一种随检进样的实时定量聚合酶链式反应(qPCR)反应器系统的制作方法

一种随检进样的实时定量聚合酶链式反应(qpcr)反应器系统
技术领域
1.本发明总体上涉及基于光的检测系统，例如用于实时定量聚合酶链反应(以下称为qpcr)的自动化系统、数字pcr仪器、dna测序仪器以及抗原-抗体elisa仪器，并且特别的，涉及上述仪器的照射系统。


背景技术：

2.聚合酶链反应(pcr)属于一种核酸的体外定量检测。在医学和生物研究实验室中，pcr经常用于各种任务，例如遗传性疾病检测、基因指纹识别、传染病诊断、基因克隆、亲子鉴定和dna计算。通过使用热稳定的dna聚合酶和能够快速加热和冷却基因样本的机器(通常称为热循环仪)，该方法能够实现自动化。
3.在一个典型的pcr实验中，目标dna被分成两条链，并使用引物合成目标dna，使目标dna的量加倍。重复上述过程，直到合成大量dna片段。这种简单的基因扩增技术可以使dna快速扩增。在pcr技术中，极少量的目标dna可以在短时间内扩增一百万次，从而大大提高了对dna分子的检测和分析能力。
4.为了推进pcr过程，必须对含有dna的溶液施加特定的温度变化，以导致分离(熔化)、引物结合(退火)和复制(延伸)。分离发生在高温下，例如95℃，退火发生在低温下，例如60℃。然而，这个过程对样本量非常敏感，并且能够导致最终扩增的巨大差异。pcr反应包括早期滞后阶段、指数增长阶段和平台阶段。仪器的灵敏度主要出现在滞后阶段。指数增长阶段开始时，有足够数量的产物已累积，能够通过特定的仪器检测出来。在最后的平台阶段，随着产物与退火引物更有效地对抗，酶的数量变得有限，扩增效率会下降。大部分的定量信息都可以在指数循环周期中找到，但指数循环周期通常只包含40个周期中的4或5个周期。
5.光学检测系统通常用于查询pcr中的反应，测量反应器中每个样品管的荧光发射强度。为了测量荧光，将激发光对准到样品容器中的样品，并检测样品中荧光团激发出的光。通常需要有效且高效地将光从光源传输到透光孔。使用本领域技术人员已知的标准技术，包括快速循环pcr，用于定量pcr的每个循环中进行热循环和荧光监测。对于传统的pcr方法，确定指数循环周期时需要将反应分成多个反应管，在不同的循环数后对pcr产物进行检测。用于将光引导至样品板的光学系统是已知的，例如us6942837b2,us7369227b2,us6852986b1,us7410793b2。虽然在本领域中已经开发了用于将光引导至样品板中的样品容器以及检测来自样品容器的光的光学系统。然而，仍然需要开发更有效地将光分布到样品容器并从样品容器接收光的光学系统。
6.实时定量pcr(qpcr)技术是一种定量荧光标记探针中荧光的方法，其基于常规pcr方法或在实时监测整个pcr过程中荧光染料，以及定量分析已知模板的最终标准曲线。
7.还有其他方法，例如数字pcr(dpcr)，其将一个pcr反应划分为许多小的独立的pcr反应，这样每个小反应平均只包含不超过一个目标核酸分子。每个小反应大约包含1或0个目标核酸分子，并在pcr扩增结束时给出正或负的二进制读数。目标基因的绝对量是通过对
实际目标分子计数来确定的，其不依赖于指数扩增循环周期和与用于量化初始量的参考基因。通过使用大量分区，dpcr可用于检测比qpcr更细微的折叠差异。
8.总的来说，qpcr仪器是实时pcr检测方式，主要有2个功能模块：温度控制系统和荧光检测/监测系统。此类仪器主要由样品台、基因扩增热循环元件、荧光检测光学系统和微电路控制系统组成。其中，基因扩增热循环元件组装基本相似。荧光检测系统包括荧光激发系统、发射系统、光学系统、荧光检测装置和控制系统。常用的荧光激发光源为卤素灯、激光或led。荧光检测通常通过光电倍增管、冷却ccd/cmos相机或光电二极管实现。
9.qpcr是目前较常用的系统之一，但是，目前的系统存在一些问题。一个是在反应板中保存的待测试样品阵列之间获得热均匀性。大多数pcr反应是在多孔反应板中进行，以便一次测试大量样品。如果每个孔之间的间距很大，那么对于多孔反应板来说，在所有孔中实现温度均匀性更加困难，对于一个pcr热循环仪中的大阵列反应板则更加困难。为了消除这个问题，必须使孔彼此靠近，以便在更小的区域内容纳更多孔和样品。当前，很多pcr反应器使用孔的底部进行检测。这种设计不允许孔彼此靠得更近，因此，导致所有孔之间的热均匀性较差。为了能够使孔尽可能靠近，必须从反应板的顶部进行检测，因为反应板的底部位于热循环仪上。一些系统使用多孔半导体微芯片，然而，这样的系统难以操作且成本高昂。另外，多孔半导体微芯片的加热和冷却导致功率和能量分布不均，以及导致加热和冷却不均匀且缓慢。
10.根据所用检测器的类型，qpcr仪器可分为点检测器(例如光电倍增管或雪崩光电二极管)和二维平面阵列检测器(ccd相机或cmos)。使用探头进行二维扫描的方式速度慢，但具有良好的性能参数，如信噪比高、动态范围大等。通常使用不带扫描的二维阵列检测器，检测速度高，但性能相对较差。
11.目前的pcr仪主要有两种形式：(i)96孔或更多孔，其中多个样品槽共用一个温度控制单元和固定式光激发检测系统。在这种情况下，样品槽必须在开始前填满。这限制了应用和周转时间。(ii)另一种形式是单孔模块化pcr仪，其中每个样品槽都有一个独立的温度控制单元和一个光激发检测系统。该系统具有很大的灵活性。然而，单一样本槽形式的制造成本高，样本吞吐量扩展能力有限。
12.本发明旨在设计一种新形式的模块化qpcr系统，其中样品测试能够随机访问，从而显著提高系统吞吐量。该系统使用一种特殊类型的照射系统和光学检测系统。本发明的高性能和可移动的光学检测系统，提供了一个qpcr系统，只需要一个光学检测单元即可实现对多达10个及以上的热循环仪模块同时扫描和监测。因此，它显著降低了制造成本。


技术实现要素：

13.本发明公开了一种自动随检进样实时qpcr仪。它由多个pcr反应器组成，每个反应器都有自己的温度控制系统，但共用一个光学系统用于检测。因为只有一个光学系统，其可以在一系列pcr反应器上快速移动，自动随检进样实时qpcr反应器可以在短时间间隔内运行多个qpcr反应器。
14.本发明的用于生物分析的随检进样pcr反应器包括多个固定在平台上的pcr反应器。每个pcr反应器都有许多反应板，每个反应板都有一组用于容纳生物样本的反应池。所述随检进样pcr反应器具有一个光学系统，平台上的所有pcr反应器共用一个光学系统。所
述光学系统包括有照射系统和成像系统。照射系统包括(i)带有一组透镜和滤光片的光源；(ii)一个导光管，以及(iii)一个导光板。导光管由一系列导光的管道组成，这些导光管接收来自光源的光并将其均匀分布到导光板中。导光板位于平台上的pcr反应器的顶部，以便其可以照亮该pcr反应器上所有反应板的所有样本管。导光管和导光板配置成l形，其中导光板形成水平段，在其上方有一个空旷空间。成像系统位于导光板上方的空旷空间中，以拍摄该反应器的样本管中的发光样本发出的荧光。所述导光板能均匀地将光分布到正在检测的pcr反应器中的所有样本管中。均匀分布的光是实现样本分析准确的关键参数。所述导光板导具有一组光反射结构，以将每条光线的一部分反射到每个样本架中的每个生物样本中，所有生物样本能够同时被照明以产生发射光。
15.所述光学系统固定在一个横移系统上，该系统可以移动和保持光学系统，将光学系统移动和保持在平台上任何一个pcr反应器的上方。计算机系统协调每个反应器的热循环时间、光学系统的移动以及发射光的成像。当光学系统在特定的pcr反应器上运行时，其他pcr反应器可以用带有新样本的新pcr反应器替换，由此提供了一个随检进样的pcr反应器。
16.所述随检进样pcr仪包括多个pcr反应器，每个pcr反应器包括阵列反应板块，其与温度控制元件热耦合。其中每个pcr反应器的热循环均由其各自的温度控制元件独立控制。在本发明的一个实施例中，pcr反应器线性排列。然而，任何其他对齐方式，例如行列阵列分布，也是可行的。光学系统由电动横梁(机架)驱动，可在不同时间将光学系统移动到pcr反应器上，从pcr反应器上方拍摄反应板发出的光的图像。光学系统可以从一个pcr反应器移动到另一个pcr反应器，同时对每个反应器上的反应板块激发和记录荧光。计算机处理器控制每个pcr反应器的温度以及光学系统的运动。
17.本装置的光学系统被设计为每个pcr反应器上的所有反应板提供均匀的光。它采用紧凑的结构，可以轻松高精度地移动。它使用一个光源，如led或卤素灯，通过光学系统照射整个pcr反应器。位于样本区域上方的相机记录样本激发出的荧光。
附图说明
18.下面将结合所提供的附图来描述本技术的实施例，但并不构成对权利要求保护范围的任何限制，其中相同的附图标记表示相同的部件。其中：
19.图1示意了本发明的光学系统以及设置在温控加热器顶部的反应板；
20.图2示意了本发明的应用于反应板的反应管的照射系统；
21.图3示意了本发明的导光管；
22.图4a示意了实施例一的导光板的俯视图；
23.图4b示意了实施例二的导光板的俯视图，其中箭头示出了光路的方向；
24.图5示意了具有平行内部结构的导光板的横截面；
25.图6a示意了没有任何内部反射特征的导光板中的光路径；
26.图6b示意了顶面上具有反射结构的导光板的立体图；
27.图6c示意了顶面上具有反射结构的导光板的侧视图，以及示意了反射到反应管中的光路径；
28.图6d示意了底面上具有反射结构的导光板的立体图；
29.图6e示意了底面上具有反射结构的导光板的侧视图，以及示意了反射到反应管中的光路径；
30.图7a示意了在顶面和底面均具有反射结构的导光板的立体图，以及示意了反射到反应管中的光路径；
31.图7b示意了在顶面和底面均具有反射结构的导光板的侧视图；
32.图8是具有与反应板的孔匹配的预成型的加热盖的俯视图；
33.图9a示意了实施例一的pcr反应器；
34.图9b示意了实施例二的pcr反应器；
35.图10示意了10个pcr反应器呈线性阵列；
36.图11示意了本发明的自动随检进样pcr系统。
具体实施方式
37.图1示意了实施例一的pcr反应系统，该反应系统使用单个温度控制单元和四个反应板。该系统包括：1个ccd摄像机1、1个摄像机镜头2、1个带滤光片的摄像机滤光轮3、1个用于冷却led的轻型冷却风扇4、1个led模块5、1个镜头6、1个光源滤光片7、1个导光管8，1个导光板9、散热器冷却风扇10、加热模块11、散热器12、若干反应板13，每个反应板具有用于容纳生物样本的样本架或样本管14的阵列，以及热盖15。
38.图2示意了本照射系统的操作方式。来自led光源210(或其他任何光源)的光线200穿过光过滤系统220和1个透镜系统225。然后，光线进入包括多个导光管的导光管230。导光管将光分成许多独立的光线。然后光线进入导光板240，光线沿着具有样本反应管250的反应板的水平方向转向。穿过导光板240的光线逐步被反射为沿着朝下的方向212，其朝向样本反应池250。导光板240具有结构245以允许部分光光通过、部分光线反射到样本反应管。一旦光212进入样本管250，样本中的发光材料吸收激发光，作为响应，通过自发产生并发射荧光。从样本管250发射的荧光214在穿过热盖260之后继续穿过导光板240。发射光由位于芯片上方的相机系统270接收。每个反应管都被单独激发且其产生的发射光均由相机记录。相机可以是电荷耦合器件(ccd)检测器阵列、互补金属氧化物半导体(cmos)检测器阵列或光电倍增管检测器。相机的灵敏度应足够高以便捕获发射光线。可以使用不同的相机分辨率，例如4兆像素相机。光源滤光片7通过特定频谱的光，去除与荧光染料发射光波长相同的光。通常，通过光源滤光片的光的波长比通过相机滤光轮的光的波长短。荧光染料发出的荧光通过滤光轮，被数码相机接收。光学器件优选的设计为反射短波激发光以及传输长波发射光。任何其他组合都是可能的。滤光轮用于在不同的发射滤光片之间切换，选择性地优先考虑来自目标荧光染料的光的波长。使用检测单元，在pcr反应过程中捕获每个反应板的实时全视野图像。
39.图3示意了导光管8，其将来自led模块5的光310传输到导光板9中。导光管8包括若干透明材料320，这些透明材料以相互搭接的方式设置。每个导光管的形状和角度被设计为以低损耗将光引导至导光板9，并管理每个出射表面330上的光输出百分比和角度以控制均匀性和其他照明要求。导光管8包括入口340和多个出射表面330，出射表面的侧表面具有预定角度350。导光管8可以一体成型，也可以由几个部件组合而成。透明材料可以是光学玻璃、pmma、聚丙烯酸、聚碳酸酯、聚乙烯或其他光学透明材料。透光片的数量取决于每个pcr
反应器上需要照明的反应板的大小和数量。对于较大的系统，最好有1-10块甚至更多的玻璃。该系统可以修改为具有不同数量的入口和出口表面。
40.导光管8连接至附图4a所示的导光板9。导光管和导光板形成l形配置，使得光线从导光板的一侧进入，在导光板的上方留下一个开放空间，开放空间为相机所在的位置。导光板是基本上平坦的结构，其具有长度和宽度。导光板具有三个主要特征：(i)光耦合或入口特征410，(ii)用于均匀性和效率的光学特征或结构420，以及(iii)反射表面430。入口特征被配置以最小损耗接收来自每个导光管部分的光。基本垂直方向到达的光转变为大致水平方向。导光板引导和扩散光线。导光板的表面是：通过导光板的顶面和底面的反射，引导光线穿过导光板。导光板将光线传导到整个样本区域，并具有特殊的特征和结构以照射每个样本管。在一个实施例中的导光板，入口特征被配置为多个台阶440的形式，其尺寸大小被设定为匹配导光管的出射表面330。导光板可由任何透光材料模压成型或制成。它将光线传导并照射到整个样本区域。
41.图4b示出了导光板入口结构的另一个实施例，其中导光板410的入口部分具有结构460，以沿着导光板的纵轴465并沿反应板表面的平行方向聚光。导光板在所有表面上具有表面涂层。图4b中导光板的远端470具有三角形结构以将光反射回导光板中，从而防止光的损失，并为pcr产生更均匀和更扩散的光源。导光板在垂直于纵轴的方向上还具有图4a中的切口420阵列和图4b中的切口475阵列，向下或向上反射光线。所述导光板还沿纵轴方向在导光板中有一个三角形孔洞480，以将光扩散到导光板的侧面，从而使光分布更加均匀，导光板中的光损耗最小。
42.图5示意了导光板510的入口结构的另一实施例，其中一个台阶被抛光平整，而另一个台阶具有使光线呈柱状的结构。入射面520被光学抛光或具有oca(光学接触角)以填充导光板出射面和导光板入射面之间的间隙。表面530上的特征被配置为将到达表面530的光线550引导至预定方向，例如556和557的方向。
43.导光板的表面具有反射性560，或者在其表面设置反射涂层/用于tir(全内反射)的材料实现反射。例如，到达反射面560的光线570从反射面反弹并沿导光板575的方向行进。
44.图6a示意了没有反射结构的简单的导光板600的侧视图。由于用于tir(全内反射)的反射涂层/材料的材料特性，光线610从顶面612和底面614反射。在优选的实施例中，导光板具有反射结构，导光板可以具有不同的反射结构以将光反射向反应板的反应池中。该导光板将光均匀的分布在整个正在测试的pcr反应器上。
45.图6b和6c示意了导光板的立体图和侧视图，导光板顶面上具有反射结构。在优选的实施例中，反射结构是一组沿导光板的宽度制成的平行切口，这些切口基本上垂直于导光板的纵轴。在一个实施例中，切口为具有预定高度和角度的三角形横截面。然而，反射结构631-633可以具有不同的形状，例如三角形/矩形/圆形。角度和形状基于入射光角度和反射光方向。这些角度可以在10到90度的范围内。反射结构(光学特征)策略性的定位于将光反射到反应板上。这些功能不仅旨在提供均匀的光分布，而且还提高了光使用的总效率。导光板上的结构和切口可以通过激光蚀刻、注射成型、压花等方式制成。图6c示意出了光线641，该光线641沿方向642从底面反射，然后从结构633反射沿方向643到反应池650中。
46.图6d和6e示意出了导光板的另一个实施例，其中反射结构661在导光板的底面上。
光线从下部结构反射，然后光从顶部表面的反射表面650向反应池670反射。图7a和7b示意出了在顶部表面和底部表面均具有反射结构(切口)的导光板的一个实施例。在优选的实施例中，顶面681上的结构是具有45度角682的直角三角形，其中它们的斜边朝向入射光源(朝向右侧)。底部三角形683在底部表面处具有41度角684并且它们的斜边朝向入射光源(朝向右侧)。
47.反射结构的数量和间距685与每个pcr反应器上的反应池的数量和间距相同。例如，如果反应池的行之间的间距685是4mm，则反射结构将相隔4mm。为了获得均匀的光分布，三角形的高度(切口的深度)沿着导光板逐渐增加。在导光板具有20个切口的一个实施例中，从入口侧开始，有4个0.06mm高度的切口、4个0.08mm高度的切口、4个0.18mm高度的切口和8个0.4mm高度的切口。反射结构有助于改善导光板端侧的均匀性。因此，底面的切口比顶面少。在一个实施例中，对于顶面有20个切口的导光板，底面有9个切口，高度为0.4mm。底部表面上的切口相对于顶部表面具有偏移686，以防止其阻挡位于导光板下方的反应管中发出的光。
48.图8示意了热盖，热盖位于反应板的顶部。热盖具有与反应板中反应管的顶面对齐的孔阵列。图9a示意了本技术的pcr装置的一个实施例。pcr包括散热器910，其可以通过散热器冷却风扇920冷却。加热模块930设置在散热器的顶部以承载反应板940。热盖950设置在反应板的顶部。在本实施例中，一个pcr装置容纳四个反应板，这些反应板设置在加热模块中。pcr装置旨在将样本加热和冷却到精确的温度，以促进核苷酸变性、退火，然后是每轮dna扩增中进行的聚合酶延伸。在一个实施例中，使用peltier热循环仪。它使用固态主动热泵，通过消耗电能，逆着温度梯度将热量从一侧传递到另一侧。peltier模块的一个非常有用的功能是可以建立热梯度，允许在单次运行优化分析的退火步骤。图9b是pcr反应器的另一个实施方案。热盖950设置在加热模块930上和反应板940上方。热盖上具有开口以让荧光通过。确定引物退火的最佳温度对于产物的高效和特异性扩增至关重要。该pcr系统可以为每个反应器实现任何期望的温度梯度。
49.反应板可以具有不同的行和列的反应管组。在本系统的一个实施例中，每个微阵列具有4
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8阵列的样本管(样本架)。每个反应管可能有不同的体积，范围从1μl到125μl。体积更小或更大的任何其他格式也可以被使用。在本pcr仪的一个实施例中，每个单元具有四个反应板，每个反应板具有32个反应管，总共128个反应管，退火、聚合或变性温度在单次运行中进行测试。可以调整热梯度以在单次运行中优化反应条件，确定多个引物组的最佳退火温度，同时执行需要不同退火温度的反应等。因此，从每个pcr反应器拍摄的每张照片都包含每个反应管的128张图像。将反应管的所有图像放在一张图片中使得图像分析和比较比现有技术容易得多。荧光报告基因，例如dna结合染料或标记探针，可以测量每个pcr反应的荧光强度，因此可以确定实验样本中是否存在目标。
50.图10示意了本发明的自动随检进样pcr反应器系统，其包括10个线性排列的pcr反应器。每个pcr反应器都有自己的热控制器，但是每个pcr反应器的启动时间是独立控制的。
51.图11示意了本系统1100的完整pcr反应器的一个实施例。该系统在平台1110上具有10个独立的pcr单元。光学系统1120安装在横移系统1130上。横移系统将光学系统移动到任意一准备成像的pcr反应器上。同时，其他任意一个pcr反应器中的反应板都可以用一组包含新样本的新反应板代替。在本系统中，pcr反应器线性排列，因此使用线性运动。然而，
该系统可以被设计成具有任何类型的pcr排列，例如成行列排列，并且可以设置进行二维或三维横移，以将光学系统移动到系统中任何所需的pcr反应器上。
52.计算机为每个pcr反应器设置热循环参数，并通过控制横移系统移动光学系统，控制检测单元拍照并存储从检测相机中获取的数据。每个pcr单元具有不同的开始时间、热循环温度和加热时间。光学系统和成像的移动被设置为与每个反应器的移动相匹配。例如，通过几秒钟完成对一个pcr反应发出的荧光进行照明和成像，然后横移系统将光学元件移动到另一个准备照明和成像的pcr单元上，依此类推。已完成操作的pcr反应器将更换新的反应板并进行检测。上述方式允许随检进样pcr单元。
53.计算单元包括系统控制加热器、横移系统、相机和开关。加热器控制系统控制加热器、冷却风扇和相应的传感器。在启动任何程序之前，每个温度控制元件的热循环参数可以在软件中单独设置和配置。可以对电机进行设置，以将检测单元移动到所需反应器的位置，以便在任何预定义的时间点进行拍照。每个微型反应器的pcr程序的初始条件不需要相同。为了在每个微型反应器的热循环的同一时间点拍照，优选以顺序延迟的方式开始pcr热循环。相机通过使用软件设置，拍照的时间、曝光时间、相机增益、目标区域和帧速率等。滤光轮通过设置所需的滤光片组合，从而获得高质量图像。
54.该软件还提供了一整套用于图像处理和数据分析的工具。软件中可以实现多种方法来校准全视野图像并降低成像噪声，包括但不限于平场校准、彩色滤光片校准、暗帧减除、多次图像的中值平均、背景减法等。
55.本光学系统可用于除pcr和qpcr之外的许多仪器中，例如用于药物发现和其他生命科学研究的荧光显微镜、流式细胞仪和微流控芯片设备。当然，在任何系统中，都需要能获得分布在测量区域上连续的、可重复、具备鲁棒性且均匀的光。分析样本可以是涉及物种的反应的一部分，包括生物聚合物，例如寡核苷酸(dna、rna irna、sirna)、蛋白质(包括抗体、酶、激动剂、抗原、激素、毒素)、寡糖和非聚合物物种例如类固醇、脂类、磷脂、有机小分子(例如维甲酸)、杀虫剂和非肽类毒素、激素和抗原。由于光与位于样本溶液中的化学物质的相互作用，所有样本发出的冷光(荧光或磷光)随后被记录在相机或类似系统上。记录的图像包含来自微阵列芯片上所有孔的图像，使系统紧凑、易于使用且价格低廉。该光学系统可用于许多其他基于光的检测系统，例如微滴式数字pcr。孔可以包含诸如寡核苷酸、dna分子、rna分子、染色体或蛋白质分子这样的生物样本。本照明系统可与诸如微量滴定板阅读器、dna测序仪、pcr仪器、q-pcr仪器、显微镜、流式细胞仪、微流控芯片、诊断医疗器械、和治疗性医疗器械等多种生物分析工具一起使用。
56.本装置的光学系统为精确定量和目标识别提供灵敏的检测。扫描反应板正上方，该设备以高灵敏度和无串扰的方式单独照射和检测来自每个反应池的荧光。在数据采集过程中，光学系统自动收集所有反应管的数据，因此您可以按自己的计划输入或编辑反应管的相关信息。
57.上述内容仅被视为是对本发明原理的说明。此外，由于本领域技术人员很容易想到许多修改和变化，因此不希望将本发明限制于所示和描述的确切结构和操作，因此，所有合适的修改和等效物，均属于本发明的范围。
58.关于上述描述，应当认识到，本发明的部件在尺寸、形状、形式、材料、功能和操作方式、组装和使用方面的最佳关系被认为是显而易见的，并且对本领域技术人员来说是显
而易见的，并且与在附图中示出和在说明书中描述的那些等同的关系旨在被本发明所涵盖。