通过甘氨酸稳定氧化酶的制作方法

1.本发明的组合物和方法涉及使用氨基酸甘氨酸来稳定氧化酶。这些组合物和方法允许对含有氧化酶的组合物进行加热干燥，而酶活性产量得以提高，以及对干燥的含有氧化酶的组合物进行长期储存，在某些情况下不需要冷藏。


背景技术：

2.氧化酶(ec 1.1.3)是催化氧化还原反应的酶，典型地涉及作为电子受体的双原子氧(o2)。氧化酶的实例是己糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、单胺氧化酶、黄嘌呤氧化酶、l-古洛糖酸内酯氧化酶、赖氨酰氧化酶、nadph氧化酶、多酚氧化酶、细胞色素p450氧化酶以及漆酶。本文列出了许多另外的酶。
3.葡萄糖氧化酶(gox；ec 1.1.3.4)是可在异源宿主中过表达以进行大规模生产，并且具有特别广泛范围的商业用途的氧化酶。gox(有时称为god)广泛用于控制微生物污染(例如在酿酒中)，以及用于生化分析和生物传感器以测量血液和尿液中的游离葡萄糖。gox还用于在烘焙中生产更强的面团，以去除食品包装中的氧气，并且防止某些食品(如蛋清)的褐变。
4.gox是热敏性酶，并且由于生产和储存过程中大量的活性损失，商业生产变得昂贵和低效。制造动物饲料的工艺(如喷雾干燥和制粒)对gox具有特别大的破坏性。鉴于gox和其他氧化酶的大量用途，需要以具有成本效益的方式提高稳定化的方法。
5.己糖氧化酶(hox：ec 1.1.3.5)催化单糖和二糖氧化为对应的内酯，伴随将分子氧还原为过氧化氢。这种酶通过在某些甲基营养酵母中过表达来商业化生产。己糖氧化酶能够氧化多种底物，这些底物包括d-葡萄糖、d-半乳糖、麦芽糖、纤维二糖以及乳糖。广泛的底物特异性将这种酶与对d-葡萄糖高度特异的gox区别开。hox还用于在烘焙中生产更强的面团。
6.gox和hox是热敏性酶，并且由于生产和储存过程中大量的活性损失，它们的商业生产变得昂贵和低效。需要以成本效益的方式提高稳定化。


技术实现要素：

7.本发明的组合物和方法涉及使用氨基酸甘氨酸来稳定氧化酶。这些组合物和方法允许对含有氧化酶的组合物进行加热干燥，而酶活性产量得以提高，以及对干燥的含有氧化酶的组合物进行长期储存，对冷藏的需要减少。这些组合物和方法的各方面和实施例描述于以下独立编号的段落中。
8.1.在一方面，提供了用于提高组合物中氧化酶的稳定性的方法，所述方法包括：将游离氨基酸甘氨酸与所述氧化酶以至少1克甘氨酸/克氧化酶的比率混合，其中所述混合的氧化酶在所述组合物中比氧化酶在缺少甘氨酸而其他方面相同的组合物中具有提高的稳定性。
9.2.在段落1的方法的一些实施例中，所述比率为至少6.4克甘氨酸/克氧化酶。
10.3.在段落1或2的方法的一些实施例中，甘氨酸在配制品中是氧化酶的主要稳定剂。
11.4.在任一前述段落所述的方法的实施例中，甘氨酸在基本不存在游离酸性氨基酸的情况下存在。
12.5.在任一前述段落所述的方法的实施例中，甘氨酸是唯一存在的游离氨基酸。
13.6.在任一前述段落所述的方法的实施例中，所述氧化酶是葡萄糖氧化酶或己糖氧化酶。
14.7.在前述段落中任一项所述的方法的实施例中，所述氧化酶和甘氨酸在水溶液或悬浮液中混合。
15.8.在段落7的方法的一些实施例中，所述混合的氧化酶和甘氨酸随后被干燥。
16.9.在另一方面，提供了包含比率为至少1克甘氨酸/克氧化酶的氧化酶和游离氨基酸甘氨酸的组合物，其中所述混合的氧化酶在所述组合物中比氧化酶在缺少甘氨酸而其他方面相同的组合物中具有提高的稳定性。
17.10.在段落9的组合物的一些实施例中，所述比率为至少6.4克甘氨酸/克氧化酶。
18.11.在段落9或10的组合物的一些实施例中，甘氨酸在基本不存在酸性氨基酸残基的情况下存在。
19.12.在前述段落9-11中任一项所述的组合物的实施例中，甘氨酸是唯一存在的游离氨基酸。
20.13.在段落9-12中任一项所述的组合物的一些实施例中，所述氧化酶是葡萄糖氧化酶己糖氧化酶。
21.14.在段落9-13中任一项所述的方法或组合物的一些实施例中，将所述氧化酶和甘氨酸掺入颗粒、膜、垫、凝胶或其他固体和/或液体组合物中。
22.根据本说明书，组合物和方法的这些和其他方面和实施例将是显而易见的。
附图说明
23.图1是显示在存在甘氨酸/克活性gox的增加量的情况下，结合的fad与游离的fad的比率的图。
具体实施方式
24.i.前言
25.本发明的诸位发明人已经发现，氨基酸甘氨酸的掺入比任何其他氨基酸更能改善配制的氧化酶浓缩物的酶组合物的加热干燥产率。虽然已经描述了使用氨基酸稳定氧化酶，如葡萄糖氧化酶(gox)(参见，例如，美国专利号4,543,326)，此类研究已经一致地鉴定出不同的氨基酸残基，如酸性氨基酸残基(即天冬氨酸和谷氨酸及其盐)，作为最优选的用于稳定的氨基酸。本发明的选择发明涉及甘氨酸(中性氨基酸)的用途，特别是作为氧化酶的优选稳定剂。
26.ii.定义和缩写
27.在详细地描述本发明的组合物和方法之前，为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语应当符合相关领域中所使用的常规含义。
28.如本文所用，术语“颗粒”是指物质的小粒子。该粒子包含任选地具有一个或多个任选包衣层的核。
29.如本文所用，“重量百分比”、“重量分数”、“质量分数”或简称为“分数”是指以％wt/wt或分数wt/wt为基础的质量的相对量，例如，成分与整个颗粒的质量相比的相对量。
30.如本文所用，术语“粒料”和“制粒”是指固体、圆形、球形和圆柱形的片剂或粒料以及形成此类固体形状，特别是饲料粒料和固体、挤出动物饲料的方法。
31.如本文所用，术语“回收活性”或“活性回收率”是指(i)在涉及一种或多种以下应激物的处理后酶的活性：加热、增压、增高ph、降低ph、储存、干燥、暴露于表面活性剂、暴露于溶剂和机械应力)与(ii)处理之前酶的活性的比率。回收活性可以表示为百分比。回收活性百分比计算如下：
[0032][0033]
如本文中所用，术语“约”是指参考值的
±
15％。
[0034]
为了便于参考，可以将本发明的组合物和方法的要素排列在一个或多个标题下。要注意的是，每个标题下的组合物和方法也适用于其他标题下的组合物和方法。
[0035]
如本文所用，单数冠词“一个/一种(a/an)”以及“该/所述(the)”涵盖复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。本文引用的所有参考文献均通过援引以其全文特此并入。除非另外说明，否则以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：
[0036]
℃摄氏度
[0037]
g或gm克
[0038]
g/l克/升
[0039]
g/mol克/摩尔
[0040]
mol/mol摩尔比
[0041]
μmol微摩尔
[0042]
hr或h小时
[0043]
kg千克
[0044]
mg毫克
[0045]
ml或ml毫升
[0046]
min分钟
[0047]
m摩尔
[0048]
mm毫摩尔
[0049]
μm微米(micron)
[0050]
μl和μl微升
[0051]
ufc超滤浓缩物
[0052]
溶解的固体活性氧化酶蛋白加上其他非氧化酶发酵固体物
[0053]
rh相对湿度
[0054]
wt重量
[0055]
％wt/wt重量百分比
[0056]
iii.可以通过甘氨酸稳定的氧化酶
[0057]
甘氨酸是示例性氧化酶的优选的氨基酸稳定剂，这是预期将适用于广泛范围的氧化酶的发现。此外，测试甘氨酸稳定特定氧化酶的能力是常规的，并且不需要过度的实验。
[0058]
预期使用甘氨酸稳定的特定氧化酶是那些使用分子氧(o2)作为受体的氧化酶，并且分类为ec 1.1.3。示例性氧化酶包括表1中列出的那些。
[0059]
表1.ec 1.1.3酶
[0060][0061][0062]
氧化酶优选地在水性混合物中用甘氨酸稳定，但随后可以干燥，如通过喷雾干燥、喷雾附聚、喷雾造粒等。氧化酶可经受高剪切和挤出，随后干燥，并且可用于流化床包衣。甘氨酸稳定的氧化酶可以掺入颗粒、制粒、膜、垫、凝胶或任何其他固体或液体组合物中，优选地是不将甘氨酸与氧化酶分离的组合物。
[0063]
iv.甘氨酸与氧化酶的比率
[0064]
不同的氧化酶可能需要不同量的甘氨酸来稳定，这些量很容易确定。此类量最好表示为甘氨酸与活性氧化酶蛋白的摩尔比或重量百分比，或者甘氨酸与氧化酶活性的摩尔比或重量百分比(以定义的单位表示)。基于附加的实例，推荐的比率为约1至约10g甘氨酸/g活性氧化酶蛋白，例如约1.6至约8.4g甘氨酸/g活性氧化酶蛋白。在一些情况下，比率为至少约6.4g甘氨酸/g活性氧化酶蛋白。
[0065]
甘氨酸的来源，即天然存在的还是合成的，并不重要。应当理解，用作稳定剂的甘氨酸是游离甘氨酸，而不是掺入到蛋白质(包括待稳定的氧化酶蛋白质)中的甘氨酸残基。甘氨酸是氧化酶稳定的主要决定因素，这意味着它是提高稳定性所必要且充分的唯一赋形剂；然而，甘氨酸也可以与其他氨基酸、其他稳定剂或其他有益试剂混合。
[0066]
实例
[0067]
以下实施例旨在举例说明，但不将本发明的范围限制于示例的氧化酶。葡萄糖氧化酶(gox)也称为notatin(ec编号1.1.3.4)，是催化葡萄糖氧化为过氧化氢和d-葡糖酸-δ-内酯的氧化酶。这种酶由某些真菌种类产生，如黑曲霉。氧化反应由黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)进行，fad是氧化还原辅因子，在两种相同的gox单体之间紧密结合(而非共价)。gox二聚体含有两种fad辅因子，这两种fad辅因子负责酶的氧化还原特性。gox是热不稳定酶，并且对涉及加热的干燥过程敏感。在变性条件下，如在加热干燥期间发生的那些条件，二聚体解离为其亚单位，导致不可逆的辅因子损失，从“结合”状态转变为“游离”状态，进而导致酶失活和聚集。
[0068]
实例1.加热干燥过程中gox的热失活
[0069]
从杜邦公司(dupont)/丹尼斯科公司(danisco)发酵工厂获得两份纯(未配制的)gox ufc(25mg活性蛋白/g ufc)样品。将这些样品在50℃下于烘箱中培养四、八和二十四小时。实验方法涉及向96孔板的内孔中添加80μl的每种样品(以避免边缘效应)，使用透气密封来密封板，并在50℃下孵育板。在干燥前后记录板的重量，以确保去除所有水分。
[0070]
为了测量活性，将每个孔的干燥内容物重悬在80μl纯化水中。重悬后，使用标准葡萄糖氧化酶测定来测定活性。葡萄糖氧化酶催化在测定中的葡萄糖和氧气转化为过氧化氢和葡萄糖酸。将过氧化氢与2,2
’‑
连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(abts)反应，使反应介质的外观从无色变为绿色。该反应由过氧化物酶催化。绿色在分光光度计上于405nm下测量。使用由已知浓度的标准物质制备的标准稀释液的线性回归来校准该方法。如表2所示，氧化酶的酶活性随着时间的推移而降低。
[0071]
表2.在50℃下孵育4、8和24小时的纯gox ufc样品的氧化酶活性产率；n＝8，平均值
±
标准偏差
[0072][0073]
实例2.通过甘氨酸使gox热稳定
[0074]
从杜邦公司(dupont)/丹尼斯科公司(danisco)发酵工厂获得的纯(未配制的)gox ufc(25mg活性蛋白/g ufc)样品。对用不同浓度范围0％-16％的甘氨酸配制的gox浓缩液进
行了一系列热应力实验。在50℃下加热样品8小时后，观察到gox变性(基于结合的fad辅因子与游离的fad辅因子的比率)与甘氨酸浓度之间存在相关性(表3)。gox样品的fad分布通过疏水相互作用色谱进行，在450nm下进行uv检测。测定“结合的”和“游离的”fad辅因子的吸收曲线下面积与保留时间，并且然后计算它们各自的比率。在gox ufc中添加甘氨酸，降低了酶蛋白在热应激下的变性程度。基于变性曲线的图示分析，优选的甘氨酸浓度大于约1g甘氨酸/g氧化酶蛋白，例如大于1.6，或甚至大于6.4g甘氨酸/g氧化酶蛋白。大于约8.4g甘氨酸/g氧化酶蛋白的量似乎不能提供更多的益处。
[0075]
表3.游离的fad和结合的fad随甘氨酸浓度的变化
[0076][0077]
制备纯gox ufc和含有阳离子或中性氨基酸的配制的gox ufc样品，在96孔板中干燥。将约20μl的每种gox制剂添加至6个孔中，并用透气盖将板密封。将板在50℃下孵育4小时，以干燥这些样品。通过上述实例1中描述的方案来测量干燥样品的酶活性。
[0078]
阳离子氨基酸包括精氨酸和赖氨酸，并且中性氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸以及苏氨酸。在测试的氨基酸中，丙氨酸、甘氨酸和脯氨酸在gox ufc中显示出的最高的溶解度。组氨酸(中性氨基酸)不包括在内，尽管其溶解度较高，因为它会增加浓缩物的ph值。
[0079]
表4显示了用不同阳离子和中性氨基酸配制的gox的回收活性。与中性和阳离子氨基酸相比，包括天冬氨酸、d-谷氨酸和l-谷氨酸在内的阴离子氨基酸在gox ufc中的溶解度较低，并且显示出较低的酶活性产率。因此，它们不是本发明的gox组合物热稳定的优选赋形剂。
[0080]
表4.在50℃下干燥4小时后的gox回收活性；n＝6，平均值
±
标准偏差
[0081][0082]
活性测定结果显示，与不含甘氨酸的纯样品和用其他中性和阳离子氨基酸配制的样品相比，含甘氨酸的干燥配制品具有最高的回收活性。在测试的其他氨基酸中，甘氨酸的分子量最低，相对于活性酶蛋白而言，甘氨酸作为热稳定剂的摩尔浓度最高。
[0083]
实例3.gox喷雾干燥组合物的储存稳定性
[0084]
将甘氨酸添加至gox浓缩物中，ufc以14％(wt甘氨酸/wt ufc)，即5.6g甘氨酸/g活
性蛋白，溶解了8.2％的固体，改善了通过喷雾干燥生产的干燥酶组合物的储存稳定性。对喷雾干燥的含甘氨酸和不含甘氨酸(对照)的gox粉末组合物进行了6个月的稳定性研究。将样品装在封闭盖子的塑料瓶中，并且在37℃和65％相对湿度下孵育180天。在此期间，通过在0、3、7、14、30、60、90和180天后分析样品来监测酶活性。表5中列出了测试样品的回收酶活性。在储存180天后，gox/甘氨酸组合物保持了高达55％的酶活性。
[0085]
表5.在37℃/65％rh下6个月后，与未配制的葡萄糖氧化酶相比，葡萄糖氧化酶/甘氨酸喷雾干燥粉末组合物的回收酶活性(％)
[0086]