CXCL10结合蛋白及其用途的制作方法

125、gm-csf、il-6、tnf-rii、he4和/或il-8)之间的比率能够区分i期(即早期)癌症或癌前病变和良性病症。
12.在一个示例中，本公开提供了一种cxcl10结合蛋白，其中所述结合蛋白与全长人cxcl10、n-末端截短的cxcl10和瓜氨酸化的cxcl10结合。
13.在上述示例的一个实施方式中，所述cxcl10结合蛋白与全长人cxcl10、n-末端截短的cxcl10和瓜氨酸化的cxcl10的表位nh2-lsrtvrctcisisnqpvnprsle-cooh(seq idno：26)结合。
14.在一个实例中，cxcl10结合蛋白：(i)以50nm或更小的kd与全长人cxcl10结合；和/或(ii)以5nm或更小的kd与n-末端截短的人cxcl10结合。
15.在一个示例中，cxcl10结合蛋白以5nm或更小的kd与全长人cxcl10结合或特异性结合。例如，cxcl10结合蛋白以约50nm，或约40nm，或约30nm，或约20nm，或约10nm的kd与全长人cxcl10结合或特异性结合。在一个示例中，cxcl10结合蛋白以49nm的kd与全长人cxcl10结合或特异性结合。
16.在上述示例的一个实施方式中，cxcl10结合蛋白需要表位 nh2-vplsrtvrctcisisnqpvnprsle-cooh(seq id no：25)的n-末端缬氨酸和/或脯氨酸与全长人cxcl10结合。
17.在一个示例中，cxcl10结合蛋白以5nm或更小的kd与n-末端截短的人cxcl10结合或特异性结合。例如，cxcl10结合蛋白以约5nm，或约4nm，或约3nm，或约2nm，或约1nm的kd与n-末端截短的人cxcl10结合或特异性结合。在一个示例中，cxcl10 结合蛋白以3nm的kd与n-末端截短的人cxcl10结合或特异性结合。
18.本公开还提供了一种cxcl10结合蛋白，其中所述结合蛋白以50nm或更小的kd与全长人cxcl10结合，但不与n-末端截短的cxcl10和瓜氨酸化的cxcl10结合。
19.在一个示例中，cxcl10结合蛋白既不能可检测地也不会显著地与n-末端截短的 cxcl10和瓜氨酸化的cxcl10结合。
20.用于确定cxcl10结合蛋白与多肽结合的方法对技术人员来说是显而易见的。例如，多肽被固定在固体或半固体表面上并且cxcl10结合蛋白与固定的多肽接触。然后，例如通过表面等离子共振(spr)成像来确定该结合。
21.在一个示例中，结合水平(例如，由kd确定)通过表面等离子共振(spr)成像测量。
22.在一个示例中，本公开的cxcl10结合蛋白包括可变区或抗原结合结构域。
23.在一个示例中，结合蛋白选自以下组成的组：
24.(i)fv；
25.(ii)单链fv片段(scfv)；
26.(iii)二聚体scfv(di-scfv)；
27.(iv)单域抗体；
28.(v)微型抗体；
29.(vi)双链抗体；
30.(vii)三链抗体；
31.(viii)四链抗体；
32.(ix)fab；
33.(x)f(ab')2；
34.(xi)抗体；
35.(xii)抗体模拟物；
36.(xiii)仅重链免疫球蛋白；
37.(xiv)t细胞受体；
38.(xv)阿德内丁蛋白；
39.(xvi)抗运载蛋白；
40.(xvii)亲和体；
41.(xvii)阿维默；
42.(xix)设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)；或者
43.(xx)连接至抗体的恒定区、fc或重链恒定结构域(ch)2和/或ch3的(i)至(xix) 中的一种。
44.在一个示例中，结合蛋白包括抗体的抗原结合结构域。例如，结合蛋白至少包括 vh和v
l
，其中vh和v
l
结合以形成包含抗原结合结构域的fv。
45.在一个示例中，结合蛋白是抗体或其抗原结合片段(例如，包含抗体可变区的scfv)。示例性抗体是全长和/或裸露的(例如，未缀合的)抗体。在一个示例中，本公开的抗体是全长抗体。
46.在一个示例中，抗体是igg或ige或igm或igd或iga或igy抗体。例如，抗体是 igg抗体。
47.在一个示例中，igg抗体是igg1或igg2或igg3或igg4。例如，抗体是igg1抗体。在另一个示例中，抗体是igg4抗体。在一个示例中，抗体是稳定的igg4抗体。
48.在一个示例中，结合蛋白是重组的、嵌合的、cdr移植的、人源化的、同人源化的、灵长类化的、去免疫化的或人抗体。
49.在一个示例中，本公开的抗原结合片段是半抗体。例如，cxcl10结合蛋白是包括一条重链和一条轻链的半抗体。
50.在一个示例中，本公开的抗原结合片段包含igg4恒定区或稳定的igg4恒定区。
51.在一个示例中，结合蛋白是抗体模拟物。例如，结合蛋白包含免疫球蛋白，例如 ignar、骆驼科动物抗体或t细胞受体的抗原结合结构域。
52.在一个示例中，结合蛋白是域抗体(例如，仅包含重链可变区或仅包含轻链可变区) 或仅重链抗体(例如，骆驼科动物抗体或ignar)或其可变区。
53.在一个示例中，结合蛋白竞争性地抑制抗体或其抗原结合片段与cxcl10的结合，所述抗体或其抗原结合片段包括：
54.(i)包含seq id no：3所示氨基酸序列的重链可变区(vh)和包含seq id no：4 所示氨基酸序列的轻链可变区(v
l
)；和/或
55.(ii)包含seq id no：11所示氨基酸序列的vh和包含seq id no：12所示氨基酸序列的v
l
。
56.在一个示例中，结合蛋白竞争性地抑制抗体或其抗原结合片段与cxcl10的结合，所述抗体或其抗原结合片段包括包含seq id no：3所示氨基酸序列的vh和包含seq idno：4所示氨基酸序列的v
l
。
57.在另一个示例中，结合蛋白竞争性地抑制抗体或其抗原结合片段与cxcl10的结合，所述抗体或其抗原结合片段包括包含seqidno：11所示氨基酸序列的vh和包含seqidno：12所示氨基酸序列的v
l
。
58.在一个示例中，结合蛋白包括:
59.(i)包含与seqidno：3所示序列具有至少90％同一性的序列的vh和包含与seqidno：4所示序列具有至少90％同一性的序列的v
l
；或
60.(ii)包含与seqidno：11所示序列具有至少90％同一性的序列的vh和包含与seqidno：12所示序列具有至少90％同一性的序列的v
l
。
61.在一个示例中，结合蛋白包括:包含与seqidno：3所示序列具有至少90％同一性的序列的vh和包含与seqidno：4所示序列具有至少90％同一性的序列的v
l
。例如，结合蛋白包括与本文公开的序列具有至少90％，或95％，或97％，或98％，或99％同一性的vh和/或v
l
。
62.在一个示例中，结合蛋白包括:包含与seqidno：11所示序列具有至少90％同一性的序列的vh和包含与seqidno：12所示序列具有至少90％同一性的序列的v
l
。例如，结合蛋白包括与本文公开的序列具有至少90％，或95％，或97％，或98％，或99％同一性的vh和/或v
l
。
63.在一个示例中，本公开的结合蛋白可选地包括本文公开的任何序列的一个或多个氨基酸取代、缺失或插入。适用于本公开的氨基酸取代对技术人员来说将是显而易见的并且包括天然发生的取代和工程化的取代。
64.在一个示例中，本公开的cxcl10结合蛋白是抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括：
65.(i)包含seqidno：3所示氨基酸序列的vh和包含seqidno：4所示氨基酸序列的v
l
；
66.(ii)包含seqidno：11所示氨基酸序列的vh和包含seqidno：12所示氨基酸序列的v
l
。
67.在一个示例中，本公开的cxcl10结合蛋白是抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括包含seqidno：3所示氨基酸序列的vh和包含seqidno：4所示氨基酸序列的v
l
。
68.在另一个示例中，本公开的cxcl10结合蛋白是抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括包含seqidno：11所示氨基酸序列的vh和包含seqidno：12所示氨基酸序列的v
l
。
69.在一个示例中，本公开的cxcl10结合蛋白是抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括：
70.(i)vh，其包含：
71.a)包含seqidno：3中氨基酸25-34所示序列的cdr1；
72.b)包含seqidno：3中氨基酸49-65所示序列的cdr2；和
73.c)包含seqidno：3中氨基酸98-108所示序列的cdr3；和
[0074]vl
，其包含：
[0075]
a)包含seqidno：4中氨基酸23-33所示序列的cdr1；
[0076]
b)包含seq id no：4中氨基酸49-55所示序列的cdr2；和
[0077]
c)包含seq id no：4中氨基酸88-96所示序列的cdr3；或
[0078]
(ii)vh，其包含：
[0079]
a)包含seq id no：11中氨基酸25-34所示序列的cdr1；
[0080]
b)包含seq id no：11中氨基酸49-65所示序列的cdr2；和
[0081]
c)包含seq id no：11中氨基酸98-108所示序列的cdr3；和
[0082]vl
，其包含：
[0083]
a)包含seq id no：12中氨基酸23-33所示序列的cdr1；
[0084]
b)包含seq id no：12中氨基酸49-55所示序列的cdr2；和
[0085]
c)包含seq id no：12中氨基酸88-96所示序列的cdr3。
[0086]
在一个示例中，本公开的cxcl10结合蛋白是抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括：
[0087]
(i)vh，其包含：
[0088]
a)包含seq id no：3中氨基酸25-34所示序列的cdr1；
[0089]
b)包含seq id no：3中氨基酸49-65所示序列的cdr2；和
[0090]
c)包含seq id no：3中氨基酸98-108所示序列的cdr3；和
[0091]
(ii)v
l
，其包含：
[0092]
a)包含seq id no：4中氨基酸23-33所示序列的cdr1；
[0093]
b)包含seq id no：4中氨基酸49-55所示序列的cdr2；和
[0094]
c)包含seq id no：4中氨基酸88-96所示序列的cdr3。
[0095]
在一个示例中，本公开的cxcl10结合蛋白是抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括：
[0096]
(i)vh，其包含：
[0097]
a)包含seq id no：11中氨基酸25-34所示序列的cdr1；
[0098]
b)包含seq id no：11中氨基酸49-65所示序列的cdr2；和
[0099]
c)包含seq id no：11中氨基酸98-108所示序列的cdr3；和
[0100]
(ii)v
l
，其包含：
[0101]
a)包含seq id no：12中氨基酸23-33所示序列的cdr1；
[0102]
b)包含seq id no：12中氨基酸49-55所示序列的cdr2；和
[0103]
c)包含seq id no：12中氨基酸88-96所示序列的cdr3。
[0104]
在一个示例中，本公开的cxcl10结合蛋白是抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括：
[0105]
(i)vh，其包含：
[0106]
a)包含seq id no：5所示序列的cdr1；
[0107]
b)包含seq id no：6所示序列的cdr2；和
[0108]
c)包含seq id no：7所示序列的cdr3；和
[0109]vl
，其包含：
[0110]
a)包含seq id no：8所示序列的cdr1；
[0111]
b)包含seq id no：9所示序列的cdr2；和
[0112]
c)包含seq id no：10所示序列的cdr3；或
[0113]
(ii)vh，其包含：
[0114]
a)包含seq id no：13所示序列的cdr1；
[0115]
b)包含seq id no：14所示序列的cdr2；和
[0116]
c)包含seq id no：15所示序列的cdr3；和
[0117]vl
，其包含：
[0118]
a)包含seq id no：16所示序列的cdr1；
[0119]
b)包含seq id no：17所示序列的cdr2；和
[0120]
c)包含seq id no：18所示序列的cdr3。
[0121]
在一个示例中，本公开的cxcl10结合蛋白是抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括：
[0122]
(i)vh，其包含：
[0123]
a)包含seq id no：5所示序列的cdr1；
[0124]
b)包含seq id no：6所示序列的cdr2；和
[0125]
c)包含seq id no：7所示序列的cdr3；和
[0126]
(ii)v
l
，其包含：
[0127]
a)包含seq id no：8所示序列的cdr1；
[0128]
b)包含seq id no：9所示序列的cdr2；和
[0129]
c)包含seq id no：10所示序列的cdr3。
[0130]
在一个示例中，本公开的cxcl10结合蛋白是抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括：
[0131]
(i)vh，其包含：
[0132]
a)包含seq id no：13所示序列的cdr1；
[0133]
b)包含seq id no：14所示序列的cdr2；和
[0134]
c)包含seq id no：15所示序列的cdr3；和
[0135]
(ii)v
l
，其包含：
[0136]
a)包含seq id no：16所示序列的cdr1；
[0137]
b)包含seq id no：17所示序列的cdr2；和
[0138]
c)包含seq id no：18所示序列的cdr3。
[0139]
在一个实例中，蛋白质、抗体或其抗原结合片段是由编码任何前述蛋白质、抗体或功能片段的核酸编码的任何形式的蛋白质、抗体或其功能片段。
[0140]
在一个示例中，cxcl10结合蛋白与可检测标记缀合。适用于本公开的可检测标记对于技术人员将是显而易见的和/或在本文中描述。例如，所述可检测标记选自以下组成的组：放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记、辅基和造影剂。
[0141]
在一个示例中，可检测标记是放射性标记。例如，放射性标记可以是但不限于放射性碘(125i、131i)、锝、钇、35s或3h。
[0142]
在一个示例中，可检测标记是酶。例如，酶可以是但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。
[0143]
在一个示例中，可检测标记是荧光标记。例如，荧光标记可以是但不限于伞形酮、
荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白。
[0144]
在一个示例中，可检测标记是发光标记。例如，发光标记可以是但不限于鲁米诺。
[0145]
在一个实例中，可检测标记是生物发光标记。例如，生物发光标记可以是但不限于萤光素酶、萤光素或水母发光蛋白。
[0146]
在一个示例中，可检测标记是磁性标记。例如，磁性标记可以是但不限于钆或氧化铁螯合物。
[0147]
在一个示例中，可检测标记是辅基。例如，辅基可以是但不限于链霉亲和素/生物素或亲和素/生物素。
[0148]
在一个示例中，可检测标记是造影剂。
[0149]
本发明还提供了一种组合物，其包含本发明的结合蛋白和载体。适用于本公开的载体对于技术人员将是显而易见的和/或在本文中描述。
[0150]
本发明还提供了编码根据本发明的cxcl10结合蛋白的多核苷酸。
[0151]
本发明还提供了一种表达载体，其包含编码本发明的cxcl10结合蛋白的多核苷酸。适用于本公开的示例性载体对于技术人员将是显而易见的和/或在本文中描述。
[0152]
本发明还提供了一种包含本发明的体外表达载体的细胞。适用于本公开的示例性细胞对于技术人员将是显而易见的和/或在本文中描述。在一个实施例中，本发明提供了该细胞用于制备本发明的cxcl10结合蛋白的用途。例如，该用途包括培养本公开的细胞并从其产生所述cxcl10结合蛋白；以及分离和纯化所述产生的结合蛋白。分离和纯化所述产生的结合蛋白的方法对技术人员来说将是显而易见的和/或在本文中描述。
[0153]
本公开提供了一种检测和/或诊断受试者恶性病症的方法，所述方法包括：
[0154]
a)确定所述受试者的活性cxcl10水平和受试者的总cxcl10水平；以及
[0155]
b)确定所述受试者中活性cxlc10与总cxcl10的cxcl10比率。
[0156]
在一个示例中，确定活性cxcl10和总cxcl10的水平包括确定受试者中活性cxcl10 蛋白的量和总cxcl10蛋白的量。
[0157]
在一个示例中，该方法进一步包括将受试者中的cxcl10比率与至少一个参照物中的cxcl10比率进行比较。确定参照物的方法对技术人员来说将是显而易见的和/或在本文中描述。
[0158]
在一个示例中，该方法包括确定：(a)是否受试者中的cxcl10比率高于参照物中的cxcl10比率；或(b)是否受试者中的cxcl10比率低于参照物中的cxcl10比率。
[0159]
在一个示例中，(i)与参照物中的cxcl10比率相比，受试者中cxcl10比率较低表明恶性病症；或者(ii)与参照物中的cxcl10比率相比，受试者中cxcl10比率较高表明良性病症。
[0160]
在一个示例中，该方法包括使用：
[0161]
(i)cxcl10结合蛋白，其与全长人cxcl10、n-末端截短的cxcl10和瓜氨酸化的 cxcl10特异性地结合，以确定所述受试者中总cxcl10的水平；和
[0162]
(ii)cxcl10结合蛋白，其与全长人cxcl10特异性地结合但不与n-末端截短的cxcl10和瓜氨酸化的cxcl10结合，以确定所述受试者中总cxcl10的水平。
[0163]
在本文所述的任何方法的一个示例中，该方法包括使用至少一种根据本公开的 cxcl10结合蛋白。
[0164]
在一个示例中，
[0165]
(i)使用抗体或其抗原结合片段测定所述受试者中的总cxcl10水平，所述抗体或其抗原结合片段包括包含seq id no：11所示氨基酸序列的vh和包含seq id no：12 所示氨基酸序列的v
l
；和/或
[0166]
(ii)使用抗体或其抗原结合片段测定所述受试者中的活性cxcl10水平，所述抗体或其抗原结合片段包括包含seq id no：3所示氨基酸序列的vh和包含seq id no：4 所示氨基酸序列的v
l
。
[0167]
在一个示例中，使用抗体或其抗原结合片段测定受试者中的活性cxcl10水平，所述抗体或其抗原结合片段包括包含seq id no：11所示氨基酸序列的vh和包含seq id no： 12所示氨基酸序列的v
l
。
[0168]
在另一个示例中，使用抗体或其抗原结合片段测定受试者中的活性cxcl10水平，所述抗体或其抗原结合片段包括包含seq id no：3所示氨基酸序列的vh和包含seq idno：4所示氨基酸序列的v
l
。
[0169]
在一个示例中，一种或多种cxcl10结合蛋白与可检测标记缀合。适用于本公开的可检测标记对于技术人员将是显而易见的和/或在本文中描述。例如，所述可检测标记选自以下组成的组：放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记、辅基和造影剂。
[0170]
在一个示例中，可检测标记是放射性标记。例如，放射性标记可以是但不限于放射性碘(125i、131i)、锝、钇、35s或3h。
[0171]
在一个示例中，可检测标记是酶。例如，酶可以是但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。
[0172]
在一个示例中，可检测标记是荧光标记。例如，荧光标记可以是但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白。
[0173]
在一个示例中，可检测标记是发光标记。例如，发光标记可以是但不限于鲁米诺。
[0174]
在一个实例中，可检测标记是生物发光标记。例如，生物发光标记可以是但不限于萤光素酶、萤光素或水母发光蛋白。
[0175]
在一个示例中，可检测标记是磁性标记。例如，磁性标记可以是但不限于钆或氧化铁螯合物。
[0176]
在一个示例中，可检测标记是辅基。例如，辅基可以是但不限于链霉亲和素/生物素或亲和素/生物素。
[0177]
在一个示例中，可检测标记是造影剂。
[0178]
检测cxcl10水平的方法对于本领域技术人员来说将是显而易见的和/或在本文中描述。例如，该方法包括进行流式细胞术、酶联免疫吸附测定或蛋白质印迹。
[0179]
在一个示例中，该方法包括进行流式细胞术。
[0180]
在一个示例中，该方法包括进行酶联免疫吸附测定。
[0181]
在一个示例中，该方法包括进行蛋白质印迹。
[0182]
在一个示例中，该方法对受试者体外或离体进行。例如，该方法对受试者体外进行。在另一个示例中，该方法对受试者离体进行。
[0183]
在一个示例中，该方法针对从所述受试者获得的至少一种生物样本进行。用于本
公开的生物样本对于技术人员将是显而易见的和/或在本文中描述。例如，生物样本选自活体组织切片、流体样本、血浆样本或细胞拭子。
[0184]
在一个示例中，生物样本是活体组织切片。
[0185]
在一个示例中，生物样本是流体样本。例如，流体样本是宫颈液、阴道分泌物或腹水。在一个示例中，生物样本是腹水。
[0186]
在一个示例中，生物样本是血浆样本。
[0187]
在一个示例中，生物样本是细胞拭子。例如，细胞拭子是宫颈拭子。在一个示例中，细胞拭子是宫颈阴道拭子(cvs)。
[0188]
在一个示例中，该方法在血浆样本和宫颈阴道拭子(cvs)上进行。
[0189]
在本文所述的任何方法的一个示例中，本发明提供了一种检测和/或诊断受试者的恶性病症的方法。例如，恶性病症是生殖癌症。在一个示例中，生殖癌症是卵巢癌。在一个示例中，卵巢癌是i期癌症。在另一个示例中，卵巢癌是癌前病变，例如具有p53 基因突变的病变。
[0190]
在一个示例中，该方法包括从良性病症检测和/或诊断恶性病症。
[0191]
在本文所述的任何方法的一个示例中，该方法还包括测定受试者中的二肽基肽酶-4 (dpp4)和/或癌抗原125(ca-125)水平。在一个示例中，该方法还包括测定受试者中的二肽基肽酶-4(dpp4)和/或癌抗原125(ca-125)水平。在另一个示例中，该方法还包括测定受试者中的二肽基肽酶-4(dpp4)水平。在又一个示例中，该方法还包括测定受试者中的癌抗原125(ca-125)水平。
[0192]
在本文所述的任何方法的一个示例中，该方法还包括：测定粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、白细胞介素6(il-6)、肿瘤坏死因子受体ii(tnf-rii)、人附睾蛋白4(he4)和白细胞介素8(il-8)中的一种或多种或全部的水平。例如，该方法进一步包括确定gm-csf、il-6、tnf-rii、he4和il-8的水平。
[0193]
在本文所述的任何方法的一个示例中，该方法进一步包括确定dpp4、gm-csf、il-6、 tnf-rii、he4和il-8的水平。
[0194]
在本文所述的任何方法的一个示例中，该方法进一步包括确定ca-125、gm-csf、 il-6、tnf-rii、he4和il-8的水平。
[0195]
在本文所述的任何方法的一个示例中，该方法进一步包括确定dpp4、ca-125、 gm-csf、il-6、tnf-rii、he4和il-8的水平。
[0196]
还提供了一种检测和/或诊断受试者病症的方法，所述方法包括使用至少一种本发明的cxcl10结合蛋白来确定受试者中的cxcl10水平。
[0197]
在该示例中，所述病症的特征在于一种或多种全长(即生物活性)cxcl10、n-末端截短的cxcl10和瓜氨酸化的cxcl10的水平和/或相对比率。在一个示例中，该病症是炎症病症。例如，炎性病症是关节炎，例如类风湿性关节炎和/或银屑病关节炎。在一个示例中，该病症是类风湿性关节炎。在另一个示例中，该病症是银屑病关节炎。在一个示例中，病症是丙型肝炎。在另一个示例中，病症是心力衰竭。
[0198]
本公开还提供了一种监测患有恶性病症的受试者的肿瘤负荷的方法，所述方法包括在一个或多个时间点测定受试者中活性cxlc10与总cxcl10之间的cxcl10比率。
[0199]
本公开还提供了一种监测受试者的恶性病症的进展的方法，所述方法包括在一个
或多个时间点测定受试者中活性cxlc10与总cxcl10之间的cxcl10比率。
[0200]
本公开还提供了一种监测患有恶性病症的受试者的肿瘤消退的方法，所述方法包括在一个或多个时间点测定所述受试者中活性cxlc10与总cxcl10之间的cxcl10比率。
[0201]
本公开还提供了一种监测患有恶性病症的受试者的肿瘤复发的方法，所述方法包括在一个或多个时间点测定受试者中活性cxlc10与总cxcl10之间的cxcl10比率。
[0202]
本公开还提供了确定治疗患有恶性病症的受试者的恶性病症的功效的方法，所述方法包括在一个或多个时间点测定受试者中活性cxlc10与总cxcl10之间的cxcl10比率。
[0203]
在一个示例中，受试者已被诊断为患有恶性疾病。例如，受试者患有恶性疾病。例如，恶性病症是生殖癌症，例如卵巢癌。
[0204]
在一个示例中，受试者是无症状的。
[0205]
在一个示例中，受试者尚未接受针对恶性病症的治疗。例如，受试者未接受过治疗。在一个示例中，受试者正在接受针对恶性病症的治疗。在另一个示例中，受试者已经接受了针对恶性病症的治疗。用于治疗恶性病症的合适疗法对于技术人员将是显而易见的和/或在本文中描述。例如，治疗包括手术、化学疗法、放射疗法、靶向药物疗法、免疫疗法或其组合。
[0206]
在一个示例中，治疗包括手术。
[0207]
在一个示例中，治疗包括化学疗法。
[0208]
在一个示例中，治疗包括放射疗法。
[0209]
在一个示例中，治疗包括靶向药物治疗。
[0210]
在一个示例中，治疗包括免疫疗法。
[0211]
在一个示例中，该方法包括确定：
[0212]
(a)是否受试者在随后的时间点的cxcl10比率低于受试者在第一个时间点的cxcl10比率；或者
[0213]
(b)是否受试者在随后的时间点的cxcl10比率高于受试者在第一个时间点的 cxcl10比率。
[0214]
在一个示例中，与第一个时间点相比，在随后的时间点受试者中cxcl10比率较低表示受试者中肿瘤负荷和/或肿瘤进展和/或肿瘤复发风险增加。例如，与治疗前(即，第一个时间点)相比，在治疗后(即，随后的时间点)受试者中cxcl10比率表示受试者中肿瘤负荷和/或肿瘤进展和/或肿瘤复发风险增加。
[0215]
在一个示例中，与第一个时间点相比，在随后的时间点受试者中cxcl10比率较高表示受试者中肿瘤负荷和/或肿瘤进展和/或肿瘤复发风险降低。例如，与治疗前(即，第一个时间点)相比，在治疗后(即，随后的时间点)受试者中cxcl10比率较高表示受试者中肿瘤负荷和/或肿瘤进展和/或肿瘤复发风险降低。
[0216]
在本文所述的任何方法的一个示例中，该方法进一步包括给予治疗以减少受试者的肿瘤负荷和/或减缓受试者的肿瘤进展。
[0217]
本公开还提供了一种治疗受试者的恶性病症的方法，所述方法包括：检测和/或诊断根据本公开的受试者的恶性病症，以及对所述受试者进行治疗。
[0218]
用于治疗恶性病症的合适疗法对于技术人员将是显而易见的和/或在本文中描述。例如，治疗包括手术、化学疗法、放射疗法、靶向药物疗法、免疫疗法或其组合。
[0219]
本公开还提供了用于检测和/或诊断受试者的恶性病症的检测组合(panel)或试剂盒，该组合或试剂盒包含本公开的一种或多种cxcl10结合蛋白。
[0220]
本公开还提供了用于在受试者中监测肿瘤负荷、监测进展、确定肿瘤消退、确定肿瘤复发和/或确定治疗恶性病症的功效的组合或试剂盒，该组合或试剂盒包含本公开的一种或多种cxcl10结合蛋白。
[0221]
除非另有明确说明，否则本文中的任何实施方式应被视为比照适用于任何其他实施方式。例如，如本领域技术人员将理解的，上文针对本发明的一个示例概述的示例同样适用于本发明的其他示例。
[0222]
本发明的范围不受本文描述的具体实施方式的限制，这些具体实施方式仅用于示例的目的。如本文所述，功能上等效的产品、组合物和方法显然在本发明的范围内。
[0223]
在整个说明书中，除非另有明确说明或上下文另有要求，否则在提及单个步骤时，物质组合物、步骤组或物质组合物组应理解为包括这些步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组中的一个和多个(即一个或更多个)。
附图说明
[0224]
图1是示出了活性cxcl10和总cxcl10之间差异的图形表示。示出了使用ra2和 rg2分别检测cxcl10的代表性标准曲线，r2》0.99。
[0225]
图2(a)是art和商用elisa之间在卵巢癌患者(n＝212)恶性腹水中定量总cxcl10 的比较。在art和商用elisa之间，未观察到匹配的腹水中的定量总cxcl10有显着差异。art和商用elisa的总cxcl10的总体平均值分别为1126.1
±
2158.6pg/ml和1192.4
ꢀ±
1059.5pg/ml。图2(b)示出了art和商用elisa之间定量总cxcl10的相关性；良性和恶性腹水的两项测试之间呈中度正相关关系，其中r值分别为0.3084和0.2594。 p≤0.05。
[0226]
图3(a)示出了证明mab-ra2和mab-rg2检测重组全长cxcl10和瓜氨酸化cxcl10 的蛋白质印迹。用(+)或不用(-)pad2处理cxcl10以在60分钟内诱导瓜氨酸化，然后通过蛋白质印迹分离。未经任何处理的重组全长cxcl10(n/t)用作阳性对照。商用抗cxcl10抗体(ab9807)在进入pad2潜伏期15分钟后未检测到瓜氨酸化的cxcl10。请注意：15分钟后观察到mab-ra2对瓜氨酸化的cxcl10的检测能力显着降低，并且没有观察到瓜氨酸化对mab-rg2检测cxcl10的影响。图3(b)示出了通过mab-ra2和 mab-rg2的art检测瓜氨酸化的cxcl10。观察到mab-ra2与瓜氨酸化的cxcl10的结合显着降低，而mab-rg与瓜氨酸化的cxcl10保持一定程度的结合。
[0227]
图4示出了通过活性cxcl10和总cxcl10的定量和有源cxcl10比率来区分卵巢癌患者的良性和恶性腹水。图4(a)示出了良性(n＝51)和恶性腹水(n＝208)中的活性 cxcl10浓度：分别为240.4
±
410.5pg/ml和818.6
±
1098.0pg/ml；图4(b)示出了良性(n＝51)和恶性腹水(n＝212)中总cxcl10浓度：分别为160.8
±
362.0pg/ml和 1126.1
±
2158.6pg/ml。图4(c)示出了良性腹水(n＝51)和恶性腹水(n＝226)之间的活性比率有显着差异：分别为2.59
±
1.18和1.43
±
1.04。图4(d)示出了与良性相比，基于卵巢癌分期的活性比率。良性：2.59
±
1.18；阶段1：1.07
±
0.44；阶段3： 1.55
±
1.23。****p≤0.0001。
[0228]
图5示出了dpp4和血浆ca125区分良性和恶性。图5(a)示出了通过抗dpp4 elisa 测量良性腹水(n＝48)和恶性腹水(n＝148)中的dpp4浓度：分别为184.8
±
177.6ng/ml 和
203.5
±
154.3ng/ml。p＝0.1031。图5(b)示出了良性腹水(n＝49)和恶性腹水(n＝50) 之间的比活性(u/ng)测量：分别为2.49
±
3.83和1.65
±
2.13。p＝0.4229。图5(c) 示出了匹配患者血浆ca125的测量：良性(n＝30)和恶性(n＝188)患者样本分别为200.8
ꢀ±
368.7u/ml和1697.0
±
3409.0u/ml。****p≤0.0001。
[0229]
图6示出了良性和恶性腹水中活性比率与血浆ca125、dpp4浓度和dpp4比活性之间的相关性。图6(a)示出了在良性或恶性样本中，活性比率与血浆ca125之间没有显着相关性。图6(b)示出了恶性腹水样本(p＝0.0002)中活性比率与dpp4(ng/ml) 呈中度负相关，而在良性样本中无显着相关性。图6(c)示出了良性腹水样本(p＝0.0895) 中活性比率与dpp4比活性(u/ng)呈中度负相关，而在恶性样本中无显着相关性。
[0230]
图7示出了接受者操作曲线(roc)分析，表明art与患者腹水样本中的其他标志物相比具有优越的auc。图7(a)示出了活性比率实现了auc(0.8617)比总cxcl10 和活性cxcl10定量的auc更高(auc分别为0.8122和0.7872)；图7(b)活性比率实现了auc比dpp4和血浆ca125的auc更高(auc分别为0.5598和auc 0.8262)。通过结合活性比率、dpp4(ng/ml)和血浆ca125(u/ml)演示了最高auc。
[0231]
图8示出了宫颈阴道拭子(cvs)和血浆的演示，它们非常适合作为基于生物标志物的测试的art。图8(a)示出了良性(n＝50)和恶性(n＝50)样本之间cvs活性比率的显着差异：良性和恶性cvs的活性比率分别为4.39
±
4.52和1.14
±
0.62。图8(b) 示出了良性(n＝30)和恶性(n＝30)血浆样本之间血浆活性比率的显着差异：良性和恶性血浆的活性比率分别为3.18
±
1.79和2.02
±
1.05。****p《0.0001，**p《0.01。
[0232]
图9示出了通过art将无癌症患者与患有良性病症或恶性卵巢癌的患者区分开来。图9(a)示出了在血浆样本中测量的活性cxcl10和总cxcl10浓度。图9(b)示出了三个患者组的活性cxcl10和总cxcl10浓度。计算的无癌(健康)样本与(c)血浆或 (d)cvs中检测到的良性和恶性样本之间的活性比率。*p≤0.05；****p≤0.0001。
[0233]
图10(a)示出了dpp4丰度；图10(b)示出了前瞻性收集队列中dpp4比活性；图10(c)-(d)示出了它们与活性比率的相关性。
[0234]
图11示出了使用cvs拭子进行的art来区分无癌和良性和恶性病症。图11(a) 示出了活性cxcl10的总浓度显着高于总cxcl10的总浓度。图11(b)示出了计算出的无癌(健康)样本与良性和恶性样本之间的活性比率。*p≤0.05；****p≤0.0001。
[0235]
图12(a)示出了cvs上的dpp4丰度；图12(b)示出了与计算的cvs活性比率的相关性。
[0236]
图13(a)示出了前瞻性收集队列中针对良性或恶性卵巢肿瘤患者的血浆ca125。图13(b)示出了ca125与活性比率之间的相关性。
[0237]
图14(a)示出了血浆和cvs的活性比率(a)、血浆与dpp4和ca125的活性比率 (b)和cvs与dpp4和ca125的活性比率(c)的组合，其中每者都能够用于区分健康女性和恶性卵巢肿瘤患者。
[0238]
图15示出了roc评估(a)单个标志物与ca125相比的区分能力和(b)标志物组合(基于良性+健康与恶性构建)。
[0239]
关键序列表
[0240]
seq id no：1人cxcl10的氨基酸序列，包括前序列
[0241]
seq id no：2成熟人cxcl10的氨基酸序列
[0242]
seq id no：3抗cxcl10抗体ra2的重链vh氨基酸序列
[0243]
seq id no：4抗cxcl10抗体ra2的轻链vl氨基酸序列
[0244]
seq id no：5抗cxcl10抗体ra2的重链vhcdr1氨基酸序列
[0245]
seq id no：6抗cxcl10抗体ra2的重链vhcdr2氨基酸序列
[0246]
seq id no：7抗cxcl10抗体ra2的重链vhcdr3氨基酸序列
[0247]
seq id no：8抗cxcl10抗体ra2的轻链vlcdr1氨基酸序列
[0248]
seq id no：9抗cxcl10抗体ra2的轻链vlcdr2氨基酸序列
[0249]
seq id no：10抗cxcl10抗体ra2的轻链vlcdr3氨基酸序列
[0250]
seq id no：11抗cxcl10抗体rg2的重链vh氨基酸序列
[0251]
seq id no：12抗cxcl10抗体rg2的轻链vl氨基酸序列
[0252]
seq id no：13抗cxcl10抗体rg2的重链vhcdr1氨基酸序列
[0253]
seq id no：14抗cxcl10抗体rg2的重链vhcdr2氨基酸序列
[0254]
seq id no：15抗cxcl10抗体rg2的重链vhcdr3氨基酸序列
[0255]
seq id no：16抗cxcl10抗体rg2的轻链vlcdr1氨基酸序列
[0256]
seq id no：17抗cxcl10抗体rg2的轻链vlcdr2氨基酸序列
[0257]
seq id no：18抗cxcl10抗体rg2的轻链vlcdr3氨基酸序列
[0258]
seq id no：19抗cxcl10抗体ra2的重链vh核苷酸序列
[0259]
seq id no：20抗cxcl10抗体ra2的轻链vl核苷酸序列
[0260]
seq id no：21抗cxcl10抗体rg2的重链vh核苷酸序列
[0261]
seq id no：22抗cxcl10抗体rg2的轻链vl核苷酸序列
[0262]
seq id no：23包含人cxcl10的完整n-末端的肽序列
[0263]
seq id no：24包含人cxcl10的n-末端截短的肽序列
[0264]
seq id no：25人cxcl10的完整n-末端表位
[0265]
seq id no：26人cxcl10的n-末端截短的表位
具体实施方式
[0266]
概述
[0267]
在整个说明书中，除非另有明确说明或上下文另有要求，否则在提及单个步骤时，物质组合物、步骤组或物质组合物组应理解为包括这些步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组中的一个和多个(即一个或更多个)。
[0268]
本公开的范围不受本文描述的具体示例的限制，这些具体示例仅用于示例的目的。功能上等效的产品、组合物和方法显然在本公开的范围内。
[0269]
本领域技术人员将理解，在不背离广义上描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对具体实施方式中所示的本发明进行多种变化和/或修改。因此，本实施方式在各方面应被视为说明性而非限制性。
[0270]
本文所讨论和/或引用的所有出版物均全文并入本文。
[0271]
已包括在本说明书中的文件、行为、材料、装置、物品等的任何讨论仅仅是为了为本发明提供上下文。不应视为承认任何或所有这些事项构成了现有技术基础的一部分，或
者是与本技术的每个权利要求的优先权日期之前存在的与本发明相关的领域中的公知常识。
[0272]
除非另有明确说明，否则本文中的本公开的任何示例均应被视为比照适用于本公开的任何其他示例。换言之，本公开的任何特定示例可以与本公开的任何其他特定示例组合(除非相互排斥)。
[0273]
将采用公开特定特征或一组特征或方法或方法步骤的本公开的任何示例，以提供对放弃该特定特征或一组特征或方法或方法步骤的明确支持。
[0274]
除非另有明确定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均应视为具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义(例如，在细胞培养、分子遗传学、分子生物学、免疫组织化学、蛋白质化学、和生物化学中)。
[0275]
除非另有说明，否则本公开中使用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员熟知的标准程序。此类技术在以下来源的文献中进行了描述和解释：例如perbal， 1984；sambrook等人，1989年；brown，1991；glover等人，1995和1996；ausubel 等人，1988；harlow等人，1988；coligan等人，1991。
[0276]
本文对可变区及其部分、免疫球蛋白、抗体及其片段的描述和定义下述讨论进一步阐明：kabat等人，1987和1991；bork等人，1994；chothia和lesk，1987；chothia 等人，1989和/或al-lazikani等人，1997。
[0277]
本文提及的范围(例如残基的范围)将被理解为包括在内。例如，提及“包含氨基酸56至65的区域”将以包容性方式理解，即该区域包含以指定的顺序排列的编号为 56、57、58、59、60、61、62、63、64和65的氨基酸序列。
[0278]
术语“和/或”，例如“x和/或y”应理解为表示“x和y”或“x或y”，并应被视为为两种含义或任一含义提供明确支持。
[0279]
在整个本说明书中，词语“包含(comprise)”或其变体诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解为暗示包含所陈述的元件、整数或步骤，或元件组、整数组或步骤组，而不排除任何其他元件、整数或步骤，或元件组、整数组或步骤组。
[0280]
如本文所用，术语“受试者”应理解为包括人类在内的任何动物，例如哺乳动物。示例性受试者包括但不限于人类和非人类灵长类动物。例如，受试者是人。
[0281]
选定的定义
[0282]
人cxcl10被表达为前序列(seq id no：1)，其n-末端22个氨基酸被切割以产生成熟的“全长”人cxcl10(seq id no：2)。因此，如本文所用，术语“全长cxcl10”是指未经翻译后修饰的cxcl10，而不是翻译后切割去除22个n-末端氨基酸后产生的“成熟”全长cxcl10。
[0283]
如本文所用，术语“n-末端截短的cxcl10”是指“成熟的”全长cxcl10，其已被二肽基肽酶iv(dpp4)截短并且由例如seq id no：2所示的氨基酸3至77组成。
[0284]
如本文所用，术语“瓜氨酸化的cxcl10”是指已通过肽基精氨酸脱亚氨酶(pad) 在例如seq id no：2所示的氨基酸位置5处的精氨酸残基处脱氨或瓜氨酸化来进行翻译后修饰的cxcl10。
[0285]
来自其他物种的cxcl10的序列可以使用本文提供的序列和/或在可公开获得的数据库中确定和/或使用标准技术确定(例如，ausubel等人，1988年(包括迄今为止的所有更新)或sambrook等人，1989年所述)。
[0286]
术语“重组”应理解为人工基因重组的产物。因此，在包含可变区或抗原结合结构域(例如，抗体抗原结合结构域)的重组蛋白的上下文中，该术语不包括受试者体内天然存在的蛋白质，该蛋白质是b细胞成熟过程中自然重组的产物。然而，如果这种蛋白质是分离的，则它被认为是包含可变区或抗原结合结构域的分离蛋白质。类似地，如果使用重组方式分离和表达编码蛋白质的核酸，则所得蛋白质是包含可变区或抗原结合结构域的重组蛋白质。重组蛋白质还包括当它例如在细胞、组织或受试者表达时，通过人工重组方式表达的蛋白质。
[0287]
术语“蛋白质”应理解为包括单个多肽链，即通过肽键连接的一系列连续氨基酸或彼此共价或非共价连接的一系列多肽链(即多肽复合物)。例如，可以使用合适的化学键或二硫键来共价连接一系列多肽链。非共价键的示例包括氢键、离子键、范德华力和疏水相互作用。
[0288]
术语“多肽”或“多肽链”将根据前一段理解为意指通过肽键连接的一系列连续氨基酸。
[0289]
如本文所用，术语“结合蛋白”应理解为指能够与抗原(例如，细胞成分或分子，例如，蛋白质)相互作用或特异性结合的蛋白质或其部分或蛋白质的其他区域。
[0290]
如本文所用，术语“抗原结合结构域”应理解为表示抗体的能够特异性结合抗原的区域，即vh或v
l
或同时包含vh和v
l
的fv。抗原结合结构域不必在完整抗体的情况下，例如，它可以是分离的(例如，结构域抗体)或以另一种形式(例如，如本文所述，例如scfv)存在。
[0291]
对于本公开的目的，术语“抗体”包括能够通过包含在fv中的抗原结合结构域特异性结合一种或几种密切相关的抗原(例如cxcl10)的蛋白质。该术语包括四链抗体 (例如，两条轻链和两条重链)、重组或修饰抗体(例如，嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、cdr-移植抗体、灵长类抗体、去免疫抗体、合成人源化抗体、半抗体、双特异性抗体)。抗体通常包含恒定结构域，其可以排列成恒定区或恒定片段或可结晶片段(fc)。示例性形式的抗体包含四链结构作为它们的基本单元。全长抗体包含两条共价连接的重链(约50至70kda)和两条轻链(各约23kda)。轻链通常包含可变区(如果存在) 和恒定域，并且在哺乳动物中是κ轻链或λ轻链。重链通常包含可变区和一个或两个通过铰链区连接到另外恒定域的恒定结构域。哺乳动物的重链属于以下类型之一：α、δ、ε、γ或μ。每条轻链也与一条重链共价连接。例如，两条重链以及重链和轻链通过链间二硫键和非共价相互作用结合在一起。不同类型的抗体之间链间二硫键的数量可能不同。每条链均具有n-末端可变区(vh或v
l
，其中每者长度约为110个氨基酸)和一个或多个位于c端的恒定结构域。轻链(c
l
，长度约为110个氨基酸)的恒定结构域与重链的第一恒定结构域(ch1，长度为330至440个氨基酸)对齐并通过二硫键结合。轻链可变区与重链可变区对齐。抗体重链可以包含2个或更多个另外的ch结构域(例如ch2、 ch3等)并且可以包含在ch1和ch2恒定结构域之间的铰链区。抗体可以属于任何类型(例如，igg、ige、igm、igd、iga和igy)、类别(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1 和iga2)或亚类。在一个示例中，抗体是鼠(小鼠或大鼠)抗体或灵长类(例如人) 抗体。在一个示例中，抗体重链缺少c-末端赖氨酸残基。在一个示例中，抗体是人源化的、合成人源化的、嵌合的、cdr移植的或去免疫的抗体。
[0292]
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“整个抗体”可互换使用，指的是基本上完整形式存在的抗体，而不是抗体的抗原结合片段。具体而言，整个抗体包括具有重链和轻链，包括
fc区的抗体。恒定域可以是野生型序列恒定结构域(例如，人野生型序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。
[0293]
如本文所用，“可变区”是指如本文所定义的抗体的轻链和/或重链部分，其能够特异性结合抗原并且包括互补决定区(cdr)，即，cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列；以及框架区(fr)。例如，可变区包含三个或四个fr(例如，fr1、fr2、fr3和任选的fr4) 以及三个cdr。vh是指重链的可变区。v
l
是指轻链的可变区。
[0294]
如本文所用，术语“互补决定区”(又称cdr；即cdr1、cdr2和cdr3)是指抗体可变区的氨基酸残基，其存在主要是用于特异性抗原结合。每个可变区结构域(vh或v
l
) 通常具有三个cdr，被识别为cdr1、cdr2和cdr3。在一个示例中，分配给cdr和fr的氨基酸位置是由kabat等人(1987和1991)定义的(在本文中也称为“kabat编号系统”)。在另一个示例中，分配给cdr和fr的氨基酸位置是根据增强型chothia编号方案(enhanced chothia numbering scheme)(http://www.bioinfo.org.uk/mdex.html) 定义的。根据kabat的编号系统，vhfr和cdr的位置如下：残基1至30(fr1)、31至 35(cdr1)、36至49(fr2)、50至65(cdr2)、66至94(fr3)、95至102(cdr3)和 103至113(fr4)。根据kabat的编号系统，v
l
fr和cdr的位置如下：残基1至23(fr1)、 24至34(cdr1)、35至49(fr2)、50至56(cdr2)、57至88(fr3)、89至97(cdr3) 和98至107(fr4)。本公开不限于由kabat编号系统定义fr和cdr，而是包括所有编号系统，包括规范编号系统或chothia和lesk(1987)、chothia等人(1989)和/或 al-lazikani等人(1997)描述的编号系统；honnegher和pl
ü
kthun(2001)描述的编号系统；或giudicelli等人(1997)讨论的imgt系统。在一个示例中，根据kabat编号系统定义cdr。任选地，根据kabat编号系统的重链cdr2不包含本文列出的五个c
‑ꢀ
末端氨基酸或这些氨基酸中的任何一个或多个被另一种天然存在的氨基酸取代。就这一点而言，padlan等人，1995年确定重链cdr2的五个c-末端氨基酸通常不参与抗原结合。
[0295]“框架区”(fr)是除cdr残基之外的那些可变区残基。
[0296]
如本文所用，术语“fv”(或可变片段)应理解为任何蛋白质，无论它是由多个多肽还是由单个多肽组成，其中v
l
和vh结合并形成具有抗原结合结构域的复合物，即，能够与抗原特异性结合。形成抗原结合结构域的vh和vl可处于单个多肽链中或处于不同的多肽链中。此外，本公开的fv(以及本公开内容的任何蛋白质)可以具有多个抗原结合结构域，这些抗原结合结构域可以与同一抗原结合或不与同一抗原结合结构。该术语应理解为包括直接衍生自抗体的片段以及对应于使用重组方法产生的这种片段的蛋白质。在一些示例中，vh未连接至重链恒定域(ch)1；和/或v
l
未连接至轻链恒定域 (c
l
)。示例性的含有fv的多肽或蛋白质包括fab片段、fab'片段、f(ab')片段、scfv、双链抗体、三链抗体、四链抗体或更高阶复合物，或与恒定区或结构域连接的任何前述物质，例如ch2或ch3结构域，例如微型抗体。“抗原结合片段”或“fab片段”由免疫球蛋白的单价抗原结合片段组成，并且可以通过用木瓜蛋白酶消化整个抗体来产生，以产生由完整的轻链和一部分重链组成的片段；或者可以使用重组方式产生。抗体的“fab' 片段”可以通过用胃蛋白酶处理整个抗体，然后还原来获得，以产生由完整轻链和包含 vh和单个恒定结构域的一部分重链组成的分子。以这种方式处理的每个抗体能够获得两个fab'片段。fab'片段也可以通过重组方式产生。抗体的“f(ab')2片段”由两个通过两个二硫键结合在一起的fab'片段的二聚体组成，并且是通过用胃蛋白酶处理整个抗体分子而不进行后续还原而获得的。“fab2”片段是包含使用例如亮氨
酸拉链或ch3 结构域连接的两个fab片段的重组片段。“单链fv”或“scfv”是含有抗体的可变区片段(fv)的重组分子，其中轻链可变区和重链可变区通过合适的柔性多肽接头共价连接。
[0297]
如本文所用，关于cxcl10结合蛋白或其抗原结合结构域与抗原的相互作用的术语“结合(binds)”是指：该相互作用取决于抗原上特定结构(例如，抗原决定簇或表位) 的存在。例如，抗体识别并与特定的蛋白质(而不是一般的蛋白质)结构结合。如果抗体与表位“a”结合，则在含有标记“a”和蛋白质的反应中，含有表位“a”(或游离的、未标记的“a”)的分子的存在将会减少与抗体结合的标记“a”的量。
[0298]
如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性地结合”应理解为表示本公开的cxcl10 结合蛋白与表达相同抗原或细胞的特定抗原或细胞相比其与替代抗原或细胞反应更频繁、更迅速、持续时间更长和/或亲和力更大。例如，cxcl10结合蛋白与cxcl10结合的亲和力比与其他趋化因子受体或与多反应性天然抗体(即，已知可与人类天然存在的多种抗原结合的天然存在抗体)通常识别的抗原的亲和力要大得多(例如，1.5倍，或 2倍，或5倍，或10倍，或20倍，或40倍，或60倍，或80倍至100倍，或150倍，或200倍)。“结合”的提及为术语“特异性结合”提供了明确的支持，反之亦然。
[0299]
如本文所用，术语“不与...结合”应理解为意指本公开的cxcl10结合蛋白不与特定抗原或表达该抗原的细胞结合。
[0300]
如本文所用，术语“不可检测地结合”应理解为表示cxcl10结合蛋白例如抗体以小于10％、或8％、或6％、或5％的水平与上述背景中的候选抗原结合。该背景可以是在不存在蛋白质和/或存在阴性对照蛋白(例如同种型对照抗体)的情况下检测到的结合信号水平，和/或在存在阴性对照抗原时检测到的结合水平。在一个示例中，使用生物传感器分析(例如biacore)检测该结合水平，其中抗原(例如多肽)被固定并与cxcl10 结合蛋白接触。
[0301]
如本文所用，术语“不显着结合”应理解为意指本公开的cxcl10结合蛋白与多肽的结合水平在统计学上没有显着高于背景，例如，在不存在cxcl10结合蛋白和/或存在阴性对照蛋白(例如，同种型对照抗体)的情况下检测到的结合信号水平，和/或在阴性对照多肽存在下检测到的结合水平。在一个示例中，使用生物传感器分析(例如,biacore)检测该结合水平，其中抗原(例如多肽)被固定并与cxcl10结合蛋白接触。
[0302]
出于阐明的目的并且基于本文示例的主题对于本领域技术人员将显而易见的是，本说明书中提及的“亲和力”是指蛋白质或抗体的kd。
[0303]
出于阐明的目的并且基于本文的描述对于本领域技术人员将显而易见的是，提及“至少约”的亲和力将被理解为是指亲和力(或kd)等于或大于所述值(即，当亲和力较低时列举的值)，即2nm的亲和力大于3nm的亲和力。换句话说，该术语可以是“x 或更小的亲和力”，其中x是这里列举的值。
[0304]
如本文所用，术语“表位”(又称“抗原决定簇”)应理解为表示cxcl10与蛋白结合的区域。该术语不一定限于与cxcl10结合蛋白接触的特定残基或结构。例如，该术语包括跨越与cxcl10结合蛋白接触的氨基酸的区域和该区域之外的5-10个(或更多个)、或2-5，或1-3个氨基酸。在一些示例中，该表位包含一系列不连续的氨基酸，当cxcl10多肽折叠时，这些氨基酸彼此靠近，例如，与另一个cxcl10多肽结合，即“构象表位”。
[0305]
术语“竞争性抑制”应理解为意指本公开的cxcl10结合蛋白(或其抗原结合结构
域)减少或阻止了所述抗体或cxcl10结合蛋白与cxcl10之间的结合。这可能是由于 cxcl10结合蛋白(或抗原结合结构域)和抗体与相同或重叠的表位结合导致的。从前述内容将显而易见的是，cxcl10结合蛋白不需要完全抑制抗体的结合，而是它只需将结合降低统计学上显着的量，例如，降低至少约10％、或20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或70％、或80％、或90％、或95％。例如，cxcl10结合蛋白将抗体的结合降低至少约30％，例如至少约50％，例如至少约70％，例如至少约75％，甚至更优选，至少约 80％或85％，例如至少约90％。用于确定结合的竞争性抑制的方法是本领域已知的和/或本文中描述的。例如，在存在或不存在cxcl10结合蛋白的情况下，将抗体暴露于cxcl10。如果与不存在cxcl10结合蛋白的情况相比，在存在cxcl10结合蛋白的情况下抗体结合减少，则认为该蛋白质竞争性地抑制抗体的结合。在一个示例中，竞争性抑制不是由于空间位阻。
[0306]
cxcl10结合蛋白
[0307]
如本文所讨论的，本公开的结合蛋白可以采取各种形式并且与全长人cxcl10、n
‑ꢀ
末端截短的cxcl10和/或瓜氨酸化的cxcl10结合。
[0308]
在一个示例中，本公开提供了一种cxcl10结合蛋白，其中所述结合蛋白与全长人 cxcl10、n-末端截短的cxcl10和瓜氨酸化的cxcl10结合。
[0309]
在另一个示例中，本公开提供了一种cxcl10结合蛋白，其中所述结合蛋白与全长人cxcl10结合，但不与n-末端截短的cxcl10和瓜氨酸化的cxcl10结合。
[0310]
抗体
[0311]
在一个示例中，本公开的cxcl10结合蛋白包括抗体或其抗原结合片段。
[0312]
基于免疫的方法
[0313]
产生抗体的方法是本领域已知的和/或在harlow等人(1988年)中描述的。通常，在此类方法中，将任选与任何合适或所需载体、佐剂或药学上可接受的赋形剂一起配制的蛋白质或其免疫原性片段或表位或表达和展示它们的细胞(即免疫原)施用于非人类动物，例如小鼠、鸡、大鼠、兔子、豚鼠、狗、马、牛、山羊或猪等。免疫原可以通过鼻内、肌肉内、皮下、静脉内、皮内、腹膜内或通过其他已知途径施用。
[0314]
多克隆抗体的产生可以通过在免疫后的不同时间点对免疫动物的血液进行取样来监测。如果需要，可以进行一次或多次进一步的免疫以达到所需的抗体滴度。重复加强和滴定的过程，直到达到合适的滴度。当获得所需水平的免疫原性时，将免疫动物取血并分离和储存血清，和/或将动物用于产生单克隆抗体(mab)。
[0315]
单克隆抗体是本公开所考虑的一种示例性抗体形式。术语“单克隆抗体”或“mab”是指能够与相同抗原结合，例如，与抗原内的相同表位结合的同质抗体群。该术语不旨在限制抗体的来源或其制备方式。
[0316]
对于mab的生产，可以使用多种已知技术中的任何一种，例如us4196265中或harlow 等人(1988年)列举的程序。
[0317]
例如，在足以刺激产生抗体的细胞的条件下，用免疫原对合适的动物进行免疫。兔子和啮齿动物如小鼠和大鼠是示例性动物。经基因工程改造以表达人免疫球蛋白并且例如不表达鼠免疫球蛋白的小鼠也可用于生产本公开的抗体(例如，如wo2002066630中所述)。
[0318]
免疫后，选择具有产生抗体潜力的体细胞，例如b淋巴细胞(b细胞)，供mab生成方案使用。这些细胞可以从脾脏、扁桃体或淋巴结的活体组织切片中获得，或者从外周血样本
中获得。然后，将来自免疫动物的b细胞与永生骨髓瘤细胞融合，该细胞通常来自与用免疫原免疫的动物相同的物种。
[0319]
通过在包含阻断组织培养基中核苷酸从头合成的试剂的选择性培养基中培养来扩增杂交体。示例性试剂是氨基蝶呤、甲氨蝶呤和氮丝氨酸。
[0320]
例如通过流式细胞术和/或免疫组织化学和/或免疫测定法(例如放射免疫测定法、酶免疫测定法、细胞毒性测定法、噬斑测定法、点免疫测定法)，对扩增的杂交瘤进行抗体特异性和/或滴度的功能选择。
[0321]
或者，使用abl-myc技术(neoclone，madison wi 53713，美国)来生产分泌mab 的细胞系(例如，如largaespada等人(1996年)的文献中所述)。
[0322]
基于库的方法
[0323]
本公开还包括筛选抗体或其抗原结合片段(例如，包含其可变区)的库。
[0324]
本公开考虑的库的示例包括初始库(来自未经处理的受试者)、免疫库(来自用抗原免疫的受试者)或综合库。编码抗体或其区域(例如可变区)的核酸通过常规技术(例如，如sambrook等人在2001年所公开的)克隆并使用本领域已知的方法用于编码和展示蛋白质。用于产生蛋白质库的其他技术在例如us6300064(例如，morphosys ag的hucal库)、us5885793、us6204023、us6291158或us6248516中有所描述。
[0325]
根据本公开的抗原结合片段可以是可溶性分泌蛋白或可以作为融合蛋白呈递在细胞或颗粒(例如，噬菌体或其他病毒、核糖体或孢子)表面上。各种显示库格式在本领域中是已知的。例如，该库是体外展示库(例如，核糖体展示库、共价展示库或mrna 展示库，例如，如us7270969中所述)。在又一个示例中，展示库是噬菌体展示库，其中包含抗体的抗原结合片段的蛋白质在噬菌体上表达，例如，如us6300064、us5885793、 us6204023、us6291158或us6248516中所述。其他噬菌体展示方法在本领域中是已知的并且被本公开考虑到。类似地，本公开考虑了细胞展示的方法，例如，如us5516637 中所述通过细菌展示库；如us6423538中所述通过酵母展示库；或通过哺乳动物展示库。
[0326]
筛选展示库的方法是本领域已知的。在一个示例中，使用亲和纯化筛选本公开的展示库，例如，如scopes在1994年所述。亲和纯化的方法通常包括：将包含由库展示的抗原结合片段的蛋白质与靶抗原接触，并在洗涤后将那些仍与抗原结合的结构域洗脱。
[0327]
如果需要，通过筛选鉴定的任何可变区或scfv都可以很容易地被修饰成完整的抗体。用于将可变区或scfv修饰或重新格式化为完整抗体的示例性方法在例如jones等人(2010年)、或jostock等人(2004)或wo2012040793的文献中均有描述。或者或另外地，还可以使用标准克隆方法，例如，如ausubel等人(1987)和/或sambrook等人(2001)所述。
[0328]
去免疫的、嵌合的、人源化的、同人化的、灵长类化的和人抗体或抗原结合片段本公开的抗体或抗原结合片段可以是人源化的。
[0329]
术语“人源化抗体”应理解为指包含类人可变区的蛋白质，其包括来自非人类物种 (例如，小鼠或大鼠或非人类灵长类动物)的移植到或插入到人抗体的fr(这种类型的抗体也称为“cdr移植抗体”)中抗体的cdr。人源化抗体还包括其中人蛋白质的一个或多个残基被一个或多个氨基酸取代修饰和/或人抗体的一个或多个fr残基被相应的非人残基取代的抗体。人源化抗体还可包含在人抗体或非人抗体中均未发现的残基。抗体的任何其他区域(例如，fc区)通常是人的。可以使用本领域已知的方法进行人源化，例如us5225539、
us6054297、us7566771或us5585089中所述。术语“人源化抗体”还包括超人源化抗体，例如，如us7732578中所述。类似的含义将同样适用于术语“人源化抗原结合片段”。
[0330]
本公开的抗体或其抗原结合片段可以是人抗体或其抗原结合片段。如本文所用，术语“人抗体”是指在人类中发现的具有可变和任选的恒定抗体区的抗体，例如：在人类生殖细胞系或体细胞中或来自使用这些区域产生的库中的那些抗体。“人”抗体可以包括不由人序列，例如通过体外随机或定点突变引入的突变(特别是涉及保守取代的突变或蛋白质少量残基，例如蛋白质的1、2、3、4或5个残基中的突变)编码的氨基酸残基。这些“人抗体”不一定需要由人的免疫反应产生，相反，它们可以使用重组方法(例如，筛选噬菌体展示库)和/或由包含编码人抗体恒定区和/或可变区的核酸的转基因动物(例如，小鼠)和/或使用引导选择(例如，如us5565332中所述)来产生。该术语还包括此类抗体的亲和力成熟形式。为了本公开的目的，人抗体也将被认为包括包含来自人抗体的fr或包含来自人fr共有序列的序列并且其中一个或多个cdr是随机或半随机的fr的蛋白质，例如，如us6300064和/或us6248516中所述。类似的含义将同样适用于术语“人抗原结合片段”。
[0331]
本公开的抗体或其抗原结合片段可以是合成人源化抗体或其抗原结合片段。术语“合成人源化抗体”是指通过wo2007019620中描述的方法制备的抗体。合成人源化抗体包括抗体的可变区，其中可变区包含来自新世界灵长类抗体可变区的fr和来自非新世界灵长类抗体可变区的cdr。
[0332]
本公开的抗体或抗原结合片段可以是灵长类化的。“灵长类化抗体”包含来自在免疫非人灵长类动物(例如食蟹猴)后产生的抗体的可变区。任选地，非人灵长类抗体的可变区与人恒定区连接以产生灵长类化抗体。us6113898中描述了产生灵长类化抗体的示例性方法。
[0333]
在一个示例中，本公开的抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体或片段。术语“嵌合抗体”或“嵌合抗原结合片段”是指其中一个或多个可变结构域来自特定物种(例如，鼠科动物，例如小鼠或大鼠)或属于特定抗体类别或亚类，而抗体或片段的其余部分来自另一个物种(例如，人类或非人类灵长类动物)或属于另一个抗体类别或亚类。在一个示例中，包含来自非人抗体(例如，鼠抗体)的vh和/或v
l
的嵌合抗体和该抗体的剩余区域来自人抗体。此类嵌合抗体及其抗原结合片段的生产在本领域中是已知的，并且可以通过标准方法来实现(如例如在us6331415；us5807715；us4816567和us4816397中所述)。
[0334]
本公开还涵盖去免疫的抗体或其抗原结合片段，例如，如wo2000034317和 wo2004108158中所述。去免疫的抗体和片段具有一个或多个表位，例如，b细胞表位或 t细胞表位被去除(即，突变)，从而降低受试者产生针对抗体或蛋白质的免疫应答的可能性。例如，分析本公开的抗体以鉴定一个或多个b或t细胞表位，并且表位内的一个或多个氨基酸残基被突变，从而降低抗体的免疫原性。
[0335]
包含蛋白质的抗体结合结构域
[0336]
单结构域抗体；
[0337]
在一些示例中，本公开的cxcl10结合蛋白是或包含单结构域抗体(其可与术语“结构域抗体”或“dab”互换使用)。单结构域抗体是包含抗体重链可变结构域的全部或部分的单个多肽链。
[0338]
双链抗体、三链抗体、四链抗体
[0339]
在一些示例中，本公开的cxcl10结合蛋白是或包括双链抗体、三链抗体、四链抗体或更高阶蛋白质复合物，例如在wo98/044001和/或wo94/007921中描述的那些。
[0340]
例如，双链抗体是包含两条相关多肽链的蛋白质，每条多肽链均包含结构v
l-x-vh或v
h-x-v
l
，其中x是包含不足以允许单条多肽链中的vh和v
l
缔合(或形成fv)残基或不存在的接头；并且其中一条多肽链的vh与另一条多肽链的v
l
结合形成抗原结合位点，即形成能够与一种或多种抗原特异性结合的fv分子。每条多肽链中的v
l
和vh可以是相同的，或者每条多肽链中的v
l
和vh可以是不同的，从而形成双特异性双链抗体(即，包括具有不同特异性的两个fv)。
[0341]
单链fv(scfv)片段
[0342]
本公开的cxcl10结合蛋白可以是scfv。本领域技术人员将意识到，scfv包含单条多肽链中的vh和v
l
区以及vh和v
l
之间的多肽接头，其使得scfv能够形成用于抗原结合的所需结构(即，对于单条多肽链的vh和v
l
相互结合形成fv)。例如，该接头包含超过 12个氨基酸残基，(gly4ser)3是对scfv更有利的接头之一。
[0343]
本公开还考虑了通过二硫键稳定化的fv(或difv或dsfv)，其中将单个半胱氨酸残基引入vh的fr和v
l
的fr中，并且半胱氨酸残基通过二硫键连接以产生稳定的fv。
[0344]
或者或另外地，本公开涵盖二聚体scfv，即包含通过非共价或共价键例如通过亮氨酸拉链结构域(例如，源自fos或jun)连接的两个scfv分子的蛋白质。或者，两个scfv通过足够长度的肽接头连接以允许两个scfv形成并与抗原结合，例如，如 us20060263367中所述。
[0345]
半抗体
[0346]
在一些示例中，本发明的抗原结合片段是半抗体或半分子。技术人员将意识到半抗体是指包含单条重链和单条轻链的蛋白质。术语“半抗体”还涵盖包含抗体轻链和抗体重链的蛋白质，其中抗体重链已突变，从而防止与另一抗体重链结合。在一个示例中，当抗体解离形成两个分子时形成半抗体，每个分子均包含一条重链和一条轻链。
[0347]
用于产生半抗体的方法是本领域已知的并且示例性方法在本文中有所描述。
[0348]
在一个示例中，半抗体可以通过将构成目的igg的单重链和单轻链的基因导入细胞中来分泌以供表达。在一个示例中，恒定区(例如，igg4恒定区)包含“键或孔”(或“突起或孔”)突变以防止异二聚体形成。在一个示例中，恒定区(例如，igg4恒定区) 包含t366w突变(或突起)。在另一个示例中，恒定区(例如，igg4恒定区)包含t366s、 l368a和y407v突变(或孔)。在另一个示例中，恒定区包含t350v、t366l、k392l和 t394w突变(突起)。在另一个示例中，恒定区包含t350v、l351y、f405a和y407v突变(孔)。示例性恒定区氨基酸取代根据欧盟编号系统编号。
[0349]
其他抗体和包含其抗原结合结构域的蛋白质
[0350]
本公开还考虑了其他抗体和包含其抗原结合结构域的蛋白质，例如：
[0351]
(i)微型抗体，例如，如us5837821中所述；
[0352]
(ii)杂缀和蛋白，例如，如us4676980中所述；
[0353]
(iii)使用化学交联剂产生的杂缀和蛋白，例如，如us4676980中所述；和
[0354]
(iv)fab3，例如，如ep19930302894中所述。
[0355]
免疫球蛋白和免疫球蛋白片段
[0356]
本公开的cxcl10结合蛋白的一个示例是包含免疫球蛋白可变区的蛋白质，例如t 细胞受体或重链免疫球蛋白(例如，ignar、骆驼科动物抗体)。
[0357]
重链免疫球蛋白
[0358]
重链免疫球蛋白在结构上不同于许多其他形式的免疫球蛋白(例如抗体)，这是因为它们包含重链，但不包含轻链。因此，这些免疫球蛋白也被称为“仅重链抗体”。重链免疫球蛋白存在于例如骆驼科动物和软骨鱼(也称为ignar)中。
[0359]
存在于天然存在的重链免疫球蛋白中的可变区在骆驼科动物ig中通常称为“v
hh
结构域”，在ignar中称为v-nar，以将它们与常规四链抗体中存在的重链可变区(称为“vh结构域”)和常规四链抗体中存在的轻链可变区(称为“v
l
结构域”)区分开来。
[0360]
重链免疫球蛋白不需要轻链的存在就能以高亲和力和高特异性与相关抗原结合。这意味着单结构域结合片段可以衍生自重链免疫球蛋白，它们易于表达并且通常是稳定和可溶的。
[0361]
在以下参考文献wo94/04678、wo97/49805和wo97/49805中可以找到来自骆驼科动物的重链免疫球蛋白及其可变区及其生产和/或分离和/或使用方法的一般描述。
[0362]
来自软骨鱼的重链免疫球蛋白及其可变区及其生产和/或分离和/或使用方法的一般描述尤其参见wo2005118629。
[0363]
v样蛋白质
[0364]
在一个示例中，本公开的cxcl10结合蛋白包含t细胞受体。t细胞受体有两个v 结构域，它们结合成类似于抗体的fv模块的结构。novotny等人在1991年描述了t细胞受体的两个v结构域(称为α和β)如何融合并表达为单链多肽，以及如何改变表面残基以降低直接类似于抗体scfv的疏水性。描述产生包含两个v-α和v-β结构域的单链t细胞受体或多聚体t细胞受体的其他出版物包括wo1999045110或wo2011107595。
[0365]
包含抗原结合结构域的其他非抗体蛋白质包括具有v样结构域的蛋白质，其通常是单分子构造的。包含此类v样结构域的蛋白质的示例包括ctla-4、cd28和icos。包含此类v-样结构域的蛋白质的进一步公开内容包括在wo1999045110中。
[0366]
阿德内丁蛋白(adnectins)
[0367]
在一个示例中，本公开的cxcl10结合蛋白包含阿德内丁蛋白。阿德内丁蛋白基于人纤连蛋白中的第十个纤连蛋白iii型(
10
fn3)结构域，其中环区被改变以进行抗原结合。例如，可以对
10
fn3结构域的β-三明治一端的三个环进行工程改造，以使阿德内丁蛋白能够特异性识别抗原。更多细节参见us20080139791或wo2005056764。
[0368]
抗运载蛋白(anticalin)
[0369]
在又一个示例中，本公开的cxcl10结合蛋白包含抗运载蛋白。抗运载蛋白衍生自脂质运载蛋白，脂质运载蛋白是一个可运输小疏水分子，例如类固醇、胆素、类维生素 a和脂质等的细胞外蛋白家族。脂质运载蛋白具有刚性β-折叠二级结构，其中在锥形结构的开口端具有多个环，可进行工程改造以与抗原结合。这种工程化的脂质运载蛋白被称为抗运载蛋白。关于抗运载蛋白的进一步描述，见us7250297或us20070224633。
[0370]
亲和体
[0371]
在另一个示例中，本公开的cxcl10结合蛋白包含亲和体。亲和体是衍生自金黄色葡萄球菌a蛋白(protein a of staphylococcus aureus)的z结构域(抗原结合结构域)的
支架，其可以被工程化以结合抗原。z结构域由大约58个氨基酸的三螺旋束组成。已通过表面残基的随机化生成文库。更多细节参见ep1641818。
[0372]
阿维默(avimer)
[0373]
在另一个示例中，本公开的cxcl10结合蛋白包含阿维默。阿维默是衍生自a-结构域支架家族的多结构域蛋白。大约35个氨基酸的天然结构域采用确定的二硫键结构。多样性是通过改组a-结构域家族展示的自然变异而产生的。更多细节参见 wo2002088171。
[0374]
darpin
[0375]
在另一个示例中，本公开的cxcl10结合蛋白包含设计的锚蛋白重复序列(designedankyrin repeat protein，darpin)。设计的锚蛋白重复序列衍生自锚蛋白，锚蛋白是介导整合膜蛋白与细胞骨架附着的蛋白质家族。单个锚蛋白重复是由两个α-螺旋和一个β-转角组成的33个残基基序。它们可以被设计成通过随机化第一个α-螺旋中的残基和每个重复的β-转角来结合不同的靶抗原。它们的结合界面可以通过增加模块的数量来增加(一种亲和力成熟的方法)。更多细节参见us20040132028。
[0376]
结合蛋白的突变
[0377]
本公开还提供了与本文公开的序列具有至少90％同一性的cxcl10结合蛋白或编码其的核酸。在一个示例中，本公开的cxcl10结合蛋白或核酸包含与本文公开的序列至少约90％、或95％、或97％、或98％、或99％的同一性的序列，其中根据任意示例，如本文所述，该蛋白与cxcl10特异性结合。
[0378]
或者或另外地，cxcl10结合蛋白包含与如本文的任意示例所述的vh或v
l
的cdr至少约90％、或95％、或97％、或98％、或99％的同一性的cdr(例如，三个cdr)，其中根据任意示例的如本文所述的蛋白质能够与cxcl10特异性结合。本文描述了用于确定蛋白质与cxcl10之间的结合的方法。
[0379]
本领域已知重链cdr2的五个c-末端残基可以突变为保守或非保守氨基酸取代(31％的残基)(padlan等人，1995年)。因此，蛋白质可以包含与本文公开的重链cdr2序列具有至少约35％的同一性的cdr2。
[0380]
本公开内容还考虑了本公开的cxcl10结合蛋白的突变形式，其与本文所述的序列相比包含一个或多个保守氨基酸取代。在一些示例中，cxcl10结合蛋白包含10个或更少个，例如9、或8、或7、或6、或5、或4、或3、或2、或1个保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是指氨基酸残基被具有相似侧链和/或亲水性和/或亲水性的氨基酸残基取代。表1中提供了示例性的保守氨基酸取代。
[0381]
表1：示例性氨基酸取代
[0382]
[0383][0384]
本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸) 和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。亲水性指数例如由kyte和doolittle(1982) 在文献中描述，而亲水指数例如在us4554101中描述。
[0385]
本公开还考虑了非保守氨基酸变化。例如，特别感兴趣的是用另一种带电氨基酸和用中性或带正电氨基酸来取代带电氨基酸。在一些示例中，cxcl10结合蛋白包含10个或更少个，例如9、或8、或7、或6、或5、或4、或3、或2、或1个非保守氨基酸取代。
[0386]
在一个示例中，突变发生在本公开的cxcl10结合蛋白的抗原结合结构域的fr内。在另一个示例中，突变发生在本公开的cxcl10结合蛋白的cdr内。
[0387]
产生突变形式的cxcl10结合蛋白的示例性方法包括：
[0388]
·
dna诱变(thie等人，2009)或rna诱变(kopsidas等人，2006；kopsidas等人，2007；和wo1999/058661)；
[0389]
·
将编码该多肽的核酸引入突变细胞，例如xl-1red、xl-muts和xl-muts-kanr细菌细胞 (stratagene)中；
[0390]
·
dna改组(例如，如stemmer(1994)所公开的)；以及
[0391]
·
定点诱变(例如，如dieffenbach等人(1995)所述)。
[0392]
用于确定本公开的突变体cxcl10结合蛋白的生物活性的示例性方法对技术人员来说是显而易见的并且包括例如抗原结合、结合的竞争性抑制、亲和力、缔合和解离等。
[0393]
在另一个示例中，本公开的核酸包含与本文公开的序列具有至少约90％、或95％、或97％、或98％、或99％的同一性的序列，并且编码具有如本文任何示例所述的功能的cxcl10结合蛋白。本公开还包括编码本公开的cxcl10结合蛋白的核酸，其由于遗传密码的简并性而不同于本文列举的序列。
[0394]
核酸或多肽的同一性百分比通过gap(needleman和wunsch，1970)分析(gcg程序)测定，空位产生罚分＝5，空位延伸罚分＝0.3。查询序列的长度至少为50个残基，gap分析在
至少50个残基的区域上将两个序列对齐。例如，查询序列的长度至少为100个残基，而gap分析在至少100个残基的区域上将两个序列对齐。例如，两个序列在其整个长度上对齐。
[0395]
恒定区
[0396]
本公开涵盖本文所述的cxcl10结合蛋白和/或抗体，其包含抗体的恒定区。这包括与fc融合的抗体的抗原结合片段。
[0397]
可用于产生本公开的蛋白质的恒定区序列可以从许多不同的来源获得。在一些示例中，蛋白质的恒定区或其部分源自人抗体。恒定区或其部分可以衍生自任何抗体类别，包括igm、igg、igd、 iga和ige，以及任何抗体同种型，包括igg1、igg2、igg3和igg4。在一个示例中，恒定区是人同种型igg4或稳定的igg4恒定区。在一个实施方案中，恒定区是iggκ恒定区。
[0398]
在一个示例中，与例如天然或野生型人iggl或igg3 fc区相比，恒定区的fc区具有降低的诱导效应功能的能力。
[0399]
在本公开的上下文中，“效应功能”是指由细胞或蛋白质介导的那些生物活性，这些细胞或蛋白质与抗体的fc区(天然序列fc区或氨基酸序列变体fc区)结合，导致细胞死亡。抗体诱导的效应功能的示例包括：补体依赖性细胞毒性(cdc)；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)；抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)；和b细胞活化。在一个示例中，效应功能是adcc和/或adcp和/或cdc。用于评估含有fc区的蛋白质的效应功能水平的方法是本领域已知的和/或在本文中描述的。
[0400]
在一个示例中，fc区是igg4 fc区(即，来自igg4恒定区)，例如，人igg4 fc区。合适的igg4 fc区的序列对技术人员来说是显而易见的和/或可在公开可用的数据库中获得(例如，可从国家生物技术信息中心获得)。
[0401]
在一个示例中，恒定区是稳定的igg4恒定区。术语“稳定的igg4恒定区”将被理解为意指igg4 恒定区，其已被修饰以减少fab臂交换或减少经历fab臂交换或形成半抗体的倾向或减少形成半抗体的倾向。“fab臂交换”是指人igg4的一种蛋白质修饰，其中igg4重链和连接的轻链(半分子) 被另一个igg4分子的重链-轻链对交换。因此，igg4分子可以获得两个不同的fab臂，用来识别两种不同的抗原(产生双特异性分子)。fab臂交换在体内自然发生，并且可以在体外由纯化的血细胞或还原剂(如还原型谷胱甘肽)诱导。当igg4抗体解离形成两个分子时，就会形成“半抗体”，每个分子均包含一条重链和一条轻链。
[0402]
在一个示例中，根据kabat系统(kabat等人，1987和/或1991)，稳定的igg4恒定区在的铰链区的位置241处包含脯氨酸。根据欧盟编号系统(kabat等人，2001和edelman等人，1969)，该位置对应于铰链区的位置228。在人igg4中，该残基通常是丝氨酸。在用丝氨酸替换脯氨酸后，igg4 铰链区包含序列cppc。就这一点，技术人员将意识到“铰链区”是抗体重链恒定区的富含脯氨酸的部分，其将赋予抗体两个fab臂移动性的fc和fab区来连接起来。铰链区包括包含在重链间二硫键中的半胱氨酸残基。根据kabat的编号系统，一般定义为人igg1从glu226延伸到pro243。其他igg 同种型的铰链区可以通过将形成重链间二硫键(s-s)键的第一个和最后一个半胱氨酸残基置于相同位置来与iggl序列对齐(参见例如wo2010/080538)。
[0403]
稳定化igg4抗体的其他示例是其中人igg4重链恒定区(根据eu编号系统)中位置409处的精氨酸被赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸取代的抗体(例如，如wo2006/033386
所述)。恒定区的 fc区可以另外或可选地在对应于405的位置(根据eu编号系统)包含选自由以下组成的组的残基：丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸和亮氨酸。可选地，铰链区在位置241(即，cppc序列)处包含脯氨酸(如上所述)。
[0404]
在另一个示例中，fc区是修饰为具有降低的效应功能的区域，即，“非免疫刺激性fe区”。例如，fc区是在选自由268、309、330和331组成的组的一个或多个位置处包含取代的iggl fc区。在另一个示例中，fc区是iggl fc区，其包含以下e233p、l234v、l235a变化中的一种或多种和g236 缺失中，和/或a327g、a330s和p331s变化中的一种或多种(armour等人，1999；shields等人， 2001)。非免疫刺激性fc区的其他示例描述于以下文献中(例如，dall'acqua等人，2006；和/或 hezareh，2001)。
[0405]
在另一个示例中，fc区是嵌合fc区，例如，包含来自igg4抗体的至少一个ch2结构域和来自 iggl抗体的至少一个ch3结构域，其中fc区在选自由240、262、264、266、297、299、307、309、 323、399、409和427(eu编号)组成的组中的一个或多个氨基酸位置处包含取代(例如，如 wo2010/085682中所述)。示例性取代包括240f、262l、264t、266f、297q、299a、299k、307p、 309k、309m、309p、323f、399s和427f。
[0406]
蛋白质生产
[0407]
在一个示例中，根据任意示例的本文所述的cxcl10结合蛋白是通过在足以产生蛋白质的条件下培养本发明的细胞来产生的，例如，如本文所述和/或如本领域已知的。
[0408]
重组表达
[0409]
在另一个示例中，根据任意示例在本文中描述的cxcl10结合蛋白是重组的。
[0410]
在重组蛋白的情况下，可以将编码其的核酸克隆到表达构建体或载体中，然后将其转染到宿主细胞中，例如大肠杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞(例如猿猴cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、人胚肾(hek)细胞)或不产生蛋白质的骨髓瘤细胞中。用于表达蛋白质的示例性细胞是cho细胞、骨髓瘤细胞或hek细胞。实现这些目的的分子克隆技术在本领域中是已知的并且例如在ausubel等人，1988(包括所有至今的更新)或sambrook等人，1989的文献中有所描述。多种克隆和体外扩增方法适用于构建重组核酸。产生重组抗体的方法也是本领域已知的，参见例如 us4816567或us5530101。
[0411]
分离后，将核酸插入表达构建体或表达载体中的启动子并可操作地连接，以进一步克隆(dna 扩增)或在无细胞系统或在细胞中表达。
[0412]
如本文所用，术语“启动子”应在其最广泛的范围内使用，并且包括基因组基因的转录调控序列，其包括在存在或不存在调控元件(例如，上游激活序列、转录因子结合位点、增强子和沉默子) 的情况下准确转录起始所需的tata盒或起始元件，所述tata盒或起始元件例如响应于发育和/或外部刺激或以组织特异性方式来改变核酸的表达。在本文中，术语“启动子”也用于描述重组、合成或融合核酸或衍生物，它们赋予、激活或增强与其可操作连接的核酸的表达。示例性启动子可以包含一种或多种特定调节元件的额外拷贝以进一步增强所述核酸的表达和/或改变空间表达和/或时间表达。
[0413]
如本文所用，术语“可操作地连接到”是指相对于核酸来定位启动子，使得核酸的表达受启动子控制。
[0414]
许多用于在细胞中表达的载体是可用的。载体组分通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列、编码蛋白质的序列(例如，源自本文提供的信息)、增强子元件、启动子和转
录终止序列。熟练的技术人员将知道用于蛋白质表达的合适序列。示例性信号序列包括原核分泌信号(例如，pelb、碱性磷酸酶、青霉素酶、ipp或热稳定肠毒素ii)、酵母分泌信号(例如，转化酶前导、α因子前导或酸性磷酸酶前导)或哺乳动物分泌信号(例如，单纯疱疹gd信号)。
[0415]
在哺乳动物细胞中具有活性的示例性启动子包括：巨细胞病毒立即早期启动子(cmv-ie)、人延伸因子1-启动子(ef1)、小核rna启动子(u1a和u1b)、肌球蛋白重链启动子、猿猴病毒40启动子(sv40)、劳斯肉瘤病毒启动子(rsv)、腺病毒主要晚期启动子、β-肌动蛋白启动子；包含cmv 增强子/β-肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子或其活性片段的杂合调节元件。有用的哺乳动物宿主细胞系的示例是由sv40(cos-7，atcc crl 1651)转化的猴肾cv1细胞系；人胚肾细胞系(293 或293细胞亚克隆以在悬浮培养中生长；幼仓鼠肾细胞(bhk，atcc ccl 10)；或中国仓鼠卵巢细胞 (cho)。
[0416]
适合在酵母细胞中表达的典型启动子，例如选自毕赤酵母(pichia pastoris)、酿酒酵母 (saccharomyces cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)的酵母细胞，包括但不限于：adh1启动子、gal1启动子、gal4启动子、cup1启动子、pho5启动子、nmt启动子、rpr1 启动子或tef1启动子。
[0417]
用于将分离的核酸或包含其的表达构建体引入细胞中用于表达的方法是本领域技术人员已知的。用于给定细胞的技术取决于已知的成功技术。将重组dna引入细胞的方法包括显微注射、deae
‑ꢀ
葡聚糖介导的转染、例如使用lipofectamine(gibco，md，美国)和/或cellfectin(gibco，md，美国)通过脂质体介导的转染、peg介导的dna摄取、电穿孔和例如使用dna包覆的钨或金颗粒 (agracetus inc.，wi，美国)等进行的微粒轰击。
[0418]
用于产生蛋白质的宿主细胞可以在多种培养基中培养，这取决于所使用的细胞类型。市售培养基如ham's fl0(sigma)、minimal essential medium((mem)，(sigma)，rpml-1640(sigma)和 dulbecco's modified eagle's medium((dmem)，sigma))适用于培养哺乳动物细胞。用于培养本文讨论的其他细胞类型的培养基是本领域已知的。
[0419]
蛋白质的分离
[0420]
用于分离蛋白质的方法是本领域已知的和/或本文中描述的。
[0421]
当cxcl10结合蛋白分泌到培养基中时，来自这种表达系统的上清液可以首先使用市售的蛋白浓缩过滤器例如amicon或millipore pellicon超滤单元进行浓缩。可以在任何上述步骤中使用蛋白酶抑制剂(如pmsf)以抑制蛋白水解，并且可以使用抗生素以防止外来污染物的生长。或者或另外地，可例如使用连续离心将上清液从表达蛋白质的细胞中过滤和/或分离出来。
[0422]
从细胞中制备的cxcl10结合蛋白可以使用例如离子交换、羟基磷灰石层析、疏水相互作用层析、凝胶电泳、透析、亲和层析(例如蛋白a亲和层析或蛋白g层析)或以上方法的任何组合进行来进行纯化。这些方法在本领域中是已知的并且在例如wo99/57134或harlow等人(1988)的文献中描述。
[0423]
本领域技术人员还将意识到，可以对蛋白质进行修饰以使其包括标签，从而促进纯化或检测，该标签例如为诸如六组氨酸标签之类的多聚组氨酸标签，或流感病毒血凝素(ha)标签，或simianvirus 5(v5)标签，或flag标签，或谷胱甘肽s-转移酶(gst)标签。然后使用本领域已知的方法纯化(例如，亲和纯化)所得蛋白质。例如，通过使包含该蛋白质的样
本与固定在固体或半固体支持物上的六-组氨酸标签特异性结合的镍-次氮基三乙酸(ni-nta)接触来纯化包含六-组氨酸标签的蛋白质，洗涤该样本以去除未结合的蛋白质，然后洗脱结合的蛋白质。或者或另外地，在亲和纯化方法中使用与标签结合的配体或抗体。
[0424]
缀合物
[0425]
在一个示例中，本公开的cxcl10结合蛋白与可检测标记缀合。
[0426]
如本文所用，术语“缀合物”或“缀合的”应理解为包括间接结合和直接结合。例如，直接缀合包括化学缀合，其可以是非共价或共价或基因缀合(也称为“融合”)。在一个示例中，缀合是共价的，例如二硫键的形式。
[0427]
如本文所用，“可检测标记”是分子或原子标签或标记，其产生或可被诱导产生可视觉或通过使用合适的检测器检测到的光学或其他信号或产物。可检测标记在本领域是众所周知的并且包括例如放射性标记、酶标记、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记、辅基、造影剂和超声剂。
[0428]
常用的荧光标记包括alexa、cy5和cy5.5等花青、吲哚菁和异硫氰酸荧光素(fitc)，但不限于此。在本公开的实践中有用的荧光标记可以包括但不限于：1，5iaedans；1，8-ans；4-甲基伞形酮；5-羧基-2，7-二氯荧光素；5-羧基荧光素(5-fam)；5-羧基荧光素(ph 10)；5-羧基四甲基罗丹明(5-tamra)；5-fam(5-羧基荧光素)；5-hat(羟基色胺)；5-羟基色胺(hat)；5-rox(羧基-x-罗丹明)；5-tamra(5-羧基四甲基罗丹明)；6-羧基罗丹明6c；6-cr 6g；6-joe；7-氨基-4
‑ꢀ
甲基香豆素；7-氨基放线菌素d(7-aad)；7-羟基-4-甲基香豆素；9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶；abq；酸性品红；acma(9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶)；吖啶橙+dna；吖啶橙+rna；吖啶橙+dna&rna；吖啶红；吖啶黄；吖啶黄素；吖啶黄feulgen sitsa；水母发光蛋白(发光蛋白)；亚历克斯荧光(alexafluor)350；亚历克斯荧光430；亚历克斯荧光488；亚历克斯荧光532；亚历克斯荧光546；亚历克斯荧光568；亚历克斯荧光594；亚历克斯荧光633；亚历克斯荧光647；亚历克斯荧光660；亚历克斯荧光680；茜素络合剂；茜素红；别藻蓝蛋白(apc)；amc、amca-s；amca(氨基甲基香豆素)；amca-x；氨基放线菌素d；氨基香豆素；氨基甲基香豆素(amca)；苯胺蓝；硬脂酸蒽环酯； apc(别藻蓝蛋白)；apc-cy7；aptra-btc＝ratio染料，zn
2+
；apts；阿斯曲拉崇橙(astrazon)亮红4g；阿斯曲拉崇橙r；阿斯曲拉崇红6b；阿斯曲拉崇黄7gll；阿的平(atabrine)； atto-tag.tm.cbqca；atto-tag.tm.fq；金胺(atabrine)；aurophosphine g；aurophosphine；bao 9(双氨基苯二唑)；bcecf(高ph)；bcecf(低ph)；硫酸黄连素；β内酰胺酶；bfp蓝移gfp(y66h)；蓝色荧光蛋白；bfp/gfp fret；bimane；bisbenzemide；双苯酰亚胺(hoechst)；双btc-ratio染料，zn
2+
；布兰科福尔(blancophor)ffg；布兰科福尔sv；bobo-1；bobo-3；bodipy492/515； bodipy493/503；bodipy500/510；bodipy 505/515；bodipy 530/550；bodipy 542/563；bodipy 558/568； bodipy 564/570；bodipy 576/589；bodipy 581/591；bodipy 630/650-x；bodipy 650/665-x；bodipy 665/676；bodipy f1；bodipy fl atp；bodipy f1-神经酰胺；bodipy r6g se；bodipy tmr；bodipytmr-x缀合物；bodipy tmr-x、se；bodipy tr；bodipy tr atp；bodipy tr-x se；bo-pro-1；bo-pro-3；亮sulphoflavin ff；btc-ratio染料ca
2+
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2+
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+染料；钙绿-2ca
2+
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叶绿素；色霉素a(chromomycin a)；色霉素a；cl-nerf(ratio 染料，ph)；cmfda；腔肠素(coelenterazine)；腔肠素cp(ca
2+
，染料)；腔肠素f；腔肠素fcp；腔肠素h；腔肠素hcp；腔肠素ip；腔肠素n；腔肠素o；香豆素鬼笔环肽(coumarin phalloidin)； c-藻蓝蛋白(phycocyanine)；cpm甲基香豆素；ctc；ctc甲臜；cy2；cy3.18；cy3.5；cy3；cy5.18； cy5.5；cy5；cy7；青色gfp(cyan gfp)；环腺苷酸荧光传感器(cyclic amp fluorosensor，ficrhr)； cyquant细胞增殖检测(cyquant cell proliferation assay)；dabcyl；丹酰；丹酰胺；丹酰尸胺；丹酰氯；丹酰dhpe；丹氟；dapi；dapoxyl；dapoxyl 2；dapoxyl 3；dcfda；dcfh(二氯二氢荧光素二乙酸酯(dichlorodihydrofluorescein diacetate))；ddao；dhr(二氢罗丹明(dihydorhodamine) 123)；二-4-anepps；二-8-anepps(非定比)；dia(4-di-16-asp)；二氯二氢荧光素二乙酸酯(dcfh)； did-亲脂示踪物；did(dilc18(5))；dids；二氢罗丹明(dihydorhodamine)123(dhr)；dil(dilc18 (3))；二硝基苯酚；dio(dioc18(3))；dir；dir(di1c18(7))；dm-nerf(高ph值)；dnp；多巴胺；dsred；红色荧光蛋白；dtaf；dy-630-nhs；dy-635-nhs；ebfp；ecfp；egfp；elf97；伊红；藻红；藻红itc；溴化乙锭；乙啡啶同型二聚物-1(ethd-1)；euchrysin；eukolight；氯化铕(111)； eyfp；速蓝；fda；孚尔根(副品红)；fif(甲醛(formaldehyd)诱导的荧光)；fitc；fitc抗体； flazo橙；fluo-3；fluo-4；荧光素(fitc)；荧光素二乙酸酯；荧光祖母绿；荧光金(fluoro-gold) (羟芪巴脒)；fluor-ruby；fluorx；fm 1-43；fm 4-46；fura红(高ph)；fura红/fluo-3；fura-2，高钙；fura-2，低钙；ifura-2/bcecf；genacryl亮红b；genacryl亮黄10gf；genacryl粉红3g； genacryl黄5gf；geneblazer(ccf2)；gfp(s65t)；gfp红移(rsgfp)；非uv激发的野生型gfp (wtgfp)；uv激发的野生型gfp(wtgfp)；gfpuv；gloxalic acid；粒状蓝(granular blue)；血卟啉；hoechst 33258；hoechst 33342；hoechst 34580；hpts；羟基香豆素；羟芪巴脒(荧光金)；羟色胺；indo-1(高钙)；indo-1(低钙)；indo二碳菁(did)；indo三碳菁(dir)；intrawhite cf； jc-1；jo-jo-1；jo-pro-1；laserpro；laurodan；lds 751(dna)；lds751(rna)；leucophor paf； leucophor sf；leucophor ws；丽丝胺罗丹明；丽丝胺罗丹明b；live/dead试剂盒动物细胞；钙黄绿素/乙啡啶同型二聚物；lolo-1；lo-pro-1；荧光(lucifer)黄；溶酶体蓝色探针(lyso trackerblue)；溶酶体蓝白探针；溶酶体绿色探针；溶酶体红色探针；溶酶体黄色探针；lysosensor蓝； lysosensor绿；lysosensor黄/蓝；mag绿；苏丹红(magdala red)(根皮红b)；mag-fura红； mag-fura-2；mag-fura-5；mag-indo-1；镁绿；镁橙；孔雀石绿；海军蓝；美色纶亮黄素(maxilonbrilliant flavin)10gff；美色纶亮黄素8gff；部花青(merocyanin)；甲氧基香豆素；绿线粒体绿色荧光探针(mitotracker greeu)fm；绿线粒体橙色荧光探针；绿线粒体红色荧光探针；普卡霉素；单溴二胺(monobromobimane)；单溴二胺(mbbr-gsh)；单氯二胺(monochlorobimane)；mps (甲基绿派洛宁二苯乙烯)；nbd；nbd胺；尼罗红(nile red)；硝基苯并噁二唑(nitrobenzoxedidole)；去甲肾上腺素(noradrenaline)；核速红(nuclear fast red)；核黄(nuclear yellow)；nylosanbrilliant lavin e8g；俄勒冈绿(oregon green)；俄勒冈绿488-x；俄勒冈绿500；俄勒冈绿514；太平蓝(pacific blue)；副品红(孚尔根)；pbfi；pe-cy5；pe-cy7；percp；percp-cy5.5；pe
‑ꢀ
德克萨斯红[613红]；根皮红(phloxin)b(麦塔喇红)；phorwite ar；phorwite bkl；phorwite rev； phorwite rpa；膦3r；光致抗蚀剂(photoresist)；藻红蛋白b[pe]；藻红蛋白r[pe]；pkh26(sigma)； pkh67；pmia；pontochrome blue black；popo-1；popo-3；po-pro-1；po-i pro-3；樱草灵
(primuline)；普施安黄(procion yellow)；碘化丙啶(p1)；pympo；芘(pyrene)；派洛宁(pyronine)；派洛宁 b；pyrozal brilliant flavin 7gf；qsy 7；芥奎吖因(quinacrine mustard)；红613[pe-德克萨斯红]；试卤灵(resorufin)；rh414；rhod-2；罗丹明；罗丹明110；罗丹明123；罗丹明5gld；罗丹明6g；罗丹明b；罗丹明b200；碱性玫瑰精(rhodamine b extra)；罗丹明bb；罗丹明bg；罗丹明绿；罗丹明毒伞素(rhodamine phallicidine)；罗丹明鬼笔环肽(phalloidine)；罗丹明红；罗丹明wt；玫瑰红；r-藻蓝蛋白(r-phycocyanine)；r-藻红蛋白(pe)；rsgfp；s65a；s65c；s65l； s65t；深蓝色gfp；sbfi；塞夫隆亮红(sevron brilliant red)2b；塞夫隆亮红4g；塞夫隆亮红 b；塞夫隆橙；塞夫隆黄l；sgbfptm(超发光(super glow)bfp)；sggfp；sggfp(超发光gfp)； sits；sits(樱草灵)；sits(stilbene isothiosulphonic acid)；snafl钙黄绿素；snafl-1；snafl-2； snar钙黄绿素；snarf1；钠绿(sodium green)；spectrumaqua；spectrumgreen；spectrumorange； spectrum red；spq(6-甲氧-n-(3-磺丙基)喹啉铵)；二苯乙烯；磺罗丹明b和c；sulphorhodamienextra；syto 11；syto 12；syto 13；syto 14；syto 15；syto 16；syto 17；syto 18；syto 20； syto 21；syto 22；syto 23；syto 24；syto 25；syto 40；syto 41；syto 42；syto 43；syto 44； syto 45；syto 59；syto 60；syto 61；syto 62；syto 63；syto 64；syto 80；syto 81；syto 82； syto 83；syto 84；syto 85；sytox蓝；sytox绿；sytox橙；四环素(tetracycline)；四甲基罗丹明(tritc)；德克萨斯红tm；德克萨斯红-xtm缀合物；硫代二羰花青(thiadicarbocyanine) (disc3)；噻嗪红r(thiazine red r)；噻唑橙；硫磺素5(thioflavin)；硫磺素s；硫磺素tcn、 thiolyte；thiozole橙；tinopol cbs(calcofluor white)；tmr；to-pro-1；to-pro-3；to-pro-5； toto-1；toto-3；tricolor(pe-cy5)；tritc四甲基罗丹明异硫氰酸酯；正蓝(true blue)；正红 (tru red)；ultralite；荧光素钠(uranine)b；uvitex sfc；wtgfp；ww781；x-罗丹明；xritc；二甲苯橙(xylene organge)；y66f；y66h；y66w；黄色gfp；yfp；yo-pro-1；yo-pro-3；yoyo-1；和yoy0-3。
[0429]
在一个示例中，可检测标记是酶。该酶可以作用于适当的底物以产生可检测的染料。可用于本公开的酶的示例包括但不限于碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。或者或另外地，酶可以是例如萤光素酶。该酶可以通过常规化学方法与抗体连接，也可以与抗体一起作为融合蛋白表达。
[0430]
在本公开中用作可检测标记的放射性同位素在本领域中是众所周知的并且可以括3h、
11
c、
18
f、
35
s、
64
cu、
67
ga、
68
ga、
99
mtc、
111
in、
123
i、
124
i、
125
i和
131
i。可与结合降钙素受体的化合物的羧基、氨基或巯基反应的任何伽马发射放射性材料，例如
99
mtc和
111
in的附着适用于使用伽马闪烁扫描的检测方法。可与一种化合物的羧基、氨基或巯基反应的放射性
11
c、
18
f、
64
cu、
67
ga、
68
ga、
124
i和
131
i化合物的附着适用于使用pet/spect成像的检测方法。
[0431]
检测cxcl10结合蛋白
[0432]
cxcl10结合及其修饰形式
[0433]
根据本文公开内容，对技术人员显而易见的是，本公开的一些cxcl10结合蛋白与全长cxcl10 结合和/或与cxcl10的特定翻译后修饰形式(例如，n-末端截短的cxcl10和/或瓜氨酸化的cxcl10) 结合。用于评估与蛋白质结合的方法是本领域已知的，例如，如scopes(1994)的文献所述。这种方法通常包括固定cxcl10结合蛋白并将其与标记的抗原接触。洗涤以去除非特异性结合蛋白后，检测标记量，从而检测结合抗原。当然，可以对cxcl10结合
蛋白进行标记并固定抗原。也可以使用淘选型测定。或者或另外地，还可以使用表面等离子共振测定。
[0434]
测定亲和力
[0435]
可选地，确定结合蛋白的解离常数(kd)或缔合常数(ka)或平衡常数(kd)。在一个示例中，结合区域(例如抗体或抗原结合片段)的这些常数通过使用表面等离子体共振测定的生物传感器分析来测量。示例性spr方法在us7229619中描述。
[0436]
亲和力测量可以通过抗体反应的标准方法确定，例如免疫测定、表面等离子共振(spr)(rich 和myszka，2000；englebienne，1998)、等温滴定量热法(itc)或本领域已知的其他动力学相互作用测定。
[0437]
确定竞争结合
[0438]
用于确定竞争性抑制本文所述的cxcl10结合蛋白的结合的抗体或其抗原结合片段的测定对于技术人员和/或本文所述的技术人员将是显而易见的。
[0439]
例如，该抗体或其抗原结合片段可缀合至可检测标记，例如荧光标记或放射性标记。然后将标记的抗体和测试cxcl10结合蛋白混合并与cxcl10或其区域或表达其的细胞接触。然后测定标记抗体的水平，并将其与当标记抗体在不存在cxcl10结合蛋白的情况下与cxcl10、区域或细胞接触时测定的水平进行比较。如果与不存在cxcl10结合蛋白的情况相比，在存在测试cxcl10结合蛋白的情况下所标记抗体的水平减少，则认为该cxcl10结合蛋白质竞争性地抑制抗体与cxcl10的结合。
[0440]
可选地，测试cxcl10结合蛋白与抗体的不同标记缀合。这种替代标记允许对测试cxcl10结合蛋白与cxcl10或其区域或细胞的结合水平进行检测。
[0441]
在另一个示例中，在使cxcl10、区域或细胞与抗体接触之前，允许cxcl10结合蛋白与cxcl10 或其区域或表达其的细胞结合。与不存在cxcl10结合蛋白的情况相比，在存在cxcl10结合蛋白的情况下结合抗体的量减少表明该蛋白质竞争性地抑制抗体与cxcl10的结合。还可以使用标记的 cxcl10结合蛋白并首先使抗体与cxcl10结合来进行相互分析。在这种情况下，与不存在抗体时相比，在存在抗体的情况下与cxcl10结合的标记cxcl10结合蛋白的量减少表明cxcl10结合蛋白竞争性地抑制抗体与cxcl10的结合。
[0442]
确定cxcl10的水平
[0443]
如上所讨论的，cxcl10与多种人类疾病有关，包括传染病、中枢神经系统疾病、慢性炎症、免疫功能障碍和癌症。
[0444]
本发明人开发了cxcl10结合蛋白以检测不同形式的蛋白质，即全长或成熟cxcl10、n-末端截短的cxcl10和/或瓜氨酸化的cxcl10。
[0445]
本发明人发现，不同形式的蛋白质以不同水平存在于良性和恶性病症中。
[0446]
因此，本文所述的任何公开的方法包括确定受试者中cxcl10的水平。
[0447]
如本文所用，关于cxcl10的术语“水平”应理解为指蛋白质的功能性水平(即，功能水平)。例如，水平(或“表达水平”)是指编码蛋白质的量度。
[0448]
特别地，发明人已发现测定受试者中活性cxcl10蛋白和总cxcl10蛋白的水平可以区分良性和恶性病症。该过程在本文中被称为活性比率测试(active ratio test，art)。
[0449]
如本文所用，术语“活性”在cxcl10水平的上下文中是指cxcl10的生物活性形式。例如，本公开与活性cxcl10结合的cxcl10结合蛋白是指与全长或成熟(即，n-末端完整)
cxcl10结合，但不与n-末端截短或瓜氨酸化的cxlc10结合的结合蛋白。
[0450]
如本文所用，术语“总”在cxcl10水平的上下文中是指cxcl10的所有形式。例如，本公开与活性cxcl10结合的cxcl10结合蛋白是指与全长或成熟(即，n-末端完整)cxcl10和n-末端截短或瓜氨酸化的cxlc10两者结合的结合蛋白。
[0451]
在一个示例中，确定活性cxcl10和总cxcl10的水平包括确定受试者中活性cxcl10蛋白的量和总cxcl10蛋白的量。
[0452]
如本文所用，关于cxcl10水平的术语“量”将被理解为指蛋白质的数量(即，活性cxcl10蛋白质或总cxcl10蛋白质)。本领域技术人员可以使用各种评估蛋白质数量的方法，并且本领域技术人员将认识到具体值或量将根据所使用的评估方法而变化。很明显，该术语包括绝对值和相对值。例如，该量可以相对于参照物或对照样本。在另一个示例中，该量可以是样本中存在的蛋白质的量的绝对值。
[0453]
发明人惊奇地发现，通过测定受试者中的cxcl10比率可以区分良性和恶性病症。
[0454]
如本文所用，术语“cxcl10比率”是指受试者中活性cxlc10水平与总cxcl10水平的比率。
[0455]
在一个示例中，该方法进一步包括将受试者中的cxcl10比率与至少一个参照物中的cxcl10比率进行比较。
[0456]
在本文所述的任何方法的一个示例中，所述方法包括确定：(a)是否受试者中的cxcl10比率高于参照物中的cxcl10比率；或(b)是否受试者中的cxcl10比率低于参照物中的cxcl10比率。
[0457]
关于cxcl10比率的术语“更高”是指与对照或参照物水平相比，受试者中的比率更大或增加。根据上述内容，将明显的是，cxcl10比率仅需要增加统计学上显着的量，例如，至少约10％、或约 20％、或约30％、或约40％、或约50％，或约60％，或约70％，或约80％，或约90％，或约95％。
[0458]
关于cxcl10比率的术语“更低”是指与对照或参照物水平相比，受试者中的比率降低或减少。根据上述内容，将明显的是，cxcl10比率仅需要减少统计学上显着的量，例如，至少约10％、或约 20％、或约30％、或约40％、或约50％，或约60％，或约70％，或约80％，或约90％，或约95％。
[0459]
测定cxcl10水平的方法
[0460]
测定cxcl10蛋白水平的方法对于本领域技术人员来说将是显而易见的和/或在本文中描述。例如，方法包括免疫组织化学、免疫荧光、免疫印迹、蛋白质印迹、斑点印迹、酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)、酶免疫测定、荧光共振能量转移(fret)、基质辅助激光解吸/电离飞行时间 (maldi-tof)、电喷雾电离(esi)、质谱分析法(包括串联质谱，例如lc ms/ms)、生物传感器技术、倏逝光纤技术或蛋白质芯片技术。例如，合适的测定是半定量测定和/或定量测定。
[0461]
在一个实施例中，用于测定样本中cxcl10水平的方法包括：使来自受试者的生物样本和与 cxcl10多肽或蛋白质特异性结合的cxcl10结合蛋白(如本文所述)接触一段时间，然后在足以在结合蛋白和多肽或蛋白质之间形成复合物的条件下，检测该复合物。例如，在本文所述的任何方法中，测量活性cxcl10的水平和总cxcl10的水平并且确定活性cxcl10与总cxcl10之间的比率。
[0462]
酶联免疫吸附测定(elisa)和荧光联免疫吸附测定(flisa)
[0463]
标准固相elisa或flisa格式在测定各种样本中的蛋白质浓度时特别有用。在一种形式中，这种测定涉及将生物样本固定在固体基质上，例如聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔或试纸、膜或玻璃支持物 (例如载玻片)上。
[0464]
使与cxcl10多肽内的标记特异性结合的抗体与固定的生物样本直接接触，并与所述样本中存在的任何其靶蛋白形成直接键合。在flisa或酶(例如辣根过氧化物酶(hrp)、碱性磷酸酶(ap)或β-半乳糖苷酶)的情况下，该抗体通常用可检测报告分子标记，例如荧光标记(例如fitc或德克萨斯红)或荧光半导体纳米晶体(如us 6，306，610中所述)来标记，或者在elisa的情况下，可使用与第一抗体结合的第二标记抗体。在洗涤以去除任何未结合的抗体之后，在荧光标记的情况下或通过添加底物，例如过氧化氢、tmb或甲苯胺，或5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷(x-gal)，在酶标记的情况下直接检测该标记。此类基于elisa或flisa的系统适用于通过以下方式定量样本中蛋白质的量：根据已知量的与抗体结合的蛋白质标准品来校准检测系统，该样本例如为分离的和/ 或重组的cxcl10多肽或其免疫原性片段或其表位。在另一个示例中，elisa通过将与cxcl10多肽内的疾病或病症标志物特异性结合的抗体或配体固定在固体基质上组成，上述固体基质例如为膜、聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔、聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔量油尺或玻璃支架。然后使样本与所述抗体发生物理关系，并且使样本内的所述标志物被结合或“捕获”。然后使用标记的抗体来检测结合的蛋白质。或者，可以使用与第二(检测)抗体结合的第三标记抗体。
[0465]
在一个示例中，固定的抗体是多克隆抗体。
[0466]
对技术人员来说显而易见的是，本文所述的测定形式适用于高通量形式，例如筛选过程的自动化或如mendoza等人(1999)所述的微阵列形式。此外，上述测定的变化，例如竞争性elisa，对于本领域技术人员将是显而易见的。
[0467]
在一个示例中，测定形式是微流体装置，例如，微流体芯片或基于液滴的微流体装置。微流控芯片(例如，微机电系统(mems)装置)的尺寸范围通常从几平方毫米到几平方厘米。这些微流控芯片设计用于处理或操纵少量流体，以执行生物或医学处理或测试。流体可以在单个微流体芯片中移动、混合或处理。
[0468]
在另一个示例中，测定形式是试纸，例如聚碳酸酯试纸。
[0469]
simoa测定
[0470]
可用于本发明的另一种测定是单分子阵列(simoa)测定，其在kuhle等人(2016)和gisslen 等人(2016)的文献中均有描述。
[0471]
蛋白质印迹
[0472]
在另一个示例中，蛋白质印迹用于测定样本中cxcl10多肽内的标志物水平。在这样的测定中，使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)等本领域已知并例如scopes(1994)中描述的技术，从样本中分离蛋白质。然后使用本领域已知的方法，例如电转移，将分离的蛋白质转移至固体支持物，例如膜(例如，pvdf膜)。然后用与cxcl10多肽内的标记特异性结合的标记抗体或配体封闭并探测该膜。或者，使用标记的二抗甚至三抗或配体来检测特异性一抗的结合。然后使用适合所用标记的测定来确定标记水平。
[0473]
合适的测定对于熟练的技术人员将是显而易见的并且包括例如光密度测定。在一个示例中，使用本领域已知的方法将蛋白质条带或斑点的强度相对于加载在sds-page凝胶
上的蛋白质总量进行标准化。或者，检测到的标志物水平相对于对照/参照蛋白质的水平进行标准化。此类对照蛋白是本领域已知的，并且包括例如肌动蛋白、甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh)、β2微球蛋白、羟甲基胆烷合酶、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1(hprt)、核糖体蛋白l13c、琥珀酸脱氢酶复合物亚基a和tata 盒结合蛋白(tbp)。
[0474]
放射免疫测定
[0475]
或者，使用放射免疫测定法(ria)检测cxcl10的水平。该测定的基本原理是使用放射性标记的抗体或抗原来检测抗体-抗原相互作用。与cxcl10多肽内的标志物特异性结合的抗体或配体与固体支持物结合，样本与所述抗体直接接触。为了检测结合抗原的水平，分离和/或重组形式的抗原被放射性标记并与同一抗体接触。洗涤后，检测结合后的放射性水平。由于生物样本中的任何抗原都会抑制放射性标记抗原的结合，因此检测到的放射性水平与样本中的抗原水平成反比。这种测定可以通过使用增加已知浓度的分离抗原的标准曲线来定量。
[0476]
如对技术人员显而易见的，可以修改这种测定以使用任何报告分子，例如酶或荧光分子，来代替放射性标记。
[0477]
生物传感器或光学免疫传感器系统
[0478]
或者，使用生物传感器或光学免疫传感器系统测定样本中cxcl10的水平。一般而言，光学生物传感器是一种利用光学原理将配体或抗体与靶多肽的结合定量地转化为电信号的装置。这些系统可以分为四大类：反射技术；表面等离子共振；光纤技术和集成光学器件。反射技术包括椭圆偏光法、多重积分反射光谱法和荧光毛细管填充装置。光纤技术包括倏逝场荧光、光纤毛细管和光纤荧光传感器。集成光学器件包括平面倏逝场荧光、输入分级耦合器免疫传感器、mach-zehnder干涉仪、 hartman干涉仪和差分干涉仪传感器。这些光学免疫传感器的示例一般在robins(1991)提供的文献中描述。例如在美国专利中可以找到这些装置的更具体的描述。例如第4，810，658号；4，978， 503；5，186，897；和brady等人(1987)公开的专利。
[0479]
生物样本
[0480]
如对技术人员显而易见的，生物样本的类型和大小将取决于所使用的检测手段。例如，基于蛋白质的测定需要足够的细胞来为基于抗原的测定提供足够的蛋白质。
[0481]
如本文所用，术语“样本”或“生物样本”是指从受试者获得的任何类型的合适材料。该术语包括临床样本(例如，宫颈或宫颈阴道拭子)、生物体液(例如，宫颈液、阴道分泌物、血浆、腹水)、组织样本、活细胞，还包括由其衍生的培养中细胞、细胞上清液、细胞裂解物。样本可以直接从源头上获得或经过至少一步(部分)纯化后使用。对于本领域技术人员显而易见的是，样本可以在不干扰本公开方法的任何介质中制备。通常，样本包含细胞或组织和/或是包含细胞或组织的水溶液或生物流体。本领域技术人员将了解选择和预处理方法。预处理可以包括例如稀释粘性流体。样本的处理可能涉及过滤、蒸馏、分离、浓缩。
[0482]
在一个示例中，生物样本先前已经从受试者中获得。因此，在一个示例中，根据任一实施方式的如本文所述的方法另外包括提供生物样本。
[0483]
在一个示例中，可以在多于一个时间点从受试者收集生物样本，以例如监测恶性疾病的进展，监测复发，和/或评估治疗方案的功效。在一个示例中，生物样本可以在对象的恶性病症治疗之前、期间和/或之后从受试者收集。可以每周、每两周、每月、每两个月、每三
个月、每四个月、每五个月或每六个月收集样本以监测恶性病症的进展或评估治疗方案的功效。
[0484]
在一个示例中，根据任何实施方案在此描述的方法是使用来自样本的提取物进行的，例如蛋白质。
[0485]
参考样本
[0486]
如从前面的描述中显而易见的，本公开的一些测定可以利用合适的参考样本或对照进行量化。
[0487]
用于本公开的方法中的合适的参考样本对于技术人员将是显而易见的和/或在本文中描述。例如，参考可以是内部参考(即，来自同一受试者)、来自正常个体或已建立的数据集(例如，与年龄、样本类型和/或周期阶段匹配)。
[0488]
在一个示例中，参考是内参或样本。例如，参考是自体参考物。在一个示例中，内参是在分析样本的同时从受试者获得的。在另一个示例中，内参是在较早的时间点从受试者获得的，作为正在分析的样本。
[0489]
如本文所用，术语“正常个体”应理解为基于他们不具有恶性和/或良性病症或他们不被怀疑具有此类病症而选择的对象。例如，正常个体是健康个体。
[0490]
在一个示例中，参考是已建立的数据集。适用于本公开的已建立的数据集对技术人员来说将是显而易见的，并且包括例如：
[0491]
·
来自正常受试者或按年龄和样本类型匹配的正常受试者群体的数据集；
[0492]
·
来自与年龄、样本类型和/或疾病/状况匹配的另一受试者或受试者群体的数据集；
[0493]
·
包含体外细胞的数据集，其中所述细胞已被处理以诱导cxcl10表达；和
[0494]
·
包含体外子宫内膜上皮细胞的数据集，其中细胞已被处理以抑制cxcl10表达。
[0495]
在一个示例中，参考不包括在测定中。取而代之的是，从先前生成的已建立数据集中得出合适的参考。然后将来自处理、分析和/或测定测试样本的数据与从样本中获得的数据进行比较。
[0496]
检测和/或诊断恶性病症
[0497]
如本文所公开，本公开的发明人已经证明了cxcl10在检测和/或诊断恶性病症中的作用。对于本领域技术人员显而易见的是，本文公开的方法可用于区分受试者的恶性病症与良性病症。例如，本公开的方法可用作用于诊断受试者的恶性病症的筛选测试。
[0498]
因此，本公开提供了例如检测和/或诊断受试者的恶性病症的方法，该方法包括：
[0499]
(i)确定所述受试者的活性cxcl10水平和受试者的总cxcl10水平；以及
[0500]
(ii)确定所述受试者中活性cxlc10与总cxcl10之间的cxcl10比率。
[0501]
如本文所用，术语“检测(detect/detecting)”或“诊断(diagnosis/diagnosing)”是指识别受试者中的恶性病症。
[0502]
如本文所用，术语“恶性病症”是指以不受控制的方式生长、侵入正常组织并且经常在远离起源组织的部位转移和生长的病症或疾病。在一个示例中，恶性疾病或病症是癌症或与癌症有关。本领域技术人员将理解癌症可以从身体中的几乎任何组织产生，并且如本文所用，该术语涵盖所有形式的疾病，包括例如癌、肉瘤、淋巴瘤和白血病(即，实体和非实体形式的癌症)。
[0503]
在一个示例中，本公开提供了一种区分恶性病症与良性病症的方法。
[0504]
如本文所用，术语“良性病症”是指缺乏侵入邻近组织能力的细胞团。
[0505]
在一个示例中，本公开提供了一种区分癌前病变与良性病症的方法。
[0506]
如本文所用，术语“癌前病变”是指已异常生长的细胞团，导致它们的大小、形状或外观看起来与正常细胞不同，但它们尚未癌变或呈恶性。在一个示例中，癌前病变是p53癌前病变。如本文所用，术语p53癌前病变是指具有p53基因突变的细胞。
[0507]
在一个示例中，受试者患有恶性病症(即癌症)。例如，癌症是实体瘤，例如肉瘤或癌。例如，癌是前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌或胃癌。例如，受试者患有卵巢癌。在一个示例中，癌症是非实体瘤，例如白血病或淋巴瘤。在一个示例中，受试者患有0期癌症。例如，癌是原位癌。在另一个示例中，受试者患有i、ii或iii期癌症。例如，癌已经扩散到起源器官以外的附近淋巴结和/或与原发肿瘤位置相邻的组织或器官。在一个示例中，受试者患有 iv期癌症。例如，癌症已经扩散到远处的组织和/或器官。
[0508]
在一个示例中，受试者尚未接受针对恶性病症的治疗。例如，受试者未接受过治疗。
[0509]
在一个示例中，受试者正在接受针对恶性病症的治疗。在一个示例中，受试者已经接受了针对恶性病症的治疗。用于治疗恶性病症的合适疗法对于技术人员将是显而易见的和/或在本文中描述。例如，治疗包括手术、化学疗法、放射疗法、靶向药物疗法、免疫疗法或其组合。
[0510]
卵巢癌
[0511]
在本文所述的任何方法的一个示例中，该方法包括检测和/或诊断受试者的卵巢癌。例如，受试者患有卵巢癌。
[0512]
如本文所用，术语“卵巢癌”是指在卵巢中开始的任何癌性生长。
[0513]
在一个示例中，该方法包括一种将受试者的卵巢癌与良性病症区分开来的方法。
[0514]
对技术人员显而易见的是，本文所述的方法适用于检测和/或诊断卵巢癌的所有亚型，包括例如上皮、子宫内膜样肿瘤、生殖细胞肿瘤、透明细胞和粘液腺癌。
[0515]
在一个示例中，本公开提供了一种用于检测和/或诊断受试者中的上皮性卵巢癌的方法。
[0516]
本领域技术人员将理解卵巢癌使用国际妇产科联合会(figo)分期系统进行分期，如下表2所述。
[0517]
在本文所述的任何方法的一个示例中，本公开提供了一种与癌症的分期无关的用于检测和/或诊断受试者中的卵巢癌的方法。
[0518]
在本文所述的任何方法的一个示例中，本公开提供了一种用于检测和/或诊断受试者的i期卵巢癌的方法。
[0519]
本领域技术人员还将理解卵巢癌是基于癌症等级分类的。例如，1级肿瘤具有良好分化的细胞； 2级肿瘤中度高分化；3级肿瘤分化差。
[0520]
在本文所述的任何方法的一个示例中，本公开提供了一种与癌症的等级无关的用于检测和/或诊断受试者中的卵巢癌的方法。
[0521]
在另一个示例中，卵巢癌是浆液性癌、粘液性癌、子宫内膜样癌、透明细胞癌、gct或其混合物癌、卵巢癌。在一个示例中，卵巢癌是浆液性癌。
[0522]
在一个示例中，受试者有患卵巢癌的风险。
[0523]
如本文所用，“有风险”患卵巢癌的受试者可能患有或可能不患有可检测的卵巢癌或卵巢癌的症状。“有风险”表示受试者具有一种或多种风险因素，其是与疾病或病症的发展相关的可测量参数，如本领域已知和/或本文所述。例如，受试者具有p53基因突变。
[0524]
表2：卵巢癌的figo阶段
[0525][0526]
风险因素包括，例如：
[0527]
·
卵巢癌和/或乳腺癌家族史；
[0528]
·
生育史，即35岁以后生育或从未生育与较高风险相关；
[0529]
·
乳腺癌病史；
[0530]
·
激素疗法，例如绝经后的激素替代疗法(hrt)与风险增加有关；和
[0531]
·
肥胖，例如体重指数大于30。
[0532]
如果受试者患卵巢癌的风险高于对照人群，则该受试者处于风险之中。对照人群可包括从未患有卵巢癌或具有卵巢癌家族史的普通人群(例如，与年龄、性别、种族和/ 或民族匹配)中随机选择的一名或多名受试者。如果发现与卵巢癌相关的“风险因素”与该对象相关，则该对象可被视为处于风险中。例如通过对受试者群体的统计或流行病学研究，风险因素可以包括与给定病症相关的任何活动、特征、事件或特性。因此，即使确定潜在风险因素的研究并未具体包括受试者，受试者也可以被归类为处于风险之中。
[0533]
在一个示例中，本公开的方法在卵巢癌症状发作之前或之后进行。卵巢癌的症状对技术人员来说是显而易见的并且包括，例如：
[0534]
·
腹部肿大或肿胀；
[0535]
·
腹部饱胀和疼痛；
[0536]
·
下腹部疼痛；
[0537]
·
吃得很少后感到饱；
[0538]
·
疲倦；
[0539]
·
肠道或膀胱习惯的改变；
[0540]
·
衣服不合身；
[0541]
·
腿部肿胀；
[0542]
·
呼吸急促；
[0543]
·
阴道出血；
[0544]
·
月经周期异常；
[0545]
·
体重减轻或增加；和
[0546]
·
不明原因背痛。
[0547]
本发明人还发现本公开的方法可以与其他生物标志物的检测相结合。
[0548]
在一个示例中，本公开的方法进一步包括测定受试者中二肽基肽酶-4(dpp4)和/ 或癌抗原125(ca-125)的水平。在一个示例中，该方法还包括测定dpp4的水平。在另一个示例中，该方法还包括测定ca-125的水平。在又一个示例中，该方法还包括测定dpp4和ca-125的水平。
[0549]
测量dpp4和/或ca-125的方法是本领域已知的(参见，例如，us 5，356，817， saho等人，2019；scholler等人，2007和vento等人，1997)和/或在本文中描述。
[0550]
在一个示例中，该方法还包括：测定粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、白细胞介素6(il-6)、肿瘤坏死因子受体ii(tnf-rii)、人附睾蛋白4(he4)和白细胞介素8(il-8)中的一种或多种或全部的水平。
[0551]
在一个示例中，该方法还包括测定gm-csf的水平。
[0552]
在一个示例中，该方法还包括测定il-6的水平。
[0553]
在一个示例中，该方法还包括测定tnf-rii的水平。
[0554]
在一个示例中，该方法还包括测定he4的水平。
[0555]
在一个示例中，该方法还包括测定il-8的水平。
[0556]
在一个示例中，该方法进一步包括确定gm-csf、il-6、tnf-rii、he4和il-8的水平。
[0557]
在本文所述的任何方法的一个示例中，该方法进一步包括确定dpp4、gm-csf、il-6、 tnf-rii、he4和il-8的水平。
[0558]
在本文所述的任何方法的一个示例中，该方法进一步包括确定ca-125、gm-csf、 il-6、tnf-rii、he4和il-8的水平。
[0559]
在本文所述的任何方法的一个示例中，该方法进一步包括确定dpp4、ca-125、 gm-csf、il-6、tnf-rii、he4和il-8的水平。
[0560]
治疗恶性病症的方法
[0561]
在一个示例中，本发明提供了一种治疗受试者的恶性病症的方法，该方法包括执行如本文所述的方法和治疗受试者的恶性病症。
[0562]
如本文所用，术语“治疗(treating/treat/treatment)包括手术切除全部或部分癌症或给予足以减轻或消除恶性病症中至少一种症状的治疗有效量的化合物/分子/放射
线。例如，用于治疗用途的“有效量”是提供临床上显着减轻疾病症状而没有过度不良副作用所需的化合物的量。可以使用诸如剂量递增研究之类的技术来确定任何个体情况下的适当“有效量”。化合物的“有效量”是有效实现期望的药理作用或治疗改善而没有过度不良副作用的量。应理解，“有效量”或“治疗有效量”可因受试者的年龄、体重、受试者的一般状况、所治疗的病症、正在治疗的病症的严重程度，以及开药医生的判断而变化。
[0563]
在一个示例中，治疗包括手术、化学疗法、放射疗法、靶向药物疗法或其组合。
[0564]
在一个示例中，治疗包括手术。例如，手术是减瘤手术。
[0565]
在另一个示例中，治疗包括化学疗法。示例性化疗剂包括，例如，卡铂、阿糖胞苷、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、多柔比星、多西他赛、多柔比星、厄洛替尼、依托泊苷、氟尿嘧啶、氟达拉滨、伊达比星、伊立替康、脂质体多柔比星、甲氨蝶呤、米托蒽醌、紫杉醇、拓扑替康、长春新碱和长春花碱。
[0566]
在一个示例中，治疗包括放射疗法。例如，放射疗法选自以下所组成的组：外束放射疗法(ebrt)、三维适形放射疗法(3d-crt)、强度调制放射疗法(imrt)、体积调制弧疗法(vmat)、适形质子束放射治疗、立体定向放射外科(srs)/立体定向放射治疗 (srt)、图像引导放射治疗(igrt)、近距离放射治疗(内部放射治疗)和全脑和脊髓放射疗法(颅脊椎放射治疗)。
[0567]
在一个示例中，治疗包括靶向药物治疗。例如，靶向药物疗法是治疗性抗体。示例性治疗性抗体是技术人员已知的并且包括但不限于：阿巴伏单抗(abagovomab)、阿昔单抗(abciximab)、阿比珠单抗(abituzumab)、阿布里单抗(abrilumab)、阿卡单抗 (actoxumab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿达卡莫单抗(adecatumumab)、阿杜单抗 (aducanumab)、阿非莫单抗(afelimomab)、阿芙土珠单抗(afutuzumab)、阿拉西马单抗(alacizumab pegol)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿妥莫单抗(alirocumab)、戊妥莫单抗(altumomab pentetate)、阿马昔单抗(amatuximab)、麻安莫单抗(anatumomabmafenatox)、安替单抗瑞伐坦(anetumab ravtansine)、阿尼弗洛姆单抗(anifrolumab)、安鲁单抗(anrukinzumab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿西莫单抗(arcitumomab)、阿斯库昔单抗(ascrinvacumab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、阿特珠单抗 (atezolizumab)、安妥明单抗(atinumab)、阿特利单抗(也称为托珠单抗)(atlizumab (tocilizumab)、阿托木单抗(atorolimumab)、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、巴维昔单抗(bavituximab)、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝格洛姆单抗(begelomab)、贝利木单抗(belimumab)、贝拉珠单抗(benralizumab)、柏替木单抗(bertilimumab)、贝索单抗(besilesomab)、贝伐单抗(bevacizumab)、贝佐洛单抗(bezlotoxumab)、比西单抗(biciromab)、双马单抗(bimagrumab)、贝美珠单抗(bimekizumab)、莫比瓦妥单抗(bivatuzumab mertansine)、博纳吐单抗 (blinatumomab)、布洛唑单抗(blosozumab)、博科齐单抗(bococizumab)、维本妥昔单抗(brentuxim abvedotin)、布里亚明单抗(briakinumab)、溴达拉单抗(brodalumab)、溴化丙单抗(brolucizumab)、支舒巴单抗(brontictuzumab)、康纳单抗(canakinumab)、莫坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)、坎妥单抗瑞伐坦(cantuzumab ravtansine)、卡普利单抗(caplacizumab)、卡罗单抗喷地肽偶联物(capromab pendetide)、卡伦单抗(carlumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、cbr96-阿霉素免疫偶联物 (cbr96-doxorubicin immunoconjugate)、西利珠单抗(cedelizumab)、
(isatuximab)、伊托珠单抗(itolizumab)、衣克珠单抗(ixekizumab)、克利昔单抗(keliximab)、拉托唑单抗(labetuzumab)、兰布利单抗(lambrolizumab)、拉帕单抗(lampalizumab)、利勃珠单抗(lebrikizumab)、利马索单抗(lemalesomab)、仑齐鲁单抗(lenzilumab)、勒德利木单抗(lerdelimumab)、莱卡单抗(lexatumumab)、利比维单抗(libivirumab)、维利伐妥单抗(lifastuzumabvedotin)、利格珠单抗(ligelizumab)、利洛单抗-赛塔坦偶联物(lilotomabsatetraxetan)、林妥珠单抗(lintuzumab)、利鲁单抗(lirilumab)、洛德昔单抗(lodelcizumab)、洛克韦单抗(lokivetmab)、莫洛伐妥单抗(lorvotuzumabmertansine)、卢卡珠单抗(lucatumumab)、peg化的卢利珠单抗(lulizumabpegol)、鲁米昔单抗(lumiliximab)、鲁曲单抗(lumretuzumab)、马塔单抗(mapatumumab)、马妥昔单抗(margetuximab)、马司莫单抗(maslimomab)、马妥单抗(matuzumab)、马维里单抗(mavrilimumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、迈他珠单抗(metelimumab)、米拉珠单抗(milatuzumab)、明妥莫单抗(minretumomab)、米维妥昔单抗-索拉素偶联物(mirvetuximabsoravtansine)、米托单抗(mitumomab)、莫加利单抗(mogamulizumab)、莫洛莫单抗(morolimumab)、莫他珠单抗(motavizumab)、莫昔单抗-帕多毒素偶联物(moxetumomabpasudotox)、穆罗莫纳-cd3(muromonab-cd3)、塔非那托克-塔芬毒素偶联物(nacolomabtafenatox)、纳霉单抗(namilumab)、萘妥莫单抗-衣塔芬毒素偶联物(naptumomabestafenatox)、纳妥单抗(narnatumab)、那他珠单抗(natalizumab)、奈巴库单抗(nebacumab)、奈米单抗(necitumumab)、奈莫珠单抗(nemolizumab)、奈利莫单抗(nerelimomab)、奈西伐单抗(nesvacumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、尼沃单抗(nivolumab)、巯诺莫单抗-美培坦偶联物(nofetumomabmerpentan)、奥比妥昔单抗(obiltoxaximab)、奥匹妥珠单抗(obinutuzumab)、奥卡鲁单抗(ocaratuzumab)、奥克里昔单抗(ocrelizumab)、奥杜莫单抗(odulimomab)、阿法单抗(ofatumumab)、奥拉他单抗(olaratumab)、奥昔单抗(olokizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、阿那妥单抗(onartuzumab)、恩妥昔单抗(ontuxizumab)、阿昔单抗(opicinumab)、阿曲单抗-莫那毒素偶联物(oportuzumabmonatox)、奥戈伏单抗(oregovomab)、奥替单抗(orticumab)、奥立昔单抗(otelixizumab)、奥特鲁单抗(otlertuzumab)、奥索单抗(oxelumab)、奥扎尼单抗(ozanezumab)、奥索利单抗(ozoralizumab)、帕吉巴昔单抗(pagibaximab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、潘科曼单抗(pankomab)、泛巴单抗(panobacumab)、帕撒单抗(parsatuzumab)、帕昔单抗(pascolizumab)、帕索妥昔单抗(pasotuxizumab)、帕替利单抗(pateclizumab)、帕特利单抗(patritumab)、彭布利单抗(pembrolizumab)、培马单抗(pemtumomab)、哌拉单抗(perakizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、培昔单抗(pexelizumab)、匹利珠单抗(pidilizumab)、维匹那妥单抗(pinatuzumabvedotin)、品妥莫单抗(pintumomab)、普鲁单抗(placulumab)、维波达单抗(polatuzumabvedotin)、庞尼泽单抗(ponezumab)、普利昔单抗(priliximab)、普罗昔单抗(pritoxaximab)、普鲁米单抗(pritumumab)、奎珠单抗(quilizumab)、拉托单抗(racotumomab)、拉德鲁单抗(radretumab)、拉维夫单抗(rafivirumab)、拉潘昔单抗(ralpancizumab)、拉莫鲁单抗(ramucirumab)、雷尼珠单抗(ranibizumab)、拉克昔单抗(raxibacumab)、瑞伐珠单抗(refanezumab)、瑞伐单抗(regavirumab)、利昔单抗(reslizumab)、利妥珠单抗(rilotumumab)、利努单抗(rinucumab)、利妥昔单抗
(rituximab)、罗巴单抗 (robatumumab)、罗乐单抗(roledumab)、罗莫索单抗(romosozumab)、罗他珠单抗 (rontalizumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)、鲁普单抗(ruplizumab)、妥珠单抗
‑ꢀ
格维他偶联物(sacituzumab govitecan)、沙马利单抗(samalizumab)、沙利鲁单抗 (sarilumab)、沙妥单抗-喷地肽偶联物(satumomab pendetide)、塞库单抗 (secukinumab)、塞巴坦单抗(seribantumab)、塞妥昔单抗(setoxaximab)、赛韦单抗(sevirumab)、西布曲单抗(sibrotuzumab)、西伐单抗(sifalimumab)、西妥昔单抗(siltuximab)、西妥珠单抗(simtuzumab)、西普利单抗(siplizumab)、西鲁库单抗(sirukumab)、维索菲妥单抗(sofituzumab vedotin)、索冷珠单抗(solanezumab)、索利单抗(solitomab)、索普昔单抗(sonepcizumab)、索妥单抗(sontuzumab)、丝塔单抗(stamulumab)、舒乐单抗(sulesomab)、苏维珠单抗(suvizumab)、他巴单抗 (tabalumab)、塔卡珠单抗-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸偶联物 (tacatuzumab tetraxetan)、塔多珠单抗(tadocizumab)、塔利单抗(talizumab)、坦纳单抗(tanezumab)、普利妥单抗-帕普毒素偶联物(taplitumomab paptox)、塔雷克斯顿单抗(tarextumab)、替非珠单抗(tefibazumab)、阿替莫单抗-阿利毒素偶联物 (telimomab aritox)、替纳单抗(tenatumomab)、替尼昔单抗(teneliximab)、替普珠单抗(teplizumab)、四丙珠单抗(teprotumumab)、司他洛单抗(tesidolumab)、替妥洛明单抗(tetulomab)、替昔单抗(ticilimumab)、替加妥单抗(tigatuzumab)、替拉珠单抗(tildrakizumab)、塔西单抗(tocilizumab)、托拉珠单抗(toralizumab)、托沙单抗(tosatoxumab)、托西单抗(tositumomab)、托维单抗(tovetumab)、曲洛单抗(tralokinumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、曲利单抗(tregalizumab)、曲美单抗(tremelimumab)、特伐单抗(trevogrumab)、图卡珠单抗-西莫白介素偶联物 (tucotuzumab celmoleukin)、妥韦单抗(tuvirumab)、乌布妥昔单抗(ublituximab)、优隆单抗(ulocuplumab)、乌洛单抗(urelumab)、乌索单抗(urtoxazumab)、乌司他单抗(ustekinumab)、伐他昔单抗-塔利素偶联物(vadastuximab talirine)、维凡多鲁单抗(vandortuzumab vedotin)、范蒂姆单抗(vantictumab)、维库珠单抗 (vanucizumab)、伐昔单抗(vapaliximab)、伐利单抗(varlilumab)、伐他珠单抗 (vatelizumab)、维多珠单抗(vedolizumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、维帕莫单抗(vepalimomab)、维森单抗(vesencumab)、维西珠单抗(visilizumab)、伏罗昔单抗(volociximab)、沃塞妥单抗-马伏毒素偶联物(vorsetuzumab mafodotin)、伏妥单抗(votumumab)、扎鲁单抗(zalutumumab)、扎诺米单抗(zanolimumab)、扎妥昔单抗 (zatuximab)、齐拉明单抗(ziralimumab)、和阿佐莫单抗-阿利毒素偶联物(zolimomabaritox)。
[0568]
在一个示例中，治疗包括免疫疗法。例如，免疫疗法选自检查点抑制剂、溶瘤病毒疗法、t细胞疗法和癌症疫苗。
[0569]
在一个示例中，免疫疗法是检查点抑制剂。合适的检查点抑制剂包括，例如， ipilimumabnivolumabpembrolizumab atezol i zumabavelumabdurvalumab
[0570]
在一个示例中，免疫疗法是溶瘤病毒疗法。例如，溶瘤病毒疗法是talimogenelaherparepvec或t-vec。
[0571]
在一个示例中，免疫疗法是t细胞疗法。例如，t细胞疗法就是car t细胞疗法。
[0572]
在一个示例中，免疫疗法是癌症疫苗。
[0573]
监测肿瘤负担、进展、复发和消退
[0574]
对技术人员显而易见的是，本公开还提供了在患有恶性病症的受试者中监测肿瘤负荷、监测进展、监测复发和/或确定肿瘤消退的方法，该方法包括：(i)确定水平受试者的活性cxcl10和受试者的总cxcl10水平；和(ii)确定受试者中活性cxlc10与总 cxcl10之间的cxcl10比率。
[0575]
如本文所用，术语“监测”可包括确定预后、对药物治疗的反应、评估正在进行的药物治疗、预测结果、确定对治疗的反应(包括并发症的诊断)、肿瘤体积的进展，或选择最有可能从治疗中受益的患者。
[0576]
如本文所用，术语“肿瘤负荷”是指肿瘤细胞的体积，不包括其他变化，例如炎症、坏死或水肿等。
[0577]
如本文所用，术语“进展”是指肿瘤的持续生长和侵袭性。
[0578]
如本文所用，术语“消退”是指肿瘤大小或体积的减小。
[0579]
如本文所用，术语“复发”是指在不能检测到恶性病症的一段时间后已经复发或复发的恶性病症。
[0580]
在一个示例中，在患有恶性病症的受试者中监测肿瘤负荷、监测进展、监测复发和/或确定肿瘤消退的方法包括在一个或多个时间点测定受试者中的cxcl10比率。例如， mirna的表达水平在1、或2、或3、或4、或5、或6、或7、或8、或9、或10个时间点处测定。
[0581]
在一个示例中，在治疗前、治疗期间和/或治疗后从受试者获得的至少一种生物样本中测定cxcl10比率。例如，cxcl10比率在治疗前的一个或多个时间点测定。在另一个示例中，cxcl10比率在治疗期间的一个或多个时间点测定。在又一个示例中，cxcl10 比率在治疗后的一个或多个时间点测定。在另一个示例中，cxcl10比率在治疗前和治疗期间测定。在又一个示例中，cxcl10比率在治疗前和治疗后测定。在另一个示例中， cxcl10比率在治疗期间和治疗后测定。在又一个示例中，cxcl10比率在治疗前和治疗后测定。
[0582]
在一个示例中，该方法包括将受试者在第一时间点的cxcl10比率与受试者在随后时间点的cxcl10比率进行比较。
[0583]
从本公开内容中技术人员显而易见的是，提及第一个和随后的时间点不是提及定义的或特定的时间点并且仅用于比较的目的。第一、第二(和任何后续)时间点可以被希望监测到受试者的恶性病症的任何时间段分开。本公开的监测方法可以利用在另外的时间点的另外的样本(例如，除了第一和第二样本之外的在第三时间点的第三样本)。
[0584]
如对技术人员显而易见的，在疾病过程中监测本公开的cxcl10比率的能力将有助于监测肿瘤负荷和疾病进展。
[0585]
对技术人员来说显而易见的是，监测对象中的肿瘤负荷和疾病进展的方法将可用于确定受试者中的肿瘤消退和/或复发。
[0586]
组合和试剂盒
[0587]
本公开提供了用于检测和/或诊断受试者的恶性病症的组合或试剂盒。本公开还提供了用于监测肿瘤负荷、肿瘤进展和/或肿瘤消退的组合或试剂盒。本发明的组合或试剂盒将优选包含本文所述的一种或多种或两种cxcl10结合蛋白。任选地，组合或试剂盒包括用于本文所述方法中的说明书。
[0588]
在一个示例中，组合或试剂盒包含参考样本。
[0589]
在一个示例中，本文所述的组合或试剂盒用于离体分析。在一个示例中，该试剂盒适用于全血、血浆、宫颈阴道(cvs)拭子和/或血清样本。
[0590]
在一个示例中，本文所述的组合或试剂盒适用于高通量筛选。术语“高通量筛选”是指可用于一次性测试或评估多个样本并可以减少测试多个样本的时间的筛选方法。在一个示例中，该方法适用于一次性测试或评估至少5个、至少10个、至少20个、至少 30个、至少50个、至少70个、至少90个、至少150个、至少200个、至少300个样本。这种高通量筛选方法可以快速分析多个样本，例如在至少30分钟内、至少1小时内、至少2小时内、至少3小时内、至少4小时内、至少5小时内、至少6小时内、至少7小时内、至少8小时内、至少9小时内或至少10小时内分析多个样本。高通量筛选还可能涉及使用液体处理装置。在一个示例中，高通量分析可以是自动化的。
[0591]
本公开包括以下非限制性示例。
[0592]
示例
[0593]
示例1：材料和方法
[0594]
试剂
[0595]
nunc-immuno microwell 96孔固体板购自sigmaaldrich(美国)。tmb色原溶液来自thermofisher(美国)。重组人cxcl10蛋白(用于免疫和测定标准)来自genscript (中国香港)(seq id no：2)。mimotopes(澳大利亚)合成了包含cxcl10的活性或截短的 n-末端的短肽。生物素(a型)快速偶联试剂盒、抗ip-10抗体、链霉亲和素过氧化物酶、抗人ip-10elisa试剂盒、人二肽基肽酶iv elisa试剂盒和活性肽基精氨酸脱亚胺酶(pad)鸡尾酒来自abcam(英国)。所有其他试剂均为分析等级。
[0596]
临床样本
[0597]
临床样本取自存储在卵巢癌研究基金会组织库中的档案样本，这些样本是从2007 年至2014年期间接受疑似妇科恶性肿瘤手术的女性中前瞻性收集的。所有样本均来自未接受过手术治疗的麻醉、未接受过化疗的患者。
[0598]
肿瘤类型、分期和分级、术前ca125测量值、年龄、绝经状态、先前存在的状况和任何先前的恶性肿瘤病史的组织学评估来自去识别的患者医疗记录。样本中血清ca125 的测量在澳大利亚墨尔本莫纳什医学中心的诊断病理学实验室进行。伦理批准获自南方健康人类研究伦理委员会(hrec证书；#06032c，#02031b)，所有参与者都提供了事先知情的书面同意。
[0599]
患者样本根据病理分为两组；良性和恶性。
[0600]
中值ca125测量值与四分位距(iqr)用于每组的变异性测量。
[0601]
良性和恶性组都涉及绝经前和绝经后(即混合)的妇女。
[0602]
本研究中测试的样本类型为腹水、血浆、宫颈阴道拭子(cvs)，详表3。
[0603]
示例
[0604]
示例1：材料和方法
[0605]
试剂
[0606]
nunc-immuno microwell 96孔固体板购自sigmaaldrich(美国)。tmb色原溶液来自thermofisher(美国)。重组人cxcl10蛋白(用于免疫和测定标准)来自genscript (中国
香港)(seq id no：2)。mimotopes(澳大利亚)合成了包含cxcl10的活性或截短的 n-末端的短肽。生物素(a型)快速偶联试剂盒、抗ip-10抗体、链霉亲和素过氧化物酶、抗人ip-10elisa试剂盒、人二肽基肽酶iv elisa试剂盒和活性肽基精氨酸脱亚胺酶(pad)鸡尾酒来自abcam(英国)。所有其他试剂均为分析等级。
[0607]
临床样本
[0608]
临床样本取自存储在卵巢癌研究基金会组织库中的档案样本，这些样本是从2007 年至2014年期间接受疑似妇科恶性肿瘤手术的女性中前瞻性收集的。所有样本均来自未接受过手术治疗的麻醉、未接受过化疗的患者。
[0609]
肿瘤类型、分期和分级、术前ca125测量值、年龄、绝经状态、先前存在的状况和任何先前的恶性肿瘤病史的组织学评估来自去识别的患者医疗记录。样本中血清ca125 的测量在澳大利亚墨尔本莫纳什医学中心的诊断病理学实验室进行。伦理批准获自南方健康人类研究伦理委员会(hrec证书；#06032c，#02031b)，所有参与者都提供了事先知情的书面同意。
[0610]
患者样本根据病理分为两组；良性和恶性。
[0611]
中值ca125测量值与四分位距(iqr)用于每组的变异性测量。
[0612]
良性和恶性组都涉及绝经前和绝经后(即混合)的妇女。
[0613]
本研究中测试的样本类型为腹水、血浆、宫颈阴道拭子(cvs)，详表3。
[0614]
示例7：art作为临床诊断
[0615]
发明人探索了是否可以使用代表生殖道的宫颈阴道拭子(cvs)来进行活性比率测量。
[0616]
与我们在腹水中的发现平行，对cvs提取物(n＝50/组)进行的活性比率测量显示出良性和恶性疾病样本之间的良好区分，auc为0.8(p《0.0001)(图8a；表6)。在匹配的血浆样本(n＝30)中，art也能够进行组间区分(auc 0.8，p《0.001)。
[0617]
为了探索roc分析之外的诊断效用，发明人还检查了每种生物标志物和样本类型的效应大小(cohen’s d)(表6)。血浆ca125的测量返回的auc为0.83，仅次于腹水中的art测量(auc 0.86)；然而，效果大小是“中等的”(cohen's d＝0.62)。相比之下， art测量在腹水和cvs(cohen's d＝0.86和1.0)中实现了“大”效应大小，这表明在同一人群中大大减少了偏差。类似地，在血浆中进行的art测量返回cohen’s d＝0.79 (表6)。
[0618]
该结果表明，art是实现统计稳健测量的首选生物标志物，并且使用cvs对其进行分析可以提供稳健且临床有用的测量来区分恶性和非恶性疾病。
[0619]
示例8：通过art将无癌症患者与患有良性病症或恶性卵巢肿瘤的患者区分开来
[0620]
在确定art应用以通过活动率区分良性和恶性卵巢肿瘤患者后，art被应用于测试一个新的患者队列(即前瞻性收集的队列)——接受预防性、降低风险的输卵管卵巢切除术且被证实为brca1/2突变携带者，或有严重的乳腺癌和/或卵巢癌家族史的患者。因此，这些患者代表了一个理想的无疾病对照队列，用于验证旨在检测早期卵巢癌存在的art。
[0621]
健康女性中活性cxcl10的浓度显着高于总cxcl10(图9a)，这表明没有癌症的患者可能具有更高水平的活性、功能性cxcl10。当将前瞻性收集的队列中健康女性的总体活性cxcl10和总cxcl10浓度与各自的良性和恶性cxcl10浓度进行比较时，它们显着低于良性和恶性cxcl10浓度(图9b)。至于活性比率，健康女性的活性比率在血浆和cvs中均显着高于良
性和恶性组(图9c和d)。
[0622]
鉴于健康女性的活性cxcl10水平和活性比率分别显着高于总cxcl10和良性和恶性患者的活性比率，数据表明在没有良性病症或恶性卵巢肿瘤的患者中，dpp4启动的功能性cxcl10裂解的程度可能较低。
[0623]
示例9：dpp4丰度和活性与活性比率无关
[0624]
为了在前瞻性收集的队列中建立dpp4和cxcl10之间的关系，测量了血浆样本中 dpp4的丰度及其比活性，并与良性或恶性卵巢癌患者的结果进行了比较。
[0625]
健康患者血浆样本中dpp4的水平显着高于良性和恶性患者组。然而，在这些健康女性样本中，dpp4丰度与计算的活性比率无关(图10a)。尽管健康女性中dpp4的水平显着高于良性和恶性患者组，但其在健康女性血浆中的比活性显着低于良性和恶性组 (图10b)。比活性也与计算的活性比率无关。这些数据表明，健康女性中dpp4的功能可能受到未知因素的抑制。
[0626]
示例10：通过cvs将健康女性与患有良性或恶性卵巢肿瘤的患者区分开来
[0627]
由于cvs是基于生物标志物的测试的首选样本，因此测量了前瞻性收集的队列的 cvs中的活性cxcl10和总cxcl10浓度水平，以获得活性比率。此外，在前瞻性收集的队列中的健康患者与患有良性或恶性卵巢肿瘤的患者之间进行了活性比率的比较。
[0628]
至于健康女性，活性、功能性cxcl10的总体水平显着高于总cxcl10(图11a)。与良性或恶性卵巢肿瘤患者相比，健康患者cvs的计算活性比率与血浆结果一致；健康女性样本的总体活性比率显着高于良性和恶性患者组(图11b)。
[0629]
示例11：cvs上的dpp4丰度及其与cvs活性比率的相关性
[0630]
由于cvs的提取物数量有限，在先前涉及卵巢癌生物库的研究中未测量cvs上的 dpp4丰度。由于需要测量来自同一样本来源的活性比率和dpp4丰度并在同一样本类型中建立它们的相关性，因此优化cvs的制备以测量cvs的活性比率和dpp4，从而将它们关联起来。如图12所示，可以对cvs的dpp4进行定量，计算出的活性比率与dpp4 呈负相关(p＝0.0094)。该数据表明将活性比率与cvs的dpp4相关联的可行性。
[0631]
示例12：活性比率和血浆ca125
[0632]
健康女性的ca125测量值显着低于良性和恶性组。该数据符合恶性疾病患者ca125 水平升高的事实(图13)。计算出的活性比率与ca125呈正相关(p＝0.0015)。
[0633]
示例13：活性比率和血浆ca125
[0634]
为了评估活性比率是否可以提供有用的临床信息，使用受试者工作特征(roc)曲线评估其在血浆和cvs中的表现。roc曲线是基于前瞻性收集队列中的健康女性与恶性卵巢肿瘤患者之间的比较构建的。
[0635]
由于在先前的腹水研究中，与单独定量活性cxcl10或总cxcl10相比，活性比率在灵敏度/特异性方面取得了显着改善，因此血浆和cvs的活性比率的组合也实现了更高的auc(图14a)。这验证了使用这两种样本类型来提高art的预后效果。血浆、dpp4 和血浆ca125的活性比率的组合测量产生了auc》0.98(图14b)，而cvs、dpp4和血浆 ca125的活性比率的组合产生了auc》0.99，用于区分健康女性和恶性肿瘤疾病。这些数据表明，活性比率与dpp4和血浆ca125的组合以及两种样本类型的组合证明可用于区分健康女性和恶性疾病。
[0636]
示例：通过art区分具有复杂背景的恶性肿瘤患者
[0637]
为了研究art在不同背景下识别恶性肿瘤的预后潜力，将健康和良性队列中的女性结合起来，并对恶性组进行roc分析。当应用于血浆样本时，单独的art的auc为0.79，应用于cvs样本时的auc为0.72。相比之下，ca125的auc为0.93(图15a)。然而， ca125在队列中表现出高度变异(cv 189.5％)和较小的效应量(cohen's d 0.097)，表明它不是从健康加良性组合队列中区分恶性样本的可靠测量值(表7)。
[0638]
相比之下，活性比率测量在cvfs(d＝0.64)和血浆(d＝1.01)中具有较大的影响量，这表明在同一人群中的偏差大大减少(表7)。这一结果表明，art可以实现统计学上稳健的测量，并且可以在健康女性或良性疾病患者的复杂背景下，优于目前用于区分恶性卵巢癌的ca125金标准。
[0639]
表7个体生物标志物在复杂背景队列中用于区分恶性疾病的效应量。
[0640][0641]
art(cvs和/或血浆)、dpp4和ca125的组合也被检查为改善组间分化的机制。与 ca125(auc 0.94)相比，使用cvs测量的art与在血浆中测量的所有其他标志物的组合获得了0.98的auc(表8)。
[0642]
所有生物标志物(art、dpp4和ca125)的组合在该队列中实现了0.98的auc，灵敏度为93.1％(表8)。相比之下，单独的ca125的auc为0.94，但灵敏度仅为78.6％ (表8)。
[0643]
表8个体标志物和联合标志物的预后表现，以将恶性疾病与由健康女性和患有良性妇科疾病的女性组成的患者队列区分开来。
[0644][0645]
因此，art、dpp4和ca125的组合将恶性肿瘤与由健康女性和患有良性疾病的女性组成的复杂背景区分开来；并且明显优于目前临床金标准ca125。
[0646]
示例15：art改进了早期(i期)癌症患者的识别
[0647]
诊断时的癌症分期与卵巢癌患者的临床结果密切相关。特别是，与iii-iv期诊断的患者(《40％)相比，诊断为figo i期(“早期”)的患者的5年和总生存率(约95％) 显着提
高。因此，评估了art(单独或联合)是否可以成功地将早期癌症患者与健康女性或患有良性疾病的女性区分开来。
[0648]
ca125在早期癌症患者和良性疾病患者或健康女性之间提供了最大的单一标志物区分(表9)。然而，art(血浆)与dpp4和ca125的组合显着改善了良性与早期恶性肿瘤之间的区分(auc 0.75vs 0.63；表9)。
[0649]
引人注目的是，与单独使用ca125(auc 0.88；灵敏度为81.8％)相比，使用3标志物组合(auc＝0.99；灵敏度为95.4％)可以高精度区分早期恶性肿瘤患者与健康女性。
[0650]
因此，与目前的ca125金标准相比，art可用于改善患者的诊断或预后评估，特别是用于检测与早期癌症相关的疾病特异性变化。
[0651]
表9单个标志物和组合标志物的预后表现以识别1期癌症。
[0652][0653]
示例16：通过art组和多重5标记组的组合在前瞻性收集的队列中识别患有癌前病变的患者
[0654]
虽然卵巢癌的病因仍不清楚，但现在很明显，许多卵巢肿瘤的形成始于输卵管中存在癌前“p53特征”。与其他癌症类型类似，在非常早期或癌前阶段检测病变将大大改善结果。
[0655]
发明人先前确定了与高级上皮性卵巢癌的诊断分析相关的几种其他生物标志物 (gm-csf、il-6、tnf-rii、he4、il8(pmid： https://doi.org/10.1038/s41598-020-59009-z)。因此，评估了这些与现有的art、 dpp4和ca125组合的潜在改进诊断性能。
[0656]
对于这些研究，在前瞻性收集的一组女性中评估了标志物组合，这些女性接受了预防性降低风险的手术(通常是双侧输卵管卵巢切除术)，已知卵巢癌发展的遗传风险。组织学评估用于将所有患者分类为“健康”(即确认没有疾病)或“癌症”(存在p53病变或早期隐匿性肿瘤)。
[0657]
结果显示在表10中(仅显示了性能最佳的组合)。5-标志物组返回的组合auc为 0.87，用于检测早期/癌前病变；而已建立的art组的auc为0.97(表10)。这些明显优于auc为0.77的ca125。
[0658]
然而，引人注目的是，当两个组组合时，达到了1.0的完美auc，这表明这种特定的标志物组合在诊断卵巢的早期和癌前病变方面具有很高的潜力。
[0659]
表10单个标志物和组合标志物的预后表现，以识别患有1期癌症或p53癌前病变的患者。
[0660][0661][0662]
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