5.5nm、5nm、4nm、3nm、2nm、1nm、0.5nm、0.3nm、0.1nm、0.01nm、0.002nm或0.001nm。在一些实施方式中，结合亲和力小于约以下中的任一者：6500nm、6000nm、5500nm、5000nm、4000nm、3000nm、2000nm、1000nm、900nm、800nm、500nm、250nm、200nm、100nm、50nm、30nm、20nm、10nm、7.5nm、7nm、6.5nm、6nm、5nm、4.5nm、4nm、3.5nm、3nm、2.5nm、2nm、1.5nm、1nm、0.5nm、0.1nm、0.05nm、0.01nm或更小nm。
[0197]
在一些实施方式中，本文提供的cd47/pd-l1双特异性抗体对pd-l1的亲和力比cd47更大(例如抗体的第二抗原结合部分对pd-l1的亲和力比抗体的第一抗原结合部分对cd47的亲和力大)。不希望受理论约束，对于pd-l1的亲和力比cd47更大的cd47/pd-l1双特异性抗体可能为合乎需要的，以便减少可能由抗体的抗cd47抗体结合部分引起的潜在副作用或毒性。除了表达于各种癌细胞上以外，cd47表达于广泛范围的健康人类细胞(包括红细胞(rbc))中，且归因于抗cd47抗体与健康细胞的结合，存在来自抗cd47抗体的显著不期望副作用的可能性。含有相对较低亲和力抗cd47抗原结合部分的cd47/pd-l1双特异性抗体由于此类双特异性抗体对于健康细胞，诸如rbc(其表达cd47蛋白质但不表达pd-l1蛋白质)的亲和力相对较低，且此类双特异性抗体对于癌细胞(其常表达cd47及pd-l1两者)的亲和力相对较高，可相对于健康细胞优先结合于癌细胞。在一些实施方式中，在相比cd47，对于pd-l1具有更大亲和力的本文提供的cd47/pd-l1双特异性抗体中，相比于抗体的抗cd47结合部分对于cd47具有的亲和力，抗体的抗pd-l1结合部分对于pd-l1具有至少2
×
(亦即2倍)、3
×
、5
×
、10
×
、20
×
、50
×
、100
×
、200
×
、500
×
、1000
×
、2000
×
或5000
×
更大的亲和力。在一些实施方式中，在相比cd47，对于pd-l1具有更大亲和力的本文提供的cd47/pd-l1双特异性抗体中，抗体的抗pd-l1结合部分对pd-l1的结合亲和力(kd)大约或小于10nm、5nm、3nm、2nm、1nm、0.9nm、0.8nm、0.7nm、0.6nm、0.5nm、0.4nm、0.3nm、0.2nm或0.1nm，且抗体的抗cd47结合部分对cd47的结合亲和力(kd)大约或小于1000nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、100nm、50nm、20nm或10nm，其中抗体的抗pd-l1结合部分对pd-l1的亲和力比抗体的抗cd47结合部分对cd47的亲和力大至少2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍或5000倍(亦即以nm计更小的值，因为较大亲和力由较低nm值指示)。
[0198]
在一些实施方式中，本文提供的cd47/pd-l1双特异性抗体对于cd47及pd-l1具有类似亲和力。
[0199]
本文提供的cd47/pd-l1双特异性抗体可具有任何适合形式。在一些实施方式中，本文所提供的双特异性抗体包含全长人类抗体。在一些实施方式中，人类抗体具有igg1、igg2、igg3或igg4同型。在一些实施方式中，抗体包含免疫惰性fc链。
[0200]
在一些实施方式中，本文提供的双特异性cd47/pd-l1抗体可具有如suurs,f.v.等人，pharmacology&therapeutics,201(2019)第103-119页中所述的形式。
[0201]
任选地，双特异性抗体可由在vh与vl之间用短接头(例如约3～10个残基)构建scfv片段以使得实现v区的链间而非链内配对，从而产生二价片段，亦即具有两个抗原结合
位点的片段来制备。双特异性抗体可衍生自全长抗体或抗体片段(例如f(ab')2双特异性抗体)。双功能抗体更充分描述于例如ep404,097；wo93/11161；及hollinger等人，proc.natl.acad.sci.usa 90:6444-6448,1993中。
[0202]
本发明涵盖包含fc链或域或其部分的双特异性抗体。在一些实施方式中，fc链或其一个或多个部分包含igg1、igg2、igg3或igg4的fc链的一个或多个恒定域(例如，ch2或ch3域)。在另一实施方式中，本发明涵盖包含fc链或其部分的分子，其中fc链或其部分相对于相当野生型fc链或其部分包含至少一个氨基酸修饰(例如取代)。变异fc链为此项技术中熟知，且主要用于改变包含变异fc链的抗体的表型，如在此项技术中熟知的结合活性或效应功能分析，例如elisa、spr分析或adcc中的任一者中所分析。此类变异fc链或其部分可延长包含fc链或其部分的本发明的双特异性抗体所展现的血浆半衰期及稳定性。在另一实施方式中，本发明涵盖此项技术中已知的任何fc变体的用途。
[0203]
在一些实施方式中，对fc链的氨基酸进行一个或多个修饰以降低fc链，且因此降低本发明的双特异性抗体分子对一或多种fcγr受体的亲和力及亲合力。在一特定实施方式中，本发明涵盖包含变异fc链或其部分的双特异性抗体，其中变异fc链相对于野生型fc链包含至少一个氨基酸修饰，该变异fc链仅结合一种fcγr，其中fcγr为fcγriiia。在另一特定实施方式中，本发明涵盖包含变异fc链或其部分的双特异性抗体，其中变异fc链相对于野生型fc链包含至少一个氨基酸修饰，该变异fc链仅结合一种fcγr，其中fcγr为fcγriia。在另一特定实施方式中，本发明涵盖包含变异fc链或其部分的双特异性抗体，其中变异fc链相对于野生型fc链包含至少一个氨基酸修饰，该变异fc链仅结合一种fcγr，其中fcγr为fcγriib。在另一实施方式中，本发明涵盖包含变异fc链的分子，其中变异赋予或介导相对于不包含fc链或包含野生型fc链的分子，adcc活性(或其他效应功能)的降低和/或与fcγriib(cd32b)的结合增加，如使用本领域技术人员已知及本文所描述的方法所测量。
[0204]
本发明亦涵盖包含来自两种或更多种igg同型的域或区的fc链的用途。如此项技术中已知，fc链的氨基酸修饰可深刻地影响fc介导的效应功能和/或结合活性。然而，当在所选igg同型的情形下实施时，功能特征的此等改变可进一步改良和/或操纵。类似地，同型fc的原生特征可由一个或多个氨基酸修饰操纵。多个igg同型(亦即igg1、igg2、igg3及igg4)由于其铰链和/或fc链的氨基酸序列差异，展现不同的物理及功能特性，包括血清半衰期、补体结合、fcγr结合亲和力及效应功能活性(例如adcc、cdc)。
[0205]
在一些实施方式中，氨基酸修饰及igg fc链基于其各单独结合和/或效应功能活性独立地选择，以便工程改造具有所要特征的双特异性抗体。在一特定实施方式中，氨基酸修饰及igg铰链/fc链已如本文所描述或在igg1的情形下此项技术中已知，分别针对结合和/或效应功能活性进行分析。在一个实施方式中，在双特异性抗体或其他含fc分子(例如，及免疫球蛋白)的情形下，氨基酸修饰及igg铰链/fc链展示类似功能性，例如adcc活性(或其他效应功能)降低和/或与fcγriib的结合增加。在另一实施方式中，本发明涵盖包含展现新颖特性的此项技术中已知的氨基酸修饰及所选择igg区域的组合的变异fc链，该等特性在修饰和/或区域独立地如本文所述分析时不可检测。
[0206]
在一些此类实施方式中，本发明的双特异性抗体包含第一多肽链上的第一异源二聚体体促进域及第二多肽链上的第二异源二聚体体促进域。结合在一起，第一及第二异源
二聚体体促进域驱动异源二聚体化和/或稳定化双特异性抗体(例如由互补异源二聚体体促进域上杵及臼的相互作用)和/或用于稳定化双特异性抗体。
[0207]
在一些实施方式中，本文所提供的双特异性抗体的fc结构域包含第一fc链及第二fc链，其中第一及第二fc链中的每一者相较于野生型fc链包含至少一个氨基酸修饰，以形成杵或臼。在一些实施方式中，第一fc链包含杵且第二fc链包含臼。在一些实施方式中，第一fc链可包含ch2和/或ch3域，其经修饰以包含杵或臼。在一些实施方式中，第一fc链包含突变y349c和/或t366w，形成杵；且第二fc链包含突变s354c、t366s、l368a和/或y407v，形成臼(编号根据eu索引)。在一些特定实施方式中，突变引起效应功能降低。
[0208]
在前述每一者的特定实施方式中，第一fc链包含seq id no：65的序列以形成杵(具有杵突变的人类igg1 fc链)；且第二fc链包含seq id no：66的序列以形成臼(具有臼突变的人类igg1 fc链)。
[0209]
任选地，本文提供的抗cd47 vh可基因融合至seq id no：65或seq id no：66的氨基酸序列以形成双特异性抗体的第一重链，且本文提供的抗pd-l1 vh可基因融合至seq id no：65或seq id no：66的氨基酸序列以形成双特异性抗体的第二重链，其中一者基因融合至seq id no：65且另一者基因融合至seq id no：66。任选地，含有seq id no：65或seq id no：66的氨基酸序列的本文提供的抗cd47或抗pd-l1重链可不具有seq id no：65或seq id no：66的c端赖氨酸。换言的，在一些情况下，本文所提供的抗体的重链的c端赖氨酸可以自抗体裂解，且此类缺失c端赖氨酸的抗体包括在本文所提供的抗体重链的范畴内。
[0210]
在一些实施方式中，提供cd47/pd-l1双特异性抗体，其具有如表6a中所提供的抗cd47重链及抗pd-l1重链氨基酸序列。表6a中的两个抗cd47重链在fc链中具有臼突变，且抗pd-l1重链在fc链中具有杵突变。在一些实施方式中，本文提供cd47/pd-l1双特异性抗体，其包含：包含如seq id no：61中所示的氨基酸序列的抗cd47重链及包含如seq id no：64中所示的氨基酸序列的抗pd-l1重链。任选地，cd47/pd-l1双特异性抗体可还包含包括如seq id no：62中所示的氨基酸序列的轻链的两个复本。包含如seq id no：62中所示的氨基酸序列的轻链是共同轻链，且其可与抗cd47重链且与抗pd-l1重链配对。在一些实施方式中，本文提供cd47/pd-l1双特异性抗体，其包含：包含如seq id no：63中所示的氨基酸序列的抗cd47重链及包含如seq id no：64中所示的氨基酸序列的抗pd-l1重链。任选地，cd47/pd-l1双特异性抗体可还包含包括如seq id no：62中所示的氨基酸序列的轻链的两个复本。
[0211]
【表6a：例示性cd47/pd-l1双特异性抗体的重链及轻链序列】
[0212][0213][0214]
在包括具有重链的抗体的本文所提供的任何实施方式中，包括在实施例范畴内的是在重链中不具有c端赖氨酸的抗体。因此，例如对于包括具有如seq id no：61中所示的氨基酸序列的重链的本文所提供的抗体，亦提供除seq id no：61的c端赖氨酸以外具有如seq id no：61中所示的氨基酸序列的抗体。在另一实例中，对于包括具有如seq id no：63中所示的氨基酸序列的重链的本文所提供的抗体，亦提供除seq id no：63的c端赖氨酸以外具有如seq id no：63中所示的氨基酸序列的抗体。在另一实例中，对于包括具有如seq id no：64中所示的氨基酸序列的重链的本文所提供的抗体，亦提供除seq id no：64的c端赖氨酸以外具有如seq id no：64中所示的氨基酸序列的抗体。在一些实施方式中，本文提供cd47/pd-l1双特异性抗体，其包含具有如seq id no：61中所示的氨基酸序列的第一重链及具有如seq id no：64中所示的氨基酸序列的第二重链，其中重链中的两者均不、一者或两者缺失各重链序列的c端赖氨酸。在一些实施方式中，本文提供cd47/pd-l1双特异性抗体，其包含具有如seq id no：63中所示的氨基酸序列的第一重链及具有如seq id no：64中所
示的氨基酸序列的第二重链，其中重链中的两者均不、一者或两者缺失各重链序列的c端赖氨酸。
[0215]
在一个实施方式中，本文提供一种cd47/pd-l1双特异性抗体，其中双特异性抗体包含对cd47具有特异性的第一重链、对pd-l1具有特异性的第二重链及共同轻链；其中第一重链具有由atcc保藏且具有atcc保藏号pta-126910的质粒的插入物的核酸序列编码的氨基酸序列；第二重链具有由atcc保藏且具有atcc保藏号pta-126911的质粒的插入物的核酸序列编码的氨基酸序列；且共同轻链具有由atcc保藏且具有atcc保藏号pta-126912的质粒的插入物的核酸序列编码的氨基酸序列。
[0216]
【多核苷酸及产生、表征及修饰抗体的方法】
[0217]
本发明亦包括编码本发明抗体的多核苷酸，包括抗体的多肽及结合区。由此项技术中已知的任何方法，可获得编码本发明的分子的多核苷酸，且测定多核苷酸的核苷酸序列。
[0218]
编码本发明抗体的多核苷酸可包括以下：仅变体的编码序列、变体的编码序列及额外编码序列，诸如功能性多肽，或信号或分泌序列或原蛋白序列；抗体的编码序列及非编码序列，诸如内含子或抗体的编码序列5'和/或3'的非编码序列。术语“编码抗体的多核苷酸”涵盖包括变体的额外编码序列的多核苷酸以及包括额外编码和/或非编码序列的多核苷酸。此项技术中已知针对特定宿主细胞/表达系统优化的多核苷酸序列可容易地自所要蛋白质的氨基酸序列获得(参见公司，regensburg,germany)。
[0219]
在一些实施方式中，本文提供包含编码本文别处(例如表1、2、3、4或5中的任一者中)提供的抗cd47或抗pd-l1抗体的氨基酸序列中的任一者的核苷酸序列的多核苷酸。本文亦提供包含多核苷酸的相关载体及宿主细胞。
[0220]
在一些实施方式中，本文提供编码特异性结合于cd47的抗体的vh的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含如seq id no：67或69中所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，本文提供编码特异性结合于cd47及pd-l1的抗体的共同轻链的vl的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含如seq id no：68中所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，本文提供编码特异性结合于pd-l1的抗体的vh的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含如seq id no：70中所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，本文提供编码特异性结合于cd47的抗体的重链的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含如seq id no：71或73中所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，本文提供编码特异性结合于cd47及pd-l1的抗体的共同轻链的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含如seq id no：72中所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，本文提供编码特异性结合于pd-l1的抗体的重链的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含如seq id no：74中所示的核苷酸序列。本文亦提供包含多核苷酸的相关载体及宿主细胞，该多核苷酸包含如seq id no：67-74中的任一者中所示的核苷酸序列。
[0221]
在一些实施方式中，本文提供包含如表6b中所示的核苷酸序列的多核苷酸。
[0222]
【表6b】
[0223]
[0224]
[0225][0226][0227]
本发明亦涵盖与任何此类序列互补的多核苷酸。多核苷酸可为单链(编码或反义)
或双链，且可为dna(基因组、cdna或合成)或rna分子。rna分子包括成熟及不成熟mrna，诸如前驱mrna(pre-mrna)或异质核mrna(heterogeneous nuclear mrna，hnrna)及成熟mrna。额外编码或非编码序列可但不必存在于本发明的多核苷酸内，且多核苷酸可但不必连接于其他分子和/或支撑材料。
[0228]
一般本领域技术人员应了解，由于遗传密码的简并，存在许多编码本文所提供的氨基酸序列的核苷酸序列。本发明尤其考虑由于密码子使用差异而变化的多核苷酸。
[0229]
在一个实施方式中，本文提供至少编码特异性结合于cd47的抗体的vh的经分离核酸，其中核酸包含atcc保藏且具有atcc保藏号pta-126910的质粒的插入物的核酸序列。本文亦提供一种多肽，其具有由atcc保藏且具有atcc保藏号pta-126910的质粒的插入物的核酸序列编码的氨基酸序列。
[0230]
在一个实施方式中，本文提供至少编码特异性结合于cd47及pd-l1的抗体的共同轻链的vl的经分离核酸，其中核酸包含atcc保藏且具有atcc保藏号pta-126912的质粒的插入物的核酸序列。本文亦提供一种多肽，其具有由atcc保藏且具有atcc保藏号pta-126912的质粒的插入物的核酸序列编码的氨基酸序列。
[0231]
在一个实施方式中，本文提供至少编码特异性结合于pd-l1的抗体的vh的经分离核酸，其中核酸包含atcc保藏且具有atcc保藏号pta-126911的质粒的插入物的核酸序列。本文亦提供一种多肽，其具有由atcc保藏且具有atcc保藏号pta-126911的质粒的插入物的核酸序列编码的氨基酸序列。
[0232]
在一个实施方式中，本发明提供一种制造本文所描述的多核苷酸中的任一者的方法。举例而言，本发明的多核苷酸可使用化学合成、重组方法或pcr获得。化学多核苷酸合成方法为此项技术中所熟知且无需详细描述于本文中。本领域技术人员可使用本文所提供的序列及商用dna合成器以产生所要dna序列。
[0233]
为使用重组方法制备多核苷酸，包含所要序列的多核苷酸可插入适合载体中，且继而载体可引入适合宿主细胞中以进行复制及扩增，如本文中进一步论述。多核苷酸可由此项技术中已知的任何手段插入至宿主细胞中。细胞由直接吸收、内饮作用、转染、f-配对或电穿孔由引入外源性多核苷酸来转化。一旦引入，外源性多核苷酸可作为非整合型载体(诸如质粒)保持在细胞内或整合至宿主细胞基因组中。如此扩增的多核苷酸可由此项技术内熟知的方法自宿主细胞分离(例如sambrook等人，1989)。
[0234]
或者，pcr允许dna序列复制。pcr技术在此项技术中熟知且描述于美国专利第4,683,195号、第4,800,159号、第4,754,065号及第4,683,202号，以及pcr：the polymerase chain reaction,mullis等人编，birkauswer press,boston,1994中。
[0235]
rna可由使用适当载体中的经分离dna且将其插入适合宿主细胞内获得。当细胞复制且dna转录成rna时，rna可随后使用本领域技术人员熟知的方法分离，如例如前述sambrook等人，1989中所阐述。
[0236]
适合克隆载体可根据标准技术构建，或可选自此项技术中大量可用的克隆载体。尽管所选克隆载体可根据旨在使用的宿主细胞变化，但适用克隆载体将一般能够自我复制，可具有特定限制性核酸内切酶的单一目标，和/或可携带可用于选择含有载体的克隆的标记物的基因。适合实例包括质粒及细菌病毒，例如puc18、puc19、bluescript(例如pbs sk+)及其衍生物、mp18、mp19、pbr322、pmb9、cole1、pcr1、rp4、噬菌体dna及穿梭载体，诸如
psa3及pat28。此等及许多其他克隆载体可购自商业供货商，诸如biorad、strategene及invitrogen。
[0237]
表达载体通常为含有根据本发明的多核苷酸的可复制多核苷酸构建体。此意味着表达载体，作为游离基因组或作为染色体dna的整体部分，在宿主细胞中必须为可复制的。适合表达载体包括但不限于质粒、病毒载体(包括腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒)、粘粒及pct公开第wo87/04462号中所揭示的一或多种表达载体。载体组件可一般包括但不限于以下中的一或多者：信号序列；复制起点；一个或多个标记基因；适合转录控制组件(诸如启动子、增强子及终止子)。对于表达(亦即翻译)而言，通常亦需要一或多种翻译控制组件，诸如核糖体结合位点、翻译起始位点及终止密码子。
[0238]
含有相关多核苷酸的载体可由许多适当手段中的任一者引入宿主细胞中，该等手段包括电穿孔、采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、deae-葡聚糖或其他物质的转染；微弹轰击；脂质体转染；及感染(例如其中载体为诸如痘苗病毒的传染剂)。引入载体或多核苷酸的选择将通常视宿主细胞的特点而定。
[0239]
能够过度表达异源dna的任何宿主细胞均可用于表达编码相关抗体、多肽或蛋白质的基因的目的。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括但不限于cos、hela及cho细胞。亦参见pct公开第wo87/04462。适合的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(诸如大肠埃希氏菌(e.coli)或枯草芽孢杆菌(b.subtilis))及酵母(诸如酿酒酵母(s.cerevisae)、粟酒裂殖酵母(s.pombe)或乳酸克鲁维酵母(k.lactis))。过度表达相关抗体或蛋白质的细胞可由已知筛选方法鉴别。
[0240]
本发明亦涵盖对本文所提供的抗体，包括功能上等效的抗体的不显著影响其特性的修饰，及具有增强或降低的活性和/或亲和力的变体。举例而言，氨基酸序列可经突变以获得具有针对cd47和/或pd-l1的所要结合亲和力的抗体。经修饰多肽的实例包括具有不使功能活性产生显著有害变化，或使多肽对其配体的亲和力成熟(增强)的氨基酸残基的保守取代、氨基酸的一个或多个缺失或添加的多肽，或使用化学类似物。
[0241]
氨基酸序列插入包括长度在一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽范围内的氨基末端和/或羧基末端融合，以及单一个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有n端甲硫胺酰基残基的抗体或融合至表位标记的抗体。抗体分子的其他插入型变体包括与酶或多肽的抗体的n端或c端的融合体，其增加抗体在血液循环中的半衰期。
[0242]
取代变体将抗体分子中的至少一个氨基酸残基移除且将不同残基插入其位置。取代型突变诱发的最相关位点包括可变区，但亦考虑fr变化。保守取代展示于表7中的标题“保守取代”下。若此类取代使得生物活性变化，则可引入表7中命名为“例示性取代”或如下文关于氨基酸类别所进一步描述的更实质性变化，且筛选产物。
[0243]
【表7：氨基酸取代】
[0244][0245][0246]
抗体生物特性的实质性修饰是由选择维持以下的作用显著不同的取代来实现：(a)多肽主链在取代区域中的结构，例如呈片状或螺旋构形；(b)分子在目标位点的电荷或疏水性；或(c)侧链的体积。基于常见侧链特性，将天然存在的氨基酸残基划分成以下组：
[0247]
(1)非极性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
[0248]
(2)极性不带电荷：cys、ser、thr、asn、gln；
[0249]
(3)酸性(带负电)：asp、glu；
[0250]
(4)碱性(带正电)：lys、arg；
[0251]
(5)影响链定向的残基：gly、pro；及
[0252]
(6)芳族：trp、tyr、phe、his。
[0253]
非保守取代由将此等类别中的一者的成员换成另一类别来进行。
[0254]
不涉及维持抗体的恰当构形的任何半胱氨酸残基一般亦可经丝氨酸取代，以提高分子的氧化稳定性及防止异常交联。反的，可将一个或多个半胱氨酸键添加至抗体中以提高其稳定性，尤其在抗体为诸如fv片段的抗体片段的情况下。
[0255]
氨基酸修饰可在改变或修饰一个或多个氨基酸至完全重新设计某区域，诸如可变区的范围内。可变区中的变化可改变结合亲和力和/或特异性。在一些实施方式中，在cdr域内进行不超过一至五个保守氨基酸取代。在其他实施方式中，在cdr域内进行不超过一至三个保守氨基酸取代。在再其他实施方式中，cdr域为vh cdr3和/或vl cdr3。
[0256]
修饰亦包括糖基化及非糖基化多肽，以及具有其他翻译后修饰，诸如使用不同糖的糖基化、乙酰化及磷酸化的多肽。抗体在其恒定区中的保守位置处糖基化(jefferis及
lund,chem.immunol.65:111-128,1997；wright及morrison,tibtech15:26-32,1997)。免疫球蛋白的寡糖侧链影响蛋白质功能(boyd等人，mol.immunol.32:1311-1318,1996；wittwe及howard,biochem.29:4175-4180,1990)及糖蛋白的部分之间的分子内相互作用，其可影响糖蛋白的构形及所呈现的三维表面(jefferis及lund，同上；wyss及wagner,current opin.biotech.7:409-416,1996)。寡糖亦可用以基于特定识别结构将给定糖蛋白靶向至某些分子。亦已报导抗体的糖基化影响抗体依赖性细胞毒性(adcc)。特定而言，据报导，具有β(1,4)-n-乙酰葡糖氨基转移酶iii(gntiii)(一种糖基转移酶，其催化等分glcnac的形成)的四环素调节的表达的cho细胞具有提高的adcc活性(umana等人，mature biotech.17:176-180,1999)。
[0257]
抗体的糖基化通常为n连接型或o连接型。n连接型是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链连接。三肽序列天冬酰胺-x-丝氨酸、天冬酰胺-x-苏氨酸及天冬酰胺-x-半胱氨酸(其中x为除了脯氨酸之外的任何氨基酸)为用于碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的酶连接的识别序列。因此，在多肽中此等三肽序列中的任一者的存在产生潜在糖基化位点。o连接型糖基化是指糖n-乙酰基半乳胺糖、半乳糖或木糖中的一者连接于羟氨基酸，最常见为丝氨酸或苏氨酸，但亦可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
[0258]
宜由改变氨基酸序列从而使其含有上述三肽序列中的一或多者，来实现向抗体添加糖基化位点(针对n连接型糖基化位点)。亦可由向原始抗体的序列添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代原始抗体的序列来进行改变(针对o连接型糖基化位点)。
[0259]
亦可在不改变基本核苷酸序列的情况下改变抗体的糖基化模式。糖基化很大程度上取决于用于表达抗体的宿主细胞。因为用于重组糖蛋白，例如作为潜在治疗剂的抗体的表达的细胞类型很少为原生细胞，所以可预期抗体糖基化模式的改变(参见例如hse等人，j.biol.chem.272:9062-9070,1997)。
[0260]
除了宿主细胞的选择之外，在重组产生抗体期间影响糖基化的因素包括生长模式、培养基配方，培养物密度、加氧作用、ph值、纯化流程及其类似因素。已提出各种方法来改变在特定宿主生物体中实现的糖基化模式，包括引入或过度表达某些涉及寡糖产生的酶(美国专利第5,047,335号；第5,510,261号及第5,278,299号)。糖基化或某些类型的糖基化可自糖蛋白酶移除，例如使用内切糖苷酶h(endo h)、n-糖苷酶f、内切糖苷酶f1、内切糖苷酶f2、内切糖苷酶f3。另外，重组宿主细胞可经基因工程改造为在处理某些类型的多糖中有缺陷。此等及类似技术为此项技术中所熟知。
[0261]
其他修饰方法包括使用此项技术中已知的偶联技术，包括但不限于酶促方式、氧化取代及螯合。修饰可例如用于连接用于免疫分析的标记。经修饰的多肽使用此项技术中已确立的程序制造且可使用此项技术中已知的标准分析筛选，该等标准分析中一些描述于下文及实例中。
[0262]
在本发明的一些实施方式中，抗体包含经修饰的恒定区，诸如对人类fcγ受体具有增加的亲和力的恒定区，为免疫惰性或部分惰性的，例如不触发补体介导的溶解，不刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)，或不活化巨噬细胞；或在以下中的任何一或多者中具有降低的活性(相较于未经修饰的抗体)：触发补体介导的溶解、刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)或活化微神经胶质细胞。恒定区的不同修饰可用于实现效应功能的
最佳水平和/或组合。参见例如morgan等人，immunology86:319-324,1995；lund等人，j.immunology 157:4963-9 157:4963-4969,1996；idusogie等人，j.immunology 164:4178-4184,2000；tao等人，j.immunology143：2595-2601,1989；及jefferis等人，immunological reviews 163:59-76,1998。在一些实施方式中，恒定区如eur.j.immunol.,29:2613-2624,1999；pct申请案第pct/gb99/01441号；和/或英国申请案第9809951.8号中所述来修饰。在再其他实施方式中，使恒定区对于n连接型糖基化非糖基化。在一些实施方式中，由使糖基化氨基酸残基或作为恒定区中的n-糖基化识别序列的一部分的侧接残基突变，使恒定区对于n连接型糖基化非糖基化。举例而言，n-糖基化位点n297可突变成a、q、k或h。参见tao等人，j.immunology 143：2595-2601,1989；及jefferis等人，immunological reviews 163:59-76,1998。在一些实施方式中，使恒定区对于n连接型糖基化非糖基化。可以酶促方式(诸如由酶pngase移除碳水化合物)或由在有糖基化缺陷的宿主细胞中表达使恒定区对于n连接型糖基化非糖基化。
[0263]
其他抗体修饰包括如pct公开第wo99/58572号中所述已经修饰的抗体。除了针对目标分子的结合域之外，此等抗体亦包含氨基酸序列与人类免疫球蛋白重链的恒定区的全部或一部分实质上同源的效应子域。此等抗体能够结合目标分子而不触发目标的显著补体依赖性溶解或细胞介导的破坏。在一些实施方式中，效应子域能够特异性结合fcrn和/或fcγriib。此等效应子域通常基于来源于两种或更多种人类免疫球蛋白重链ch2域的嵌合域。以此方式修饰的抗体尤其适用于慢性抗体疗法，以避免常规抗体疗法的发炎反应及其他不良反应。
[0264]
在一些实施方式中，本文所提供的抗体的fc链可经修饰以消除效应功能。举例而言，人类igg1的fc链可使用标准引物引导pcr突变诱发修饰以引入突变l234a、l235a及g237a，以消除由于结合于fcγriii而产生的效应功能，提供效应功能无效表型(canfield等人，j.exp.med(1991)173：1483-1491；shields等人，j.biol.chem.(2001)276:6591-604)。
[0265]
在一些实施方式中，本文所提供的双特异性抗体可经工程改造以包含至少一个半胱氨酸残基，其可与本发明的另一多肽链上的对应半胱氨酸残基相互作用以形成链间二硫键。链间二硫键可用以稳定化双特异性抗体，改良重组系统中的表达及回收率，产生稳定且一致的分子式，以及改良经分离和/或纯化产物的活体内稳定性。一个或多个半胱氨酸残基可以单一氨基酸形式或以多肽链的任何部分中较大氨基酸序列，例如铰链区的一部分形式引入。在一特定实施方式中，至少一个半胱氨酸残基经工程改造以存在于多肽链的c端处。
[0266]
【组合物、方法及试剂盒】
[0267]
在一些实施方式中，本发明涵盖组合物，包括包含如本文所描述或由本文所描述的方法制造且具有本文所描述的特征的本发明抗体的医药组合物。如本文所用，医药组合物可包含一或多种结合于cd47的抗体、一或多种结合于pd-l1的抗体、一或多种结合于cd47及pd-l1的双特异性抗体，和/或一或多种包含编码一或多种此等抗体的序列的多核苷酸。此等组合物可还包含此项技术中熟知的适合赋形剂，诸如医药学上可接受的赋形剂，包括缓冲剂。
[0268]
本文提供的本发明进一步涵盖用于治疗、预防或管理个体的癌症的方法及组合物，其包含向个体施用治疗有效量的本文所提供的抗cd47、抗pd-l1或双特异性cd47/pd-l1
抗体。抗cd47、抗pd-l1及cd47/pd-l1双特异性抗体可尤其适用于预防、抑制、减少原发性肿瘤的生长和/或退行以及癌细胞的转移。
[0269]
在一个实施方式中，本发明提供一种治疗个体的与cd47和/或pd-l1表达相关的病状的方法。在一些实施方式中，治疗个体的与cd47和/或pd-l1表达相关的病状的方法包含向有需要的个体施用有效量的如本文所述的包含相应抗cd47、抗pd-l1和/或cd47/pd-l1双特异性抗体的组合物(例如医药组合物)。与cd47和/或pd-l1表达相关的病状包括但不限于异常cd47和/或pd-l1表达、改变或异常cd47和/或pd-l1表达、表达cd47和/或pd-l1的恶性细胞及增生性病症(例如癌症)。在特定实施方式中，癌症为膀胱癌、乳癌、透明细胞肾癌、头部/颈部鳞状细胞癌[头颈部鳞状细胞癌(scchn)]、肺鳞状细胞癌、肺腺癌、恶性黑素瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌(sclc)、三阴性乳癌、尿道上皮癌、急性淋巴母细胞白血病(all)、急性骨髓白血病(aml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性骨髓白血病(cml)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、滤泡性淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(hl)、套细胞淋巴瘤(mcl)、多发性骨髓瘤(mm)、骨髓细胞白血病-1蛋白(mcl-1)、骨髓发育不良综合征(mds)、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、小淋巴细胞性淋巴瘤(sll)、子宫内膜癌、b细胞急性淋巴母细胞白血病、大肠直肠癌、成神经胶质细胞瘤、子宫癌、子宫颈癌、阴茎癌或非黑素瘤皮肤癌。
[0270]
在一个实施方式中，本发明提供本文所述的抗cd47抗体、抗pd-l1抗体和/或cd47/pd-l1双特异性抗体，或包含此类抗体的医药组合物，以用于疗法中。在一特定实施方式中，本发明亦提供用于治疗cd47和/或pd-l1相关病症的抗cd47抗体、抗pd-l1抗体和/或cd47/pd-l1双特异性抗体。在特定实施方式中，cd47和/或pd-l1相关病症是本文所定义的癌症。
[0271]
本发明进一步提供本文所述的抗cd47抗体、抗pd-l1抗体和/或cd47/pd-l1双特异性抗体，或包含此类抗体的医药组合物，以用于制造用于疗法的药剂。在一些实施方式中，疗法是cd47和/或pd-l1相关病症的治疗。在特定实施方式中，cd47和/或pd-l1相关病症为癌症。
[0272]
在一特定实施方式中，相对于在不存在抗体或双特异性抗体的情况下的癌细胞生长，本文提供的抗cd47抗体、抗pd-l1抗体和/或cd47/pd-l1双特异性抗体抑制或减少至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％或至少10％的癌细胞生长。
[0273]
在一特定实施方式中，本文提供的抗cd47抗体、抗pd-l1抗体和/或cd47/pd-l1双特异性抗体比抗体或双特异性抗体不存在时至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％更优选地杀灭细胞或抑制或减少癌细胞生长。
[0274]
在一些实施方式中，本文所述的方法及用途还包含用疗法的额外形式治疗个体的步骤。在一些实施方式中，疗法的额外形式为额外抗癌疗法，包括但不限于化学疗法、辐射、手术、激素疗法和/或额外免疫疗法。
[0275]
本发明进一步涵盖与本领域技术人员已知的用于治疗或预防癌症的其他疗法(包括但不限于当前标准及实验化学疗法、生物疗法、免疫疗法、辐射疗法或手术)组合施用本发明的分子。在一些实施方式中，本发明的分子可与治疗或预防有效量的一或多种试剂、治
疗性抗体或本领域技术人员已知用于治疗和/或预防癌症的其他试剂组合施用。
[0276]
因此，用于治疗癌症的方法及用途包括向有需要的个体施用有效量的本发明的抗体或双特异性抗体以及化学治疗剂。此类组合治疗可分开、依序或同时施用。适合的化学治疗剂包括但不限于至少一种额外试剂，诸如贝伐单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximb)、西罗莫司(sirolimus)、帕尼单抗(panitumumab)、5-氟尿嘧啶(5-fu)、卡培他滨(capecitabine)、替沃扎尼(tivozanib)、伊立替康(irinotecan)、奥沙利铂(oxaliplatin)、顺铂(cisplatin)、曲氟尿苷(trifluridine)、替吡嘧啶(tipiracil)、甲酰四氢叶酸(leucovori)、吉西他滨(gemcitabine)和/或埃罗替尼盐酸盐(erlotinib hydrochloride)。
[0277]
本文所提供的施用剂量及频率由术语治疗有效及预防有效涵盖。剂量及频率可进一步根据对各患者具有特异性的因素，取决于所施用的特定治疗剂或预防剂、癌症的严重程度及类型、施用途径以及患者的年龄、体重、反应及过去病史而变化。本领域技术人员可由考虑此类因素，且由遵循例如文献中所报导且在physician's desk reference(第56版，2002)中所建议的剂量来选择适合方案。
[0278]
本发明的抗体或双特异性抗体可呈用于施用的医药组合物形式，其经调配以适合于所选择的施用模式，及医药学上可接受的稀释剂或赋形剂，诸如缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等张剂、稳定剂、载剂及其类似物。remington's pharmaceutical sciences,mack publishing公司，easton pa.，第18版，1995年提供医师通常已知的调配技术的纲要。
[0279]
此等医药组合物可由此项技术中已知的任何手段施用，该等手段达成治疗癌症的一般预期目的。投药途径可为非经肠的，在本文中定义为是指包括但不限于经食道、瘤内、经结肠镜、经皮、静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下及关节内注射及输注的投药模式。根据本发明的分子(例如抗cd47抗体、抗pd-l1抗体、cd47/pd-l1双特异性抗体、相关医药组合物)的施用及给药方式取决于待对抗的疾病的类型、在适当时其阶段、待控制的抗原、同时治疗(若存在)的种类、治疗频率、所要作用的性质以及患者的体重、年龄、健康状况、饮食及性别。因此，实际上所采用的给药方案可能变化很大，且因此可偏离本文中所阐述的给药方案。
[0280]
本发明抗体(例如抗cd47抗体、抗pd-l1抗体、cd47/pd-l1双特异性抗体)的各种调配物可用于施用。在一些实施方式中，抗体可以纯净形式施用。在一些实施方式中，抗体及医药学上可接受的赋形剂可呈各种调配物形式。医药学上可接受的赋形剂为此项技术中已知，且为有助于药理学上有效物质的施用的相对惰性物质。举例而言，赋形剂可提供形式或稠度，或充当稀释剂。适合赋形剂包括但不限于稳定剂、湿润剂及乳化剂、改变容积渗透浓度的盐、囊封剂、缓冲剂及皮肤渗透增强剂。用于非经肠及经肠药物递送的赋形剂以及调配物阐述于remington,the science and practice of pharmacy第21版mack publishing,2005中。
[0281]
在一些实施方式中，此等试剂经调配以用于由注射(例如腹膜内、静脉内、皮下、肌内等)施用。因此，此等试剂可与医药学上可接受的媒剂，诸如生理盐水、林格氏溶液(ringer's solution)、右旋糖溶液及其类似物组合。特定给药方案，亦即，剂量、时序及重复次数将视特定个体及该个体的病史而定。
[0282]
如本文所述的抗体(例如抗cd47抗体、抗pd-l1抗体、cd47/pd-l1双特异性抗体)可
使用任何适合的方法施用，包括由注射(例如腹膜内、静脉内、皮下、肌肉内等)。抗体，例如单克隆抗体或双特异性抗体，亦如本文所述经由吸入施用。一般而言，对于本发明的抗体的施用，剂量视所治疗的宿主及特定施用模式而定。在一个实施方式中，本发明的抗体的剂量范围将为约0.001μg/kg体重至约20,000μg/kg体重。术语“体重”在治疗患者时适用。在处理经分离细胞时，如本文所用，“体重”是指“总细胞体重”。术语“总体重”可应用于经分离细胞处理及患者治疗两者。在本技术案中表示为“体重”或简单地“kg”的所有浓度及治疗/处理水平，亦视为涵盖类似“总细胞体重”及“总体重”浓度。然而，一般本领域技术人员将认识到多种剂量范围的效用，例如0.01μg/kg体重至20,000μg/kg体重、0.02μg/kg体重至15,000μg/kg体重、0.03μg/kg体重至10,000μg/kg体重、0.04μg/kg体重至5,000μg/kg体重、0.05μg/kg体重至2,500μg/kg体重、0.06μg/kg体重至1,000μg/kg体重、0.07μg/kg体重至500μg/kg体重、0.08μg/kg体重至400μg/kg体重、0.09μg/kg体重至200μg/kg体重或0.1μg/kg体重至100μg/kg体重。此外，本领域技术人员应认识到，多种不同剂量水平将为适用的，例如0.0001μg/kg、0.0002μg/kg、0.0003μg/kg、0.0004μg/kg、0.005μg/kg、0.0007μg/kg、0.001μg/kg、0.1μg/kg、1.0μg/kg、1.5μg/kg、2.0μg/kg、5.0μg/kg、10.0μg/kg、15.0μg/kg、30.0μg/kg、50μg/kg、75μg/kg、80μg/kg、90μg/kg、100μg/kg、120μg/kg、140μg/kg、150μg/kg、160μg/kg、180μg/kg、200μg/kg、225μg/kg、250μg/kg、275μg/kg、300μg/kg、325μg/kg、350μg/kg、375μg/kg、400μg/kg、450μg/kg、500μg/kg、550μg/kg、600μg/kg、700μg/kg、750μg/kg、800μg/kg、900μg/kg、1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、12μg/kg、15mg/kg、20mg/kg和/或30mg/kg。所有此等剂量为例示性的，且此等剂量点之间的任何剂量亦预期在本发明中适用。以上剂量范围或剂量水平中的任一者均可用于本发明的抗体。对于历经数日或更长时间的重复施用，视病状而定，持续治疗直至出现所要症状抑制或直至达成足够治疗水平，例如以抑制或推迟肿瘤生长/进展或癌细胞转移。
[0283]
一般而言，对于本文所提供的抗体的施用，候选剂量可每天、每周、每隔一周、每三周、每四周、每五周、每六周、每七周、每八周、每十周、每十二周或多于每十二周施用。
[0284]
在一些实施方式中，视上文所提及的因素而定，每日施用候选剂量，其剂量范围为约1μg/kg、至30μg/kg、至300μg/kg、至3mg/kg、至30mg/kg、至100mg/kg或更多中的任一者。举例而言，可使用约0.01mg/kg、约0.03mg/kg、约0.1mg/kg、约0.3mg/kg、约1mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg及约25mg/kg的每日剂量。
[0285]
在一些实施方式中，视上文所提及的因素而定，每周施用候选剂量，其剂量范围为约1μg/kg、至30μg/kg、至300μg/kg、至3mg/kg、至30mg/kg、至100mg/kg或更多中的任一者。举例而言，可使用约0.01mg/kg、约0.03mg/kg、约0.1mg/kg、约0.3mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约25mg/kg及约30mg/kg的每周剂量。
[0286]
在一些实施方式中，视上文所提及的因素而定，每两周施用候选剂量，其剂量范围为约1μg/kg、至30μg/kg、至300μg/kg、至3mg/kg、至30mg/kg、至100mg/kg或更多中的任一者。举例而言，可使用约0.1mg/kg、约0.3mg/kg、约1mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约25mg/kg及约30mg/kg的每两周剂量。
[0287]
在一些实施方式中，视上文所提及的因素而定，每三周施用候选剂量，其剂量范围为约1μg/kg、至30μg/kg、至300μg/kg、至3mg/kg、至30mg/kg、至100mg/kg或更多中的任一
者。举例而言，可使用约0.1mg/kg、约0.3mg/kg、约1mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg及约50mg/kg的每三周剂量。
[0288]
在一些实施方式中，视上文所提及的因素而定，每月或每四周施用候选剂量，其剂量范围为约1μg/kg、至30μg/kg、至300μg/kg、至3mg/kg、至30mg/kg、至100mg/kg或更多中的任一者。举例而言，可使用约0.1mg/kg、约0.3mg/kg、约1mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg及约50mg/kg的每月剂量。
[0289]
在其他实施方式中，视上文所提及的因素而定，每天施用候选剂量，其剂量范围为约0.01mg至约1200mg或更大。举例而言，可使用约0.01mg、约0.1mg、约1mg、约10mg、约50mg、约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1000mg、约1100mg或约1200mg的每日剂量。
[0290]
在其他实施方式中，视上文所提及的因素而定，每周施用候选剂量，其剂量范围为约0.01mg至约2000mg或更大。举例而言，可使用约0.01mg、约0.1mg、约1mg、约10mg、约50mg、约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1000mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、约1600mg、约1700mg、约1800mg、约1900mg或2000mg的每周剂量。
[0291]
在其他实施方式中，视上文所提及的因素而定，每两周施用候选剂量，其剂量范围为约0.01mg至约2000mg或更大。举例而言，可使用约0.01mg、约0.1mg、约1mg、约10mg、约50mg、约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1000mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、约1600mg、约1700mg、约1800mg、约1900mg或2000mg的每两周剂量。
[0292]
在其他实施方式中，视上文所提及的因素而定，每三周施用候选剂量，其剂量范围为约0.01mg至约2500mg或更大。举例而言，可使用约0.01mg、约0.1mg、约1mg、约10mg、约50mg、约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1000mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、约1600mg、约1700mg、约1800mg、约1900mg、约2000mg、约2100mg、约2200mg、约2300mg、约2400mg或约2500mg的每三周剂量。
[0293]
在其他实施方式中，视上文所提及的因素而定，每四周或每月施用候选剂量，其剂量范围为约0.01mg至约3000mg或更大。举例而言，可使用约0.01mg、约0.1mg、约1mg，约10mg、约50mg、约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1000mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、约1600mg、约1700mg、约1800mg、约1900mg、约2000mg、约2100mg、约2200mg、约2300mg、约2400mg、约2500mg、约2600mg、约2700mg、约2800mg、约2900mg或约3000mg的每月剂量。
[0294]
其他给药方案亦可适用，视医师希望实现的药物动力学衰变模式而定。在一个实施方式中，本发明的抗体以初始准备剂量、随后更高和/或连续的实质上恒定的剂量施用。在一些实施方式中，考虑一周一至四次给药。在其他实施方式中，考虑每月一次或每隔一月或每三个月一次给药。此疗法的进展可容易地由常规技术及分析来监测。给药方案可随时间变化。
[0295]
出于本发明的目的，抗体(例如抗cd47抗体、抗pd-l1抗体、cd47/pd-l1双特异性抗体)的适当剂量将取决于所采用抗体或其组合物、待治疗症状的类型及严重程度、试剂是否是出于治疗目的施用、先前疗法、患者临床病史及对试剂的反应、患者对所施用试剂的清除速率及主治医师的判断。通常，临床医师将施用抗体直至达到获得所要结果的剂量。剂量和/或频率可在治疗过程内变化。经验考虑因素，诸如半衰期一般将有助于剂量的确定。举例而言，与人类免疫系统兼容的抗体，诸如人源化抗体或完全人类抗体可用于延长抗体半衰期且防止抗体受宿主的免疫系统攻击。施用频率可在疗法过程内确定及调节，且其一般但未必是基于症状的治疗和/或抑制和/或改善和/或推迟，例如肿瘤生长抑制或推迟等。或者，抗体的持续连续释放调配物可为适当的。用于达成持续释放的各种调配物及装置为此项技术中已知的。
[0296]
在一个实施方式中，抗体(例如抗cd47抗体、抗pd-l1抗体、cd47/pd-l1双特异性抗体)的剂量可凭经验在已给予抗体的一或多次施用的个体中确定。向个体给予递增剂量的抗体。为评估功效，可跟踪疾病的指标。
[0297]
在一些实施方式中，可向先前已接受抗pd-1或抗pd-l1抗体治疗剂以治疗疾病(例如癌症)的个体施用本文所提供的抗体(例如抗cd47抗体、抗pd-l1抗体、cd47/pd-l1双特异性抗体)。在一些实施方式中，可向先前已接受抗pd-1或抗pd-l1抗体治疗剂以治疗疾病的个体施用本文所提供的抗体，且其中先前抗pd-1或抗pd-l1抗体治疗剂在个体中功效有限或无功效(例如，其中个体的疾病对先前抗pd-1或抗pd-l1治疗剂的治疗具有抗性)。
[0298]
在一些实施方式中，可向患有pd-l1表达测试为阳性的癌症的个体施用本文所提供的抗体(例如抗cd47抗体、抗pd-l1抗体、cd47/pd-l1双特异性抗体)。在一些实施方式中，可向患有pd-l1表达未测试为阳性的癌症的个体施用本文所提供的抗体。
[0299]
如本文所用，“pd-l1表达”是指细胞表面上pd-l1蛋白质或细胞或组织内pd-l1 mrna的任何可检测表达量。pd-l1蛋白表达可在肿瘤组织切片的免疫组织化学(ihc)分析中由诊断抗pd-l1抗体或由流式细胞术检测。细胞的pd-l1表达亦可使用特异性结合于pd-l1的结合剂(例如抗体)由pet成像来检测。用于检测及测量pd-l1 mrna表达的技术包括例如rt-pcr及实时定量rt-pcr。
[0300]
已描述若干用于在肿瘤组织切片的ihc分析中定量pd-l1表达的方法。参见例如thompson,r.h.等人，pnas 101(49)；17174-17179(2004)；thompson,r.h.等人，cancer res.66:3381-3385(2006)；gadiot,j.等人，cancer 117:2192-2201(2011)；taube,j.m.等人，sci transl med 4,127ra37(2012)；及toplian,s.l.等人，new eng.jaed 366(26)：2443-2454(2012)。
[0301]
一种方法采用对于pd-l1表达呈阳性或阴性的简单二元终点，其中阳性结果以呈现细胞表面膜染色的组织学迹象的肿瘤细胞的百分比定义。若一定百分比的肿瘤细胞对pd-l1表达呈阳性，则肿瘤组织切片可视为对pd-l1表达呈阳性。举例而言，若至少0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、50％、75％、90％或95％的肿瘤细胞对pd-l1表达呈阳性，则肿瘤组织切片可视为对pd-l1表达呈阳性。
[0302]
在另一方法中，肿瘤组织切片中的pd-l1表达在肿瘤细胞以及浸润性免疫细胞中定量，该等细胞主要包含淋巴细胞。呈现膜染色的肿瘤细胞及浸润性免疫细胞的百分比可分别定量，诸如＜5％、5～9％，且随后以10％增量直至100％。对于肿瘤细胞，分别地，若评
分小于例如1％、2％或5％，则pd-l1表达可视为阴性，且若评分大于1％、2％或5％，则为阳性。浸润性免疫细胞中的pd-l1表达可报导为半定量测量值，称为经调节的发炎评分(ais)，其由膜染色细胞的百分比乘以浸润的强度来确定，浸润的强度分级为无(0)、轻度(1分，罕有淋巴细胞)、中度(2分，淋巴组织细胞聚集体局部浸润肿瘤)或重度(3分，扩散性浸润)。若ais大于5，则肿瘤组织切片可视为由免疫浸润对pd-l1表达呈阳性。
[0303]
pd-l1 mrna表达量可与时常用于定量rt-pcr的一或多种参考基因(诸如泛素c)的mrna表达量相比。
[0304]
在一些实施方式中，基于与适当对照物的pd-l1表达量(蛋白和/或mrna)比较，将肿瘤内恶性细胞和/或浸润性免疫细胞的pd-l1表达量(蛋白和/或mrna)确定为“过度表达”或“升高”。举例而言，对照pd-l1蛋白质或mrna表达量可为在相同类型的非恶性细胞中或在来自匹配正常组织的切片中定量的表达量。在一些实施方式中，若样品中的pd-l1蛋白(和/或pd-l1 mrna)比对照物中多至少10％、20％或30％，则将肿瘤样品中的pd-l1表达确定为升高。
[0305]
在一些实施方式中，在对自患者移除的肿瘤样品的组织切片进行的免疫组织化学(ihc)分析中，使用诊断性抗pd-l1抗体检测癌症中的pd-l1表达。通常，测试肿瘤样品以测定在用本文所提供的抗体处理之前的pd-l1表达，但其亦可在处理开始后进行测试。
[0306]
适用作ihc检测肿瘤组织切片中的pd-l1表达的诊断mab的诊断抗人类pd-l1 mab的特定实例为抗体20c3及抗体22c3，其描述于wo2014/100079中。例示性pd-l1 ihc测试包括pd-l1 ihc 22c3 pharmdx(daco)及ventana pd-l1 sp263分析。
[0307]
在某些实施方式中，施用抗体(例如抗cd47抗体、抗pd-l1抗体、cd47/pd-l1双特异性抗体)会引起至少一种选自由以下组成的群的效用：抑制肿瘤生长、肿瘤消退、缩小肿瘤尺寸、减少肿瘤细胞数目、推迟肿瘤生长、远隔效应(abscopal effect)、抑制肿瘤转移、随着时间推移减少转移性病灶、减少使用化学治疗剂或细胞毒素剂、减小肿瘤负荷、延长无恶化存活期、延长总存活期、完全反应、部分反应及稳定疾病。
[0308]
根据本发明的方法施用抗体(例如抗cd47抗体、抗pd-l1抗体、cd47/pd-l1双特异性抗体)可为连续或间歇性，取决于例如接受者的生理学条件，施用目的是否为治疗性的或预防性，及本领域技术人员已知的其他因素。抗体的施用可在预选时间段内基本上连续或可呈一系列间隔剂量形式。
[0309]
根据本发明使用的抗体(例如抗cd47抗体、抗pd-l1抗体、cd47/pd-l1双特异性抗体)的治疗调配物是由混合具有所要纯度的抗体与视情况选用的医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(remington,the science and practice of pharmacy第21版mack publishing,2005)，制成冻干调配物或水性溶液的形式，以供储存。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所采用剂量及浓度下对接受者无毒性，且可包含：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；盐类，诸如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六羟季铵(hexamethonium chloride)；氯化苯甲烃铵(benzalkonium chloride)、苄索氯铵(benzethonium chloride)；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯啶酮；氨基酸，诸如甘氨酸、麸酰氨酸、天冬酰胺、
组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如edta；糖类，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属错合物(例如，zn-蛋白质错合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如tween
tm
、pluronics
tm
或聚乙二醇(peg)。
[0310]
在一些实施方式中，本文提供的抗cd47抗体、抗pd-l1抗体或cd47/pd-l1双特异性抗体可与施用一或多种额外治疗剂组合施用。任选地，额外治疗剂可包括额外抗癌剂。其包括但不限于施用生物治疗剂和/或化学治疗剂，诸如但不限于疫苗、基于car-t细胞的疗法、放射线疗法、细胞介素疗法、cd3双特异性抗体、其他免疫抑制路径的抑制剂、血管生成的抑制剂、t细胞活化剂、代谢路径的抑制剂、mtor抑制剂、腺苷路径的抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂(包括但不限于inlyta、alk抑制剂及舒尼替尼(sunitinib))、braf抑制剂、表观遗传修饰剂、ido1抑制剂、jak抑制剂、stat抑制剂、周期素依赖性激酶抑制剂、生物治疗剂(包括但不限于针对vegf、vegfr、egfr、her2/neu、其他生长因子受体、cd40、cd-40l、ctla-4、ox-40、4-1bb、tigit及icos的抗体)、免疫原性剂(例如减毒癌细胞、肿瘤抗原、抗原呈递细胞(诸如经肿瘤来源抗原或核酸脉冲的树突状细胞)、免疫刺激细胞介素(例如，il-2、ifnα2、gm-csf)及经编码免疫刺激细胞介素(诸如但不限于gm-csf)的基因转染的细胞)。
[0311]
生物治疗剂的实例包括治疗性抗体、免疫调节剂及治疗性免疫细胞。
[0312]
治疗性抗体可具有针对多种不同抗原的特异性。举例而言，治疗性抗体可针对肿瘤相关抗原，使得抗体与抗原的结合促进表达抗原的细胞死亡。在其他实例中，治疗性抗体可针对免疫细胞上的抗原(例如pd-1)，使得抗体的结合防止表达抗原的细胞的活性下调(且由此促进表达抗原的细胞的活性)。在一些情况下，治疗性抗体可经由多种不同机制起作用(例如其可(i)促进表达抗原的细胞死亡，且(ii)防止抗原引起与表达抗原的细胞接触的免疫细胞活性的下调)。
[0313]
治疗性抗体可针对例如如下所列的抗原。对于一些抗原，针对抗原的例示性抗体亦包括于下文中(在抗原之后的括号/圆括号中)。如下的抗原本文中亦可称为“目标抗原”或其类似物。本文中的治疗性抗体的目标抗原包括例如：4-1bb(例如乌图木单抗(utomilumab))；5t4；a33；α-叶酸受体1(例如米妥昔单抗索星(mirvetuximab soravtansine))；alk-1；bcma[例如pf-06863135(参见us9969809)]；btn1a1(例如参见wo2018222689)；ca-125(例如阿巴伏单抗(abagovomab))；碳酸酐酶ix；ccr2；ccr4(例如莫格珠单抗(mogamulizumab))；ccr5(例如勒隆利单抗(leronlimab))；ccr8；cd3[例如博纳吐单抗(blinatumomab)(cd3/cd19双特异性抗体)，pf-06671008(cd3/p-钙粘素双特异性抗体)，pf-06863135(cd3/bcma双特异性抗体)，cd19(例如博纳吐单抗(blinatumomab)，mor208)；cd20(例如替伊莫单抗替歇坦(ibritumomab tiuxetan)，阿托珠单抗(obinutuzumab)，奥伐木单抗(ofatumumab)，利妥昔单抗(rituximab)，乌妥昔单抗(ublituximab))；cd22(英妥珠单抗奥佐米星(inotuzumab ozogamicin)，帕西妥单抗帕苏多托(moxetumomab pasudotox))；cd25；cd28；cd30(例如贝伦妥单抗维多汀(brentuximab vedotin))；cd33(例如吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin))；cd38(例如达雷木单抗(daratumumab)，艾萨昔单抗(isatuximab))，cd40；cd-40l；cd44v6；cd47；cd52(例如阿伦珠单抗(alemtuzumab))；cd63；cd79(例如保纳珠单抗维多汀(polatuzumab vedotin))；cd80；cd123；cd276/b7-h3(例如奥伯塔单抗(omburtamab))；cdh17；cea；clhcg；ctla-4(例
如伊匹单抗(ipilimumab)，曲美单抗(tremelimumab))，cxcr4；桥粒粘蛋白(desmoglein)4；dll3(例如洛妥珠单抗特林(rovalpituzumab tesirine))；dll4；e-钙粘素；eda；edb；efna4；egfr(例如西妥昔单抗(cetuximab)，迪妥珠单抗玛汀(depatuxizumab mafodotin)，耐妥珠单抗(necitumumab)，帕尼单抗)；egfrviii；内皮唾酸蛋白(endosialin)；epcam(例如奥普珠单抗莫纳托克斯(oportuzumab monatox))；fap；胚胎乙酰胆碱受体；flt3(例如参见wo2018/220584)；gd2(例如迪奴图单抗(dinutuximab)，3f8)；gd3；gitr；globoh；gm1；gm2；gucy2c(例如pf-07062119)；her2/neu[例如马妥昔单抗(margetuximab)，帕妥珠单抗(pertuzumab)，曲妥珠单抗(trastuzumab)；曲妥珠单抗-美坦新偶联物(ado-trastuzumab emtansine)，曲妥珠单抗多卡马嗪(trastuzumab duocarmazine)，pf-06804103(参见us8828401)]；her3；her4；icos；il-10；itg-avb6；lag-3(例如瑞拉单抗(relatlimab))；lewis-y；lg；ly-6；m-csf[例如pd-0360324(参见us7326414)]；mcsp；间皮素；muc1；muc2；muc3；muc4；muc5ac；muc5b；muc7；muc16；notch1；notch3；nectin-4(例如恩诺单抗维多汀(enfortumab vedotin))；o
×
40[例如pf-04518600(参见us7960515)]；p-钙粘素[例如pf-06671008(参见wo2016/001810)]；pcdhb2；pd-1[例如bcd-100，坎立珠单抗(camrelizumab)，测米匹单抗(cemiplimab)，杰诺珠单抗(genolimzumab)(cbt-501)，medi0680，纳武单抗(nivolumab)，派立珠单抗(pembrolizumab)，rn888(参见wo2016/092419)，斯迪利单抗(sintilimab)，斯巴珠单抗(spartalizumab)，sti-a1110，缇勒珠单抗(tislelizumab)，tsr-042]；pd-l1(例如阿特珠单抗(atezolizumab)，德瓦鲁单抗(durvalumab)，bms-936559(mdx-1105)或ly3300054)；pdgfra(例如奥拉单抗(olaratumab))；浆细胞抗原；polysa；psca；psma；ptk7[例如pf-06647020(参见us9409995)]；ror1；sas；scr
×
6；slamf7(例如埃妥珠单抗(elotuzumab))；shh；sirpa(例如ed9，effi-dem)；steap；tgf-β；tigit；tim-3；tmprss3；tnf-α前驱体；trop-2(例如沙妥珠单抗戈维特坎(sacituzumab govitecan))；tspan8；vegf(例如贝伐单抗，布卢珠单抗(brolucizumab))；vegfr1(例如兰比珠单抗(ranibizumab))；vegfr2(例如雷莫芦单抗(ramucirumab)，兰比珠单抗(ranibizumab))；wue-1。
[0314]
与本文所提供的抗体组合施用的治疗性抗体可具有任何适合的形式。举例而言，治疗性抗体可具有如本文中其他地方所描述的任何形式。在一些实施方式中，治疗性抗体可为裸抗体。在一些实施方式中，治疗性抗体可连接于药物或其他试剂(亦称为“抗体-药物缀合物”(adc))。在一些实施方式中，针对特定抗原的治疗性抗体可并入多特异性抗体(例如双特异性抗体)中。
[0315]
在一些实施方式中，本文提供的抗cd47抗体、抗pd-l1抗体或cd47/pd-l1双特异性抗体可与模式识别受体(prr)促效剂、免疫刺激细胞介素及癌症疫苗组合施用。存在多种类别的prr分子，包括toll-样受体(tlr)、rig-i样受体(rlr)、核苷酸结合寡聚化结构域(nod)样受体(nlr)、c型凝集素受体(clr)及干扰素基因刺激蛋白(sting)。其他prr包括例如ifn调节因子的dna依赖性活化因子(dai)及黑素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，aim2)。
[0316]
在一些实施方式中，本文所提供的抗cd47抗体、抗pd-l1抗体或cd47/pd-l1双特异性抗体可与活化一或多种tlr的分子，本文在本文中称为“tlr促效剂”组合施用。tlr促效剂可包括例如小分子(例如具有低于约1000道尔顿的分子量的有机分子)以及大分子(例如寡核苷酸及蛋白质)。一些tlr促效剂对单一类型的tlr(例如tlr3或tlr9)具有特异性，而一些
tlr促效剂活化两种或更多种类型的tlr(例如tlr7及tlr8两者)。本文所提供的例示性tlr促效剂包括tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8及tlr9的促效剂。例示性小分子tlr促效剂包括例如揭示于以下中的tlr促效剂：美国专利第4,689,338号；第4,929,624号；第5,266,575号；第5,268,376号；第5,346,905号；第5,352,784号；第5,389,640号；第5,446,153号；第5,482,936号；第5,756,747号；第6,110,929号；第6,194,425号；第6,331,539号；第6,376,669号；第6,451,810号；第6,525,064号；第6,541,485号；第6,545,016号；第6,545,017号；第6,573,273号；第6,656,938号；第6,660,735号；第6,660,747号；第6,664,260号；第6,664,264号；第6,664,265号；第6,667,312号；第6,670,372号；第6,677,347号；第6,677,348号；第6,677,349号；第6,683,088号；第6,756,382号；第6,797,718号；第6,818,650号；及第7,7091,214号；美国专利公开第2004/0091491号、第2004/0176367号及第2006/0100229号；及国际公开第wo 2005/18551号、第wo 2005/18556号、第wo 2005/20999号、第wo 2005/032484号、第wo 2005/048933号、第wo 2005/048945号、第wo 2005/051317号、第wo 2005/051324号、第wo 2005/066169号、第wo 2005/066170号、第wo 2005/066172号、第wo 2005/076783号、第wo 2005/079195号、第wo 2005/094531号、第wo 2005/123079号、第wo 2005/123080号、第wo 2006/009826号、第wo 2006/009832号、第wo 2006/026760号、第wo 2006/028451号、第wo 2006/028545号、第wo 2006/028962号、第wo 2006/029115号、第wo 2006/038923号、第wo 2006/065280号、第wo 2006/074003号、第wo 2006/083440号、第wo 2006/086449号、第wo 2006/091394号、第wo 2006/086633号、第wo 2006/086634号、第wo 2006/091567号、第wo 2006/091568号、第wo 2006/091647号、第wo 2006/093514号及第wo 2006/098852号。小分子tlr促效剂的额外实例包括某些嘌呤衍生物(诸如美国专利第6,376,501号及第6,028,076号中所描述者)、某些咪唑并喹啉酰胺衍生物(诸如美国专利第6,069,149号中所描述者)、某些咪唑并吡啶衍生物(诸如美国专利第6,518,265号中所描述者)、某些苯并咪唑衍生物(诸如美国专利第6,387,938号中所描述者)、稠合至五员含氮杂环的4-氨基嘧啶的某些衍生物(诸如美国专利第6,376,501号、第6,028,076号及第6,329,381号及wo 02/08905中所描述的腺嘌呤衍生物)及某些3-.β.-d-呋喃核糖基噻唑并[4,5-d]嘧啶衍生物(诸如美国公开第2003/0199461号中所描述者)及某些小分子免疫增效剂化合物，诸如例如美国专利公开第2005/0136065号中所描述者。例示性大分子tlr促效剂包括为寡核苷酸序列。一些tlr促效剂寡核苷酸序列含有胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(cpg)且描述于例如美国专利第6,194,388号、第6,207,646号、第6,239,116号、第6,339,068号及第6,406,705号中。一些含有cpg的寡核苷酸可包括合成免疫调节结构模体，诸如描述于例如美国专利第6,426,334号及第6,476,000号中的彼等。其他tlr促效剂核苷酸序列不具有cpg序列且描述于例如国际专利公开第wo 00/75304号中。再其他tlr促效剂核苷酸序列包括鸟苷及尿苷富集单链rna(ssrna)，诸如描述于例如heil等人，science，第303卷，第1526页至第1529页，2004年3月5日中的彼等。其他tlr促效剂包括生物分子，诸如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸盐(agp)且描述于例如美国专利第6,113,918号、第6,303,347号、第6,525,028号及第6,649,172号中。tlr促效剂亦包括不活化病原体或其部分，其可活化多种不同类型的tlr受体。例示性病原体衍生的tlr促效剂包括bcg、大府分支杆菌(mycobacterium obuense)提取物、塔里穆尼拉赫帕雷普韦克(talimogene laherparepvec，t-vec)(衍生自hsv-1)及pexa-vec(衍生自痘苗病毒)。在一些实施方式中，本文提供的抗cd47抗体、抗pd-l1抗体或cd47/pd-l1双特异
性抗体可与以下组合施用：spm-105(衍生自经热压处理的分枝杆菌)、om-174(脂质a衍生物)、omps1(来自伤寒沙门氏菌(salmonella typhi)的孔蛋白)、omps1(来自伤寒沙门氏菌的孔蛋白)、ospa(来自博氏疏螺旋体(borrelia burgdorferi))、支原体巨噬细胞活化的脂肽-2kd(malp-2)、可溶性肺结核因子(stf)、cu-t12-9、迪普罗沃辛(diprovocim)及衍生自细胞壁组分的脂肽，诸如pam2csk4、pam3csk4及pam3cys。适用于本发明的治疗方法、药剂及用途的tlr2促效剂的实例包括例如细菌脂蛋白(例如二酰化脂蛋白)及其衍生物，诸如spm-105(衍生自经热压处理的分枝杆菌)、om-174(脂质a衍生物)、omps1(来自伤寒沙门氏菌的孔蛋白)、omps1(来自伤寒沙门氏菌的孔蛋白)、ospa(来自博氏疏螺旋体)、支原体巨噬细胞活化的脂肽-2kd(malp-2)、可溶性肺结核因子(stf)、cu-t12-9、迪普罗沃辛、安普利特(amplivant)及衍生自细胞壁组分的脂肽，诸如pam2csk4、pam3csk4及pam3cys。适用于本发明的治疗方法、药剂及用途的tlr3促效剂的实例包括tlr3配体，诸如合成dsrna、聚肌苷酸-聚胞苷酸[“聚(i:c)”](可以高分子量(hmw)及低分子量(lmw)制剂形式购自例如invivogen)、聚腺苷酸-聚尿苷酸[“聚(a:u)”](可购自例如invivogen)、聚iclc(参见levy等人，journal of infectious diseases，第132卷，第4号，第434-439页，1975)、阿普林津(ampligen)(参见jasani等人，vaccine，第27卷，第25-26号，第3401-3404页，2009)、希托洛(hiltonol)、林他莫德(rintatolimod)及rgc100(参见naumann等人，clinical and developmental immunology，第2013卷，文献id 283649)。适用于本发明的治疗方法、药剂及用途的tlr4促效剂的实例包括例如细菌脂多糖(lps)及其衍生物，诸如b:0111(sigma)、单磷酰基脂质a(mpla)、3-o-去酰化mpl(3dmpl)、gla-aq、g100、as15、aso2、gsk1572932a(glaxosmithkline，uk)。适用于本发明的治疗方法、药剂及用途的tlr5促效剂的实例包括例如自枯草芽孢杆菌纯化的细菌鞭毛蛋白、自铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)纯化的鞭毛蛋白、自鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)纯化的鞭毛蛋白及重组鞭毛蛋白(均可购自invivogen)、恩托莫德(entolimod)(cblb502；药理学上优化的鞭毛蛋白衍生物)。适用于本发明的治疗方法、药剂及用途的tlr6促效剂的实例包括例如以上提供的许多tlr2促效剂，因为tlr2及tlr6可形成异源二聚体体。tlr6亦可与tlr4形成异源二聚体体，且tlr6促效剂可包括上文所提供的各种tlr4促效剂。适用于本发明的治疗方法、药剂及用途的tlr7促效剂的实例包括重组单链(“ss”)rna；咪唑并喹啉化合物，诸如咪喹莫特(imiquimod)(r837)、嘎德莫特(gardiquimod)及雷西莫特(resiquimod)(r848)；洛索立宾(loxoribine)(7-烯丙基-7,8-二氢-8-侧氧基-鸟苷)及相关化合物；7-硫杂-8-侧氧基鸟苷、7-去氮鸟苷及相关鸟苷类似物；ana975(anadys pharmaceuticals)及相关化合物；sm-360320(sumimoto)；3m-01、3m-03、3m-852及3m-s-34240(3m pharmaceuticals)；gsk2245035(glaxosmithkline；8-侧氧基腺嘌呤分子)、azd8848(astrazeneca；8-侧氧基腺嘌呤分子)、medi9197(medimmune；以前的3m-052)、ssrna40及腺苷类似物，诸如uc-1v150(jin等人，bioorganic medicinal chem lett(2006)16:4559-4563，化合物4)。许多tlr7促效剂亦为tlr8促效剂。适用于本发明的治疗方法、药剂及用途的tlr8促效剂的实例包括重组单链ssrna、咪喹莫特(r837)、嘎德莫特、雷西莫特(r848)、3m-01、3m-03、3m-852及3m-s-34240(3m pharmaceuticals)；gsk2245035(glaxosmithkline；8-侧氧基腺嘌呤分子)、azd8848(astrazeneca；8-侧氧基腺嘌呤分子)、medi9197(medimmune；以前的3m-052)、聚-g10、莫托莫德(motolimod)及以上提供的各种tlr7促效剂(如先前所述，许多tlr7促效剂亦为tlr8促效剂)。适用于本发明的治
疗方法、药剂及用途的tlr9促效剂的实例包括含未甲基化的cpg的dna、免疫刺激寡脱氧核苷酸(odn)，诸如含cpg的odn，诸如cpg24555、cpg10103、cpg7909(pf-3512676/阿托莫德(agatolimod))、cpg1018、azd1419、odn2216、mgn1703、sd-101、1018iss及cmp-001。tlr9促效剂亦包括含有合成胞嘧啶-磷酸酯-2'-脱氧-7-去氮鸟苷二核苷酸(cpr)的核苷酸序列(hybridon公司)、dslim-30l1及免疫球蛋白-dna复合物。例示性tlr9促效剂揭示于wo2003/015711、wo2004/016805、wo2009/022215、pct/us95/01570、pct/us97/19791及美国专利第8552165号、第6194388号及第6239116号，其出于所有目的各自以引用的方式并入本文中。
[0317]
适用于本发明的治疗方法、药剂及用途的rlr促效剂的实例包括例如具有未封端的5'三磷酸酯的短双链rna(rig-i促效剂)；聚i:c(mda-5促效剂)及bo-112(mda-a促效剂)。
[0318]
适用于本发明的治疗方法、药剂及用途的nlr促效剂的实例包括例如脂质体胞壁酰三肽/米伐木肽(mifamurtide)(nod2促效剂)。
[0319]
clr包括检测例如碳水化合物及糖蛋白的各种prr。clr包括跨膜clr及分泌clr两者。clr的实例包括例如dec-205/cd205、巨噬细胞甘露糖受体(mmr)、c型凝集素-1(dectin-1)、c型凝集素-2、巨噬细胞诱导c型凝集素(mincle)、dc-sign、dngr-1及甘露糖结合凝集素(mbl)。
[0320]
适用于本发明的治疗方法、药剂及用途的clr促效剂的实例包括例如md-部分(md-fraction)(来自grifola frondosa的经纯化的可溶性β-葡聚糖提取物)及因普拉姆pgg(imprimepgg)(衍生自酵母的β-1,3/1,6-葡聚糖pamp)。
[0321]
适用于本发明的治疗方法、药剂及用途的sting促效剂的实例包括各种免疫刺激性核酸，诸如合成双链dna、环状二gmp、环状gmp-amp(cgamp)；合成环二核苷酸(cdn)，诸如mk-1454及adu-s100(miw815)；及小分子，诸如p0-424。
[0322]
适用于本发明的治疗方法、药剂及用途的免疫刺激性细胞介素的实例包括gm-csf、g-csf、ifn-α、ifn-γ；il-2(例如，白喉毒素地尼介白素(denileukin difitox))、il-6、il-7、il-11、il-12、il-15、il-18、il-21及tnf-α。
[0323]
适用于本发明的治疗方法、药剂及用途的癌症疫苗的实例包括例如西普亮塞-t(sipuleucel-t)及塔里穆尼拉赫帕雷普韦克(t-vec)。
[0324]
适用于本发明的治疗方法、药剂及用途的免疫细胞疗法的实例包括例如肿瘤浸润性淋巴细胞(til)及嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)。
[0325]
化学治疗剂的实例包括烷基化剂，诸如噻替派(thiotepa)及环磷酰胺；磺酸烷基酯，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，诸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；乙烯亚胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、三伸乙基三聚氰胺、三伸乙基磷酰胺、三伸乙基硫代磷酰胺及三羟甲基三聚氰胺；多聚乙酰(尤其布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓朴替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；卡利他汀(callystatin)；cc-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)及比折来新合成类似物)；念珠藻环肽(尤其念珠藻环肽1及念珠藻环肽8)；海兔毒素；多卡霉素(duocarmycin)(包括合成类似物kw-2189及cbi-tmi)；软珊瑚醇(eleutherobin)；水鬼焦碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥，诸如氯芥苯丁酸、萘氮芥、氯磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、甲基二
(氯乙基)胺(mechlorethamine)、氧化甲基二(氯乙基)胺盐酸盐、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺、尿嘧啶芥；亚硝基脲，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)，尤其卡奇霉素γ1i及卡奇霉素φi1，参见例如agnew,chem.intl.ed.engl.,33:183-186(1994)；达米辛(dynemicin)，包括达米辛a；双膦酸盐，诸如氯屈膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新抑癌蛋白发色团及相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放射菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素c(cactinomycin)、卡拉比辛(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、更生霉素(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-侧氧基-l-正亮氨酸、小红莓(doxorubicin)(包括(n-吗啉基)-小红莓、氰基(n-吗啉基)-小红莓、2-吡咯啉基-小红莓及脱氧小红莓)、聚乙二醇化脂质体小红莓、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、埃达霉素(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、诸如丝裂霉素c的丝裂霉素(mitomycin)、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泼非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、奎那霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲胺喋呤(methotrexate)及5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，诸如迪诺特宁(denopterin)、甲胺喋呤、蝶罗呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉宾(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪内酯testolactone)；抗肾上腺，诸如胺鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；贝斯布西(bestrabucil)；比山群(bisantrene)；埃达曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾福米辛(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；磨菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；类美登素，诸如美登素(maytansine)及安丝菌素(ansamitocin)；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；苯来美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofuran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2
”‑
三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecene)(尤其t-2毒素、弗纳库林a(verracurina)、杆孢菌素a及胺
癸叮(anguidine))；尿烷；长春地辛(vindesine)；达喀尔巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“ara-c”)；环磷酰胺；噻替派；类紫杉醇，例如太平洋紫杉醇及多西他赛(doxetaxel)；氯芥苯丁酸；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲胺喋呤；铂类似物，诸如顺铂及卡铂；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(vp-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱(vincristine)；长春瑞宾(vinorelbine)；米托蒽醌(novantrone)；替尼泊甙(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素(daunomycin)；氨基喋呤；截瘤达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；cpt-11；拓朴异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；类视黄素，诸如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；及以上中的任一者的医药学上可接受的盐、酸或衍生物。亦包括用来调节或抑制肿瘤上的激素作用的抗激素剂，诸如抗雌激素及选择性雌激素受体调节剂(serm)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷诺昔酚(raloxifene)、曲洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、ly117018、奥那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)(法乐通(fareston))；抑制酶芳香酶的芳香酶抑制剂，其调节肾上腺中的雌激素产量，诸如4(5)-咪唑、胺鲁米特(aminoglutethimide)、乙酸甲地孕酮、依西美坦(exemestane)、福美司坦(formestane)、法屈唑(fadrozole)、伏罗唑(vorozole)、来曲唑(letrozole)及阿那曲唑(anastrozole)；及抗雄激素，诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁胺(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；kras抑制剂；mct4抑制剂；mat2a抑制剂；酪氨酸激酶抑制剂，诸如舒尼替尼(sunitinib)、阿西替尼(axitinib)；alk/c-met/ros抑制剂，诸如克唑替尼(crizotinib)、劳拉替尼(lorlatinib)；mtor抑制剂，诸如坦罗莫司(temsirolimus)、吉达力丝(gedatolisib)；src/abl抑制剂，诸如伯舒替尼(bosutinib)；周期素依赖性激酶(cdk)抑制剂，诸如帕泊昔布(palbociclib)、pf-06873600；erb抑制剂，诸如达可替尼(dacomitinib)；parp抑制剂，诸如拉唑帕尼(talazoparib)；smo抑制剂，诸如格拉德吉(glasdegib)、pf-5274857；egfr t790m抑制剂，诸如pf-06747775；ezh2抑制剂，诸如pf-06821497；prmt5抑制剂，诸如pf-06939999；tgfrβr1抑制剂，诸如pf-06952229；及以上任一者的医药学上可接受的盐、酸或衍生物。在特定实施方式中，此类额外治疗剂为贝伐单抗、西妥昔单抗、西罗莫司、帕尼单抗、5-氟尿嘧啶(5-fu)、卡培他滨、替沃扎尼、伊立替康、奥沙利铂、顺铂、曲氟尿苷、替吡嘧啶、甲酰四氢叶酸、吉西他滨、瑞格非尼(regorafinib)或埃罗替尼盐酸盐。
[0326]
在一些实施方式中，抗cd47、抗pd-l1或cd47/pd-l1双特异性抗体疗法可与其他试剂治疗共施用，或在其之前或之后依序施用，间隔在数分钟至数周范围内。在其他试剂和/或蛋白质或多核苷酸分开施用的实施方式中，将一般确保在各递送之间未经过显著时间段，使得本发明的试剂及组合物将仍能对个体发挥有利组合作用。在此类情况下，经考虑可在彼此的约12～24小时内，且更优选在彼此的约6～12小时内施用两种治疗(modality)。然而，在一些情况下，在各施用之间流逝若干天(2、3、4、5、6或7)至若干周(1、2、3、4、5、6、7或8)时可能需要显著延长施用时间段。
[0327]
在一些实施方式中，抗cd47抗体、抗pd-l1抗体或cd47/pd-l1双特异性抗体疗法组合物是与治疗方案组合，该治疗方案还包含选自由以下组成的群的传统疗法：手术、辐射疗
法、化学疗法、靶向疗法、免疫疗法、激素疗法、血管生成抑制及姑息性照护。
[0328]
【试剂盒】
[0329]
本发明的另一实施方式为一种试剂盒，其包含如上文所揭示的抗cd47抗体、抗pd-l1抗体或cd47/pd-l1双特异性抗体，及根据本文所述的本发明的方法中的任一者的使用说明书。一般而言，此等说明书包含施用用于上文所描述的治疗性治疗的抗cd47抗体、抗pd-l1抗体或cd47/pd-l1双特异性抗体的描述。此试剂盒包含本文所揭示的任何医药组合物。医药组合物及其他试剂可以任何便利形式存在于试剂盒中，诸如以溶液形式或以粉末形式存在。
[0330]
在另一实施方式中，试剂盒进一步在一个或多个容器中包含适用于治疗癌症的一或多种其他预防剂或治疗剂。在一个实施方式中，其他预防剂或治疗剂为化学治疗剂。在其他实施方式中，预防剂或治疗剂为生物或激素治疗剂。
[0331]
本发明的医药组合物、预防剂或治疗剂的若干实施方式优选在用于人类中之前针对所要治疗活性在活体外、在细胞培养系统中及在动物模型生物体，诸如啮齿动物动物模型系统中测试。
[0332]
本发明的预防和/或治疗方案的毒性及功效可由细胞培养物或实验动物中的例如用于测定ld
50
(50％群体致死剂量)及ed
50
(50％群体治疗有效剂量)的标准医药程序测定。毒性作用与治疗作用之间的剂量比率为治疗指数且其可表示为比率ld
50
/ed
50
。呈现大治疗指数的预防剂和/或治疗剂优选。
[0333]
此外，可使用本领域技术人员已知的任何分析来评价本文所揭示的疗法或组合疗法用于治疗或预防癌症的预防和/或治疗效用。
[0334]
关于如本文所述的抗cd47抗体、抗pd-l1抗体或cd47/pd-l1双特异性抗体的使用的说明书通常包括关于预期治疗的剂量、给药时程及施用途径的信息。容器可为单位剂量、散装(例如多剂量包装)或次单位剂量。本发明试剂盒中供应的说明书通常为标签或药品说明书(例如，试剂盒中包括的纸片)上的书面说明书，但机器可读说明书(例如，磁性或光学储存碟上承载的说明书)亦为可接受的。
[0335]
本发明的试剂盒呈适合包装形式。对于包括试剂，例如缓冲剂、平衡盐溶液等的各医药组合物及其他，适合包装包括但不限于小瓶、安瓿、管、瓶、罐、柔性包装(例如密封聚酯薄膜或塑料袋)及其类似物，用于向个体施用医药组合物。亦考虑用于与特定装置，诸如吸入器、经鼻施用装置(例如，雾化器)或输注装置(诸如小型泵)组合的包装。试剂盒可具有无菌进入口(例如，容器可为静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。容器亦可具有无菌进入口(例如，容器可为静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂为抗cd47抗体、抗pd-l1抗体或cd47/pd-l1双特异性抗体。容器可还包含第二医药活性剂。
[0336]
通常，试剂盒包含容器及在容器上或与容器相关联的一个或多个标签或药品说明书。
[0337]
出于所有目的，美国临时专利申请案第62/949,120号(2019年12月17日申请)及第63/110,693号(2020年11月6日申请)的内容以引用的方式并入本文中。
[0338]
【生物保藏】
[0339]
本发明的代表性材料于2020年12月8日保藏于美国典型培养物保藏中心
(american type culture collection),美国，弗吉尼亚州，马纳萨斯市，大学大道20110-2209，10801(10801,university boulevard,manassas,va.20110-2209,usa)。具有atcc保藏号pta-126910的载体“cd47_p01a11_75重链”包含编码命名为“cd47_p01a11_75重链”的抗cd47重链的dna插入序列、具有atcc保藏号pta-126911的载体“pd-l1_p06b05_245重链”包含编码命名为“pd-l1_p06b05_245重链”的抗pd-l1重链的dna插入序列，且具有atcc保藏号pta-126912的载体“共同轻链1完整轻链”包含编码命名为“共同轻链1完整轻链”的抗cd47及抗pd-l1共同轻链的dna插入序列。
[0340]
遵循国际承认用于专利程序目的的微生物体保藏布达佩斯条约(budapest treaty on the international recognition of the deposit of microorganisms for the purpose of patent procedure)及其下规定(布达佩斯条约)的条款进行保藏。此确保自保藏日起维持保藏物的活培养物30年。保藏将由atcc遵循布达佩斯条约的条款提供，且受制于pfizer公司与atcc之间的协议，其确保在相关美国专利发布后或在任何美国或外国专利申请案对公众公布后(以先者为准)，公众可永久且无限制地使用保藏物培养物的后代，且确保由美国专利及商标局专员根据35u.s.c.第122节及依据其的专员规则(包括37c.f.r.第1.14节，特定参考886og 638)指定有权享有者可使用后代。
[0341]
本技术案的受让人已同意，若在适合条件下培养时，保藏的材料的培养物死亡或丢失或毁坏；则将通知以实时用另一相同者替代该等材料。保藏材料的可用性不应解释为许可在违反由任何政府部门根据其专利法律授予的权利的情况下实践本发明。
[0342]
用于实行本发明的特定实施方式的以下实例仅出于说明的目的提供，且不旨在以任何方式限制本发明的范畴。
【实施例】
[0343]
【实施例1：例示性抗cd47抗体】
[0344]
下文提供关于抗cd47共同轻链(clc)抗体p14d04、p01a11、p01a08及其变体的信息。p14d04具有seq id no：6中所示的轻链氨基酸序列。p01a11及p01a08具有seq id no：2中所示的轻链氨基酸序列。
[0345]
【表9：例示性抗cd47 clc抗体的序列特性的概述】
[0346][0347]
【表10：例示性抗cd47 clc抗体的结合特性的概述】
[0348][0349]
下表11a概述两种额外抗cd47 clc抗体的特性。
[0350]
【表11a：例示性抗cd47 clc抗体的特性的概述】
[0351][0352][0353]
表11b提供亲本p01a11抗体的变体及变体与人类cd47(“hcd47”)及食蟹猴cd47(“cycd47”)蛋白的结合的kd数据。表11b中的氨基酸编号参考cd47_p01a11_亲本vh氨基酸序列(seq id no：7)。举例而言，“y27g”是指seq id no：7的位置27的“y”残基，且指示y残基突变为“g”残基。如表11b中所示，在位置27、30、31、53、54、55、100、105、108处具有突变的p01a11的各种变体以小于50nm的kd结合于hcd47，且在多个位置处的突变亦可组合。位置27、30及31在cdr1中，位置50、52、53、54及55在cdr2中，且位置99、100、105、108、113及114在cdr3中。
[0354]
【表11b：p01a11的突变形成的蛋白】
[0355][0356][0357]
【实施例2：例示性抗pd-l1抗体】
[0358]
下文提供关于抗pd-l1共享轻链(clc)抗体p04d09、p06b05及p06a09及其变体的信息。p04d09具有如seq id no：6中所示的轻链氨基酸序列。p06b05及p06a09具有如seq id no：2中所示的轻链氨基酸序列。
[0359]
【表13：例示性抗pd-l1 clc抗体的序列特性的概述】
[0360][0361]
【表14：例示性抗pd-l1 clc抗体的结合特性的概述】
[0362][0363]
两种额外抗pd-l1抗体p04d09_113及p06b05_245的特性概述于下表15a中。
[0364]
【表15a：例示性抗pd-l1 clc抗体的特性的概述】
[0365][0366][0367]
表15b提供亲本p06b05克隆的额外变体及关于突变形成的蛋白与人类pd-l1(“hpd-l1”)、食蟹猴pd-l1(“cypd-l1”)及小鼠pd-l1(“mpd-l1”)蛋白质的结合的kd数据。表15b中的氨基酸编号参考pd-l1_p06b05_亲本vh氨基酸序列(seq id no：11)。举例而言，“s104a”是指seq id no：11的位置104的“s”残基，且指示“s”残基突变为“a”残基。如表15b中所示，在位置103、104、105、107、112、113、61及62具有突变的p06b05的各种变体以小于50nm的kd结合于hpd-l1，且在多个位置处的突变亦可组合。位置56、57、61及62在cdr2中，且位置103、104、105、107、109、112及113在cdr3中。
[0368]
【表15b】
[0369]
抗pd-l1抗体变体hpd-l1 kd(nm)cypd-l1 kd(nm)mpd-l1 kd(nm)p06b05_亲本2.363.11nd
id no：75)接头，随后添加6
×
组氨酸标记至杵抗pd-l1重链的c端(“ggggshhhhhh”)(seq id no：76)。此抗体与bsab1的未标记型式具有基本上相同的与cd47及pd-l1的结合亲和力及其他特性，且用于涉及本文提供的bsab1的大部分实验。
[0374]
【表16：bsab1的氨基酸序列】
[0375][0376]
cd47/pd-l1双特异性抗体2(在本文中亦称为“bsab2”)是由组合抗cd47抗体p01a11_497(seq id no：3中所示的vh氨基酸序列)与抗pd-l1抗体p06b05_245(seq id no：4中所示的vh氨基酸序列)而制备。此等两种抗体均具有相同轻vl氨基酸序列(展示于seq id no：2中)，且因此bsab2对于抗cd47可变区及抗pd-l1可变区具有相同轻链氨基酸序列(亦即共同轻链)。bsab2具有人类igg1 fc结构域，具有杵-臼突变。bsab2的抗cd47重链、抗pd-l1重链及共同轻链的氨基酸序列展示于下表17中。fc链中产生“杵”或“臼”结构的突变加下划线。
[0377]
亦制备与bsab2一致的cd47/pd-l1双特异性抗体，不同之处在于添加“ggggs”(seq id no：75)接头，随后添加6
×
组氨酸标记至杵抗pd-l1重链的c端(“ggggshhhhhh”)(seq id no：76)。此抗体与bsab2的未标记型式具有基本上相同的与cd47及pd-l1的结合亲和力及其他特性，且用于涉及本文提供的bsab2的大部分实验。
[0378]
【表17：bsab2的氨基酸序列】
[0379][0380]
cd47/pd-l1双特异性抗体bsab1及bsab2各自由用含有编码3种不同多肽(分别是抗cd47重链；抗pd-l1重链及共同轻链)的核酸序列的多核苷酸转染cho细胞来制备。各cd47/pd-l1双特异性抗体在此等细胞中表达，且经由柱层析纯化。因此，值得注意的是，cd47/pd-l1双特异性抗体比许多其他类型及形式的双特异性抗体显著更易于产生，因为可以类似于标准igg mab的方式产生及纯化本文所提供的cd47/pd-l1双特异性抗体。与标准igg mab相比，本文所提供的双特异性抗体的主要差异在于对于标准igg mab，宿主细胞是用编码两种多肽链[亦即(i)mab重链及(i)mab轻链]的多核苷酸转染，而对于本文提供的cd47/pd-l1双特异性mab，宿主细胞是用编码三种多肽链[亦即(i)抗cd47重链，(ii)抗pd-l1重链，及(iii)共同轻链]的多核苷酸转染。
[0381]
使用针对与小鼠cd47及小鼠pd-l1蛋白的结合选择的抗体(在本文中称为“bsab3”)制备小鼠替代cd47/pd-l1双特异性抗体。
[0382]
【实施例4：cd47/pd-l1双特异性抗体与cd47及pd-l1蛋白的结合亲和力】
[0383]
评估cd47/pd-l1 bsab1、bsab2及bsab3(描述于上文实施例3中)与人类、食蟹猴及小鼠cd47及pd-l1蛋白的结合亲和力。亲和力概述于下表18中。
[0384]
【表18：bsab1、bsab2及bsab3对各种蛋白质的结合亲和力】
[0385][0386]
*＝两个独立测量；“nd”＝无数据。
[0387]
由流式细胞术使用产生以稳定地过度表达人类cd47的cho细胞评价细胞表面上bsab1、bsab2、阳性对照抗体(抗cd47抗体p01a11_75)及阴性对照抗体(抗pd-l1抗体p06b05_245)与人类cd47的结合。所得ec50值(亦即抗体结合50％的cd47蛋白的浓度)为：bsab1：11.8nm；bsab2：101.2nm；抗体p01a11_75：0.98nm；及抗体p06b05_245：不适用(n/a)。
[0388]
由流式细胞术使用产生以异位过度表达人类pd-l1的cho细胞评价细胞表面上bsab1及bsab2与人类pd-l1的结合。所得ec50值(亦即抗体结合50％的pd-l1蛋白的浓度)为：bsab1：0.38nm及bsab2：0.24nm。
[0389]
【实施例5：cd47/pd-l1双特异性抗体与肿瘤细胞及红细胞的结合】
[0390]
相较于抗cd47单特异性抗体cd47/pd-l1双特异性抗体的潜在优势为，cd47/pd-l1双特异性抗体相较于仅表达cd47的血细胞(例如红细胞)潜在地对于肿瘤微环境中的肿瘤细胞和/或免疫细胞(两者可共表达cd47及pd-l1)选择性更大。由潜在地比抗cd47单特异性抗体对肿瘤微环境中的细胞选择性更大，cd47/pd-l1双特异性抗体相比于抗cd47单特异性抗体潜在地具有降低的毒性。
[0391]
在由1:10比率的肿瘤细胞(亦即具有cd47及pd-l1表达两者的ht1080细胞)以及红细胞(rbc)(仅cd47表达)组成的混合物中，将bsab1及bsab2与人类cd47的结合与单特异性抗cd47 mab 5f9[liu,j等人，plos one.2015；10(9)]及2a1(美国公开第20140140989号)的结合相比。抗cd47 5f9及2a1与肿瘤及rbc的结合的ec50均小于0.1nm，不具有选择性。对比而言，bsab1及bsab2两者在＜0.1nm下结合100％肿瘤细胞，但rbc结合的ec50＞10nm，表明肿瘤细胞相对于rbc的至少100倍选择性。
[0392]
【实施例6：cd47/pd-l1双特异性抗体对cd47-sirpa及pd-l1-pd-1相互作用的阻断活性】
[0393]
此实例说明bsab1及bsab2的阻断能力。
[0394]
进行基于细胞的sirpa阻断ic50分析以测试bsab1及bsab2对sirpa蛋白与cho细胞过度表达的人类cd47(“cho-hcd47”)的结合的影响。类似地，进行基于细胞的sirpa阻断ic50分析以测试bsab3对sirpα蛋白与cho细胞过度表达的小鼠cd47(“cho-小鼠cd47”)的结合的影响。此分析的结果展示于下表19中。
[0395]
另外，进行基于细胞的pd-1阻断ic50分析以测试bsab1及bsab2对pd-1蛋白与cho细胞过度表达的人类pd-l1(“cho-hpd-l1”)的结合的影响。特别是，对于pd-l1阻断活性，当经由试剂盒(prω编号j1250)将pd-l1 aapc/cho-k1与pd-1效应细胞共培养时，pd-1/pd-l1相互作用抑制tcr介导的发光。当pd-1/pd-l1相互作用受pd-1阻断mab破坏时，tcr活化经由nfat路径的活化诱导发光。亦进行类似基于细胞的pd-1阻断ic50分析以测试双特异性bsab3对pd-1蛋白与cho细胞过度表达的小鼠pd-l1(“cho-小鼠pd-l1”)的结合的影响。此分
析的结果亦展示于下表19中。
[0396]
【表19：cd47/pd-l1双特异性抗体的阻断活性】
[0397]
抗cd47/抗pd-l1双特异性mab阻断/非阻断sirpa阻断/非阻断pd-1bsab1阻断，ic50＝114nm阻断bsab2阻断，ic50＝3693nm阻断bsab3阻断，ic50＝115.2nm阻断
[0398]
如表19中所示，bsab1、bsab2及bsab3中的每一者阻断sirpα与cd47之间的相互作用。另外，bsab1、bsab2及bsab3中的每一者阻断pd-1与pd-l1之间的相互作用。
[0399]
【实施例7：抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)增强cd47/pd-l1双特异性抗体的活性】
[0400]
【adcp分析】
[0401]
为测试抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)活性，自来自两个供体的pbmc分离的单核细胞分化人类巨噬细胞，且在双特异性cd47/pd-l1 bsab1存在下与表达cd47及pd-l1两者的肿瘤细胞(nci-h292细胞；肺粘液表皮样癌)共培养。如图1中所示，用bsab1处理增强对具有cd47及pd-l1表达的人类目标细胞nci-h292的巨噬细胞吞噬作用。另外，如图1中所示，对增强肿瘤细胞的吞噬作用，bsab1比抗cd47单特异性抗体(p01a11_75)或抗pd-l1单特异性抗体(p06b05_245)更有效。举例而言，在0.32nm浓度下，bsab1的总肿瘤细胞吞噬作用％为接近60％，而对于抗cd47单特异性抗体(p01a11_75)及抗pd-l1单特异性抗体(p06b05_245)，其仅约30％(图1)。
[0402]
【实施例8：小鼠替代cd47/pd-l1双特异性抗体的活体内功效研究】
[0403]
此实例说明cd47/pd-l1双特异性抗体在三种同基因型小鼠肿瘤模型[ct26-热肿瘤模型(小鼠结肠癌细胞)；mc38-温肿瘤模型(小鼠结肠癌细胞)；b16f10-冷肿瘤模型(小鼠黑素瘤细胞)]中的抗肿瘤功效。
[0404]
在ct26肿瘤模型中，将用cd47/pd-l1双特异性抗体bsab3处理之后的功效及体重变化与单独单特异性抗mcd47 mab及单独单特异性抗mpd-l1 mab及其组合(图2a、2b及2c)进行比较。另外，制备bsab3的fc无效型式且包括于实验中，以评估fc介导的效应功能对bsab3活性的贡献。在以100μg(约5mg/kg)施用腹膜内(ip)处理总共三个相隔三或四天的剂量之后，bsab3 cd47/pd-l1双特异性抗体的功效在统计学上比单独的抗cd47或抗pd-l1更优选[图2a；bsab3(实心菱形)处理得到所测试抗体或抗体组合中的任一者的最小肿瘤体积]。此外，如由体重减轻(图2b)所证明，抗cd47 mab在此剂量下不耐受，而bsab3在整个处理中具有良好耐受性。[在图2b中，抗cd47单特异性抗体(空心正方形)及抗cd47单特异性抗体与抗pd-l1单特异性抗体的组合(倒空心三角形)的数据点大部分重迭。另外，抗pd-l1单特异性抗体(实心三角形)及双特异性cd47/pd-l1 bsab3(实心菱形)的数据点大部分重迭。fc无效双特异性cd47/pd-l1 bsab3(空心圆形)数据不存在于图2b中。]用bsab3处理引起类似于用抗cd47与抗pd-l1 mab的组合实现的肿瘤生长抑制的肿瘤生长抑制，然而，单特异性抗体的组合引起＞10％体重减轻。具有及不具有igg效应功能的bsab3的功效的比较展示与mg2a野生型相比mg2a fc无效的功效降低(图2a及图2c)。在所测试化合物中，用具有mg2a野生型效应功能的bsab3处理(实心菱形)得到最佳存活率结果(图2c)。如图2c中所示，用具有mg2a野生型效应功能的bsab3处理(实心黑色菱形)的动物在处理后28天具有约75％存活
率。相比的下，用抗cd47单特异性抗体与抗pd-l1单特异性抗体组合处理(倒空心三角形)的动物在处理后28天具有约65％存活率。用具有mg2a fc无效的bsab3处理(空心圆形)的动物在处理后28天具有约25％的存活率。
[0405]
在mc38肿瘤模型中，评估不同剂量的双特异性bsab3抑制肿瘤生长的功效。用10、20或40mg/kg bsab3腹膜内处理携带mc38肿瘤的小鼠，每周两次，持续三周，总计6次剂量。在此模型中，10、20或40mg/kg处理的所观测功效分别为约25.7％、52.6％及75.8％肿瘤生长抑制(亦即与同型对照抗体相比)(图3a)。所有此等剂量均具有良好耐受性，无体重减轻(图3b)。
[0406]
在b16f19肿瘤模型中，评估20mg/kg bsab3的抗肿瘤功效。用20mg/kg双特异性bsab3腹膜内处理携带b16f19肿瘤的小鼠，每周三次，持续三周，总计9次剂量。在此模型中，20mg/kg处理的所观测功效为约68％肿瘤生长抑制(亦即与同型对照抗体相比)(图4a)。此剂量具有良好耐受性，体重无实质性减轻(图4b)。
[0407]
【实施例9：小鼠替代cd47/pd-l1双特异性抗体的作用机制研究】
[0408]
在此实验中，进行分析以确定小鼠替代cd47/pd-l1双特异性抗体的抗肿瘤功效需要何种免疫细胞类型。
[0409]
在携带mc38肿瘤的小鼠中与小鼠cd47/pd-l1双特异性bsab3(40mg/kg，一周两次，持续三周)共施用已知耗乏cd8 t细胞(抗cd8；抗体：2.43)、cd4 t细胞(抗cd4；抗体：gk1.5)、nk细胞(抗nk1.1；抗体：pk136)及肿瘤相关巨噬细胞(抗csf1r)的抗体。如图5a、5c及5d中所示，数据表明在无单独cd8 t细胞存在下(图5a)及cd8加cd4 t细胞的组合(图5a)，但不在无单独cd4 t细胞存在下(图5a)、在无nk细胞存在下(图5d)或在无肿瘤相关巨噬细胞存在下(图5c)，功效受损。另外，亦在相比于野生型c57bl/6小鼠，不具有经典1型树突状细胞(dc1)(cd8α+及cd103+)子集的batf3-/-小鼠(hildner,k.等人，science,2008.322(5904)：第1097-100页)中进行此研究。如图5b中所示，功效在不存在cdc1的情况下损失。[在图5b中，用对照抗体处理的野生型小鼠(实心圆形)、用对照抗体处理的batf3-/-小鼠(空心正方形)及用bsab3处理的batf3-/-小鼠(实心三角形)的数据点紧密重迭，特别是在第25天。]
[0410]
【实施例10：cd47/pd-l1双特异性抗体的药效学作用】
[0411]
此实验的目的为了解活体内cd47/pd-l1双特异性抗体的药效学作用。
[0412]
在肿瘤植入后第11、14及18天用5mg/kg、10mg/kg或20mg/kg双特异性bsab3处理携带mc38肿瘤的小鼠。肿瘤植入三周后，自小鼠收集肿瘤及脾且分析不同细胞类型。如表20a-20e中所示，存在诸如cd8+cd11c+dc的一些脾树突状细胞(dc)子集的剂量依赖性增加(表20a)。此外，cd11c+中dec205+cd8+cd103+dc的百分比在脾中显著增加(表20b)。就肿瘤而言，存在t细胞(thy1.2+)(表20c)及cd8+t细胞(表20d)而非cd4+t细胞(表20e)的增加，表明在用双特异性bsab3处理的后先天性及后天性免疫细胞两者受到调节。
[0413]
【表20a：脾中的cd8+dc(cd11c的％)】
[0414]
组平均值sem对照组29.844.80bsab3_5mg/kg26.323.50bsab3_10mg/kg52.504.02
bsab3_20mg/kg60.801.53
[0415]
【表20b：脾中的cd103+dc(cd11c的％)】
[0416][0417][0418]
【表20c：肿瘤中的t细胞(cd45的％)】
[0419]
组平均值sem对照组19.082.49bsab3_5mg/kg33.022.57bsab3_10mg/kg39.123.83bsab3_20mg/kg41.023.19
[0420]
【表20d：肿瘤中的cd8 t细胞(cd45的％)】
[0421]
组平均值sem对照组6.440.77bsab3_5mg/kg14.481.68bsab3_10mg/kg19.521.71bsab3_20mg/kg19.401.61
[0422]
【表20e：肿瘤中的cd4 t细胞(cd45的％)】
[0423]
组平均值sem对照组8.791.46bsab3_5mg/kg14.000.78bsab3_10mg/kg14.612.63bsab3_20mg/kg15.151.90
[0424]
【实施例11：cd47/pd-l1 bsab1的活体内功效研究】
[0425]
此实验的目的为测试cd47/pd-l1 bsab1及bsab2的活体内功效。
[0426]
nsg免疫缺陷小鼠在右侧腹皮下接种2
×
106mda-mb-231三阴性人类乳癌细胞。此等细胞内源性地过度表达cd47及pd-l1两者。当肿瘤达到目标尺寸时，小鼠随机分配至处理组。处理在随机分配的同一天开始。小鼠一周一次用10mg/kg higg1同型mab(对照物)或1、5或10mg/kg的cd47/pd-l1 bsab1或bsab2处理6周。肿瘤尺寸以各种时间间隔使用测径规以2维测量，且体积使用式：v＝0.5l
×
w2以立方毫米计算，其中l为肿瘤的最长直径且w为垂直于l的直径。
[0427]
结果展示于图6中。如图6中所示，相较于同型对照组，用5或10mg/kg his标记的cd47/pd-l1 bsab1或bsab2处理实质上推迟mda-mb-231肿瘤生长。特别是，对于bsab1，肿瘤生长抑制(tgi)相较于同型抗体在1mg/kg、5mg/kg及10mg/kg剂量下分别为16.8％、68.4％及78.7％。对于bsab2，相较于同型抗体，肿瘤生长抑制(tgi)在1mg/kg、5mg/kg及10mg/kg剂量下分别为6.9％、62.8％及74.1％。[在图6中，对照同型抗体(实心圆形)、1mg/kg bsab1
(实心三角形)及1mg/kg bsab2(空心圆形)的数据点一般彼此接近或重迭。类似地，5mg/kg bsab1(空心菱形)、10mg/kg bsab1(空心三角形)、5mg/kg bsab2(实心菱形)及10mg/kg bsab2(实心正方形)的数据点一般彼此接近，其中10mg/kg bsab1具有最低值。]
[0428]
【实施例11：食蟹猴中抗cd47/抗pd-l1 bsab1及bsab2的毒性研究】
[0429]
此实验的目的为在食蟹猴中用his标记的bsab1及his标记的bsab2进行探索性毒性研究(ets)。bsab1及bsab2对人类及食蟹猴cd47及pd-l1部分具有类似结合亲和力，且以对人类红细胞及血小板类似的亲和力结合于食蟹猴红细胞及血小板。因此，此等数据支持使用食蟹猴作为cd47/pd-l1 bsab1及bsab2的毒性评估的相关物种。
[0430]
对于bsab1及bsab2中的每一者，向一只猴施用10mg/kg的剂量，向一只猴施用30mg/kg的剂量，且向3只猴施用100mg/kg的剂量。mab在第1天及第8天静脉内施用。在第15天，分析来自各猴的样品的各种免疫细胞子集及细胞介素，如下表21-24中所示。表21及23提供关于在向猴施用不同剂量的bsab1或bsab2之后各种免疫细胞子集的活化和/或增殖的数据。表22及24提供关于在向猴施用不同剂量的bsab1或bsab2后各种细胞介素的增加的数据。
[0431]
在下表中，nc＝无变化；il＝介白素；ifn＝干扰素；mcp＝单核细胞化学引诱蛋白质；ip＝干扰素诱导蛋白质。比率(例如，“1/1”或“2/3”)是指在处理组中经历参数变化的猴数目相对于猴总数。举例而言，“2/3”指示处理的三只猴中的两者具有相关参数的变化。圆括号中提供的值[例如，“(4.9
×
)”]提供相比于基线的倍数变化；当存在来自两只或更多只猴的数据时，在圆括号中提供值范围[例如，“(4.0
×
至9.2
×
)”]。
[0432]
【表21：cd47/pd-l1 bsab1的免疫细胞活化/增殖】
[0433][0434]
【表22：cd47/pd-l1 bsab1对细胞介素含量的作用】
[0435] 媒剂10mg/kg/剂30mg/kg/剂100mg/kg/剂il-6(＜1.0
×
至1.9
×
)nc1/1(4.9
×
)3/3(4.0
×
至9.2
×
)ifn-γ(＜1.0)ncnc1/3(4.9
×
)mcp-1/ccl2(0.9
×
至2.7
×
)nc1/1(＞4.8
×
)3/3(4.4
×
至5.6
×
)ip-10/cxcl10(0.4
×
至1.0
×
)nc1/1(5.6
×
)2/3(5.7
×
至7.2
×
)
[0436]
【表23：cd47/pd-l1 bsab2的免疫细胞活化/增殖】
[0437][0438]
【表24：cd47/pd-l1 bsab2对细胞介素含量的作用】
[0439][0440][0441]
如表21及23中所指示，存在施用bsab1及bsab2的食蟹猴中t细胞的活化和/或增殖及单核细胞的活化的迹象。另外，存在单核细胞/巨噬细胞/dc或t细胞相关细胞介素，包括il6、infg、ccl2、cxcl10轻微短暂增加的迹象，如表22及24中所示。总体而言，此数据支持食蟹猴中使用抗cd47/抗pd-l1 bsab1及bsab2施用的免疫系统的药理学活性及活化。
[0442]
【实施例12：组合处理：cd47/pd-l1双特异性mab与tlr9促效剂】
[0443]
此实例说明抗cd47/抗pd-l1 mab与tlr9促效剂的组合的处理活性。
[0444]
上文描述小鼠替代cd47/pd-l1双特异性bsab3。以10mg/kg于磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的亚有效剂量(sub-efficacious dose)施用双特异性bsab3，一周两次，持续两周(总计4次剂量)。
[0445]
tlr9促效剂是cpg24555，其为b类cpg寡核苷酸(odn)。cpg odn为在特定序列背景(cpg模体)中含有未甲基化cpg二核苷酸的合成odn。cpg24555描述于例如美国专利第8552165号中，该专利出于所有目的并入本文中。肿瘤接种之后11天cpg24555以5mg/kg于磷酸盐缓冲盐水(pbs)(life technologies)中瘤内(it)给药一次剂量。
[0446]
六至八周龄雌性c57bl/6小鼠系购自jackson laboratories。所有动物圈养在pfizer的无病原体饲养设施中且根据方案根据实验动物照护及使用委员会(institutional animal care and use committee，iacuc)规范进行实验。
[0447]
mc38结肠癌细胞系系购自美国典型培养物保藏中心(atcc)。收集在指数生长期中生长的无病原体细胞且用于肿瘤接种。
[0448]
c57bl/6小鼠在右侧腹用含0.5
×
105个mc38细胞的0.1ml pbs皮下接种。当肿瘤达到目标尺寸时，小鼠随机分配至处理组。处理在随机分配的同一天开始。肿瘤尺寸以各种时间间隔使用测径规以2维测量，且体积使用式：v＝0.5l
×
w2以立方毫米计算，其中l为肿瘤的最长直径且w为垂直于l的直径。亦记录体重。
[0449]
结果展示于图7中。如图7中所示，相比于同型对照组(实心圆形)，cd47/pd-l1双特异性bsab3(空心正方形)及tlr9促效剂(实心倒三角形)处理推迟mc38结肠癌肿瘤生长，且
cd47/pd-l1双特异性bsab3加tlr9促效剂的组合(空心三角形)的功效大于个别cd47/pd-l1双特异性bsab3及tlr9试剂。[在图7中，cd47/pd-l1双特异性bsab3(空心正方形)及tlr9促效剂(实心倒三角形)的数据点大部分重迭。]
[0450]
cd47/pd-l1双特异性mab及tlr9促效剂的组合处理观测到的功效增加与主体肿瘤rna定序数据一致，该数据展示响应于tlr3、tlr7/8、tlr9或sting促效剂的瘤内施用的b16f10肿瘤细胞中的cd47及pd-l1表达增加(数据未示出)。
[0451]
【实施例13：组合处理：cd47/pd-l1双特异性mab与cdk 2/4/6抑制剂】
[0452]
此实例说明cd47/pd-l1 mab与周期素依赖性激酶(cdk)2/4/6抑制剂的组合的处理活性。
[0453]
上文描述小鼠替代cd47/pd-l1双特异性bsab3。双特异性bsab3以20mg/kg于磷酸盐缓冲盐水(pbs)中给药，一周三次持续三周。
[0454]
cdk 2/4/6抑制剂为pf-06873600。pf-06873600或6-(二氟甲基)-8-((1r,2r)-2-羟基-2-甲基环戊基)-2-(1-(甲磺酰基)哌啶-4-基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮为cdk2、cdk4及cdk6的强效及选择性抑制剂，其具有以下结构：
[0455][0456]
pf-06873600及其医药学上可接受的盐揭示于2018年2月22日公开的国际公开第wo 2018/033815号中。该参考文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
[0457]
六至八周龄雌性c57bl/6小鼠系购自jackson laboratories。所有动物圈养在pfizer的无病原体饲养设施中且根据方案根据实验动物照护及使用委员会(iacuc)规范进行实验。
[0458]
b16f10黑素瘤细胞系系购自美国典型培养物保藏中心(atcc)。收集在指数生长期中生长的无病原体细胞且用于肿瘤接种。
[0459]
c57bl/6小鼠在右侧腹用含0.5
×
105个b16f10细胞的0.1ml pbs皮下接种。当肿瘤达到目标尺寸时，小鼠随机分配至处理组。处理在随机分配的同一天开始。肿瘤尺寸以各种时间间隔使用测径规以2维测量，且体积使用式：v＝0.5l
×
w2以立方毫米计算，其中l为肿瘤的最长直径且w为垂直于l的直径。亦记录体重。
[0460]
结果展示于图8中。如图8中所示，相比于同型对照组(实心圆形)，cd47/pd-l1双特
异性bsab3(实心三角形)及cdk 2/4/6抑制剂pf-06873600(空心正方形)处理推迟b16f10黑素瘤肿瘤生长，且cd47/pd-l1双特异性mab及pf-06873600的组合(空心菱形)的功效大于个别cd47/pd-l1双特异性mab及pf-06873600试剂。
[0461]
cd47/pd-l1双特异性mab及cdk2/4/6抑制剂的组合处理观测到的功效增加与展示响应于pf-06873600施用，由流式细胞术，b16f10肿瘤细胞上的cd47及pd-l1表达增加的数据(数据未示出)一致。
[0462]
尽管已参考各种申请案、方法、试剂盒及组合物描述所揭示教导内容，但应了解在不背离本文中的教导内容及下文所主张的本发明情况下可进行各种变化及修改。提供前述实例以更好地说明所揭示的教导内容，且不旨在限制本文中呈现的教导内容的范畴。尽管已在此等例示性实施例方面描述本发明教导内容，但本领域技术人员将容易理解在无不当实验情况下此等例示性实施例的大量变化及修改为可能的。所有此类变化及修改皆在本教导内容的范畴内。
[0463]
本文中所引用的所有参考文献，包括专利、专利申请案、论文、教科书及其类似文献且其中引用的参考文献(就其尚未经引用的程度)在此以全文引用的方式并入本文中。在所并入文献及类似材料中的一或多者与本技术案不同或抵触的情况下，包括但不限于所定义的术语、术语用法、所描述的技术或其类似物，以本技术案为准。
[0464]
前述描述及实例详述本发明的某些特定实施例，且描述本发明人考虑的最优选模式。然而应了解，无论前述内容在文中显得多么详细，本发明仍可以许多方式实践，且本发明应根据随附申请专利范围及其任何等效物来解释。
[0465]
应理解，在本文中用语言“包含”描述实施例的任何地方，亦提供用术语“由
……
组成”和/或“基本上由
……
组成”所描述的在其他方面类似的实施例。
[0466]
当本发明的实施方式或实施例根据马库西组(markush group)或其他替代组进行描述时，本发明不仅涵盖整体列出的全部组，而且个别地涵盖组的各成员且涵盖主组的所有可能子组，且亦涵盖缺乏组成员中的一或多者的主组。本发明亦设想明确排除所主张的本发明中的任何组成员中的一或多者。
[0467]
在涉及如本文所描述的治疗方法的实施方式中，此类实施例亦为供用于该治疗，或者用于制造供用于该治疗的药剂的其他实施例。
[0468]
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语均具有与一般熟习本发明所属技术者通常所理解相同的含义。在有冲突的情况下，将以本说明书，包括定义为准。在整个本说明书及申请专利范围中，字组“包含(comprise)”或诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的变体应理解为意谓着包括所述整数或整数群但不排除任何其他整数或整数群。除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。在术语“例如(e.g.)”或“例如(for example)”之后的任何一个或多个实例并不旨在为穷尽性或限制性的。除非上下文另外明确规定，否则当用于列举多个选项的上下文(例如“a、b或c”)中时，术语“或”应解释为包括该等选项中的任何一或多者。
[0469]
本文描述例示性方法及材料，但与本文所述的方法及材料类似或等效的方法及材料亦可用于实施或测试本发明。材料、方法及实例仅为说明性的且并不旨在为限制性的。