利用工程酿酒酵母高效生产胆固醇的发酵培养基及其制备方法

本发明属于发酵工程技术领域，具体地说，是涉及用于微生物生产固醇类物质的培养基的技术领域，更具体地说，是关于一种利用工程酿酒酵母rh6829高效生产胆固醇的发酵培养基及其制备方法以及利用该培养基发酵生产胆固醇的发酵方法。

背景技术：

固醇类化合物由于其化学结构的特异性，常常表现出良好的生物和药理活性，包括抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒和酶抑制等，可为新药研究提供重要的先导化合物。胆固醇是一种重要的固醇，作为最早发现的甾体，它是构成动物细胞膜的功能元素之一。大部分生物体内的甾体都是从胆固醇开始合成的，因此胆固醇作为重要前体物质为许多活性甾体化合物的合成提供重要支持。

在从动植物资源寻找潜在药物远不能满足人类对疾病的治疗需求的情况下，从微生物中寻找新的活性天然产物成为重要的选择。也正因为多数生物体内都有固醇类物质的转化路径，所以微生物转化法成功取代植物提取法成为目前大量固醇类物质的主要生产方法。

酿酒酵母本身具有甲羟戊酸合成途径，且能够完成复杂的蛋白结构形成和功能修饰，因此酿酒酵母成为多数的萜类化合物和甾体类化合物生物合成的底盘生物。瑞士日内瓦大学在2011年便研究通过敲除erg6和erg5基因，并导入不同来源的固醇c-7还原酶和固醇c-24还原酶，构建得到稳定生产胆固醇的酿酒酵母菌株rh6829，其胆固醇产量约为1mg/g细胞湿重。

然而，目前利用工程酿酒酵母发酵得到胆固醇的产量不高，生产效率较低，因此通过设计优化培养基方案与发酵方法来提高酿酒酵母rh6829生产胆固醇能力是本发明的主要目标。

技术实现要素：

本发明的主要目的就是针对以上现状，解决限制工程酿酒酵母生产胆固醇的瓶颈问题，提供了一种用于发酵工程酿酒酵母rh6829高效生产胆固醇的培养基及其制备方法。为此，本发明通过联用pb设计和响应面设计，确定重要因素，获得了可以用于发酵工程酿酒酵母rh6829发酵生产胆固醇产量的培养基，该培养基成分与配制方法简单，价格低廉，不需要特殊设备，能显著提高工程酿酒酵母生产胆固醇的能力。同时，申请人结合重要因素，对发酵工艺进行调整，获得了一种可以利用上述工程酿酒酵母rh6829发酵生产胆固醇的发酵方法。因此，本发明的第一个目的是提供一种利用工程酿酒酵母rh6829生产胆固醇的发酵培养基。本发明的第二个目的是提供一种上述所述的发酵培养基的制备方法。本发明的第三个目的是一种使用上述所述的发酵培养基发酵生产胆固醇的发酵方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

作为本发明的第一个方面，利用工程酿酒酵母rh6829生产胆固醇的发酵培养基，每升发酵培养基包括如下重量份的组分：

葡萄糖50-70g，玉米浆12-28g，磷酸氢二钾2.5-3.5g，氯化镁1-1.5g，氯化钙0.75-0.9g，柠檬酸3.2-4.8g，硫酸锌0.32-0.48g，腺嘌呤硫酸盐25-35mg，腺嘌呤30-50mg，尿嘧啶30-50mg，色氨酸15-25mg，余量为去离子水。

根据本发明，每升发酵培养基包括如下重量份的组分：葡萄糖48-72g，玉米浆16-24g，磷酸氢二钾2.4-3.6g，氯化镁1-1.5g，氯化钙0.666-1g，柠檬酸3.2-4.8g，硫酸锌0.32-0.48g，腺嘌呤硫酸盐30mg，腺嘌呤40mg，尿嘧啶40mg，色氨酸20mg，余量为去离子水。

优选的，每升发酵培养基包括如下重量份的组分：葡萄糖60g，玉米浆20g，磷酸氢二钾3g，氯化镁1.25g，氯化钙0.83g，柠檬酸4g，硫酸锌0.4g，腺嘌呤硫酸盐30mg，腺嘌呤40mg，尿嘧啶40mg，色氨酸20mg，余量为去离子水。

进一步的，所述发酵培养基的ph值为5.0-6.0。

作为本发明的第二个方面，一种利用工程酿酒酵母rh6829生产胆固醇的发酵培养基的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、将上述所述的葡萄糖、玉米浆、磷酸氢二钾、氯化镁、氯化钙、柠檬酸、硫酸锌、腺嘌呤硫酸盐、腺嘌呤、尿嘧啶、色氨酸按上述重量份准确称量后，以去离子水溶解并定容至1l；

步骤二、用naoh调节ph＝5.0-6.0，然后在115℃下灭菌30分钟，即得工程酿酒酵母生产胆固醇的发酵培养基。

作为本发明的第三个方面，一种使用上述所述的发酵培养基发酵生产胆固醇的发酵方法，包括如下步骤：

步骤一、将冷冻保存的工程酿酒酵母菌株解冻后，用移液枪取50μl-100μl于5ml-10ml种子培养基中，在30℃、175rpm震荡摇床培养48h，得到一级种子液；

步骤二、用移液枪取一级种子液于种子培养基中，在20℃、175rpm震荡摇床培养24h，得到二级种子液，其中，一级种子液与种子培养基的体积比为1:40-1:25；

步骤三、取上述新鲜二级种子液，接入装有50ml-30l上述所述的发酵培养基的发酵容器中，在30℃、175rpm-300rpm震荡摇床培养120h后，收集发酵液，其中，二级种子液与发酵培养基按体积比为1:10；

步骤四、将获得的发酵液进行抽提、萃取、纯化，获得胆固醇。

根据本发明，步骤三的发酵容器中接种后，每隔12h补充添加400g/l-600g/l的葡萄糖溶液，其中，葡萄糖溶液与步骤三的发酵培养基的体积比为1:30。

进一步的，所述发酵方法包括如下步骤：

步骤一、将冷冻保存的工程酿酒酵母菌株解冻后，用移液枪取50μl于5ml种子培养基中，在30℃、175rpm震荡摇床培养48h，得到一级种子液；

步骤二、用移液枪取2ml的一级种子液于50ml种子培养基中，在20℃、175rpm震荡摇床培养24h，得到二级种子液；

步骤三、取上述新鲜二级种子液，按10％(v/v)的接种量接入装有50ml上述所述的培养基的发酵容器中，在30℃、175rpm震荡摇床培养120h后，收集发酵液；

步骤四、将获得的发酵液进行抽提、萃取、纯化，获得胆固醇。

进一步的，所述发酵方法包括如下步骤：

步骤一、将冷冻保存的工程酿酒酵母菌株解冻后，用移液枪取50μl于5ml种子培养基中，在30℃、175rpm震荡摇床培养48h，得到一级种子液；

步骤二、用移液枪取2ml的一级种子液于50ml种子培养基中，在20℃、175rpm震荡摇床培养24h，得到二级种子液；

步骤三、取上述新鲜二级种子液，按10％(v/v)的接种量接入装有3l上述所述的培养基的发酵容器中，每隔12h补充添加400g/l的葡萄糖溶液100ml，在30℃、300rpm震荡摇床培养120h后，收集发酵液；

步骤四、将获得的发酵液进行抽提、萃取、纯化，获得胆固醇。

优选的，所述发酵方法包括如下步骤：

步骤一、将冷冻保存的工程酿酒酵母菌株解冻后，用移液枪取100μl于10ml种子培养基中，在30℃、175rpm震荡摇床培养48h，得到一级种子液；

步骤二、用移液枪取10ml的一级种子液于400ml种子培养基中，在20℃、175rpm震荡摇床培养24h，得到二级种子液；

步骤三、取上述新鲜二级种子液，按10％(v/v)的接种量接入装有30l上述所述的培养基的发酵容器中，每隔12h补充添加600g/l的葡萄糖溶液1l，在30℃、175rpm震荡摇床培养120h后，收集发酵液；

步骤四、将获得的发酵液进行抽提、萃取、纯化，获得胆固醇。

根据本发明，每升所述的种子培养基包含有如下重量份的组分：葡萄糖15-25g/l，蛋白胨15-25g/l，酵母浸膏8-12g/l，以去离子水溶解。

本发明的有益效果：培养基成分简单，价格低廉，制作方法方便，发酵工艺精简，不需要特殊设备。50-l反应器上胆固醇的最高产量可达到330.53±5.37mg/l，而初始水平是60.13±2.90mg/l，是初始水平的5.50倍。

附图说明

图1为实施例1-4以及对比例1的胆固醇产量的结果图；

图2-4为designexpert软件根据实验结果给出的响应面图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或厂商提供的条件进行。

应当说明，本发明选用的培养基成分均为市售产品，其中葡萄糖、磷酸氢二钾、氯化镁、氯化钙、硫酸锌购自国药集团化学试剂有限公司；玉米浆购自山东无棣波皓生物科技有限公司；蛋白胨、酵母浸膏、柠檬酸购自上海麦克林生化科技有限公司；腺嘌呤硫酸盐、腺嘌呤、尿嘧啶、色氨酸购自上海泰坦科技股份有限公司。

1、本发明的所用的菌种：

发酵工程酿酒酵母rh6829，由上海大学章焰生课题组提供。

2、种子培养基：

每升所述的种子培养基包含有如下重量份的组分：葡萄糖15-25g/l，蛋白胨15-25g/l，酵母浸膏8-12g/l，以去离子水溶解。

实施例1

1、发酵培养基的配置

准确称取葡萄糖60g，玉米浆20g，磷酸氢二钾3g，氯化镁1.25g，氯化钙0.83g，柠檬酸4g，硫酸锌0.4g，腺嘌呤硫酸盐30mg，腺嘌呤40mg，尿嘧啶40mg，色氨酸20mg，以去离子水溶解并定容至1l，用naoh调节ph＝5.0-6.0，然后在115℃下高温灭菌30分钟。

2、发酵操作过程

将冷冻保存的工程酿酒酵母菌株解冻后，用移液枪取50μl接入装有5ml种子培养基的25ml血清瓶中，在30℃、175rpm震荡摇床培养48h，得到一级种子液。用移液枪取2ml一级种子液接入装有50ml种子培养基的250ml摇瓶中，在20℃、175rpm震荡摇床培养24h，得到二级种子液。取上述新鲜二级种子液，按10％(v/v)的接种量接入装有50ml上述发酵培养基的250ml摇瓶中，在30℃、175rpm震荡摇床培养120h后，收集发酵液。

3、胆固醇提取与检测

取50ml所获发酵液，3500rpm离心10min，弃上清液。菌体中倒入30ml乙醇，超声裂解破壁30min后倒入250ml锥形瓶中，加入10ml的60％氢氧化钾溶液，于85℃水浴锅加热回流2h，转移皂化液于分液漏斗，分别用5ml无水乙醇和30ml水洗涤锥形瓶，洗涤液并入分液漏斗，分两次共加入40ml石油醚，震荡5min后静置30min，分离上层有机相旋蒸至干后用5ml甲醇溶解。取500μl溶解液用高效液相色谱法测定胆固醇含量。

通过胆固醇标准曲线制作，测得胆固醇含量为184.39±2.30mg/l。

实施例2试验设计、数据分析及检测结果

1)plackett-burman试验设计

plackett-burman试验设计，又称pb设计，是一种常用的挑选显著因素的统计分析方法。通过对发酵培养基成分选择高(+1)和低(-1)两水平设计组合实验，可以找出影响发酵产物产量，菌体生物量和产物得率等的关键因素。本实例选择培养基中7个因素进行分析，通过designexpert12.0数据处理软件设计n＝12的实验方案，各参数代表的因素及其水平如表1和表2所示，表1中x1，x2，x3，x4，x5，x6，x7分别代表葡萄糖、玉米浆、磷酸二氢钾、氯化镁、氯化钙、柠檬酸和硫酸锌。实验结果如表3所示。

表1plackett-burman实验设计结果

表2plackett-burman设计试验培养基成分及浓度

表3plackett-burman设计试验结果分析

通过以胆固醇的产量和产率为考察目标对七个因子进行分析，结果如表3所示，选择p值小于0.05的柠檬酸、玉米浆和硫酸锌三个因素进行下一步响应面优化试验。

2)响应面优化试验设计

根据pb设计的试验结果，选择柠檬酸、玉米浆和硫酸锌进行响应面分析实验，以获得培养基中三者最佳的组合浓度。响应面采用centralcompositedesign(ccd)中心组合设计，利用designexpert软件设计三因素水平安排及胆固醇产量如表4所示。各因素编码水平按(-1.68，-1，0，1，1.68)分别对应柠檬酸(1.477,2.5,4,5.5,6.523g/l)、玉米浆(6.544,12,20,28,33.456g/l)和硫酸锌(0.0636，0.2,0.4,0.6,0.7364g/l)，其他组分不变。中心组合设计结果及分析结果如表4和表5所示。

表4中心组合设计结果及胆固醇产量

表5中心组合试验分析结果

图2至图4为designexpert软件根据实验结果给出的响应面图，通过designexpert软件进行优化预测，所得三组分方案为柠檬酸2.547g/l，玉米浆21.915g/l，硫酸锌0.4g/l，预计胆固醇产量为203.49mg/l。

3)预测方案发酵验证

a、配制发酵培养基

准确称取葡萄糖60g，玉米浆21.915g，磷酸氢二钾3g，氯化镁1.25g，氯化钙0.83g，柠檬酸2.547g，硫酸锌0.4g，腺嘌呤硫酸盐30mg，腺嘌呤40mg，尿嘧啶40mg，色氨酸20mg，以去离子水溶解并定容至1l，用naoh调节ph＝5.0-6.0，然后在115℃下高温灭菌30分钟。

b、发酵操作过程

发酵操作过程同实施例1。

c、胆固醇提取与检测

提取和检测方法同实施例1，测得该方案的试剂胆固醇产量为201.89±6.34mg/l，与预测值较为接近。

实施例3

1)配制发酵培养基

同实施例1的发酵培养基。

2)发酵操作过程

将冷冻保存的工程酿酒酵母菌株解冻后，用移液枪取50μl装入接有5ml种子培养基的25ml血清瓶中，在30℃、175rpm震荡摇床培养48h，得到一级种子液。用移液枪取2ml一级种子液接入装有50ml种子培养基的250ml摇瓶中，在20℃、175rpm震荡摇床培养24h，得到二级种子液。取上述新鲜二级种子液，按10％(v/v)的接种量接入装有3l上述发酵培养基的5-l生物反应器，在30℃、300rpm搅拌转速下培养120h后，收集发酵液。

3)胆固醇提取与检测

提取和检测方法同实施例1，测得的胆固醇含量为240.86±5.35mg/l。

实施例4

1)配制发酵培养基

同实施例1的发酵培养基。

2)发酵操作过程

将冷冻保存的工程酿酒酵母菌株解冻后，用移液枪取50μl接入装有5ml种子培养基的25ml血清瓶中，在30℃、175rpm震荡摇床培养48h，得到一级种子液。用移液枪取2ml一级种子液接入装有50ml种子培养基的250ml摇瓶中，在20℃、175rpm震荡摇床培养24h，得到二级种子液。取上述新鲜二级种子液，按10％(v/v)的接种量接入装有3l上述发酵培养基的5l生物反应器，每隔12h补充添加400g/l的葡萄糖溶液100ml，在30℃、300rpm搅拌转速下培养120h后，收集发酵液。

3)胆固醇提取与检测

提取和检测方法同实施例1，测得的胆固醇含量为302.72±6.51mg/l。

实施例5

1)配置发酵培养基

同实施例1的发酵培养基。

2)发酵操作过程

将冷冻保存的工程酿酒酵母菌株解冻后，用移液枪取100μl接入装有10ml种子培养基的25ml血清瓶中，在30℃、175rpm震荡摇床培养48h，得到一级种子液。用移液枪取10ml一级种子液于400ml种子培养基中，在20℃、175rpm震荡摇床培养24h，得到二级种子液。取上述新鲜二级种子液，按10％(v/v)的接种量接入装有30l上述发酵培养基的50-l生物反应器，每隔12h补充添加600g/l的葡萄糖溶液1l，在30℃、175rpm搅拌转速下培养120h后，收集发酵液。

3)胆固醇提取与检测

提取和检测方法同实施例1。测得的胆固醇含量为330.53±5.37mg/l。

对比例1初始发酵工艺

1)配制发酵培养基(对照组)

准确称取葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸膏10g，腺嘌呤硫酸盐30mg，腺嘌呤40mg，尿嘧啶40mg，色氨酸20mg，以去离子水溶解并定容至1l。在115℃下高温灭菌30分钟。

2)发酵操作过程

发酵操作过程同实施例1。

3)胆固醇提取与检测

胆固醇提取与检测方法同实施例1。测得的胆固醇含量为60.13±2.9mg/l。

上述实施例1-4以及对比例1的胆固醇产量结果如图1所示。

从实施例1-4与对比例1的实例结果可以发现，使用本发明所述的培养基以及发酵方法来培养工程酿酒酵母rh6829得到的胆固醇产量有明显提升，50-l反应器上胆固醇产量最高达到330.53±5.37mg/l，是对照组的5.50倍。

综上所述，本发明的培养基成分简单，制备方法操作方便，成本低廉，不需要特殊设备。用本发明的培养基和发酵工艺能显著提高来培养工程酿酒酵母rh6829能显著提高胆固醇的产量。

以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。